Комплексное соединение иона co2+ и полиакриловой кислоты, обладающее гемостатическими, антимикробными и ранозаживляющими свойствами

Изобретение относится к фармацевтике и медицинской химии, в частности к комплексному соединению иона Со²⁺ и полиакриловой кислоты с молекулярной массой 9356, 46072, 99013 или 184631 Да. Предложенное комплексное соединение обладает высокой гемостатической, антимикробной и ранозаживляющей активностью при минимальной общей токсичности для позвоночных. 11 ил., 13 табл., 7 пр.

 

Задачи обработки раневых поверхностей с целью остановки кровотечения и предотвращения нагноений, гемостаз крупных сосудов (вен и артерий), обработка поверхностей ожогов и трофических язв с целью скорейшего заживления обладают высокой актуальностью для практической медицины, в частности хирургии (военно-полевой, гнойной, челюстно-лицевой зоны), травматологии, стоматологии (в частности, при борьбе с кровоточивостью десен при пародонтите), при лечении язвенной болезни желудка и кишечника, геморроидальных кровотечений, воспалительных патологий урогенитальной зоны. До настоящего времени медицина не располагает универсальным средством для решения всех перечисленных задач. Из уровня техники известны следующие основные подходы к решению проблемы гемостаза сосудистого, паренхиматозного и капиллярного кровотечения при операциях:

1. Механический метод (лигатура крупных сосудов) [ЕР 0609212 А4; US 5222974 A; RU 2454958 C1; RU 2635081 С1];

2. Физические методы: использование нагретого хирургического воска [US 3364577 A; RU 181729 U1], электрокоагуляция [US 4364377 А; RU 2486874], использование холодной плазмы атмосферного воздуха [US 7777151 В2];

3. Использование гемостатических губок из коллагена и желатина [US 6162192 А; IL 245530 D0; AU 3965899 A; AU 748773 В2; СА 2330634 А1; ЕР 1083855 А1; JP 2002513639 A; JP 4297205 В2; US 6162192 A; US 7048710 В1; WO 9956692 A1; US 4098728 A; US 4211227 A; US 4636208 A; US 5180375 А; US 5645565 A; JP 2000510357 A; RU 2485963; RU 2562569; RU 2708622 С1; RU 2419458];

4. Использование биосовместимых клеев, сшитых гидрогелей и самоагрегирующих пептидов, образующих пленки и волокна на раневой поверхности [US 7399831 В2; US 7713923 В2; US 7846891 В2; US 7884185 В2; US 8039258 В2; US 8999916 В2; US 9364412 В2; US 2009169625 А1; US 20120085262 A1; WO 2007059171 A2; WO 2007059171 A3; ЕР 1542709 A2; EP 2711025A3; CA 2592292A1; ES 2776709 T3; IL 159156D0; RU 2503464; RU 2254145; RU 2415938 C2];

5. Использование производных витамина К, в частности менадиона бисульфита [US 4577019 A; AT 373576 В; AT А490879 A; BE 877807 A; BE 877807 A1; BR 7904749 А; СА 1198439 А; СА 1198439 Al; СН 646131 А5; DE 2855851 А1; DE 2855851 С; ES 482681 А0; ES 482681 D0; ES 8107143 A1; FR 2431477 A1; FR2431477B1; GB 2025976 A; GB 2025976 B; IE 49458 B1; IE 791342 L; IL 57847 A; RU 2454997; RU 2453312].

6. Использование местных сосудосуживающих средств (гидрохлорид адреналина) [RU 2266752; RU 2342137 С];

7. Использование химических агентов с денатурирующими свойствами (этиловый спирт, пероксид водорода, капрофер - карбонильный комплекс треххлористого железа с аминокапроновой кислотой) [RU 2414932; RU2 229 881 C2; SU 1782614 А1];

8. Использование белков системы свертывания крови и фибриногена, в частности, концентрат протомбинового комплекса, рекомбинантный преактивированный фактор свертывания VII - эптаког альфа [WO 2009-155626 А2; WO 9522316 А; US 2006-0009376 A1; US 2008-003272 A1, US 2008-181878 A1; US 6489446 B1; US 7919592 B2; EP 1240200 A1; EP 0771324 A1; EP 1519944 A1; EP 0555135 A1; RU 2522237; RU 2606155 C2; RU 2663792 C2; RU 2325401 C2];

9. Использование ингибиторов тромболиза (апротинин, аминокапроновая и транексамовая кислоты) [US 4171377; BY 5157 C1; RU 2197983 C2; RU 2205604C2]

10. Использование механических индукторов системы свертывания крови, в частности, графена, каолина, бентонита, магнетита и окисленной целлюлозы [US 8999916 В2; RU 93037869 A; Li G., Li Y., Liang С, Xu С.Polydopamine reinforced hemostasis of a graphene oxide sponge via enhanced platelet stimulation. 2018. Colloids and surfaces B: Biointerfaces, DOI: 10.1016/j.colsurfb.2018.10.074;];

11. Использование химических индукторов свертывания крови местного применения на основе солей металлов, растворимого хитозана или полиакрилатов металлов (серебра, меди, железа и кобальта) [WO 0027327 А1; US 7261861; US 7879615; US 8236568; US 9068966; RU 2519220; RU 2487701; RU 2519220; RU 2220982 C2; RU 2163147 C1; RU 2074200 C1; RU 2585366].

Механические методы гемостаза крупных сосудов являются наиболее традиционными и не имеют приемлемой альтернативы в виде химических или физических методов. Однако их недостатком является трудоемкость (длительность перекрывания каждого поврежденного сосуда). Поэтому при возникновении множественных повреждений крупных сосудов, например, при огнестрельных ранениях или разрыве матки механический метод гемостаза не гарантирует предотвращение молниеносной жизнеугрожающей кровопотери. Этот метод не применим для гемостаза паренхиматозных кровотечений при оперативном вмешательстве на печени, селезенке, отчасти, на почках, а также капиллярных кровотечений.

Физические методы тромбообразования (термо- и электрокоагуляция, использование лазеров и холодной плазмы) активно применяются в хирургии, так как позволяют быстро останавливать кровотечение, обеспечивают хирургу хороший обзор рабочей зоны. Однако, их крупным и неустранимым недостатком является то, что неестественный характер запуска каскада свертывания крови, основанный на денатурации белков крови и тканей, приводит к снижению механической прочности сгустка и поверхностей его контакта с окружающими тканями. В результате часто уже в процессе операции или вскоре после нее происходит нарушение целостности тромба и возникает вторичное кровотечение, которое требует повторного хирургического вмешательства, создает угрозу здоровью пациента. Кроме того, сгусток, сформированный из денатурированных белков, не обладает антимикробными свойствами, характерными для фибриновых сгустков, сформированных естественным путем. Поэтому раневые поверхности, сформированные с применением методов термо- или электрокоагуляции часто подвержены инфицированию и гнойным осложнениям. Использование антибиотиков и других антимикробных агентов является стандартной практикой в этих случаях, однако, не позволяет полностью возместить снижение эффективности действия естественных местных защитных систем организма. Сгустки, сформированные при использовании термоденатурации, медленно рассасываются, что приводит к риску возникновения спаек и рубцов.

Те же недостатки присущи методам, основным на химической денатурации белков плазмы крови, прежде всего, этилового спирта и пероксида водорода. Относительно массовое применение гемостатических средств на основе аминокапроновой кислоты, которая рассматривается, в первую очередь, как ингибитор тромболиза, также часто приводит к денатурации белков плазмы крови, что повышает риск возникновения вторичного кровотечения и гнойных осложнений.

Использование коллагеновых, желатиновых или синтетических гемостатических губок в хирургии является стандартной практикой. Их преимуществом является теоретическая возможность гемостаза крупных сосудов, так как губки могут быть зафиксированы на поверхности сосудистого дефекта и удерживаться до момента образования тромба, перекрывающего кровотечение. Кроме того, они часто используются при гемостазе паренхиматозных кровотечений, например, при операциях на печени, где использование механического гемостаза невозможно. Однако, качественные гемостатические губки, например, Тахокомб (Никомед Австрия Гмбх, бывшая Такеда-Австрия ГмбХ, Австрия), имеют высокую стоимость. Это объясняется тем, у некоторой части больных при контакте лимфоцитов с коллагеновой губкой возникает иммунный конфликт, приводящий к реакциям, сходным с анафилактическим шоком. Создание коллагеновых губок, полностью лишенных реактогенности, до настоящего времени остается нерешенной проблемой.

Альтернативой использованию губок является использование мелкодисперсных механических индукторов свертывания крови: каолина, микрокристаллической целлюлозы (в том числе, частично окисленной), магнетита, хитина и хитозана. Этот способ гарантирует отсутствие острых иммунологических реакций в момент выполнения хирургического вмешательства, однако, его недостатком является невозможность удаления микрочастиц из восстанавливающийся ткани, что приводит к хроническому стерильному воспалению в нем. В долгосрочной перспективе стерильное воспаление существенно снижает качество жизни больного, снижает его иммунный статус.

Перечисленные недостатки полностью исключаются при использовании для гемостаза индукторов естественного механизма запуска каскада свертывания крови. К этой категории относится использование солей кальция и других катионов (железа, меди, кобальта, серебра), в том числе, в форме прочных координационных комплексов с полианионами (полиакрилаты, альгинаты и другие). Использование комплексов металлов с полиакриловой кислотой существенно снижает их общую токсичность, не ухудшая, и даже потенциируя их участие в механизме взаимоактивации белков системы свертывания крови, прежде всего, тромбина. Примерами эффективного использования этого принципа создания гемостатических средств местного применения являются Феракрил (полиакрилат железа) и гемостатический пластырь на его основе (RU 2163147 С1), Ликуприл (полиакрилат меди) (RU 2585366) и Аргакрил (полиакрилат серебра) (RU 2220982 С2). Все эти субстанции обладают высокой гемостатической активностью, индуцируя ускоренное образование тромбинового сгустка нативной структуры. Важным преимуществом Феракрила, Ликуприла и Аргакрила перед гемостатиками на основе аминокапроновой кислоты является наличие выраженной антимикробной активности, что не только не стимулирует инфицирование тромба микробной микрофлорой, но и обеспечивает выраженный антимикробный эффект in vivo. Все перечисленные препараты обладают также ранозаживляющей активностью, сокращая сроки резорбции сгустка, ускоряют ремоделирование коллагенового матрикса восстанавливаемой ткани, что способствует восстановлению естественной, а не рубцовой структуры ткани. Однако, до настоящего времени, полиакрилаты металлов в качестве гемостатического средства остаются недостаточно известными хирургам-практикам. За пределами РФ они совершенно не известны. Производство Феракрила в РФ, начавшееся в 1999 г, прекращено, регистрация и промышленный выпуск Ликуприла не произошло, Аргакрил выпускается ООО «Пульсар» под марками Гемосорб-Дент, Гемоблок, Гемоблок-Дент.

К недостаткам изобретений, описанных в патентах RU 2163147 C1, RU 2585366 и RU 2220982 С2 относится недостаточная степень детализации технологии синтеза активной субстанции, что осложняет выполнение операций по контролю качества достижение стандартности лекарственного средства (медицинского изделия). В частности, в описаниях изобретений не раскрыты методы определения молекулярной массы полимера (полиакриловой кислоты), используемой для синтеза комплекса с металлами, хотя на примере комплексной соли полиарилата золота показано, что этот параметр существенно влияет на свойства готовой субстанции [RU 2690536 С1]. Ни в одном из описаний изобретения не раскрывается способ оценки доли металла, образовавшего прочный (координационный) комплекс с полиакриловой кислотой, хотя известно, что наряду с прочным комплексом в результате ионного обмена может образовываться слабый (солевой) комплекс, фармакокинетика которого существенно отличается от прочного комплекса (Г.И. Джардималиева, А.Д. Помогайло, В.И. Пономарев, Л.О. Атовмян, Ю.М. Шульга, А.Г. Стариков. Синтез и исследование акрилатов переходных металлов // Изв. АН СССР, сер. хим. 1988. №7. С.1525-1530; Н.П. Поролло, Г.И. Джардималиева, И.Е. Уфлянд, А.Д. Помогайло. Координационные полимеры на основе непредельных дикарбоновых кислот // Росс.Хим. ж. (Ж. ВХО им. Д.И. Менделеева). Металлохелаты. 1996. Т. 40. №4-5. С. 190-193).

Таким образом, технической проблемой, решаемой настоящим изобретением, является создание способа синтеза полиакрилата металла, обладающего выраженной гемостатической, антимикробной и ранозаживляющей активностью при низкой общей токсичности, соответствующей 3-му или 4-му классу опасности. В качестве иона металла для решения поставленной задачи выбран ион Со²⁺. Выбор обусловлен тем, что этот ион, входящий в состав цианкобаламина (витамин В12) - важнейшего кофактора ферментов фолатного обмена, обладает минимальной среди ионов переходных металлов токсичностью. Ближайшим аналогом заявляемого изобретения является RU 2074200 С1 (авторов Жданкович Е.Л., Арбузова О.В., Анненкова В.З., Воронков М.Г., Бродская Э.И., Страшникова Н.В., приоритет от 12.07.1993, Сшитая Co-содержащая полиакриловая кислота в качестве суперсорбента, патентообладатель Иркутский институт органической химии СО РАН). В прототипном изобретении предложен способ синтеза полиакрилата кобальта, основанный на цепной полимеризации кобальтовой соли акриловой кислоты в присутствии персульфата аммония при 98-100°С. В описании прототипного изобретения не описаны какие-либо методы оценки молекулярной массы синтезированного полимера (с учетом возможной дисперсии этой величины). Для подтверждения факта образования координационного комплекса кобальта с полиакрилатной матрицей использован метод ИК(Фурье)-спектроскопии, который является качественным и не позволяет оценивать долю металла, находящуюся в прочном комплексе относительно доли металла, остающегося в форме соли. Назначение полимера, описанного в прототипном изобретении, обозначено как «использование в качестве суперсорбента», что подтверждается количественным измерением влагоудерживающих свойств. Обнаружив, что коэффициент равновесного набухания Q для разных серий сорбента на основе полиакрилата кобальта в диапазоне от 675 до 1 290 г/г, авторы предложили использовать его в качестве медицинского изделия для пропитки бинтов, подразумевая возможность удержания крови и экссудата, выделяющихся из раны. Однако, они не предложили использовать синтезированный ими полиакрилат кобальта в качестве гемостатического средства. Они не приводят сведений об испытаниях его антимикробной и ранозаживляющей активности, а также испытаниях острой, субхронической и хронической токсичности, что является необходимым условием возможности применения средства в фармацевтике качестве медицинского изделия или лекарственного средства.

Таким образом, техническим результатом, достигаемым в ходе раскрываемого в настоящей заявке изобретения, является описание неполной соли полиакрилата кобальта с известной молекулярной массой исходной полиакриловой кислоты и известным содержанием прочного комплекса Со²⁺, обладающий высокой гемостатической, антимикробной и ранозаживляющей активностью при умеренной токсичности для позвоночных.

Осуществление изобретения

Первым этапом осуществления изобретения является синтез образцов полиакрилата с заданной средней молекулярной массой 9 356, 46 072, 99 013 и 184 631 Да.

Водный раствор полиакриловой кислоты (ПАК) получают методом радикальной полимеризации акриловой кислоты в водной среде с применением инициатора персульфата калия и регулятора роста цепи - изопропанола (ИПС). В качестве сырья для синтеза используют акриловую кислоту ректификат по ТУ 6-01-1182-89 с изм.1,2 (массовая доля основного вещества, не менее 99,5%; содержание воды не более 0,35%; массовая доля гидрохинона не более 0,005%), персульфат калия квалификации по ГОСТ 4146-74 (массовая доля основного вещества, не менее 98,5%) и изопропиловый спирт по ТУ 2632-181-44493179-2014.

Процесс полимеризации протекает по схеме:

Деионизованная водя для синтеза должна иметь электропроводность не более 2×10^-4 мкСм. Показатель электропроводности используемой в синтезах воды измеряют на приборе Кондуктометр HI2300, датчик HI76310.

Синтез проводят в реакторе номинальным объемом 1 л, снабженном мешалкой, термометром, обратным холодильником и капельной воронкой (Фиг. 1).

В реактор при комнатной температуре загружают расчетное количество дистиллированной воды (приблизительно 80% от общего необходимого количества) и полное расчетное количество изопропилового спирта (ИПС). Включают перемешивающее устройство и нагревают водно-спиртовую смесь до 80°С, затем запускают реакцию полимеризации, загружая в реактор водный раствор акриловой кислоты и персульфата калия со скоростью 1 мл в минуту. При одновременной подаче в реактор и водного раствора инициатора и акриловой кислоты повышения температуры реакционной массы (гель-эффекта) не наблюдается. По окончании загрузки реакционной массы ее выдерживают в реакторе 60 минут при температуре 85°С. Общая длительность полимеризации составляет, таким образом, от 2 до 2,5 часов. ИПС из конечного продукта удаляют дистилляцией при температуре 75-80°С и давлении 50-100 мм рт. ст. на вакуумном дистилляторе: собирают азеотропную смесь ИПС - вода (Фиг. 2).

Полученные растворы полиакриловой кислоты в воде анализируются по следующим параметрам: молекулярно-массовые характеристики полиакриловой кислоты, содержание остаточного мономера, содержание основного вещества, содержание изопропилового спирта.

Молекулярно-массовые характеристики образцов ПАК определяют гель-проникающей хроматографией (ГПХ) на хроматографе высокого давления, оснащенном колонками Styragel HR 5Е или HR 4Е, 300×7,8 мм с сорбентом в виде высокосшитого сополимера стирола и дивинилбензола. В качестве детектора используют рефрактометр. В качестве растворителя используют воду, подаваемую со скоростью 1 мл/мин (плотность потока 1 мг/мл). Объем вводимого образца ПАК - 100 мкл, содержание сухого вещества -~0,5 мг/мл. Калибровку системы проводят по стандартам Agilent InfinityLab EasiVial РМ, используя программное обеспечение МультиХром, версия 1.5Х (ЗАО Амперсенд, Москва). Программное обеспечение позволяет рассчитать среднюю массу ПАК и индекс полидисперности. В ходе осуществления изобретения получают полимеры со средней молекулярной массой MW=184 631 Да и индексом полидисперсности MW/MN=3,16; MW=99 013 Да и MW/MN=2,89; MW=46 072 Да и MW/MN=2,34 и MW=9 356 Да и MW/MN=1,48. Полученные полимеры ПАК используют для синтеза неполной комплексной соли полиакрилатов кобальта.

Синтез неполной комплексной соли полиакрилатов кобальта выполняют при комнатной температуре в водной среде. Готовят раствор хлорида кобальта Umicore, Бельгия, номер CAS 7791-13-1, WE 231-589-4 (соответствует ГОСТ 4525-77) или аналогичного по качеству с концентрацией 100 мМ, используя апирогенную стерильную воду с электропроводностью 4±2 мкСм получаемую на установке Milli-Q^® Advantage А 10 (Millipore, США).

Готовят реакционную смесь, содержащую 1% полиакриловой кислоты (140 мМ в расчете на звено массой) и 10 мМ CoCl₂. Таким образом, синтез выполняют при молярных соотношениях иона Со²⁺ к звену полиакриловой кислоты: для полиакриловой кислоты 1:14. Перед началом реакции полиакриловую кислоту тщательно перемешивают в течение 60±15 минут для равномерного распределения полимерных частиц по всему объему раствора. Раствор хлорида кобальта добавляют порциями, капельно, при непрерывном перемешивании реакционной смеси. Перемешивание продолжают не менее 24±4 часов для получения внутримолекулярных комплексов с равномерным распределением катионов кобальта по всей длине молекул полиакриловой кислоты. Выпадение осадка свидетельствует о нарушении процесса получения кобальт-полиакрилового водорастворимого гемостатического средства, в этом случае процесс синтеза прекращают, раствор утилизируют или отправляют на доработку.

Раствор полиакрилата кобальта после завершения синтеза очищают от хлороводородной кислоты (побочного продукта реакции ионного обмена) и иона Со²⁺, не вошедшего в состав прочных координационных комплексов методом диализа. Для этого реакционную смесь, полученную после синтеза, количественно переносят диализный мешок с размером пор 12-14 кДа. Мешок с образцом герметично закупоривают зажимами и опускают в стеклянную емкость с дистиллированной водой, имеющей показатели электропроводности не выше 4±2 мкСм. В течение 24±4 часов образец подвергается диализу. Дистиллированную воду в стеклянной емкости меняют первый раз спустя 8 часов после начала диализа, затем 4 раза через каждые 4 часа. Для каждого образца полиакрилата кобальта определяют точный объем и остаточное содержание иона Со²⁺, метод спектрофотометрии. Для этого в кювету с длиной оптического пути 1 мм помещают 1 мл раствора и определяют поглощение при 520 нм. Коэффициент экстинкции Со²⁺ принимают равным 5,0 ед/М^-1см^-1. Выход иона кобальта с учетом разбавления раствора при диализе указывают в таблице 1.

Очищенные образцы полиакрилата кобальта подвергают лиофильной сушке на установке Scientz 10N/10ND Ordinary. После сушки гемостатическое средство представляет собой окрашенные в красно-малиновый цвет стеклообразные частицы без запаха, либо мелкодисперсный гигроскопичный порошок розового цвета.

Следующие фигуры чертежей поясняют сущность изобретения:

Фиг. 1. Установка для получения полиакриловой кислоты. Показаны 1 -цилиндрический реактор с рубашкой, 2 - обратный холодильник, 3 - электропривод, 4 -термостат, 5 - мешалка, 6 - капельная воронка.

Фиг. 2. Внешний вид вакуумного дистиллятора, используемого для удаления ИПС из реакционной смеси полимеризации ПАК после окончания синтеза

Фиг. 3. Контрольная группа крыс с моделированной стерильной раной на 3 день эксперимента. Воспалительные и дегенеративные изменения клеток и межклеточного вещества с участками некроза. Окраска гематоксилином и эозином, увеличение х 280.

Фиг. 4. Контрольная группа крыс с моделированной стерильной раной на 10 день эксперимента. Выраженность воспалительных явлений. На поверхности раны сохраняется некротическое содержимое; отек и инфильтрация распространяются на всю глубину тканей. Окраска гематоксилином и эозином, увеличение х 280.

Фиг. 5. Контрольная группа крыс с моделированной стерильной раной на 14 день эксперимента. На поверхности раны сохраняется некротическое содержимое, в пределах дермы отмечается снижение выраженности отека и воспалительной инфильтрации. Окраска гематоксилином и эозином, увеличение 280^×

^Фиг. 6. Экспериментальная группа крыс, получавшая лечение Со²⁺ ПАК 9 356 Да (1:32), на 3 день эксперимента. Заметны воспалительные и дегенеративные изменения клеток и межклеточного вещества с участками некроза. Окраска гематоксилином и эозином, увеличение х 280.

Фиг. 7. Экспериментальная группа крыс, получавшая лечение Со²⁺ ПАК 9 356 Да (1:32), на 10 день эксперимента. Заметны выраженные воспалительные явления. На поверхности раны сохраняется некротическое содержимое, отек и инфильтрация. Окраска гематоксилином и эозином, увеличение х 280.

Фиг. 8. Экспериментальная группа крыс, получавшая лечение Со²⁺ ПАК 9 356 Да (1:32), на 14 день эксперимента. Заметна незрелая волокнистая соединительная ткань, представленная тонкими волокнами, между которыми встречаются единичные фибробласты и макрофаги. Окраска гематоксилином и эозином, увеличение х 280.

Фиг. 9. Экспериментальная группа крыс, получавшая лечение Со²⁺ ПАК 46 072 Да (1:22), на 3 день эксперимента. Заметны воспалительные и дегенеративные изменения клеток и межклеточного вещества с участками некроза. Окраска гематоксилином и эозином, увеличение х 280.

Фиг.10. Экспериментальная группа крыс, получавшая лечение Со²⁺ ПАК 46 072 Да (1:22), на 10 день эксперимента. Выражены воспалительные явления. На поверхности раны сохраняется некротическое содержимое, отек и инфильтрация. Мелкие участки грануляционной ткани. Окраска гематоксилином и эозином, увеличение х 280.

Фиг. 11. Экспериментальная группа крыс, получавшая лечение Со²⁺ ПАК 46 072 Да (1:22), на 14 день эксперимента. Заметно образование эпителия в области дефекта эпидермиса. Окраска гематоксилином и эозином, увеличение х 280.

Пример 1. Оценка гемостатической активности образцов полиакрилата кобальта in vivo на модели капиллярного кровотечения у кроликов

Исследование гемостатической активности образцов полиакрилата кобальта, приготовленных на основе ПАК с молекулярной массой 9 356, 46 072, 99 013 и 184 631 Да, проводят на здоровых кроликах обоего пола (не альбиносах) породы пестрый немецкий великан массой 2,0-3,5 кг, содержащихся на полноценном рационе. Каждый кролик содержится в отдельной клетке в помещении с постоянной температурой +18-24°С. Суточные колебания температуры не должны превышать ±3°С. При уборке клеток и взвешивании животных их оберегают от возбуждения (избегают шума и резких движений). В течение недели, предшествующей опыту, кролики не должны терять в массе. Взвешивание их проводят до дачи корма не менее трех раз, через день. Животные, теряющие в массе, к опыту не допускаются. В течение трех суток перед испытанием у каждого подопытного кролика измеряют температуру. Измерения проводят ежедневно утром, до дачи корма при помощи медицинского ртутного или электротермометра, позволяющего определить температуру с точностью до 0,1°С. Датчик термометра вводят в прямую кишку на глубину 7-9 см (в зависимости от массы кролика) за внутренний сфинктер на время, необходимое для достижения максимальной температуры. Исходная температура подопытных кроликов должна быть в пределах 38,5°С - 39,5°С. Животные с более высокой или более низкой температурой к опыту не допускаются. Кроме того, кроликов, впервые используемых для испытания лекарственных средств, проверяют на реактивность путем внутривенного введения 10 см ГОСТ 31926-2013 Средства лекарственные для ветеринарного применения. Методы определения безвредности/кг 0,9%-ного стерильного непирогенного раствора натрия хлорида, соответствующего требованиям Фармакопеи, действующей на территории государства, принявшего стандарт. В случае изменения температуры у кроликов более чем на ±0,4°С животные отбраковываются.

Не позднее, чем за 18 ч до опыта кроликов переводят в помещение, в котором осуществляется испытание на гемостатическую активность. Оно должно проводиться в отдельной комнате с постоянной температурой, не отличающейся от температуры помещения, в котором кролики постоянно содержались до опыта, более чем на ±2°С, и с колебаниями во время испытания, не превышающими 2°С, изолированной от шума, в спокойной обстановке. Вечером накануне опыта у животных убирают остаток корма. До и во время опыта животные корм не получают (воду дают без ограничения). Вода для инъекций или другие применяемые растворители, а также шприцы и иглы должны быть стерильными и непирогенными. Шприцы, иглы и необходимую стеклянную посуду стерилизуют при температуре 180°С в течение 60 мин.

Каждый образец полиакрилата кобальта проверяют на трех кроликах. Группа должна состоять из животных, близких по массе (допускается отличие не более, чем на 0,5 кг). Перед проведением эксперимента у кролика дважды, с интервалом 30 мин, измеряют температуру. Различия в показателях температуры не должны превышать 0,2°С. Если различия в температуре превышает 0,2°С, кролик для испытания не допускается. Результат последнего измерения принимают за исходную температуру.

Для испытаний используют образцы полиакрилата кобальта, описанные в Таблице 1. Из каждого образца готовят с использованием стерильной апирогенной воды в качестве растворителя готовят растворы с массовой долей вещества 1%. Растворы инкубируют при комнатной температуре не менее 1 часа с момента приготовления. Стерильные ватные тампоны массой 50±5 мг пропитывают 0,5 мл раствора экспериментального образца. Тампоны помещают в стерильный полипропиленовый пакет для автоклавирования и высушивают в течение 10 часов при температуре 50°С в суховоздушном термостате Binder. В качестве отрицательного контроля используют аналогичным образом, приготовленный тампон, где вместо испытуемого образца наносится стерильная апирогенная деионизованная вода. Каждый тампон взвешивают на аналитических весах с точностью 0,2 мг.

Кролику проводят депиляцию обеих сторон левого уха, выполняют премедикацию введением следующих растворов: атропин - 0,1 мл, ксиланит 0,2 мл, анальгин - 0,4 мл, димедрол 0,1 мл. Через 30 минут после премедикации проводят наркотизацию внутримышечным введением 100 мг золетила и 100 мг внутривенно. Через 15 минут после введения анастетиков на край депилированного уха наносят разрез с помощью одноразового бритвенного лезвия, после чего сразу накладывают сухой ватный тампон с нанесенным испытуемым средством, обертывая им порез с обеих сторон уха. Удерживая тампон на разрезе, подставляют под разрез одноразовую полистироловую чашку Петри диаметром 900 мм с заранее определенной массой. После полной остановки кровотечения помещают тампон в чашку Петри взвешивают на аналитических весах с точностью 0,2 мг. Массу истекшей из разреза крови считают равной массе тампона и чашки Петри после сбора кровяного сгустка за вычетом массы тампона и чашки Петри до сбора сгустка. Статистическую обработку результатов исследования проводят на ЭВМ с использованием методов однофакторного дисперсионного анализа с помощью электронных таблиц Microsoft Excel 2007 и программы «Биостатистика». Вычисляют средние величины количественных показателей и их среднеквадратичные отклонения. Достоверность различий средних величин между серией сравнения и остальными сериями оценивают по критерию Манна-Уитни.

Результаты представляют в виде таблицы 2.

В результате испытаний устанавливают, что в случае капиллярного кровотечения использование образцов полиакрилата кобальта позволяет сократить объем истекшей крови в 7,0-11,4 раза по сравнению с контролем. При этом наиболее выраженный гемостатический эффект показывает образец, полученный с использованием ПАК со средней молекулярной массой 184 631 Да.

Пример 2. Оценка гемостатической активности образцов полиакрилата кобальта in vivo на модели паренхиматозного кровотечения у кроликов

Исследование гемостатической активности образцов полиакрилата кобальта, приготовленных на основе ПАК с молекулярной массой 9 356, 46 072, 99 013 и 184 631 Да, на модели паренхиматозного кровотечения у кроликов в части формирования групп животных, приготовления тампонов, пропитанных испытуемыми образами полиакрилата кобальта, премедикацию и нароктизацию животных, сбор и определение массы кровяного сгустка, статистическую обработку результатов исследования проводят аналогично описанному в Примере 1.

Результаты представляют в виде таблицы 3.

В результате испытаний устанавливают, что в случае паренхиматозного кровотечения использование образцов полиакрилата кобальта позволяет сократить объем истекшей крови в 8,0-13,2 раза по сравнению с контролем. При этом наиболее выраженный гемостатический эффект показывает образец, полученный с использованием ПАК со средней молекулярной массой 184 631 Да.

Пример 3. Оценка гемостатической активности образцов полиакрилата кобальта in vivo на модели венозного кровотечения у кроликов

Исследование гемостатической активности образцов полиакрилата кобальта, приготовленных на основе ПАК с молекулярной массой 9 356, 46 072, 99 013 и 184 631 Да, на модели венозного кровотечения у кроликов в части формирования групп животных, приготовления тампонов, пропитанных испытуемыми образами полиакрилата кобальта, премедикацию и нароктизацию животных, сбор и определение массы кровяного сгустка, статистическую обработку результатов исследования проводят аналогично описанному в Примере 1.

Результаты представляют в виде таблицы 4.

В результате испытаний устанавливают, что в случае венозного кровотечения использование образцов полиакрилата кобальта позволяет сократить объем истекшей крови в 3,7-5,2 раза по сравнению с контролем. При этом наиболее выраженный гемостатический эффект показывает образец, полученный с использованием ПАК со средней молекулярной массой 184 631 Да.

Пример 4. Оценка антимикробной активности образцов полиакрилата кобальта in vitro в отношении модельных микроорганизмов - имитаторов возбудителей гнойно-септических инфекций: Е. coli (грамотрицательный микроорганизм), В. anthracis (грамположительный микроорганизм) и Y. lipolytica (дрожжи-аскомицеты).

Синтезированные образцы полиакрилата кобальта используют для проведения биологических испытаний гемостатической активности in vivo на модели капиллярного, паренхиматозного и венозного кровотечения у кроликов, а также для оценки антимикробной активности in vitro в отношении модельных микроорганизмов -имитаторов возбудителей гнойно-септических инфекций: Escherichia coli (грамотрицательный микроорганизм), Bacillus anthracis (грамположительный микроорганизм) и Yarrowia lipolytica (дрожжи-аскомицеты).

Для проведения испытаний используют штаммы модельных микроорганизмов, имитирующих патогены 2-й и 3-й групп биологической опасности (таблица 5).

Получение рабочих культур проводят в пенициллиновых флаконах объемом 20 мл с ватно-марлевыми пробками в объеме среды 1,5 мл без качания в течение 14-16 часов. Оценочное содержание жизнеспособных микробных тел в культурах - 10⁹ к.о.е. в мл.

Приготовление рабочих растворов образцов полиакрилата кобальта и проведение инкубации тест-объектов с тестируемыми веществами

Сухие препараты полиакрилата кобальта с массой полимера 9 356, 46 072, 99 013 и 184 631 Да с содержанием кобальта в виде координационного комплекса 32:1; 22:1; 15:1 и 19:1 на звено полиакрилата растворяют в концентрации 1% (10 мг на 1 мл) в стерильной деионизованной апирогенной воде, полученной на установке Milli-Q^® Advantage А 10 (Millipore, США), инкубируют раствор 1 сутки при +37°С для полной гомогенизации. Полученные культуры имеют следующие концентрации по иону Со²⁺: 424,4 мкМ; 610,6 мкМ; 895,5 мкМ и 707,0 мкМ. Используя полученные концентрированные растворы и ростовую среду для выращивания каждого микроорганизма в качестве растворителя, из них готовят рабочие растворы с концентрацией по иону Со²⁺ 200 мкМ. В качестве объекта сравнения используют растворы полиакриловой кислоты в той же массовой концентрации, в которой она вводится в эксперимент в составе полиакрилата кобальта.

Для проведения тестирования используют ночную культуру Е. coli TGI и В. anthracis 55, выращенную при 37°С в течение 14-16 часов, или ночную культуру Y. lipolytica Polf, выращенную при 28°С в течение 20-22 часов. Для культивирования микроорганизмов используют среды, указанные в таблице 5. Культуры разбавляют в 100 раз свежей средой (в соответствии с таблицей 5) и подращивают в течение 1 час в тех же условиях среды и температуры, которые использовались для получения ночной культуры. Подрощенные в течение 1 часа дневные культуры микроорганизмов распределяют по лункам поливинилового планшета Costar по 10 мкл в каждую лунку: по пять лунок для каждого испытуемого препарата. Далее в пять лунок ряда, содержащие культуру микроорганизма, вносят следующие объемы 200 мкМ раствора испытуемого препарата в ростовой среде: 90, 75, 60, 45, 30 и 15 мкл. Далее объем жидкости в лунке доводят до 100 мкл, добавляя следующие объемы ростовой среды: 0, 15, 30, 45, 60 и 75 мкл. При этом получают бактериальные суспензии с содержанием ионов Со²⁺ 180, 150, 120, 90 и 60 мкМ.

В планшетах определяют оптическую плотность при 595 нм, используя планшетный спектрофотометр Униплан (Пикон, Россия). Планшеты помещают в стерильные влажные камеры и инкубируют при оптимальной для каждого микроорганизма температуре в течение 24 часов. Через 20 и 24 часа после начала инкубации в лунках определяют оптическую плотность при 595 нм, используя планшетный спектрофотометр Униплан (Пикон, Россия). Фиксируют отсутствие изменения оптической плотности при сравнении результатов, полученных через 20 и 24 часа инкубации.

Эксперимент выполняют в трех независимых повторностях. В качестве отрицательного контроля используют лунки, в которые к культурам микроорганизмов вместо разведения испытуемого препарата вносят ростовую среду, не содержащую добавок. Результат выражают в виде LC₅₀ - молярной концентрации иона Со²⁺, вызывающей снижение плотности культуры микроорганизма в 2 раза по сравнению с контролем. Результаты испытаний приводят в таблицах 6 и 7.

Пример 5. Оценка острой токсичности образцов полиакрилата кобальта in vivo на модели зондового (энтерального) введения мышам

Согласно Руководству по проведению доклинических исследований лекарственных средств под редакцией Миронова А.Н., острая токсичность изучается на нескольких видах животных. Обязательным требованием является использование того вида животных, на котором была показана специфическая фармакологическая активность вещества, и которые будут использоваться при исследовании хронической токсичности. Полученные результаты должны адекватно обеспечить возможность вычисления LD₅₀, что предполагает наличие среди изучаемых групп одной группы со 100% летальностью и одной, в которой гибель животных отсутствует.

С учетом перечисленных требований, при исследовании острой токсичности образцов полиакрилата кобальта в сравнении исходными реагентами для его получения -образцами полиакриловой кислоты и хлорида кобальта выполняют острые опыты на мышах при внутрижелудочном введении.

В качестве отрицательного контроля используют животных, подвергнутых внутрижелудочному введению эквивалентной дозы 1% крахмального клейстера. Опыты проводят на белых мышах обоего пола массой 22±2 г. Животным однократно внутрижелудочно вводят исследуемые растворы полиакрилата кобальта и исходных реагентов для его получения - образцами полиакриловой кислоты и хлорида кобальта в виде приготовленной суспензии в 1% крахмальном клейстере, при помощи металлического зонда с гладкой оливой на конце в максимально допустимом для данного вида животных и массы их тела объеме - 0,5 мл.

В опыте используют беспородных белых мышей обоего пола массой 22±2 г разведения питомника лабораторных животных «Столбовая» (Филиал «Столбовая» ФГБУН НЦБМТ ФМБА России). Животные перед исследованием проходят двухнедельный карантин при следующих условиях содержания: температура воздуха -22±2°С, влажность 40-70%, световой режим - 12 часов день, 12 часов ночь. В качестве корма используют экструдированный комбикорм для лабораторных животных (сертификат №РОСС RU/ПО81.BOO.365 ГОСТ 50258-92), для питья - фильтрованную воду. Животным обеспечивают свободный доступ к воде и пище на всем протяжении эксперимента.

Для приготовления суспензий исследуемого полиакрилата кобальта и исходных реагентов для его получения - полиакриловой кислоты и хлорида кобальта испытуемые образцы смешивают с 1% крахмальным клейстером таким образом, чтобы концентрация препаратов была максимальна и, вместе с тем, сохранялась возможность прохождения приготовленных взвесей через просвет зонда для внутрижелудочного введения препаратов. Этим условиям удовлетворяет растворение 48 мг полиакрилата кобальта или полиакриловой кислоты в 1 мл 1% крахмального клейстера (4,8% действующего вещества). Таким образом, мыши с массой тела 22 г вводили 0,5 мл исследуемого препарата, что при максимальной нагрузке образца соответствует дозе 2,2 г действующего вещества на кг массы тела. Для человека с массой тела 70 кг эквивалентная доза составляет приблизительно 12,3 г на кг массы тела. Для оценки острой токсичности хлорида кобальта готовят растворы, эквивалентные по молярному содержанию иона Со²⁺ с наиболее концентрированным по иону Со²⁺ образцам полиакрилата кобальта (образец с массой ПАК 99 013 Да): молярное соотношение иона Со²⁺ к звену ПАК 1:15. При дозировке суммарного действующего вещества этого образца 2,2 г действующего вещества на кг массы тела дозировка иона Со²⁺ составляет 2 мг на кг массы тела. Для создания такой нагрузки готовят 1% крахмальный клейстер, содержащий 21,8 мг/мл образца соли CoCl₂×6Н₂О (Mr=999 г/моль).

Помимо максимальной дозировки, каждый испытуемый образец вводят в дозировке и от максимальной, для чего снижают объем вводимого одному животному раствора в 1% крахмальном клейстере с 0,5 мл до 0,25 и 0,125 мл, соответственно. В случае CoCl₂×6Н₂О готовят также дополнительные 2-кратное и 4-хкратное разведения (дозировка иона Со²⁺ при введении которых в объеме 0,5 мл на голову составляет 2 мг на кг массы тела). Для испытания острой токсичности каждой дозировки каждого образца формируют группу из 6 мышей.

О токсическом действии препарата судят по общему состоянию животных и их выживаемости, LD₅₀. Подсчет выживших и погибших животных проводят на 3 сутки после затравки препаратами, с последующим наблюдением за выжившими животными на протяжении 2-х недель. На основании полученных результатов рассчитывают LD₅₀ в соответствии с требованиями руководства по проведению доклинических исследований лекарственных средств под редакцией Миронова А.Н.

Проведенные исследования показывают, что после внутрижелудочного введения мышам образцов полиакрилата кобальта и полиакриловой кислоты в максимальной дозе 2,2 г/кг, а также в дозах и от максимальной - 1,1 г/кг и 0,55 г/кг никаких токсических явлений и падежа мышей не наблюдается (таблица 8). Поскольку увеличить дозировку испытуемых средств не представляется возможным из-за достижения предела растворимости образцов, делают вывод, что все синтезированные образцы полиакрилата кобальта с молекулярной массой 9 356, 46 072, 99 013 и 184 631 Да с содержанием иона Со²⁺ 1:32; 1:22: 1:15 и 1:19, как и ПАК с этими же средними молекулярными массами могут быть отнесены к IV классу «Малотоксичные лекарственные вещества». Состояние переживших острую интоксикацию животных свидетельствует о хорошей переносимости и безвредности препарата в дозах, превышающих терапевтические в десятки раз. Напротив, препарат CoCl₂×6H₂O в дозировках 1,0 и 2,0 мг/кг массы тела (дозировка иона Со²⁺ эквивалентна Со²⁺-ПАК с молекулярной массой 99 013 Да) вызывает гибель 30 и 70% животных, соответственно. Таким образом, по результатам испытаний делают вывод о том, что ион Со²⁺ в виде прочного комплекса имеет существенно меньшую острую токсичность при внутрижелудочном введении, чем тот же ион в составе CoCl₂×6H₂O.

Пример 6. Оценка острой токсичности образцов полиакрилата кобальта in vivo на модели парентерального (внутрибрюшинного) введения мышам

При исследовании острой токсичности образцов полиакрилата кобальта в сравнении исходными реагентами для его получения - образцами полиакриловой кислоты и хлорида кобальта выполняют острые опыты на мышах при парентеральном (внутрибрюшинном) введении.

В качестве отрицательного контроля используют животных, подвергнутых парентеральному (внутрибрюшинному) введению эквивалентной дозы стерильного физиологического раствора. Опыты проводят на белых мышах обоего пола массой 22±2 г. Животным однократно внутрибрюшинно вводят исследуемые растворы полиакрилата кобальта и исходных реагентов для его получения - образцами полиакриловой кислоты и хлорида кобальта в виде стерильного раствора в максимально допустимом для данного вида животных и массы их тела объеме - 1,0 мл (50 мл на 1 кг тела).

В опыте используют беспородных белых мышей обоего пола массой 22±2 г разведения питомника лабораторных животных «Столбовая» (Филиал "Столбовая" ФГБУН НЦБМТ ФМБА России). Животные перед исследованием проходят двухнедельный карантин при следующих условиях содержания: температура воздуха -22±2°С, влажность 40-70%, световой режим - 12 часов день, 12 часов ночь. В качестве корма используют экструдированный комбикорм для лабораторных животных (сертификат №РОСС RU/ПО81.BOO.365 ГОСТ 50258-92), для питья - фильтрованную воду. Животным обеспечивают свободный доступ к воде и пище на всем протяжении эксперимента.

Для приготовления суспензий исследуемого полиакрилата кобальта и исходных реагентов для его получения - полиакриловой кислоты и хлорида кобальта испытуемые образцы смешивают со стерильным апирогенным физиологическим раствором таким образом, чтобы концентрация препаратов была максимальна. Этим условиям удовлетворяет растворение 48 мг полиакрилата кобальта или полиакриловой кислоты в 1 мл физиологического раствора (4,8% действующего вещества). Таким образом, мыши с массой тела 22 г вводят 1 мл исследуемого препарата, что при максимальной нагрузке образца соответствует дозе 4,4 г действующего вещества на кг массы тела. Для человека с массой тела 70 кг эквивалентная доза составляет приблизительно 24,6 г на кг массы тела. Для оценки острой токсичности хлорида кобальта готовят растворы, эквивалентные по молярному содержанию иона Со²⁺ с наиболее концентрированным по иону Со²⁺ образцов полиакрилата кобальта (образец с массой ПАК 99 013 Да): молярное соотношение иона Со²⁺ к звену ПАК 1:15. При дозировке суммарного действующего вещества этого образца 4,4 г действующего вещества на кг массы тела дозировка иона Со²⁺ составляет 4 мг на кг массы тела. Для создания такой нагрузки готовят образец соли CoCl₂×6H₂O (Mr=999 г/моль), растворяя 21,8 мг/мл вещества в 1 мл стерильного физиологического раствора с последующим автоклавированием.

Помимо максимальной дозировки, каждый испытуемый образец вводят в дозировке и от максимальной, для чего снижают объем вводимого одному животному раствора в стерильном физиологическом растворе с 0,5 мл до 0,25 и 0,125 мл, соответственно. В случае CoCl₂×6H₂O готовят также дополнительные 2-кратное и 4-кратное разведения (дозировка иона Со²⁺ при введении которых в объеме 1 мл на голову составляет 8 и 16 мг на кг массы тела). Для испытания острой токсичности каждой дозировки каждого образца формируют группу из 6 мышей.

О токсическом действии препарата судят по общему состоянию животных и их выживаемости, LD₅₀. Подсчет выживших и погибших животных проводят на 3 сутки после затравки препаратами, с последующим наблюдением за выжившими животными на протяжении 2-х недель. На основании полученных результатов рассчитывают LD50 в соответствии с требованиями руководства по проведению доклинических исследований лекарственных средств под редакцией Миронова А.Н.

Проведенные исследования показывают, что после внутрибрюшинного введения мышам образцов полиакрилата кобальта и Полиакриловой кислоты в максимальной дозе 4,4 г/кг, а также в дозах и от максимальной -2,2 г/кг и 1,1 г/кг никаких токсических явлений и падежа мышей не наблюдается (таблица 9). Поскольку увеличить дозировку испытуемых средств не представляется возможным из-за достижения предела растворимости образцов, делают вывод о том, что все синтезированные образцы полиакрилата кобальта с молекулярной массой 9 356, 46 072, 99 013 и 184 631 Да с содержанием иона Со²⁺ 1:32; 1:22: 1:15 и 1:19, как и ПАК с этими же средними молекулярными массами могут быть отнесены к IV классу «Малотоксичные лекарственные вещества». Состояние переживших острую интоксикацию животных свидетельствует о хорошей переносимости и безвредности препарата в дозах, превышающих терапевтические в десятки раз. Напротив, препарат CoCl₂×6H₂O в дозировках 2,0 и 4,0 мг/кг массы тела (дозировка тона Со²⁺ эквивалентна Со²⁺-ПАК с молекулярной массой 99 013 Да) вызывает гибель 100% животных. Таким образом, по результатам испытаний делают вывод о том, что ион Со²⁺ в виде прочного комплекса имеет существенно меньшую острую токсичность при внутрижелудочном введении, чем тот же ион в составе CoCl₂×6H₂O.

Пример 7. Оценка ранозаживляющей активности образцов полиакрилата кобальта in vivo на модели стерильных ран у крыс

Ранозаживляющую активность образцов полиакрилата кобальта in vivo изучают на модели белых лабораторных крыс линии Wistar обоего пола. Исследование выполняют с использованием визуального, инструментального и лабораторного контроля за состоянием животных, современных морфологических методов оценки действия препаратов в соответствии с разработанным Федеральным государственным учреждением «Научный центр экспертизы средств медицинского назначения» Федеральной службы по надзору в сфере здравоохранения и социального развития «Руководством по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ» под общей редакцией чл.-корр. РАМН, проф. Р.У. Хабриева.

При изучении ранозаживляющей активности образцов полиакрилата кобальта на модели стерильной раны крысам линии Wistar под наркозом в стерильных условиях моделируют рану по методике П.И. Толстых (1976). После снятия швов марлевую повязку удаляют и эвакуируют из раны экссудат, определяют площадь исходной раны и затем выполняют обработку раны физраствором. В соответствии с поставленной целью и задачами эксперимента животных разделяют на 5 групп, из которых отрицательная контрольная группа не получает лечения (выполняется обработка физраствором), а четыре получают обработку раневых поверхностей 1% растворами полиакрилата кобальта, приготовленного на основе ПАК с молекулярной массой 9 356, 46 072, 99 013 и 184 631 Да.

Обработку выполняют с помощью ватного тампона, смоченного в 1% растворе испытуемого средства, ежедневно в течение 21 дня с начала эксперимента. Для каждого животного фиксируют следующие сроки: купирование отека и начало эпителизации, очищение раны и начало появления грануляций. Один раз в семь дней для каждого животного фиксируют остаточную площадь раны.

Количество животных, используемое в исследовании - 10 голов на группу. Испытания in vivo выполняют на 30 белых беспородных крысах-самцах, в соответствии с Европейской Конвенцией (Страсбург, 18 марта 1986 г.) ETS N123 о защите позвоночных животных, используемых для экспериментов или в иных научных целях. Для исследования отбирают животных массой 220,0±20,0 г без внешних признаков заболевания, прошедших карантин в течение 10 суток. Все животные содержатся в одинаковых условиях на стандартном пищевом рационе.

Животным под наркозом в стерильных условиях наносят стерильные раны по методике П.И. Толстых (1976). Для этого на выбритом от шерсти участке спины, обработанном антисептиком, иссекают кожу с подкожной клетчаткой размером 20×20 мм. Для стандартизации условий лечения, предупреждения деформации раны, а также для предупреждения высыхания, загрязнения раневой поверхности и укусов другими животными над раной подшивают к коже марлевую повязку. После снятия швов марлевую повязку удаляют и эвакуируют гной из раны.

Площадь исходной раны определяют путем нанесения контура на прозрачную полиэтиленовую пленку. В соответствии с поставленной целью и задачами эксперимента животных разделяют на 5 групп: контрольную (без использования ранозаживляющего и четыре экспериментальных, в которых раневой дефект обрабатывают 1% раствором полиакрилата кобальта, приготовленного на основе ПАК с молекулярной массой 9 356, 46 072, 99 013 и 184 631 Да, соответственно. Распределение животных по группам в каждой из 3-х серий экспериментов представлено в таблице 10.

В контрольной группе животным производят ежедневную обработку физиологическим раствором. В экспериментальных группах ежедневно производят обработку раны тампоном, смоченным 1% раствором испытуемого Со²⁺ ПАК. Обработку ран экспериментальным животным во всех сериях производят один раз в день, ежедневно в течение 14 суток.

Течение раневого процесса у экспериментальных животных оценивают по внешнему состоянию раны, планиметрическим методом, а также гистологически с использованием морфометрии. Протоколирование показателей и выведение животных из эксперимента (путем передозировки нембуталового наркоза) осуществляют на 3-е, 10-е и 14-е сутки от начала лечения.

При визуальном осмотре ран обращают внимание на ее состояние и фиксируют сроки исчезновения отека окружающих тканей, сроки полного очищения, начала появления грануляций, начала краевой эпителизации и полного заживления раны.

Планиметрический метод исследования. Для объективной оценки скорости заживления раны по изменению ее площади используют метод Л.Н. Поповой в модификации В.И. Бирюкова. Площадь ран определяют следующим образом: на рану накладывают прозрачную полиэтиленовую пленку, на которую перманентным маркером наносят ее контур (данную процедуру выполняют поочередно каждому исследуемому животному). Площадь ран рассчитывают следующим образом:

1. Пленку с полученными контурами сканируют с помощью офисного сканера на белом фоне. Разрешение при сканировании - 300 dpi (пике/дюйм). Далее производят обработку изображения с помощью программы «Adobe Photoshop» CS5 Extended.

2. Фрагмент с контуром раны выделяют, далее выбирают команду меню «Анализ» и производят вычисление площади выделенного фрагмента. Определив площадь ран у экспериментальных животных в каждой серии, вычисляют среднюю площадь (М±m).

Процент остаточной площади на момент измерения от исходного размера (т.е. остаточная площадь раны от исходного размера) вычисляют по формуле:

где ПОП - процент остаточной площади,

S₀ - исходная средняя площадь ран на начало лечения, мм²

S - средняя площадь ран на момент измерения, мм².

Процент уменьшения площади ран от исходного размера (т.е. процент заживления раны) вычисляют по формуле:

где ПУП - процент уменьшения площади,

S₀ - исходная средняя площадь ран на начало лечения, мм²

S - средняя площадь ран на момент измерения, мм².

Скорость заживления ран (т.е. процент уменьшения площади за сутки) вычисляют по формуле:

где СЗ - скорость заживления,

ПУП₁ - процент уменьшения площади ран от исходной на момент измерения,

ПУП₀ - процент уменьшения площади ран при предыдущем измерении,

Т - количество дней между измерениями.

Гистологическое исследование раневых биоптатов выполняют на 3-е, 10-е, 14-е сутки от начала лечения после выведения подопытного животного из эксперимента путем передозировки наркоза. Забор материала осуществляют путем иссечения участка мягких тканей дна и прилежащего края раны лезвием. Взятый материал сразу фиксируют в 10% растворе нейтрального формалина с последующей проводкой по восходящим спиртам и заливкой в парафин по стандартной методике. Приготовленные парафиновые срезы окрашивают гематоксилин-эозином. При оценке гистологических срезов обращают внимание на выраженность воспалительных реакций, сроки появления грануляционной ткани, возникновение краевой эпителизации, а также структурную полноценность вновь образованного эпителия.

Выполняют морфометрическое исследование, заключающееся в следующем: на срезах гистологических препаратов при увеличении 400^×, на выбранном участке в пределах раневого дефекта под лейкоцитарно-фибринозным струпом производят подсчет фибробластов, гранулоцитов, лимфоцитов и макрофагов до 100 клеток, полученные результаты выражают в процентах.

Статистическую обработку результатов исследования проводят на ЭВМ с использованием методов однофакторного дисперсионного анализа с помощью электронных таблиц Microsoft Excel 2007 и программы «Биостатистика». Вычисляют средние величины количественных показателей и их среднеквадратичные отклонения. Достоверность различий средних величин между серией сравнения и остальными сериями оценивают по критерию Манна-Уитни.

После моделирования стерильной раны на 3-е сутки во всех сериях раны выглядят следующим образом: отек, гиперемия и инфильтрация окружающих тканей и краев ран, дно покрыто налетом фибрина с участками некроза, гнойное или гнойно-геморрагическое отделяемое в основном отсутствует.

После моделирования раны на 3-е сутки гнойное или гнойно-геморрагическое отделяемое в ране не обнаруживается, однако присутствуют участки некротизированных тканей и отечность тканей в области дна раны.

В процессе заживления стерильных ран происходит изменение внешнего вида ран: купируется отек и инфильтрация окружающих тканей, происходит очищение ран от некротических масс, появляется грануляции, начинается эпителизация. Динамика этих изменений отражена в таблице 11.

Анализ данных, представленных в таблице 8, свидетельствует, что во всех экспериментальных группах по сравнению с контрольной достоверно сокращаются сроки: купирования отека и начала эпителизации, очищения раны и начала появления грануляций.

Полученные в ходе эксперимента данные по измерению площади ран и их скорости заживления представляют в таблице 12.

Во всех экспериментальных группах заживление ран происходит существенно быстрее, в чем в контрольной группе животных, причем скорость заживления ран по мере увеличения массы ПАК, использованной для изготовления Со²⁺ ПАК, достоверно повышается.

На 3-и сутки моделирования стерильной раны у контрольной группы животных выявляют некротические явления - поверхность раны покрыта некротическим содержимым. Обрывки эпидермиса обращены в просвет раны. В пределах дермы определяется выраженная экссудативная реакция, наличие многочисленных очагов кровоизлияний, воспалительная инфильтрация тканей. В области дна раны отмечаются фрагменты коллагеновых волокон в окружении клеток воспалительного ряда, наблюдаются явления отека на всем протяжении дермы (Фиг. 3).

Морфологическое исследование тканей из зоны раны у животных контрольной группы через 10 суток от начала исследования позволяет выявить наличие выраженных воспалительных явлений. На поверхности раны сохраняется некротическое содержимое, отек и инфильтрация распространяются на всю глубину тканей. Воспалительный инфильтрат содержит лейкоциты и макрофаги). По периферии дефекта тканей начинает формироваться демаркационный вал, отграничивающий жизнеспособные и некротизированные ткани (Фиг. 4).

При гистологическом исследовании ран контрольной группы на 14-е сутки после моделирования выявляют наличие некротических масс, заполняющих раневой дефект. В пределах дермы отмечают снижение выраженности отека и воспалительной инфильтрации при сохранении микроабсцессов. В области дна раны определяются участки грануляционной ткани. Отмечается частичная эпителизация дефекта с периферии неповрежденной кожи (Фиг. 5).

На 3-и сутки в экспериментальной группе, получавшей лечение Со²⁺ ПАК 9 356 Да (1:32), выявляют дефект тканей, заполненный некротическими массами. Для дермы в области раневого дефекта характерен интерстициальный отек и полнокровие расширенных капилляров. В реакцию вовлекается популяция тучных клеток, которая находится в гетерогенном функциональном состоянии (Фиг. 6).

На 10 сутки в экспериментальной группе, получавшей лечение Со²⁺ ПАК 9 356 Да (1:32), морфологическая картина указывает на уменьшение содержания некротических масс в пределах дефекта тканей. Воспалительные процессы на уровне дермы менее выражены по сравнению со сроком 3 суток. Клеточный компонент представлен преимущественно клетками воспалительного ряда: лимфоцитами и нейтрофилами, в реакцию активно вовлекаются тучные клетки. Новообразованный эпидермис имеет глубокие базальные разрастания. Грануляционная ткань содержит хаотично расположенные коллагеновые (Фиг. 7).

На 14 сутки морфологическая картина регенерата в экспериментальной группе крыс, получавшей лечение Со²⁺ ПАК 9 356 Да (1:32), характеризуется наличием незрелой волокнистой соединительной ткани, представленной тонкими волокнами, между которыми встречаются единичные фибробласты и макрофаги. Толщина эпидермиса не отличается от интактной кожи, но в зоне рубца выявляется небольшая деформация (Фиг. 8).

В экспериментальной группе крыс, получавшей лечение Со²⁺ ПАК 46 072 Да (1:22), через 3 суток после моделирования стерильной раны отмечают наличие некротических масс в области дефекта тканей, ткани инфильтрированы нейтрофильными лейкоцитами на всю толщину кожи с проникновением в подкожно-жировую клетчатку и мышцы. Краевой эпидермис некротизирован. В области дна и стенок раны определяются деформированные коллагеновые волокна с явлениями отека в интерстициальных пространствах. Между волокнами располагаются клетки воспалительного ряда (Фиг. 9).

Структурно-функциональные особенности тканей в области раны на 10-е сутки у животных экспериментальной группе крыс, получавшей лечение Со²⁺ ПАК 46 072 Да (1:22), выражаются в сохранении некротического содержимого на фоне воспалительного инфильтрата. В некоторых препаратах отмечается тонкий эпидермальный пласт, направленный в сторону дефекта тканей. На дне раны визуализируются мелкие участки грануляционной ткани, клеточный компонент которой представлен фибробластами, макрофагами, тучными клетками (Фиг. 10).

Структурная реакция тканей в области раны на 14-е сутки у животных экспериментальной группы, получавшей лечение Со²⁺ ПАК 46 072 Да (1:22), выражается в наличии эпителия в области дефекта эпидермиса. Клеточный компонент грануляционной ткани представлен макрофагами, фибробластами, ТК. Фиброзная ткань представлена коллагеновыми волокнами, ориентированными, либо параллельно поверхности регенерата, либо беспорядочно. Коллагеновые волокна находятся в окружении фибробластов (Фиг. 11).

Комплексное соединение иона Со²⁺ и полиакриловой кислоты с молекулярной массой 9356, 46072, 99013 или 184631 Да, обладающее гемостатическими, антимикробными и ранозаживляющими свойствами.