Антитела против vsig4 человека и их применение
Изобретение относится к биотехнологии и представляет собой выделенное гуманизированное анти-VSIG4 антитело, или его антигенсвязывающий фрагмент, с определенной структурой. Изобретение относится также к фармацевтической композиции, содержащей такое антитело. Изобретение позволяет эффективно лечить заболевание, обусловленное VSIG4. 9 н. и 21 з.п. ф-лы, 42 ил., 12 табл., 6 пр.
ПЕРЕКРЕСТНАЯ ССЫЛКА НА РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ
Настоящая заявка представляет собой PCT заявку, по которой испрашивается приоритет и преимущество на основании предварительной патентной заявки США № 62/738255, поданной 28 сентября 2018 г., и предварительной патентной заявки США № 62/776523, поданной 7 декабря 2018 г. Содержание вышеуказанных заявок включено в настоящий документ посредством ссылки в полном объеме.
ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ, К КОТОРОЙ ОТНОСИТСЯ ИЗОБРЕТЕНИЕ
Настоящее изобретение относится к антителам и антигенсвязывающим фрагментам, которые связываются с V-набором и доменом иммуноглобулина, содержащим белок 4 (VSIG4).
ПРЕДПОСЫЛКИ СОЗДАНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Рак остается одной из ведущих причин смертности в мире. Последние статистические данные сообщают, что 13% населения мира умирает от рака. По оценкам Международного агентства по изучению рака (IARC) в 2012 году в мире было зарегистрировано 14,1 миллиона новых случаев рака и 8,2 миллиона смертей от рака. К 2030 году глобальное бремя, как ожидается, вырастет до 21,7 миллиона новых случаев рака и 13 миллионов смертей от рака вследствие роста населения и старения, а также воздействия таких факторов риска, как курение, нездоровое питание и недостаточная физическая активность. Кроме того, страдания и медицинские расходы на лечение рака приводят к снижению качества жизни как пациентов, страдающих от рака, так и их семей. Очевидно, что прежде всего рак представляет собой заболевание, для которого срочно необходимо найти усовершенствованные способы лечения.
Макрофаги представляют собой полифункциональные антигенпрезентирующие клетки, играющие центральную роль в нашей иммунной системе и связанные с биологией рака. В контексте рака опухоль-ассоциированные макрофаги (ОАМ) инфильтрируют злокачественные опухолевые ткани и, будучи связаны с биологией рака, влияют на прогрессирование опухоли. ОАМ, как считают, могут быть разделены на две категории: M1 и M2. M1 макрофаги, как известно, обладают провоспалительной и цитотоксической (противоопухолевой) функцией, в то время как M2 макрофаги являются противовоспалительными (проопухолевыми) и стимулируют заживление ран. Вследствие этих функций ОАМ, в частности, макрофаги фенотипа M2, тесно связаны с неблагоприятным клиническим прогнозом при злокачественных опухолях многих видов. Сами инфильтрирующие ОАМ, или путь поляризации ОАМ, считают новыми терапевтическими мишенями в терапии злокачественных опухолей.
СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Настоящее изобретение относится, по меньшей мере частично, к антителам и их фрагментам, которые связываются с VSIG4 (V-набор и домен иммуноглобулина содержащим белком 4; также называемым CRIg или Z39Ig), а также к способам использования таких антител и антигенсвязывающих фрагментов для лечения рака, индукции секреции цитокинов и/или хемокинов в макрофагах и превращения M2 макрофагов в M1 макрофаги.
В одном аспекте настоящее изобретение относится к выделенному гуманизированному антителу, или антигенсвязывающему фрагменту, содержащему: (a) CDR1 тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 17, CDR2 тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 18, CDR3 тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 19; и (b) CDR1 легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 20, CDR2 легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 21, и CDR3 легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 22 или SEQ ID NO: 23.
В некоторых вариантах осуществления антитело, или антигенсвязывающий фрагмент, описанное в настоящем документе, может содержать любое из: (a) вариабельного домена тяжелой цепи, содержащего аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичную аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 14 или SEQ ID NO: 16; (b) вариабельного домена легкой цепи, содержащего аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичную аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10 или SEQ ID NO: 12; или (c) вариабельного домена тяжелой цепи, содержащего аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичную аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 14 или SEQ ID NO: 16, и вариабельного домена легкой цепи, содержащего аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичную аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10 или SEQ ID NO: 12.
В некоторых вариантах осуществления антитело, или антигенсвязывающий фрагмент, описанное в настоящем документе, может содержать любое из: вариабельного домена тяжелой цепи, содержащего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 14 или SEQ ID NO: 16, вариабельного домена легкой цепи, содержащего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10 или SEQ ID NO: 12, или вариабельного домена тяжелой цепи, содержащего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 14 или SEQ ID NO: 16, и вариабельного домена легкой цепи, содержащего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10 или SEQ ID NO: 12.
В некоторых вариантах осуществления антитело, или антигенсвязывающий фрагмент, описанное в настоящем документе, может содержать CDR3 легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 23.
В некоторых вариантах осуществления антитело, или антигенсвязывающий фрагмент, описанное в настоящем документе, может содержать вариабельный домен тяжелой цепи, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2, и вариабельный домен легкой цепи, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4. В некоторых вариантах осуществления антитело, или антигенсвязывающий фрагмент, описанное в настоящем документе, может содержать вариабельный домен тяжелой цепи, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 6, и вариабельный домен легкой цепи, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 8. В некоторых вариантах осуществления антитело, или антигенсвязывающий фрагмент, может содержать вариабельный домен тяжелой цепи, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 6, и вариабельный домен легкой цепи, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 10. В некоторых вариантах осуществления антитело, или антигенсвязывающий фрагмент, может содержать вариабельный домен тяжелой цепи, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 6, и вариабельный домен легкой цепи, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 12. В некоторых вариантах осуществления антитело, или антигенсвязывающий фрагмент, описанное в настоящем документе, может содержать вариабельный домен тяжелой цепи, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 14, и вариабельный домен легкой цепи, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 10. В некоторых вариантах осуществления антитело, или антигенсвязывающий фрагмент, описанное в настоящем документе, может содержать вариабельный домен тяжелой цепи, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 16, и вариабельный домен легкой цепи, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 12.
В некоторых вариантах осуществления антитело, или антигенсвязывающий фрагмент, описанное в настоящем документе, имеет аффинность связывания (KD) для молекулы человеческого V-набор и домен иммуноглобулина содержащего белка 4 (VSIG4), составляющую 1×10-7-1×10-9. В некоторых вариантах осуществления антитело, или антигенсвязывающий фрагмент, описанное в настоящем документе, имеет аффинность связывания (KD) для молекулы VSIG4, составляющую от примерно 7,156×10-8 до примерно 7,636×10-9. В некоторых вариантах осуществления антитело, или антигенсвязывающий фрагмент, описанное в настоящем документе, имеет аффинность связывания (KD) для молекулы VSIG4, составляющую примерно 7,156×10-8, примерно 7,636×10-9, примерно 7,952×10-9, примерно 8,226×10-9 или примерно 8,688×10-9.
В другом аспекте настоящее изобретение относится к молекуле нуклеиновой кислоты, кодирующей любое из антител, или антигенсвязывающих фрагментов, описанных в настоящем документе.
В другом аспекте настоящее изобретение относится к рекомбинантному вектору, содержащему любую из молекул нуклеиновой кислоты, описанных в настоящем документе. В некоторых вариантах осуществления рекомбинантный вектор, описанный в настоящем документе, содержит молекулу нуклеиновой кислоты, описанную в настоящем документе, которая функционально связана с промотором. В некоторых вариантах осуществления рекомбинантный вектор включает два отдельных вектора, каждый из которых содержит нуклеотидную последовательность, соответствующую тяжелой цепи и легкой цепи антитела, или антигенсвязывающего фрагмента, предложенного в настоящем документе.
В другом аспекте настоящее изобретение относится к клетке-хозяину, содержащей молекулу нуклеиновой кислоты или рекомбинантный вектор, описанные в настоящем документе. В некоторых вариантах осуществления клетка-хозяин представляет собой клетку млекопитающего, дрожжевую клетку или бактериальную клетку. В некоторых вариантах осуществления клетка-хозяин представляет собой клетку, выбранную из группы, состоящей из E. coli, P. pastoris, Sf9, COS, HEK293, Expi293, CHO-S, CHO-DG44, CHO-K1 и лимфоцита млекопитающего. В некоторых вариантах осуществления клетка-хозяин представляет собой клетку Expi293.
В другом аспекте настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции, содержащей: любое из антител, или антигенсвязывающих фрагментов, описанных в настоящем документе, любую из молекул нуклеиновой кислоты, описанных в настоящем документе, любой из рекомбинантных векторов, описанных в настоящем документе, или любую из клеток-хозяев, описанных в настоящем документе; и фармацевтически приемлемый носитель.
В качестве дополнительного примера, в другом аспекте настоящее изобретение относится к способу лечения индивида, который нуждается в этом, включающему этапы: (a) введения индивиду композиции, которая содержит или доставляет любое из антител, или антигенсвязывающих фрагментов, описанных в настоящем документе, любую из молекул нуклеиновой кислоты, описанных в настоящем документе, любой из рекомбинантных векторов, описанных в настоящем документе, или любую из клеток-хозяев, описанных в настоящем документе, за счет чего осуществляется лечение заболевания или состояния. В некоторых вариантах осуществления индивид страдает от, или имеет риск развития, рака. В некоторых вариантах осуществления рак выбирают из рака мочевого пузыря, рака молочной железы, рака шейки матки, рака толстого кишечника, рака эндометрия, рака пищевода, рака фаллопиевой трубы, рака желчного пузыря, рака желудочно-кишечного тракта, рака головы и шеи, гематологического рака, рака гортани, рака печени, рака легкого, лимфомы, меланомы, мезотелиомы, рака яичника, первичного рака брюшины, рака слюнных желез, саркомы, рака желудка, рака щитовидной железы, рака поджелудочной железы, почечноклеточного рака, глиобластомы и рака предстательной железы.
В некоторых вариантах осуществления индивид получал, или будет получать, один или более дополнительных видов противораковой терапии, выбранных из ионизирующего излучения, химиотерапевтического средства, антитела и клеточной терапии, так что индивид получает оба вида терапии. Например, в некоторых вариантах осуществления один или более дополнительных видов противораковой терапии могут включать использование ингибитора иммунных контрольных точек, IL-12, GM-CSF, анти-CD4 средства, цисплатина, фторурацила, доксорубицина, иринотекана, паклитаксела, ингибитора индоламин-2,3-диоксигеназы 1 (IDO1) или циклофосфамида.
В другом аспекте настоящее изобретение также относится к способу увеличения секреции цитокинов или хемокинов в M2 макрофагах, включающему создание контакта M2 макрофагов с любым из антител, или антигенсвязывающих фрагментов, описанных в настоящем документе.
В другом аспекте настоящее изобретение относится к способу индукции пролиферации CD8+ T-клеток, включающему: (a) создание контакта M2 макрофага с любым из антител, или антигенсвязывающих фрагментов, описанных в настоящем документе; и (b) совместную инкубацию M2 макрофага с CD8+ T-клетками.
В другом аспекте настоящее изобретение также относится к способу превращения M2 макрофага в M1 макрофаг, включающему создание контакта M2 макрофага с любым из антител, или антигенсвязывающих фрагментов, описанных в настоящем документе.
Если нет иных указаний, все технические и научные термины, используемые в настоящем документе, имеют то значение, которое им обычно придают специалисты в области, к которой относится настоящее изобретение. Хотя способы и материалы, аналогичные или эквивалентные тем, которые описаны в настоящем документе, могут быть использованы при осуществлении на практике или тестировании настоящего изобретения, подходящие способы и материалы описаны ниже. Все публикации, патентные заявки, патенты и другие литературные источники, упомянутые в настоящем документе, включены посредством ссылки в полном объеме. В случае конфликта, настоящая спецификация, включая определения, будет иметь преимущественную силу. Кроме того, материалы, способы и примеры являются исключительно иллюстративными и не предназначены быть ограничивающими.
Другие признаки и преимущества изобретения станут очевидными из следующего далее подробного описания, а также из формулы изобретения.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ
На ФИГУРЕ 1 представлено схематическое изображение, иллюстрирующее механизм, за счет которого доставка анти-VSIG4 антитела к макрофагам приводит к превращению M2 макрофагов в M1 макрофаги, результатом чего является пролиферация CD8+ T-клеток и последующее подавление рака.
На ФИГУРЕ 2A представлено выравнивание последовательностей VSIG4 с различными человеческими белками семейства B7.
На ФИГУРЕ 2B представлено филогенетическое дерево, показывающее эволюционную взаимосвязь между VSIG4 и различными человеческими белками семейства B7.
На ФИГУРАХ 3A и 3B показана корреляция экспрессии мРНК VSIG4 с различными генами в опухолевой ткани.
На ФИГУРЕ 4A представлен график ВЭЖХ, показывающий белковый профиль антитела EU103.2.
На ФИГУРЕ 4B представлены данные поверхностного плазмонного резонанса, демонстрирующие связывание антитела EU103.2 с VSIG4.
На ФИГУРЕ 5 представлены полученные с помощью светового микроскопа изображения M1 и M2 макрофагов (вверху слева и вверху справа, соответственно), а также полученные в FACS-анализе данные, демонстрирующие экспрессию VSIG4 в M1 и M2 макрофагах.
На ФИГУРЕ 6 представлен набор графиков, показывающих индукцию провоспалительных цитокинов и хемокинов в M1 и M2 макрофагах за счет EU103.2.
На ФИГУРЕ 7 представлен набор данных FACS-анализа, показывающих уменьшение экспрессии CD163 в M2 макрофагах, обработанных EU103.2.
На ФИГУРЕ 8 представлен набор данных FACS-анализа (первые шесть колонок) и количественная оценка этих данных (последняя колонка), которые показывают индукцию пролиферации CD8+ T-клеток при совместном культивировании CD8+ T-клеток с M2 макрофагами, обработанными EU103.2.
На ФИГУРЕ 9 представлен набор данных FACS-анализа, демонстрирующих экспрессию VSIG4 в макрофагах, выделенных из абдоминальной жидкости пациентов с раком яичника.
На ФИГУРЕ 10 представлен набор данных FACS-анализа, демонстрирующих индукцию пролиферации CD8+ T-клеток при совместном культивировании с обработанными EU103.2 макрофагами, полученными от пациентов с раком яичника.
На ФИГУРЕ 11 представлен график, показывающий индукцию пролиферации CD8+ T-клеток при совместном культивировании с обработанными антителом EU103.2 макрофагами, полученными от пациентов с раком яичника.
На ФИГУРЕ 12 представлен набор полученных с помощью микроскопа изображений M1 и M2 макрофагов, демонстрирующих морфологические отличия после превращения M2 макрофагов в M1 макрофаги в результате воздействия антитела EU103.2.
На ФИГУРЕ 13 представлен набор данных FACS-анализа, демонстрирующих, что блокирование взаимодействия между CD8+ клетками и VSIG4 приводит к увеличению пролиферации CD8+ T-клеток.
На ФИГУРАХ 14A и 14B представлен набор графиков, показывающих увеличение пролиферации CD8+ клеток в результате блокирования супрессии THP-1 клетками.
На ФИГУРАХ 15A-15C представлены наборы графиков, показывающих противоопухолевую активность анти-VSIG4 антитела в трех разных мышиных моделях опухолей.
На ФИГУРЕ 16 представлен набор графиков, показывающих противоопухолевую активность анти-VSIG4 антитела в мышиной модели с нокаутом VSIG4.
На ФИГУРЕ 17A представлен набор данных FACS-анализа, показывающих статус активации T-клеток и МСК в ДОЛУ в отсутствие сигнализации VSIG4.
На ФИГУРЕ 17B представлен набор графиков, показывающих статус активации T-клеток и МСК в ДОЛУ в отсутствие сигнализации VSIG4.
На ФИГУРЕ 17C представлен набор графиков, показывающих статус активации T-клеток и МСК в ДОЛУ в отсутствие сигнализации VSIG4.
На ФИГУРЕ 17D представлен набор графиков, показывающих статус активации T-клеток и МСК в ДОЛУ в отсутствие сигнализации VSIG4.
На ФИГУРЕ 18A представлен график, показывающий подавление роста опухоли в отсутствие сигнализации VSIG4.
На ФИГУРЕ 18B представлен собой набор гистологических срезов, показывающих подавление роста опухоли в отсутствие сигнализации VSIG4.
На ФИГУРЕ 19 представлен график, показывающий противоопухолевую активность анти-VSIG4 антитела в гуманизированной мышиной модели.
На ФИГУРЕ 20 представлено схематическое изображение, иллюстрирующее механизм, за счет которого доставка антитела EU103.2 к макрофагам приводит к превращению M2 макрофагов в M1 макрофаги, результатом чего является пролиферация CD8+ T-клеток.
На ФИГУРАХ 21A и 21B представлены схематические изображения, показывающие экспрессионные векторы, используемые для клонирования и экспрессии гуманизированных анти-VSIG4 антител.
На ФИГУРЕ 22 представлен график ВЭЖХ, показывающий белковый профиль антитела A1 (EU103_T01.01).
На ФИГУРЕ 23 представлен график ВЭЖХ, показывающий белковый профиль антитела A2 (EU103_T01.02).
На ФИГУРЕ 24 представлен график ВЭЖХ, показывающий белковый профиль антитела A1.3 (EU103_T01.01S).
На ФИГУРЕ 25 представлен график ВЭЖХ, показывающий белковый профиль антитела A2.3 (EU103_T01.02S).
На ФИГУРЕ 26A представлен набор данных FACS-анализа, показывающих уменьшение экспрессии CD163 в M2 макрофагах, обработанных антителами A1 или A2.
На ФИГУРЕ 26B представлен график, показывающий уменьшение экспрессии CD163 в M2 макрофагах, обработанных антителами A1 или A2.
На ФИГУРЕ 27 представлен набор графиков, показывающих уменьшение содержания цитокинов и хемокинов M2-типа в M2 клетках, обработанных антителами A1 или A2.
НА ФИГУРЕ 28 представлен набор данных FACS-анализа, показывающих уменьшение экспрессии CD163 и увеличение экспрессии CD86 в M2 макрофагах, обработанных антителами A1 или A2.
НА ФИГУРЕ 29 представлен набор графиков, показывающих увеличение экспрессии цитокинов/хемокинов M1-типа в M2 макрофагах, обработанных антителами A1 или A2.
НА ФИГУРЕ 30 представлен график, показывающий данные анализа хемотаксиса, в котором измеряют способность к хемотаксису макрофагов после превращения M2 макрофагов в M1 макрофаги под воздействием антител A2.
На ФИГУРАХ 31A-31C показан противоопухолевый эффект антител A1 и A2 в гуманизированной мышиной модели.
На ФИГУРАХ 32A-32C показано превращение макрофагов под воздействием антител A2 in vivo.
На ФИГУРАХ 33A и 33B показано превращение макрофагов под воздействием антител A2 in vivo путем анализа эффекта превращения M2 макрофагов в M1 макрофаги на рост опухоли.
На ФИГУРАХ 34A-34E показан противоопухолевый антител A2 в гуманизированной мышиной модели.
На ФИГУРАХ 35A-35D показан противоопухолевый антител A2 и A2.3 в гуманизированной мышиной модели.
На ФИГУРАХ 36A и 36B представлен набор данных анализа совместного культивирования, показывающих, что при совместном культивировании антител A1, A1.3, A2 и A2.3 с M2 макрофагами наблюдается увеличение пролиферации CD8+ T-клеток.
НА ФИГУРЕ 37 представлен график на основании данных анализа совместного культивирования, показывающий, что при совместном культивировании антител A2 и A2.3 с M2 макрофагами наблюдается увеличение пролиферации CD8+ T-клеток.
На ФИГУРАХ 38A и 38B представлен набор графиков, показывающих использование экспрессирующих hVSIG4 клеток HeLa-hVSIG4 для наблюдения пролиферации CD8+ T-клеток под воздействием антител A2 или A2.3.
НА ФИГУРЕ 39 представлен график, показывающий использование панели с человеческой фосфокиназой для анализа сигнального пути превращения макрофагов под воздействием антител A2.
НА ФИГУРЕ 40 показано выравнивание последовательностей тяжелых цепей и легких цепей гуманизированных антител EU103.3, A1, A2, A1.3 и A2.3.
НА ФИГУРЕ 41 показано создание и определение характеристик мышей с нокаутом VSIG4.
НА ФИГУРЕ 42 представлены данные анализа с генной матрицей, показывающие изменение генной экспрессии после превращения M2 макрофагов в M1 макрофаги под воздействием антител A2.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Настоящее изобретение основано, по меньшей мере частично, на том открытии, что ингибирование взаимодействия VSIG4 с CD8+ T-клетками при помощи определенных анти-VSIG4 антител приводит к пролиферации CD8+ T-клеток, что может приводить к подавлению рака.
В настоящем документе термин «примерно» при использовании применительно к значению, относится к значению, которое является аналогичным, в контексте эталонного значения. Как правило, специалисты в данной области, знакомые с контекстом, понимают относительную степень вариации, охваченную термином «примерно», в данном контексте. Например, в некоторых вариантах осуществления термин «примерно» может включать диапазон значений, находящихся в пределах 25%, 20%, 19%, 18%, 17%, 16%, 15%, 14%, 13%, 12%, 11%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1% или менее от эталонного значения.
Используемый в настоящем документе термин «введение», как правило, означает введение композиции индивиду или в систему для осуществления доставки средства, которое находится в композиции, или включено в нее. Специалистам в данной области известны различные пути, которые, при соответствующих обстоятельствах, могут быть использованы для введения индивиду, например, человеку. Например, в некоторых вариантах осуществления введение может быть глазным, пероральным, парентеральным, топическим и так далее. В некоторых конкретных вариантах осуществления введение может быть бронхиальным (например, путем инстилляции в бронхи), трансбуккальным, кожным (которое может представлять собой или включать, например, одно или более из топического нанесения на кожу, внутрикожного, интрадермального, чрескожного введения и так далее), энтеральным, внутриартериальным, внутрикожным, внутрижелудочным, интрамедуллярным, внутримышечным, интраназальным, внутрибрюшинным, интратекальным, внутривенным, интравентрикулярным, в конкретный орган (например, в печень), мукозальным, назальным, пероральным, ректальным, подкожным, подъязычным, топическим, интратрахеальным (например, путем интратрахеальной инстилляции), вагинальным, в стекловидное тело и так далее. В некоторых вариантах осуществления введение может включать введение только одной дозы. В некоторых вариантах осуществления введение включать использование фиксированного количества доз. В некоторых вариантах осуществления введение может включать введение доз, которое является прерывистым (например, множество доз, разделенных во времени) и/или периодическим (например, отдельные дозы, разделенные одинаковыми периодами времени) введением доз. В некоторых вариантах осуществления введение может включать непрерывное введение доз (например, перфузию) в течение по меньшей мере выбранного периода времени.
Используемый в настоящем документе термин «аффинность», как правило, означает меру прочности связывания конкретного лиганда с его партнером по связыванию. Аффинность можно измерять различными способами. В некоторых вариантах осуществления аффинность измеряют путем количественного анализа. В некоторых таких вариантах осуществления концентрация партнера по связыванию может быть фиксирована в избытке относительно концентрации лиганда для имитации физиологических условий. Альтернативно или дополнительно, в некоторых вариантах осуществления концентрацию партнера по связыванию и/или концентрацию лиганда можно варьировать. В некоторых таких вариантах осуществления аффинность можно сравнивать с эталоном при сопоставимых условиях (например, концентрациях).
Используемый в настоящем документе термин «созревание аффинности» означает процесс, в котором антитело изменяют относительно эталонного антитела (также называемого в настоящем документе базовым или исходным антителом), как правило, за счет мутации одного или более аминокислотных остатков, для приобретения им более высокой активности в отношении антигена-мишени, чем активность соответствующей формы эталонного антитела для того же антигена-мишени. Таким образом, измененное антитело является оптимизированным в сравнении с эталонным, или базовым, антителом. Используемый в настоящем документе термин «антитело с созревшей аффинностью», как правило, означает антитело, которое имеет повышенную активность в отношении антигена-мишени в сравнении с эталонным антителом. В некоторых вариантах осуществления антитело с созревшей аффинностью демонстрирует усиленное связывание с антигеном-мишенью в сравнении с эталонным или исходным антителом. Как правило, антитело с созревшей аффинностью связывается с тем же эпитопом, что и эталонное антитело.
Используемый в настоящем документе термин «антитело» означает полипептид, который включает канонические элементы последовательности иммуноглобулина, достаточные для обеспечения специфического связывания с конкретным антигеном-мишенью. Как известно в данной области, интактные антитела, продуцируемые в природе, представляют собой тетрамерные молекулы размером примерно 150 кДа, состоящие из двух идентичных полипептидов тяжелой цепи (примерно 50 кДа каждая) и двух идентичных полипептидов легкой цепи (примерно 25 кДа каждая), которые связаны друг с другом в структуру, которую обычно называют «Y-образной» структурой. Каждая тяжелая цепь состоит из по меньшей мере четырех доменов (каждый длиной примерно 110 аминокислот): амино-концевого вариабельного (VH) домена (расположенного на концах Y-образной структуры), за которым следуют три константных домена: CH1, CH2 и карбокси-концевой CH3 (расположенный в основании стебля «Y»). Короткая область, известная как «стрелка», соединяет вариабельную и константные области тяжелой цепи. «Шарнир» соединяет домены CH2 и CH3 с остальной частью антитела. Две дисульфидные связи в этой шарнирной области соединяют два полипептида тяжелой цепи друг с другом в интактном антителе. Каждая легкая цепь состоит из двух доменов: амино-концевого вариабельного (VL) домена и следующего за ним карбокси-концевого константного (CL) домена, отделенных друг от друга другой «стрелкой». Тетрамеры интактных антител состоят из двух димеров тяжелая цепь-легкая цепь, в которых тяжелая и легкая цепи связаны между собой одной дисульфидной связью; две другие дисульфидные связи соединяют шарнирные области тяжелых цепей друг с другом так, что димеры связываются между собой и образуют тетрамер. Продуцируемые в природе антитела также являются гликозилированными, как правило, на домене CH2. Каждый домен в природном антителе имеет структуру, называемую «иммуноглобулиновой складкой», образованную из двух бета-листов (например, 3-, 4- или 5-цепочечных листов), упакованных друг против друга в сжатый антипараллельный бета-ствол. Каждый вариабельный домен содержит три гипервариабельные петли, известные как «определяющие комплементарность области» (CDR1, CDR2 и CDR3) и четыре в некоторой степени инвариантные «каркасные» области (FR1, FR2, FR3 и FR4). При сворачивании природных антител области FR образуют бета-листы, которые обеспечивают структурный каркас для доменов, и области петель CDR как тяжелой, так и легкой, цепей сближаются в трехмерном пространстве, образуя один гипервариабельный антигенсвязывающий сайт, расположенный на конце Y-образной структуры. Fc-область природных антител связывается с элементами системы комплемента, а также с рецепторами на эффекторных клетках, включая, например, эффекторные клетки, которые опосредуют цитотоксичность. Как известно в данной области, аффинность и/или другие характеристики связывания Fc-областей с рецепторами Fc можно модулировать посредством гликозилирования или другой модификации. В некоторых вариантах осуществления антитела, получаемые и/или используемые в соответствии с настоящим изобретением, содержат гликозилированные Fc-домены, включая Fc-домены с модифицированным или рекомбинантно измененным таким гликозилированием. Для целей настоящего изобретения в конкретных вариантах осуществления любой полипептид, или комплекс полипептидов, содержащий достаточные последовательности доменов иммуноглобулина, присутствующих в природных антителах, могут быть названы, и/или использованы как, «антитело», произведен ли такой полипептид естественным образом (например, произведен организмом, реагирующим на антиген), или произведен путем рекомбинантной модификации, химического синтеза, либо с использованием другой искусственной системы или методологии. В некоторых вариантах осуществления антитело является поликлональным; в некоторых вариантах осуществления антитело является моноклональным. В некоторых вариантах осуществления антитело имеет последовательности константной области, характерные для антител мыши, кролика, примата или человека. В некоторых вариантах осуществления элементы последовательностей антитела являются гуманизированными, приматизированными, химерными, и так далее, как известно в данной области. Кроме того, используемый в настоящем документе термин «антитело» в соответствующих вариантах осуществления (если нет иных указаний или это не ясно из контекста) может означать любой из известных в данной области или разработанных конструктов или форматов для использования структурных и функциональных признаков антител в альтернативном представлении. Например, в вариантах осуществления антитело, используемое по настоящему изобретению, находится в формате, выбранном из, но без ограничения, интактных IgA, IgG, IgE или IgM антител; би- или мультиспецифических антител (например, Zybodies® и так далее); фрагментов антител, таких как Fab-фрагменты, Fab'-фрагменты, F(ab')2-фрагменты, Fd'-фрагменты, Fd-фрагменты, а также выделенные области CDR или их наборы; одноцепочечных Fv-фрагментов; слитых белков полипептид-Fc; однодоменных антител (например, однодоменных антител акул, таких как IgNAR или их фрагменты); антител верблюдовых; замаскированных антител (например, Probodies®); малых модульных иммунофармацевтических средств («SMIP™»); одноцепочечных или тандемных диател (TandAb®); Humabodies®, VHH; антикалинов®; нанотел®, минител; BiTE®; белков с анкириновыми повторами или дарпинов®; авимеров®; DART; TCR-подобных антител; аднектинов®; аффилинов®; транстел®; аффител®; TrimerX®; микробелков; финомеров®, сентиринов® и калбиторов®. В некоторых вариантах осуществления антитело может быть лишено ковалентной модификации (например, присоединения гликана), которую оно имело бы при естественном продуцировании. В некоторых вариантах осуществления антитело может иметь ковалентную модификацию (например, присоединение гликана, полезную нагрузку [например, детектируемый фрагмент, терапевтический фрагмент, каталитический фрагмент и так далее] или другую боковую группу [например, полиэтиленгликоль и так далее].
Используемый в настоящем документе термин «фрагмент антитела» означает часть антитела или средства в виде антитела, описанного в настоящем документе, и, как правило, означает часть, которая включает антигенсвязывающую часть или ее вариабельную область. Фрагмент антитела может быть получен любым способом. Например, в некоторых вариантах осуществления фрагмент антитела может быть получен путем ферментативной или химической фрагментации интактного антитела или средства в виде антитела. Альтернативно, в некоторых вариантах осуществления фрагмент антитела может быть получен рекомбинантными методами (то есть, путем экспрессии генетически модифицированной нуклеотидной последовательности. В некоторых вариантах осуществления фрагмент антитела может быть полностью, или частично, получен методом синтеза. В некоторых вариантах осуществления фрагмент антитела (в частности антигенсвязывающий фрагмент антитела) может иметь длину по меньшей мере примерно 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190 аминокислот или более, в некоторых вариантах осуществления по меньшей мере примерно 200 аминокислот.
Используемый в настоящем документе термин «связывание», как правило, означает нековалентную ассоциацию между, или среди, двух или более молекул. «Прямое» связывание включает физический контакт между молекулами или фрагментами; непрямое связывание включает физическое взаимодействие за счет физического контакта с одной или более промежуточными молекулами. Связывание между двумя или более молекулами, как правило, можно оценивать в любом из различных контекстов - включая случаи, когда взаимодействующие молекулы или фрагменты изучают в изолированном виде или в контексте более сложных систем (например, в ковалентной или иной связи с молекулой носителя и/или в биологической системе или клетке).
Используемые в настоящем документе термины «рак», «злокачественная опухоль», «новообразование», «опухоль» и «карцинома», как правило, относятся к клеткам, которые демонстрируют относительно аномальный, неконтролируемый и/или автономный рост, так что они обладают фенотипом аберрантного роста, характеризующимся значительной утратой контроля клеточной пролиферации. В некоторых вариантах осуществления опухоль может представлять собой, или содержать, клетки, которые являются предраковыми (например, доброкачественными), злокачественными, пре-метастатическими, метастатическими и/или не метастатическими. В настоящем документе конкретно указаны определенные виды рака, при которых описанные в документе идеи могут быть особенно полезны. В некоторых вариантах осуществления релевантный рак может быть охарактеризован как солидная опухоль. В некоторых вариантах осуществления релевантный рак может быть охарактеризован как гематологическая опухоль. Как правило, примеры разных видов рака, известных в данной области, включают, например, гемопоэтические виды рака, включая лейкозы, лимфомы (ходжкинские и неходжкинские), миеломы и миелопролиферативные заболевания; саркомы, меланомы, аденомы, карциномы твердой ткани, плоскоклеточный рак рта, горла, гортани и легкого, рак печени, рак мочеполовой системы, такой как рак предстательной железы, рак шейки матки, рак мочевого пузыря, рак тела матки, рак эндометрия и почечноклеточный рак, рак костей, рак поджелудочной железы, рак кожи, кожную или внутриглазную меланому, рак эндокринной системы, рак щитовидной железы, рак паращитовидной железы, рак головы и шеи, рак молочной железы, рак желудочно-кишечного тракта и рак нервной системы, доброкачественные лезии, такие как папилломы, и тому подобное.
Используемый в настоящем документе термин «CDR» означает определяющую комплементарность область в вариабельной области антитела. В каждой из вариабельных областей тяжелой цепи и легкой цепи имеется три области CDR, которые обозначены CDR1, CDR2 и CDR3, для каждой из вариабельных областей. «Набор из CDR» или «набор CDR» означает группу из трех или шести CDR, которые присутствуют в любой одной вариабельной области, способной к связыванию антигена, либо CDR соответствующих вариабельных областей тяжелой и легкой цепей, способных к связыванию антигена. В данной области были созданы конкретные системы для определения границ CDR (например, Kabat, Chothia и так далее); специалисты в данной области понимают различия между, и среди этих систем и способны понимать границы CDR в степени, необходимой для понимания и осуществления на практике заявленного изобретения.
Используемый в настоящем документе термин «химиотерапевтическое средство» имеет принятое в данной области значение, относящееся к одному или более проапоптотическим, цитостатическим и/или цитотоксическим средствам, например, включая средства, используемые и/или рекомендованные для использования в лечении одного или более заболеваний, нарушений или состояний, связанных с нежелательной клеточной пролиферацией. Во многих вариантах осуществления химиотерапевтические средства могут быть использованы для лечения рака. В некоторых вариантах осуществления химиотерапевтическое средство может представлять собой, или содержать, одно или более алкилирующих средств, один или более антрациклинов, одно или более средств, разрушающих цитоскелет (например, средств, направленных на микротрубочки, таких как таксаны, майтанзин и их аналоги), один или более эпотилонов, один или более ингибиторов гистондеацетилазы HDAC), один или более ингибиторов топоизомеразы (например, ингибиторов топоизомеразы I и/или топоизомеразы II), один или более ингибиторов киназы, один или более аналогов нуклеотидов или аналогов предшественников нуклеотидов, один или более пептидных антибиотиков, одно или более средств на основе платины, один или более ретиноидов, один или более алкалоидов барвинка и/или один или более аналогов одного или более из перечисленного (то есть, также обладающих соответствующей антипролиферативной активностью). В некоторых конкретных вариантах осуществления химиотерапевтическое средство может представлять собой, или содержать, одно или более из актиномицина, полностью транс-ретиноевой кислоты, ауристатина, азацитидина, азатиоприна, блеомицина, бортезомиба, карбоплатина, капецитабина, цисплатина, хлорамбуцила, циклофосфамида, куркумина, цитарабина, даунорубицина, доцетаксела, доксифлуридина, доксорубицина, эпирубицина, эпотилона, этопозида, фторурацила, гемцитабина, гидроксимочевины, идарубицина, иматиниба, иринотекана, майтанзина и/или его аналогов (например, DM1), мехлорэтамина, меркаптопурина, метотрексата, митоксантрона, майтанзиноида, оксалиплатина, паклитаксела, пеметрекседа, тенипозида, тиогуанина, топотекана, валрубицина, винбластина, винкристина, виндезина, винорелбина, а также их сочетания. В некоторых вариантах осуществления химиотерапевтическое средство может быть использовано в контексте конъюгата антитело-лекарственное средство. В некоторых вариантах осуществления химиотерапевтическое средство представляет собой средство в конъюгате антитело-лекарственное средство, выбранном из группы, состоящей из: hLL1-доксорубицина, hRS7-SN-38, hMN-14-SN-38, hLL2-SN-38, hA20-SN-38, hPAM4-SN-38, hLL1-SN-38, hRS7-Pro-2-P-Dox, hMN-14-Pro-2-P-Dox, hLL2-Pro-2-P-Dox, hA20-Pro-2-P-Dox, hPAM4-Pro-2-P-Dox, hLL1-Pro-2-P-Dox, P4/D10-доксорубицина, гемтузумаб озагомицина, брентуксимаб ведотина, трастузумаб эмтанзина, инотузумаб озагомицина, глембатумомаб ведотина, SAR3419, SAR566658, BIIBO15, BT062, SGN-75, SGN-CD19A, AMG-172, AMG-595, BAY-94-9343, ASG-5ME, ASG-22ME, ASG-16M8F, MDX-1203, MLN-0264, анти-PSMA ADC, RG-7450, RG-7458, RG-7593, RG-7596, RG-7598, RG-7599, RG-7600, RG-7636, ABT-414, IMGN-853, IMGN-529, ворсетузумаб мафодотина и лорвотузумаб мертанзина.
Используемый в настоящем документе термин «комбинированная терапия» относится к таким ситуациям, в которых для индивида одновременно используют два или более терапевтических режимов (например, два или более лекарственных средств). В некоторых вариантах осуществления два или более терапевтических режимов могут быть использованы одновременно. В некоторых вариантах осуществления два или более терапевтических режимов могут быть использованы последовательно (например, используют первый режим перед использованием какой-либо дозы из второго режима). В некоторых вариантах осуществления два или более терапевтических режимов используют в перекрывающихся режимах введения доз. В некоторых вариантах осуществления использование комбинированной терапии может включать получение одного или более лекарственных средств, или процедур, индивидом, получающим другое средство(а) или процедуру.
Используемый в настоящем документе термин «каркас», или «каркасная область», относится к последовательностям вариабельной области за вычетом CDR. Поскольку последовательность CDR можно определять с использованием различных систем, то последовательность каркаса также подлежит разной интерпретации. Шесть CDR делят каркасные области на тяжелой и легкой цепях на четыре подобласти (FR1, FR2, FR3 и FR4) на каждой цепи, при этом CDR1 расположена между FR1 и FR2, CDR2 между FR2 и FR3, и CDR3 между FR3 и FR4. Без указания конкретных подобластей, FR1, FR2, FR3 или FR4, каркасная область, как упоминалось в других источниках, представляет собой объединенные области FR в вариабельной области одной природной цепи иммуноглобулина. В настоящем документе FR представляет собой одну из четырех подобластей, FR1, например, представляет собой первую каркасную область, ближайшую к амино-концу вариабельной области и расположенную в 5'-направлении относительно CDR1, и области FR представляют собой две или более из подобластей, составляющих каркасную область.
В настоящем документе термин «гуманизированные» обычно используют применительно к антителам (или компонентам антител), аминокислотная последовательность которых включает последовательности областей VH и VL из эталонного антитела, выработанного у биологического вида, отличного от человека (например, мыши), но также имеет модификации в этих последовательностях в сравнении с эталонным антителом, предназначенные для того, чтобы сделать их более «похожими на человеческие», то есть, более аналогичными последовательностям человеческих вариабельных областей зародышевой линии. В некоторых вариантах осуществления «гуманизированное» антитело (или компонент антитела) представляет собой антитело, которое с иммунологической специфичностью связывает интересующий антиген, и которое имеет каркасную (FR) область, содержащую аминокислотную последовательность, практически такую же, как последовательность человеческого антитела, и определяющую комплементарность область (CDR), содержащую аминокислотную последовательность, практически такую же, как последовательность не принадлежащего человеку антитела. Гуманизированное антитело содержит практически все из по меньшей мере одного и, как правило, двух, вариабельных доменов (Fab, Fab', F(ab')2, FabC, Fv), в которых все, или практически все, из областей CDR соответствуют таковым у не принадлежащего человеку иммуноглобулина (то есть, донорского иммуноглобулина), и все, или практически все, из каркасных областей являются областями, имеющими консенсусную последовательность человеческого иммуноглобулина. В некоторых вариантах осуществления гуманизированное антитело также содержит по меньшей мере часть константной области (Fc) иммуноглобулина, как правило, из константной области человеческого иммуноглобулина. В некоторых вариантах осуществления гуманизированное антитело содержит как легкую цепь, так и по меньшей мере вариабельный домен тяжелой цепи. Антитело также может содержать область CH1, шарнир, CH2, CH3 и, необязательно, CH4 константной области тяжелой цепи.
Используемый в настоящем документе термин «in vitro» относится к событиям, которые происходят в искусственном окружении, например, в пробирке или реакционном сосуде, в клеточной культуре и так далее, а не в многоклеточном организме.
Используемый в настоящем документе термин «in vivo» относится к событиям, которые происходят в многоклеточном организме, таком как человек и животное, не являющееся человеком. В контексте клеточных систем термин может быть использован применительно к событиям, которые происходят в живой клетке (в отличие, например, от in vitro систем).
Используемый в настоящем документе термин «выделенное» относится к веществу, и/или молекуле, которое было (1) отделено от по меньшей мере некоторых из компонентов, с которыми оно было связано при исходном продуцировании (или в природе, и/или в экспериментальных условиях) и/или (2) сконструировано, продуцировано, получено и/или произведено рукой человека. Выделенные вещества и/или молекулы могут быть отделены от примерно 10%, примерно 20%, примерно 30%, примерно 40%, примерно 50%, примерно 60%, примерно 70%, примерно 80%, примерно 90%, примерно 91%, примерно 92%, примерно 93%, примерно 94%, примерно 95%, примерно 96%, примерно 97%, примерно 98%, примерно 99% или более чем примерно 99% других компонентов, с которыми они были исходно связаны. В некоторых вариантах осуществления выделенные средства имеют чистоту примерно 80%, примерно 85%, примерно 90%, примерно 91%, примерно 92%, примерно 93%, примерно 94%, примерно 95%, примерно 96%, примерно 97%, примерно 98%, примерно 99% или более примерно 99%. В настоящем документе вещество считают «чистым», если оно практически свободно от других компонентов. В некоторых вариантах осуществления, как будет понятно специалистам в данной области, вещество все-еще можно считать «выделенным», или даже «чистым», после объединения его с некоторыми другими компонентами, такими как, например, один или более носителей или эксципиентов (например, буфер, растворитель, вода и так далее); в таких вариантах осуществления выделение или чистоту вещества в процентах рассчитывают без учета таких носителей или эксципиентов. В качестве одного лишь примера, в некоторых вариантах осуществления биологический полимер, такой как полипептид или полинуклеотид, существующий в природе, считают «выделенным», когда a) в силу своего происхождения или источника получения он не связан с некоторыми, или всеми, из компонентов, которые сопровождают его в его естественном состоянии в природе; b) он практически свободен от других полипептидов или нуклеиновых кислот того же вида от биологического вида, который продуцирует его в природе; c) он экспрессируется, или иным образом находится в связи с, компонентами из клетки или иной экспрессионной системы, которая не принадлежит биологическому виду, который продуцирует его в природе. Таким образом, например, в некоторых вариантах осуществления полипептид, который химически синтезирован или синтезирован в клеточной системе, отличной от той, которая продуцирует его в природе, считают «выделенным» полипептидом. Альтернативно или дополнительно, в некоторых вариантах осуществления полипептид, который был подвергнут одному или более методам очистки, можно считать «выделенным» полипептидом в той степени, в которой он был отделен от других компонентов a) с которыми он связан в природе; и/или b) с которыми он был связан при исходном продуцировании.
Используемый в настоящем документе термин «KD» означает константу диссоциации связывающего вещества (например, антитела или его связывающего компонента) от комплекса с его партнером по связыванию (например, эпитопом, с которым связывается антитело или его связывающий компонент).
Используемый в настоящем документе термин «макрофаг» означает клетку моноцитарной/макрофагальной линии дифференцировки, которая находится в селезенке или была дифференцирована в тканевой макрофаг. Эти клетки включают фолликулярные дендритные клетки (ФДК), дендритные клетки, клетки Лангерганса, а также другие тканевые макрофаги. Макрофаги представляют собой фагоциты и антигенпрезентирующие клетки, которые дифференцируются из моноцитов в циркулирующей периферической крови. Они играют важную роль как во врожденном, так и в приобретенном иммунитете, за счет активации T-лимфоцитов. Макрофаги, которые активируют Th1 T-лимфоциты, обеспечивают воспалительный ответ, и их называют M1 макрофаги. M1 макрофаги, также называемые «макрофаги-киллеры», ингибируют клеточную пролиферацию, вызывают повреждение тканей и агрессивны по отношению к бактериям. Макрофаги, которые активируют Th2 T-лимфоциты, обеспечивают противовоспалительный ответ, и их называют M2 макрофаги. M2 макрофаги, также называемые «восстанавливающие макрофаги», стимулируют клеточную пролиферацию и восстановление тканей, и являются противовоспалительными. Используемый в настоящем документе термин «опухоль-ассоциированные макрофаги» (ОАМ), как правило, относится к макрофагам, которые присутствуют в микросреде рака, например, опухоли.
Используемый в настоящем документе термин «функционально связанные» относится к совместному расположению, при котором описанные компоненты находятся в отношениях, позволяющих им функционировать предназначенным для них образом. Контролирующий элемент, «функционально связанный» с функциональным элементом, связан таким образом, что экспрессия и/или активность функционального элемента достигается в условиях, совместимых с контролирующим элементом. В некоторых вариантах осуществления «функционально связанные» контролирующие элементы являются смежными (например, ковалентно связанными) с интересующими кодирующими элементами; в некоторых вариантах осуществления контролирующие элементы действуют в транс-положении, или ином положении, по отношению к интересующему функциональному элементу.
Используемый в настоящем документе термин «фармацевтическая композиция» означает композицию, в которой активное средство сформулировано совместно с одним или более фармацевтически приемлемыми носителями. В некоторых вариантах осуществления композиция подходит для введения индивиду, человеку или животному. В некоторых вариантах осуществления активное средство присутствует в количестве стандартной дозы, подходящей для введения в терапевтическом режиме, который имеет статистически значимую вероятность достижения заранее определенного терапевтического эффекта при введении в соответствующей популяции.
Используемый в настоящем документе термин «полипептид», как правило, имеет признанное в данной области значение, то есть, означает полимер из по меньшей мере трех аминокислот. Специалисты в данной области понимают, что термин «полипептид» должен быть достаточно общим, чтобы охватывать не только полипептиды, имеющие полную последовательность, приведенную в настоящем документе, но также охватывать полипептиды, которые представляют собой функциональные фрагменты (то есть, фрагменты, сохраняющие по меньшей мере одну активность) таких полных полипептидов. Кроме того, специалисты в данной области понимают, что белковые последовательности, как правило, допускают некоторые замены без нарушения активности. Таким образом, любой полипептид, который сохраняет активность и имеет по меньшей мере примерно 30-40% общую идентичность последовательности, часто более примерно 50%, 60%, 70% или 80%, и, кроме того, как правило, имеет по меньшей мере одну область с более высокой степенью идентичности, часто более 90% или даже 95%, 96%, 97%, 98% или 99% в одной или более высоко консервативных областях, как правило, охватывающих по меньшей мере 3-4 и часто до 20 или более аминокислот, с другим полипептидом того же класса, охвачен соответствующим используемым в настоящем документе термином «полипептид». Полипептиды могут содержать L-аминокислоты, D-аминокислоты или и те, и другие, и могут иметь любые из множества аминокислотных модификаций или аналогов, известных в данной области. Полезные модификации включают, например, концевой ацетилирование, амидирование, метилирование и так далее. В некоторых вариантах осуществления белки могут содержать природные аминокислоты, неприродные аминокислоты, синтетические аминокислоты и их сочетания. Термин «пептид», как правило используют применительно к полипептиду, имеющему длину менее примерно 100 аминокислот, менее примерно 50 аминокислот, менее 20 аминокислот или менее 10 аминокислот. В некоторых вариантах осуществления белки представляют собой антитела, фрагменты антител, их биологически активные части и/или их характерные части.
В настоящем документе термин «предотвращать», или «предотвращение», при использовании применительно к развитию заболевания, нарушения и/или состояния, означает уменьшение риска развития заболевания, нарушения и/или состояния, и/или отсрочку начала и/или уменьшение степени тяжести одного или более признаков или симптомов заболевания, нарушения или состояния. В некоторых вариантах осуществления предотвращение оценивают на базе популяции, так что считают, что средство «предотвращает» конкретное заболевание, нарушение или состояние, если статистически значимое уменьшение степени развития, частоты и/или интенсивности одного или более симптомов заболевания, нарушения или состояния наблюдается в популяции, подверженной заболеванию, нарушению или состоянию.
Используемый в настоящем документе термин «рекомбинантные» относится к полипептидам, которые спроектированы, сконструированы, изготовлены, экспрессированы, созданы, произведены и/или выделены рекомбинантными способами, например, полипептидам, экспрессируемым при помощи рекомбинантного экспрессионного вектора, трансфицированного в клетку-хозяина; полипептидам, выделенным из рекомбинантной, комбинаторной библиотеки человеческих полипептидов; полипептидам, полученным от животного (например, мыши, кролика, овцы, рыбы и так далее), которое является трансгенным, или иным образом было изменено для экспрессии гена или генов, или компонентов генов, которые кодируют и/или непосредственно экспрессируют полипептид или один или более его компонентов, частей, элементов или доменов; и/или полипептидам, полученным, экспрессированным, созданным или выделенным любыми другими способами, включающими сплайсинг или лигирование выбранных элементов нуклеотидной последовательности друг с другом, химический синтез выбранных элементов последовательности и/или иным образом получение нуклеиновой кислоты, которая кодирует и/или управляет экспрессией полипептида или одного или более его компонентов, частей, элементов или доменов. В некоторых вариантах осуществления один или более из таких выбранных элементов последовательности встречается в природе. В некоторых вариантах осуществления один или более из таких выбранных элементов последовательности проектируют in silico. В некоторых вариантах осуществления один или более из таких выбранных элементов последовательности являются следствием мутагенеза (например, in vivo или in vitro) известного элемента последовательности, например, из природного или синтетического источника, такого как, например, в зародышевой линии интересующего исходного организма (например, человека, мыши и так далее).
Используемый в настоящем документе термин «специфическое связывание» означает способность к дискриминации между возможными партнерами по связыванию в среде, в которой будет происходить связывание. Связывающее средство, которое взаимодействует с одной конкретной мишенью в присутствии других потенциальных мишеней, называют «специфически связывающим» мишень, с которой он взаимодействует. В некоторых вариантах осуществления специфическое связывание оценивают путем обнаружения, или определения степени, ассоциации между связывающим средством и его партнером; в некоторых вариантах осуществления специфическое связывание оценивают путем обнаружения, или определения степени, диссоциации комплекса связывающее средство-партнер; в некоторых вариантах осуществления специфическое связывание оценивают путем обнаружения, или определения, способности связывающего средства конкурировать с альтернативным взаимодействием между его партнером и другой молекулой. В некоторых вариантах осуществления специфическое связывание оценивают путем проведения такого обнаружения или определения в диапазоне концентраций.
Используемый в настоящем документе термин «индивид» относится к организму, как правило, млекопитающему (например, человеку, в некоторых вариантах осуществления включая человека в пренатальном состоянии). В некоторых вариантах осуществления индивид страдает от соответствующего заболевания, нарушения или состояния. В некоторых вариантах осуществления индивид предрасположен к заболеванию, нарушению или состоянию. В некоторых вариантах осуществления индивид проявляет один или более симптомов или признаков заболевания, нарушения или состояния. В некоторых вариантах осуществления индивид не проявляет никакого симптома или признака заболевания, нарушения или состояния. В некоторых вариантах осуществления индивид является индивидом с одним или более признаками, характерными для предрасположенности или риска развития заболевания, нарушения или состояния. В некоторых вариантах осуществления индивид является пациентом. В некоторых вариантах осуществления индивид является индивидуумом, который диагностирован и/или был диагностирован, и/или получает, и/или получал терапию.
Используемый в настоящем документе термин «лекарственное средство», как правило, означает любое средство, которое вызывает желаемый фармакологический эффект при введении в организм. В некоторых вариантах осуществления средство считают лекарственным средством, если оно проявляет статистически значимый эффект в соответствующей популяции. В некоторых вариантах осуществления соответствующая популяция может представлять собой популяцию модельных организмов. В некоторых вариантах осуществления соответствующую популяцию можно определять на основании различных критериев, таких как определенная возрастная группа, пол, генетический фон, ранее существовавшие клинические состояния и так далее. В некоторых вариантах осуществления лекарственное средство представляет собой вещество, которое может быть использовано для облегчения, улучшения, ослабления, ингибирования, предотвращения, задержки начала развития, уменьшения степени тяжести и/или уменьшения частоты возникновения одного или более симптомов или признаков заболевания, нарушения и/или состояния. В некоторых вариантах осуществления «лекарственное средство» представляет собой средство, которое было, или должно быть, одобрено правительственным учреждением, прежде чем оно может продаваться на рынке для введение людям. В некоторых вариантах осуществления «лекарственное средство» представляет собой средство, для введения которого людям необходимо медицинское предписание.
Используемый в настоящем документе термин «терапевтически эффективное количество» означает количество, которое является достаточным при введении в популяции индивидов, страдающих от, или предрасположенных к заболеванию, нарушению и/или состоянию, в соответствии с терапевтическим режимом введения доз для лечения заболевания, нарушения и/или состояния. В некоторых вариантах осуществления терапевтически эффективное количество представляет собой количество, которое уменьшает частоту случаев и/или степень тяжести, стабилизирует одну или более характеристик и/или отсрочивает начало развития одного или более симптомов заболевания, нарушения и/или состояния. Специалисты в данной области понимают, что термин «терапевтически эффективное количество» фактически не означает, что успешное лечение было достигнуто для конкретного индивидуума. Скорее, терапевтически эффективное количество может представлять собой такое количество, которое обеспечивает конкретный желаемый фармакологический ответ у значительного количества индивидов при введении пациентам, которые нуждаются в таком лечении. Например, в некоторых вариантах осуществления термин «терапевтически эффективное количество» означает количество, которое при введении индивидууму, который нуждается в этом, в контексте терапии по изобретению, будет блокировать, стабилизировать, облегчать или обращать вспять поддерживающий рак процесс, происходящий в организме указанного индивидуума, либо будет усиливать или стимулировать подавляющий рак процесс в организме указанного индивидуума. В контексте лечения рака «терапевтически эффективное количество» представляет собой количество, которое при введении индивидууму, у которого диагностирован рак, будет предотвращать, стабилизировать, ингибировать, уменьшать дальнейшее развитие рака у индивидуума. Особенно предпочтительное «терапевтически эффективное количество» композиции, описанной в настоящем документе, обращает вспять (в терапевтическом лечении) развитие злокачественного новообразования, такого как карцинома поджелудочной железы, или помогает достигать или продлевать ремиссию злокачественного новообразования. Терапевтически эффективное количество, вводимое индивидууму для лечения рака у этого индивидуума, может быть таким же, или отличаться от терапевтически эффективного количества, вводимого для стимуляции ремиссии или ингибирования метастазирования. Как в ситуации с большинством противораковых методов лечения, терапевтические способы, описанные в настоящем документе, не должны быть интерпретированы, лимитированы или иным образом ограничены «излечением» рака; скорее способы лечения направлены на использование описанных композиций для «лечения» рака, то есть, вызывания желаемого или полезного изменения состояния здоровья индивидуума, страдающего от рака. Такие преимущества признаются квалифицированными медицинскими работниками в области онкологии и включают, но без ограничения, стабилизацию состояния пациента, уменьшение размера опухоли (регрессию опухоли), улучшение жизненно важных функций (например, улучшение функции пораженных раком тканей или органов), уменьшение или ингибирование дальнейшего метастазирования, уменьшение оппортунистических инфекций, увеличение выживаемости, уменьшение боли, улучшение двигательной функции, улучшение когнитивной функции, улучшение ощущения наличия энергии (жизненной силы, уменьшение недомогания), улучшение самочувствия, восстановление нормального аппетита, восстановление здорового увеличения массы тела, а также их сочетания. Кроме того, регрессию конкретной опухоли у индивидуума (например, в результате способов лечения, описанных в настоящем документе) также можно оценивать, отбирая образцы раковых клеток из зоны опухоли, такой как аденокарцинома поджелудочной железы (например, на протяжении курса лечения), и тестируя раковые клетки на уровень метаболических и сигнальных маркеров для контроля состояния раковых клеток с целью подтверждения на молекулярном уровне регрессии раковых клеток к менее злокачественному фенотипу. Например, на регрессию опухоли, вызванную использованием способов по настоящему изобретению, указывало бы обнаружение уменьшения содержания любого из проангиогенных маркеров, описанных выше, увеличения содержания антиангиогенных маркеров, описанных в настоящем документе, нормализации (то есть, изменения в сторону состояния, характерного для здоровых индивидуумов, не страдающих от рака) метаболических путей, межклеточных сигнальных путей или внутриклеточных сигнальных путей, которые проявляют аномальную активность у индивидуумов с диагностированным раком. Специалисты в данной области понимают, что в некоторых вариантах осуществления терапевтически эффективное количество может быть сформулировано и/или введено в одной дозе. В некоторых вариантах осуществления терапевтически эффективное количество может быть сформулировано и/или введено во множестве доз, например, в виде части режима введения доз.
Используемый в настоящем документе в контексте молекул, например, нуклеиновых кислот, белков или малых молекул, термин «вариант» означает молекулу, которая имеет значительную структурную идентичность с эталонной молекулой, но отличается структурно от эталонной молекулы, например, присутствием или отсутствием, или уровнем, одного или более химических фрагментов в сравнении с эталонной молекулой. В некоторых вариантах осуществления вариант также отличается функционально от его эталонной молекулы. Как правило, решение о том, можно ли конкретную молекулу считать «вариантом» эталонной молекулы, основано на степени ее структурной идентичности с эталонной молекулой. Как понятно специалистам в данной области, любая биологическая или химическая эталонная молекула имеет определенные характерные структурные элементы. Вариант по определению является другой молекулой, которая имеет общие один или более таких характерных структурных элементов, но отличается по меньшей мере одним аспектом от эталонной молекулы. В качестве некоторых примеров, полипептид может иметь характерный элемент последовательности, состоящий из множества аминокислот, имеющих определенные положения относительно друг друга в линейном или трехмерном пространстве и/или участвующих в конкретном структурном мотиве и/или биологической функции; нуклеиновая кислота может иметь характерный элемент последовательности, состоящий из множества нуклеотидных остатков, имеющих определенные положения относительно друг друга в линейном или трехмерном пространстве. В некоторых вариантах осуществления вариантный полипептид, или нуклеиновая кислота, может отличаться от эталонного полипептида, или нуклеиновой кислоты, в результате одного или более отличий в аминокислотной или нуклеотидной последовательности. В некоторых вариантах осуществления вариантный полипептид, или нуклеиновая кислота, имеет общую идентичность последовательности с эталонным полипептидом, или нуклеиновой кислотой, которая составляет по меньшей мере 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97% или 99%. В некоторых вариантах осуществления вариантный полипептид, или нуклеиновая кислота, не имеет общий по меньшей мере один характерный элемент последовательности с эталонным полипептидом, или нуклеиновой кислотой. В некоторых вариантах осуществления вариантный полипептид, или нуклеиновая кислота, обладает одним или более видами биологической активности. В некоторых вариантах осуществления вариантный полипептид, или нуклеиновая кислота, имеет общие один или более видов биологической активности с эталонным полипептидом, или нуклеиновой кислотой.
Используемый в настоящем документе термин «вектор» означает молекулу нуклеиновой кислоты, способную переносить другую нуклеиновую кислоту, с которой она была связана. Одним типом вектора является «плазмида», которая представляет собой кольцевую петлю двухцепочечной ДНК, в которую могут быть лигированы дополнительные сегменты ДНК. Другим типом вектора является вирусный вектор, в котором дополнительные сегменты ДНК могут быть лигированы в вирусный геном. Некоторые векторы способны к автономной репликации в клетке-хозяине, в которую они были введены (например, бактериальные векторы, имеющие бактериальную точку начала репликации, и эписомные векторы млекопитающих). Другие векторы (например, не эписомные векторы млекопитающих) могут интегрироваться в геном клетки-хозяина при введении в клетку-хозяина и, таким образом, реплицироваться вместе с геномом хозяина. Кроме того, некоторые векторы способны к прямой экспрессии генов, с которыми они функционально связаны. Такие векторы в настоящем документе называют «экспрессионными векторами». Для получения рекомбинантных ДНК, олигонуклеотидного синтеза, а также культивирования тканей и трансформации (например, электропорации, липофекции) можно использовать стандартные методы. Ферментативные реакции и методы очистки можно применять в соответствии с инструкциями производителя или как обычно осуществляют в данной области, или как описано в настоящем документе. Вышеуказанные методы и процедуры могут быть, в целом, выполнены в соответствии с общепринятыми способами, хорошо известными в данной области, и как описано в различных литературных источниках общего и более конкретного назначения, которые цитированы и описаны в настоящей спецификации. Смотри, например, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2-е издание, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989)), содержание которого включено в настоящий документ посредством ссылки для любых целей.
Макрофаги при раке
Макрофаги представляют собой фагоциты и антигенпрезентирующие клетки, которые дифференцируются из моноцитов в циркулирующей периферической крови. Известно, что эти клетки играют важную роль как во врожденном, так и в приобретенном иммунитете, за счет активации T-лимфоцитов. Макрофаги, которые активируют Th1 T-лимфоциты, обеспечивают воспалительный ответ, и их называют M1 макрофаги. M1 макрофаги, также называемые «макрофаги-киллеры», ингибируют клеточную пролиферацию, вызывают повреждение тканей и агрессивны по отношению к бактериям. Макрофаги, которые активируют Th2 T-лимфоциты, обеспечивают противовоспалительный ответ, и их называют M2 макрофаги. M2 макрофаги, также называемые «восстанавливающие макрофаги», стимулируют клеточную пролиферацию и восстановление тканей, и являются противовоспалительными.
Когда макрофаги образуются путем дифференциации моноцитов, моноциты созревают либо в M1 (CD68+ и CD80+), либо в M2 (CD68+ и CD163+), макрофаги в зависимости от цитокинов и факторов роста, которые вызывают их дифференциацию. Липополисахарид (ЛПС) и интерферон-гамма (IFNγ) активируют моноциты к дифференциации в M1 макрофаги, которые секретируют высокие уровни интерлейкина 1 (IL-1) и интерлейкина 12 (IL-12), и низкие уровни интерлейкина 10 (IL-10). Альтернативно, интерлейкин 4 (IL-4), IL-10, антагонист рецептора интерлейкина 1 (IL-1ra) и трансформирующий фактор роста бета (TGFβ) активируют моноциты к дифференциации в M2 макрофаги, которые секретируют высокие уровни IL-10, TGFβ и инсулиноподобного фактора роста 1 (IGF-1), и низкие уровни IL-12.
Роль иммунитета при онкогенезе становится все более признанной. Поскольку известно, что макрофаги играют важную роль как во врожденном, так и в приобретенном, иммунитете, они были признаны ключевыми компонентами опухолей и их микросреды. Опухоль-ассоциированные макрофаги (ОАМ), как правило, представляют собой макрофаги, которые находятся в микросреде раковой опухоли. Роль опухоль-ассоциированных макрофагов (ОАМ) в росте, инвазии и метастазировании опухоли была интенсивно исследована, и известно, что ОАМ проявляют широкий спектр фенотипов, от M1-подобного фенотипа на ранних стадиях избранных опухолей до M2-подобного фенотипа в наиболее запущенных опухолях. Как доказательство их роли в стимулировании онкогенеза, M2 макрофаги демонстрируют характерный фенотип с повышенной экспрессией IL-10, IL4, MMP и VEGF, но сниженной экспрессией провоспалительных цитокинов и цитотоксических iNO и ROI, которые вовлечены в туморицидную активность. Помимо их внутренней функции в стимулировании туморогенеза, ОАМ также участвуют в подавлении противоопухолевого иммунитета путем изменения T-клеточных ответов и равновесия в микросреде опухоли.
Помимо стимуляции клеточной пролиферации, играя противовоспалительную роль, при раке M2 макрофаги могут индуцировать васкуляризацию в области опухоли. Следовательно, в таких сценариях было бы полезно ингибировать М2 поляризацию макрофагов и индуцировать M1 поляризацию макрофагов, которые, как известно, атакуют опухолевые клетки.
VSIG4
VSIG4 (V-набор и домен иммуноглобулина содержащий белок 4) представляет собой родственный семейству B7 мембранный белок, принадлежащий к рецепторам комплемента суперсемейства иммуноглобулинов (CRIg), который, как известно, отрицательно регулирует пролиферацию CD8+ T-клеток и продуцирование IL-2 путем связывания iC3b и C3b. Экспрессия VSIG4 ограничена тканевыми макрофагами, включая макрофаги брюшной полости и находящиеся в печени клетки Купфера. На Фигурах 2A и 2B показана связь VSIG4 (гомология и филогенетические отношения, соответственно) с другими белками семейства B7 (VSIG4 называют EU103 на Фигурах 2A и 2B). На Фигуре 2A показано выравнивание аминокислотной последовательности VSIG4 с различными другими белками семейства B7. На Фигуре 2B показана эволюционная связь между VSIG4 и другими белками семейства B.
Анти-VSIG4 антитело для лечения рака
Опухоль-ассоциированные макрофаги (ОАМ) являются ключевыми клетками, создающими иммуносупрессивную микросреду опухоли (МСО), обеспечивая множество мишеней для иммунотерапии. Также известно, что макрофаги являются очень пластичными и могут легко менять полярность и приобретать антитуморогенный M1-подобный фенотип.
Опухоль-ассоциированные макрофаги (ОАМ), как правило, известны своими протуморогенными функциями, такими как стимуляция перемещения раковых клеток, образования метастазов и ангиогенеза. Образование ОАМ зависит от факторов микросреды, которые присутствуют в развивающейся опухоли. ОАМ в изобилии встречаются в раковых опухолях многих видов, особенно в микросреде опухоли, и часто проявляют иммуносупрессивный M2-подобный фенотип, который стимулирует рост опухоли и способствует развитию резистентности к терапии. ОАМ также продуцируют иммуносупрессивные цитокины, такие как IL-10, TGFβ и PGE2, очень небольшие количества NO или ROI и низкие уровни воспалительных цитокинов, таких как IL-12, IL-1β, TNFα и IL-6. Превращение макрофагов в ОАМ приводит к уменьшению способности представлять опухоль-ассоциированные антигены и стимулировать противоопухолевые функции T- и NK-клеток. Кроме того, ОАМ неспособны лизировать опухолевые клетки. Вследствие этого, таргетирование ОАМ является новой терапевтической стратегией подавления и лечения рака, например, путем доставки средств либо для изменения рекрутинга и распределения ОАМ, деплеции существующих ОАМ, либо для индукции «переучивания» (или превращения) ОАМ из M2 в M1 фенотип.
Настоящее изобретение основано на том открытии, что экспрессирующие VSIG4 M2 макрофаги могут быть обработаны гуманизированными анти-VSIG4 антителами для превращения (или изменения полярности) M2 макрофагов в подавляющие опухоль M1 макрофаги, за счет чего индуцируется пролиферация CD8+ T-клеток и продуцирование провоспалительных цитокинов, что приводит к подавлению опухоли. Кроме того, использование анти-VSIG4 антител может эффективно приводить к подавлению рака за счет как (1) превращения M2 макрофагов в M1 макрофаги, так и (2) индукции пролиферации CD8+ T-клеток и продуцирования провоспалительных цитокинов, с воздействием на саму микросреду опухоли. Данный подход с использованием анти-VSIG4 антитела для подавления рака превосходит другие методы лечения, которые только приводят к индукции пролиферации T-клеток или только блокируют опухоль-стимулирующую активность макрофагов. Смотри Фигуру 1 (схематически изображающую эффекты анти-VSIG4 антител на функцию макрофагов, их эффекты на пролиферацию T-клеток и последующее подавление рака.)
Гуманизация мышиного антитела
Хотя моноклональные антитела могут быть быстро продуцированы иммунной системой мышей для биологических исследований, в клинических условиях использование этих мышиных антител может приводить к развитию ответа в организме человека на мышиные антитела (HAMA). При том, что химерные антитела могут вызывать менее выраженные анти-IgG ответы в организме человека, мышиные вариабельные домены могут все-еще содержать провоцирующие T-клетки эпитопы, что приводит к необходимости «гуманизации» их каркасных областей.
Классическую гуманизацию антитела, как правило, начинают путем переноса всех шести мышиных определяющих комплементарность областей (CDR) на каркас человеческого антитела (Jones et al., Nature 321, 522-525 (1986)). Эти CDR-привитые антитела, как правило, не сохраняют их исходную аффинность при связывании антигена и, фактически, аффинность часто серьезно ухудшается. Помимо CDR, некоторые не принадлежащие человеку остатки каркаса также должны быть включены в вариабельные домены для сохранения правильной конформации CDR (Chothia et al., Nature 342:877 (1989)). Включение мышиных остатков в ключевые положения каркасных областей антител человека для восстановления функции, как правило, называют «обратными мутациями». Обратные мутации могут способствовать поддержанию структурной конформации привитых CDR и восстанавливать способность к связыванию антигена и аффинность. Были идентифицированы многие из положений каркаса, которые, вероятно, влияют на аффинность, таким образом, структурное моделирование для выбора новых остатков в пошаговом режиме обычно может приводить к получению вариантов с восстановленной способностью к связыванию антигена. Альтернативно, также можно использовать фаговые библиотеки антител с направленностью на данные остатки для усиления и ускорения процесса созревания аффинности (Wu et al., J. Mol. Biol. 294:151-162 (1999) и Wu, H., Methods in Mol. Biol. 207:197-212 (2003)).
Созревание аффинности антитела
Созревание аффинности представляет собой процесс, посредством которого активированные TFH клетками B-клетки продуцируют антитела с повышенной аффинностью для конкретного антигена в процессе иммунного ответа. При повторных воздействиях одного и того же антигена хозяин будет продуцировать антитела с последовательно возрастающей аффинностью. При вторичном ответе могут вырабатываться антитела с аффинностью, которая в несколько раз выше, чем при первичном ответе. Созревание аффинности является важной стратегией в оптимизации антитела для создания безопасных и эффективных терапевтических средств второго поколения. Обычно терапевтические антитела получают путем иммунизации мышей или трансгенных животных, экспрессирующих гены человеческих иммуноглобулинов, нужным антигеном. Стимулированные антигеном иммунные клетки от этих животных трансформируют в гибридомы, а затем подвергают скринингу для идентификации моноклональных антител с низкой наномолярной аффинностью для их антигена-мишени. In vivo естественное созревание аффинности в иммунной системе происходит в результате соматических гипермутаций и клональной селекции, в то время как in vitro, при созревании аффинности в условиях лаборатории, оно может быть достигнуто путем мутаций и селекции. Кроме того, и другие способы созревания аффинности, помимо способов с использованием активированных TFH клетками B-клеток, известны в данной области и входят в объем настоящего изобретения.
ПРИМЕРЫ
Далее изобретение описано с помощью следующих примеров, которые не ограничивают объем изобретения, описанный в формуле изобретения.
МЕТОДЫ И МАТЕРИАЛЫ
Следующие методы и материалы были использованы в экспериментах, описанных в примерах.
Выделение CD14+ моноцитов из человеческих МКПК
Дифференциацию макрофагов в M1 или M2 макрофаги проводили путем получения МКПК от индивидов и инкубации макрофагов в 50 нг/мл растворе hGM-CSF в течение 6 дней для превращения в M1 макрофаги или инкубации макрофагов в 100 нг/мл растворе M-CSF в течение 6 дней для превращения в M2 макрофаги (Фигура 5).
Превращение макрофагов в M1 или M2 макрофаги подтверждали путем проверки фенотипа (Фигуры 6 и 7).
Последующее превращение M1 или M2 макрофагов в M1 макрофаги проводили путем инкубации макрофагов в смеси ЛПС (100 нг/мл) + IFNγ (100 нг/мл) или 500 нг/мл растворе анти-VSIG4 антитела (EU103.2) в течение 24 часов (Фигура 12).
Превращение M1 или M2 макрофагов в M2 макрофаги проводили путем инкубации макрофагов в 20 нг/мл растворе IL-4 в течение 24 час (Фигура 12).
Гуманизированное анти-VSIG4 антитело - антитело EU103.2
Антитело EU103.2 представляет собой гуманизированное анти-VSIG4 антитело, полученное из мышиного анти-VSIG4 антитела mu6H8. На Фигурах 4A и 4B показано определение биохимических характеристик антитела EU103.2 методом эксклюзионной ВЭЖХ (Фигура 4A) и поверхностного плазмонного резонанса, демонстрирующее связывание VSIG4 с антителом EU103.2 (Фигура 4B). Сводные данные по очистке антитела EU103.2 приведены в Таблице 1, ниже.
ТАБЛИЦА 1: Сводные данные эксклюзионной ВЭЖХ для антитела EU103.2
| Концентрация | Всего на 30 мл (x5) при трансфекции Expi293F | |
| EU103.2 | 1,2 мг/мл × 7 мл 0,37 мг/мл × 2 мл |
9,14 мг |
Гуманизация мышиного анти-VSIG4 антитела - антитела EU103.3
Гуманизированное анти-VSIG4 антитело hu6H8 (или EU103.3) получали, как описано ниже.
Гуманизация mu6H8 VH
Каркас для гуманизированного варианта VH получали с использованием мышиного антитела 6H8 и Blast (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PAGE=Proteins) (ген зародышевой линии: VH2-5/D3-3/JH6c). Использовали систему нумерации Kabat для классификации CDR, и гуманизированные VH проектировали с каркасом и классифицированными mu6H8 VH CDR, обратными мутациями VH2, VH27, VH30, VH93 и VH94. (hu6H8.3 VH).
Гуманизация mu6H8 VL
Каркас для гуманизированного варианта VL получали с использованием мышиного антитела 6H8 и Blast (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PAGE=Proteins) (ген зародышевой линии: A17/JK2). Использовали систему нумерации Kabat для классификации CDR, и гуманизированные VL проектировали с каркасом и классифицированными mu6H8 VL CDR, обратными мутациями VH2, VH4, VH36 и VH46. (hu6H8.3 VL).
Клонирование и экспрессия IgG антитела - антитела EU103.3
Последовательность вариабельной области тяжелой цепи модифицировали путем FES (L234F, L235E, P331S) мутаций для конструирования экспрессионной плазмиды тяжелой цепи pOptivec (Invitrogen) без эффекторных функций Fc, как показано на Фигуре 21A. Последовательность вариабельной области легкой цепи конструировали с использованием pcDNA3.3 (Invitrogen) и синтезировали с использованием IDT, как показано на Фигуре 21B. Ген, кодирующий тяжелую цепь (HC), был фланкирован сайтами для ферментов рестрикции EcoR1, Nhe1 для конструирования плазмидного вектора pOptivec (FES), и ген, кодирующий легкую цепь (LC), был фланкирован сайтами для ферментов рестрикции EcoR1, BsiW1 для конструирования плазмидного вектора pcDNA3.3. Клонирование производили с сайтами мутаций, субклонированными в каркас hu6H8.3. Каждый из полученных генов вставки и линеаризованных векторов клонировали с использованием In-Fusion® HD набора для клонирования (Clontech), и праймер для секвенирования был определен с CMV прямым, EMCV IRES обратным праймером.
Мыши с нокаутом VSIG4
Мышей с нокаутом VSIG (K/O) получали путем гомологичной рекомбинации, заменяющей экзон 1 геном устойчивости к неомицину. Получали направленный вектор для использования в гомологичной рекомбинации в клетках ES. E1 и E1 и E2 обозначают экзон 1 и 2 гена CRIg (Фигура 41A). Гомологичную рекомбинацию аллеля CRIg в гетерозиготных самках потомства от скрещивания химерных мышей с ES клеточными клонами 1 и 2 (C1, C2) с мышами ДТ подтверждали методом саузерн-блоттинга (Фигура 41B). Сравнивали количество лейкоцитов в периферической крови самок и самцов мышей ДТ и K/O. Общее количество клеток определяли при помощи гематоцитометра. Лейкоциты инкубировали с флуорохром-конъюгированными антителами, специфическими для нескольких клеточных поверхностных маркеров, и количество различных подгрупп лейкоцитов определяли методом проточной цитометрии. Данные представляют средние значения+SD для 5-7 мышей (Фигура 41C).
Антитела A1, A2, A1.3 и A2.3
Антитела A1 и A2 получали путем созревания аффинности антитела EU103.3 (смотри Таблицу 2, ниже), при этом вариабельные области легкой цепи в положениях 76, 90 и/или 92 (нумерация Kabat) мутированы, как показано в Таблице 2, ниже.
Антитела A1.3 и A2.3 получали из антител A1 и A2, соответственно, для дополнительного усовершенствования аффинности в отношении VSIG4.
На Фигуре 40 показано выравнивание аминокислотных последовательностей для тяжелых цепей и легких цепей EU103.3, A1, A2, A1.3 и A2.3, наряду с консенсусными аминокислотными последовательностями для тяжелой цепи и легкой цепи. Аминокислотные остатки, которые отличаются у разных антител, показаны в прямоугольных рамках.
ТАБЛИЦА 2: Клоны гуманизированных анти-VSIG4 антител, подвергнутых скринингу в экспериментах по созреванию аффинности
| Название Ат | Библиотека | HC | LC | Сайты мутаций (HC) (нумерация Kabat) |
Сайты мутаций (LC) (нумерация Kabat) |
| T01.01 (A1) | L3A | ДТ | T01L1 | - | H90Q, R92G |
| T01.02 (A2) | L3A | ДТ | T01L2 | - | L76F, H90Q, R92G |
| T01.03 | L3B | ДТ | T01L3 | - | L76F, H90Q, R92F |
| T01.04 | L3B | ДТ | T01L4 | - | L76F, H90Q, R92L |
| T01.05 | H3B | T01H1 | ДТ | N99H | - |
| T01.06 | H3B | T01H2 | ДТ | Q1K, N99S | - |
| T01.07 | H3B | T01H3 | ДТ | K98E, N99K | - |
| T01.08 | L2 | ДТ | T01L5 | - | S52E, M106I |
| T01.09 | L2 | ДТ | T01L6 | - | L54R, M106I |
| T01.10 | L2 | ДТ | T01L7 | - | S52E, L54R, M106I |
| T01.11 | H1 | T01H4 | ДТ | S32Y | - |
| T01.12 | H1 | T01H5 | ДТ | S32F | - |
| T01.13 | H2A | T01H6 | ДТ | D50E, F52Y, W53S, D54G, D55E | - |
| T01.14 | H2A | T01H7 | ДТ | D50E, W53S | - |
| T01.15 | L1C | ДТ | T01L8 | - | L76F |
| T01.16 | L1C | ДТ | T01L9 | - | M33V, L76F |
| T01.17 | L1A | ДТ | T01L10 | - | K27E, L76F |
| T01.18 | L1B | ДТ | T01L11 | - | T27E, L76F |
| T01.19 | L1B | ДТ | T01L12 | - | T27K, L76F |
| T01.20 | H1 | T01H8 | ДТ | S32W | - |
Получение антител с высокой аффинностью связывания
Ген гуманизированного антитела вставляли в плазмиду и экспрессировали в форме IgG с использованием экспрессионной системы Expi293 (Invitrogen), затем очищали с использованием AktaPure (GE healthcare), AktaPrime purifier (GE healthcare) и колонки MabselectSURE (GE healthcare, каталожный № 11-0034-95). Очищенные антитела пропускали через обессоливающую колонку (GE healthcare, каталожный № 17-1408-01) с заменой буфера PBS, и концентрацию антитела измеряли при помощи Multiskan GO (Thermo).
ТАБЛИЦА 3: Показатели выхода при получении антител с высокой аффинностью связывания
| Название Ат | Объем культуры (мл) | Концентрация Ат (мг/мл) | Выход (мг) |
| T01.01 (A1) | 30 | 0,68 | 1,020 |
| T01.02 (A2) | 30 | 0,22 | 0,330 |
| T01.03 | 30 | 0,87 | 0,104 |
| T01.04 | 30 | 0,99 | 0,119 |
| T01.05 | 30 | 0,26 | 0,390 |
| T01.06 | 30 | 1,2 | 0,144 |
| T01.07 | 30 | 0,33 | 0,495 |
| T01.08 | 30 | 1,46 | 0,292 |
| T01.09 | 30 | 1,73 | 0,346 |
| T01.10 | 30 | 2,07 | 0,414 |
| T01.11 | 30 | 0,27 | 0,054 |
| T01.12 | 30 | 1,26 | 0,252 |
| T01.13 | 30 | 0,72 | 0,144 |
| T01.14 | 30 | 0,89 | 0,178 |
| T01.15 | 30 | 0,21 | 0,042 |
| T01.16 | 30 | 1,05 | 0,21 |
| T01.17 | 30 | 0,76 | 0,15 |
| T01.18 | 30 | 0,33 | 0,07 |
| T01.19 | 30 | 0,44 | 0,09 |
| T01.20 | 30 | 0,99 | 0,198 |
Дифференциация полученных из МКПК макрофагов
M1 и M2 макрофаги получали из МКПК с использованием приведенного ниже протокола.
1. 20 мл смеси крови с PBS (1:1) наслаивают на 10 мл Ficoll-Paque™ Plus (GE Healthcare, каталожный № 17-1440-02)
2. Центрифугируют при 400xg в течение 35 мин (ускорение 2, тормоз 0)
3. Выделяют МКПК и промывают средой RPMI-1640 (WelGene, каталожный № LB011-01) при 2000 об/мин в течение 5 мин x 2 раза
4. Подсчитывают клетки
5. MACs буфер (2% ЭБС (Millipore, каталожный № TMS-013-BKR) в PBS (WelGene, каталожный № LB004-02) 1~2 мл суспензии
6. Добавляют CD14-микрогранулы (20 мкл/107 клеток) (Miltenyi Biotec, каталожный № 130-050-201)
7. Инкубируют в течение 30 мин на льду
8. Промывают MACs буфером при 2000 об/мин в течение 5 мин x 2 раза
9. Подсчитывают клетки
10. Наносят клетки на колонку MACs (Miltenyi Biotec, каталожный № 130-042-401)
11. Проводят положительную селекцию и подсчитывают клетки
12. Суспендируют в среде для культивирования (RPMI-1640+10% ЭБС+пенициллин/стрептомицин (Gibco, каталожный № 15140-122) + Glutamax (Gibco, каталожный № 35050-061) + 20~40 нг/мл rhM-CSF (Biolegend, каталожный № 574806)
13. Высевают CD14+ клетки в 100-мм культуральную чашку (1×106 клеток/10 мл/чашку) (Thermo Scientific, каталожный № 150466)
14. Затем каждые 3 дня заменяют среду для культивирования
15. Через 7~10 дней проверяют дифференциацию M0 макрофагов методом FACS
16. Проводят дифференциацию M0 в M1 или M2 макрофаги при помощи ЛПС 20 нг/мл (Sigma-Aldrich, каталожный № L4391) + rhIFNγ 20 нг/мл (Biolegend, каталожный № 570204) (M1) и rhIL4 20 нг/мл (Biolegend, каталожный № 574002) + rhIL13 20 нг/мл (Biolegend, каталожный № 571102) (M2) в среде для культивирования (RPMI-1640 +10% ЭБС+пенициллин/стрептомицин+Glutamax) в течение 2 дней
17. После дифференциации в M1 или M2 проверяют фенотип клеток методом FACS
18. Для превращения M2 в M1 макрофаги добавляют антитела 20 мкг/мл или ЛПС 20 нг/мл+rhIFNγ 20 нг/мл (положительный контроль) в свежей среде для культивирования (RPMI-1640 +10% ЭБС+пенициллин/стрептомицин+Glutamax) на 2 дня
19. После превращения M2 в M1 макрофаги проверяют фенотип клеток методом FACS и проверяют содержание цитокинов/хемокинов в культуральном супернатанте с использованием LEGENDplex™ (Biolegend, каталожный № 740502).
FACS-анализ
Для FACS-анализа использовали следующие антитела:
- hCD14-BV650 (BD Bioscience, каталожный № 563419)
- hCD14-BV421 (BD Bioscience, каталожный № 565283)
- hIFNγ-PE/Cy7 (BD Bioscience, каталожный № 557844)
- hCD3-BV510 (BD Bioscience, каталожный № 563109)
- hCD8-V450 (BD Bioscience, каталожный № 560347)
- hCD68-PE (Biolegend, каталожный № 333808)
- hCD93-PE (Biolegend, каталожный № 336108)
- HLA-DR-BV421 (Biolegend, каталожный № 307636)
- hCD45-PE (Biolegend, каталожный № 304008)
- hCD64-APC (Biolegend, каталожный № 305014)
- hCD163-APC/Cy7 (Biolegend, каталожный № 333622)
- hCD86-PerCP/Cy5,5 (Biolegend, каталожный № 305420)
- hCD86-BV421 (BD Bioscience, каталожный № 562432)
Пример 1: Экспрессия VSIG4 в макрофагах
VSIG4 экспрессируется в M2 макрофагах. На Фигурах 3A и 3B показаны данные корреляции экспрессии VSIG4 (измеренной на основании мРНК) с экспрессией различных генов, связанных с макрофагами 2 типа (M2) и опухоль-ассоциированными макрофагами. Как показано на Фигуре 3A, экспрессия VSIG4 отрицательно коррелирует с экспрессией [CXCL11, CXCL13, ZNMB, IFNAR1, IFNAR2], но при этом она положительно коррелирует с экспрессией CCL19, IRF5 и IL1A. На Фигуре 3B показано, что экспрессия VSIG 4 положительно коррелирует с экспрессией CD163, CSF1R, MSR1, TGFBR2, STAT6, IL1R1, IL10RA, MS4A4A, CCL2, CCL14, CCL17 и MS4A6A.
На Фигуре 5 показана экспрессия VSIG4 в M2 макрофагах. Две панели в верхнем ряду на Фигуре 5 представляют полученные при помощи светового микроскопа изображения морфологии M1 и M2 макрофагов. Во втором и третьем ряду приведены данные проточной цитометрии для лимфоцитов, окрашенных на CD14 и VSIG4, показывающие, что M2 клетки (положительно окрашенные на CD14) также экспрессируют VSIG4.
Пример 2: Человеческое анти-VSIG4 антитело индуцирует секрецию цитокинов и хемокинов в M2 макрофагах
M1 и M2 макрофаги обрабатывали антителом EU103.2 и измеряли секрецию провоспалительных цитокинов и хемокинов. Как показано на Фигуре 6, обработка M2 макрофагов EU103.2 приводила к индукции цитокинов и хемокинов IL12, IFNγ, IL10 и IL23.
Пример 3: Гуманизированное анти-VSIG4 антитело превращает M2 макрофаги в M1 макрофаги
Для дальнейшего тестирования эффектов EU103.2 на макрофаги M2 макрофаги обрабатывали антителом EU103.2 и окрашивали на маркер M2 макрофагов CD163. Как показано на Фигуре 7, обработка EU103.2 приводила к уменьшению экспрессии маркера M2 макрофагов CD163 в M2 макрофагах, это указывало на то, что блокирование VSIG4 при помощи EU103.2 приводило к превращению M2 макрофагов в клетки другого типа.
Затем тестировали влияние антитела EU103.2 на взаимодействие макрофаг-T-клетка путем совместной инкубации M2 макрофагов с CD8+ T-клетками с добавлением, или без добавления, обработки антителом EU103.2. Как показано на Фигуре 8, обработанные EU103.2 M2 макрофаги при совместной инкубации с CD8+ T-клетками вызывали пролиферацию CD8+ T-клеток, это указывало на то, что M2 макрофаги превращаются в M1 макрофаги при обработке антителом EU103.2, поскольку M1 макрофаги индуцируют пролиферацию CD8+ T-клеток, в то время как M2 макрофаги подавляют пролиферацию CD8+ T-клеток.
Затем, для дальнейшего изучения влияния антитела EU103.2 на человеческие макрофаги в контексте биологии рака собирали образцы абдоминальной жидкости от пациентов с раком яичника и сначала анализировали на экспрессию VSIG4. Как показано на Фигуре 9, макрофаги, полученные из абдоминальной жидкости пациентов с раком яичника, содержали M2 макрофаги, которые совместно экспрессировали VSIG4 и CD14, и, как показано на Фигурах 10 и 11, индуцировали пролиферацию CD8+ T-клеток.
Затем полученные с помощью микроскопа изображения подтвердили, что обработка антителом EU103.2 превращала M2 макрофаги в M1 макрофаги, как показано на Фигуре 12.
Роль сигнализации VSIG4 в пролиферации CD8+ T-клеток, вызываемой макрофагами, была дополнительно подтверждена путем совместного культивирования клеток HeLa, экспрессирующих VSIG4, с МКПК, с добавлением или без добавления анти-VSIG4 антитела для блокирования VSIG4, как показано на Фигуре 13. Этот эксперимент показал, что блокирование взаимодействия между VSIG4 и CD8+ T-клетками ведет к увеличению пролиферации CD8+ T-клеток.
Для дальнейшего изучения роли VSIG4 применительно к CD8+ T-клеткам моноцитарные клетки THP-1 совместно инкубировали в разных соотношениях с T-клетками, в присутствии либо анти-VSIG4 антитела, либо контрольного IgG антитела, и было показано, что анти-VSIG4 антитело было способно увеличивать количество CD8+ T-клеток в 4 делениях, в отличие от контрольного IgG.
Пример 4: Противоопухолевые эффекты блокирования сигнализации VSIG4 при помощи анти-VSIG4 антитела, или мышиная модель с нокаутом VSIG4
Для определения противоопухолевых эффектов анти-VSIG4 антитела были использованы три мышиных опухолевых модели: мышиная опухолевая модель MC38 аденокарциномы толстой кишки, мышиная опухолевая модель B16F10 меланомы и мышиная опухолевая модель 3LL карциномы легкого с использованием мышей с нокаутом VSIG4, и проведено сравнение с мышами дикого типа, как показано на Фигурах 15A, 15B и 15C, соответственно. Рост опухолей был подавлен, особенно в случае мышиных опухолевых моделей MC38 и 3LL, у мышей с нокаутом VSIG4 в сравнении с мышами дикого типа (смотри Фигуры 15A и 15C, соответственно), это подтверждало, что рост опухолей подавляется в отсутствие сигнализации VSIG4.
Аналогичное подавление роста опухолей наблюдали в мышиной опухолевой модели MC38 на мышах дикого типа, которым вводили инъекцией анти-VSIG4 антитело, в сравнении с мышами, которым инъецировали контрольное IgG, как показано на Фигуре 16. Степень подавления роста опухоли анти-VSIG4 антителом была по меньшей мере такой же, если не более выраженной, как у мышей с нокаутом VSIG4.
Затем изучали статус активации лимфоцитов из дренирующих опухоль лимфатических узлов у мышей с нокаутом VSIG4 и сравнивали с мышами дикого типа. Как показано на Фигурах 17A и 17B, сопоставимые уровни CD4+ и CD8+ лимфоцитов наблюдали у мышей с нокаутом VSIG4 в сравнении с мышами дикого типа, и сопоставимую экспрессию CD62L наблюдали в этих лимфоцитах, экспрессирующих CD4 и CD8, у мышей с нокаутом VSIG4 и мышей дикого типа. Кроме того, мыши с нокаутом VSIG4 имели повышенное содержание CD8β+ T-клеток в сравнении с мышами дикого типа, как показано на Фигуре 17C, но сопоставимые уровни CD11β+/Gr-1-лимфоцитов, как показано на Фигуре 17D.
Для дальнейшей оценки роли сигнализации VSIG4 в росте опухоли использовали мышиную опухолевую модель CD38 аденокарциномы толстой кишки как на мышах с нокаутом VSIG4, так и на мышах дикого типа, при этом химиотерапевтическое средство клафоран (CTX) вводили внутрибрюшинной инъекцией в дни 18 и 23 после инъекции опухолевых клеток мышам, как показано в верхней части схематического изображения на Фигуре 18A. Инъекция клафорана приводила к большему уменьшению объема опухолей у мышей с нокаутом VSIG4 в сравнении с мышами дикого типа, и это уменьшение объема опухоли сохранялось в течение 40 дней после инъекции опухолевых клеток. Напротив, у мышей дикого типа инъекция CTX приводила к незначительному уменьшению объема опухолей, с последующим постоянным увеличением размера опухолей, как показано на Фигуре 18A. Изображения мышей и микрофотографии срезов опухолей как у мышей с нокаутом VSIG4, так и у мышей дикого типа, в день 24 после инъекции опухолевых клеток представлены на Фигуре 18B. Срезы опухолей получали для мышей VSIG4+/+ и VSIG4-/- C57BL/6 в день 24, и парафиновые срезы опухолевых тканей окрашивали H&E.
Эффекты анти-VSIG4 на подавление опухолей в гуманизированной мышиной модели оценивали путем инъекции 10 мг/кг анти-VSIG4 антитела в дни 19, 22, 25, 28 и 31 после инъекции раковых клеток HT29 гуманизированным мышам, как показано на Фигуре 19. Значительное подавление роста опухоли наблюдали у мышей, которые получали анти-VSIG4 антитело, в сравнении с теми, которые получали инъекцию контрольного IgG.
Эти эксперименты продемонстрировали, как схематически показано на Фигуре 20, что сигнализация VSIG4 модулирует супрессию пролиферации T-клеток M2 макрофагами, и что блокирование сигнализации VSIG4 приводит к (1) устранению подавления пролиферации T-клеток, индуцированного M2 макрофагами, что ведет к пролиферации CD8+ T-клеток и подавлению опухоли; и (2) превращению M2 макрофагов в M1 макрофаги.
Пример 5: Оценка антител A1, A2, A1.3 и A2.3
Клоны антител A1, A2, A1.3 и A2.3 были получены путем созревания аффинности антител EU103.2. Белковые профили, полученные методом эксклюзионной ВЭЖХ, представлены на Фигурах 22, 23, 24 и 25, соответственно, и сводные результаты приведены в Таблице 4.
ТАБЛИЦА 4: Данные эксклюзионной ВЭЖХ для антител A1, A2, A1.3 и A2.3
| Ат | Время | Площадь | Высота | Ширина | % Площади | Log (ММ) | ММ |
| A1 | 7,551 | 8,57E+02 | 29,91175 | 0,4484 | 100,000 | 2,135 | 136,605 |
| A2 | 7,567 | 2,62E+02 | 8,96929 | 0,4567 | 100,000 | 2,128 | 134,380 |
| A1.3 | 7,525 | 2,02E+03 | 106,8666 | 0,2842 | 100,000 | 2,134 | 136,081 |
| A2.3 | 7,542 | 6,61E+02 | 34,47963 | 0,2898 | 100,000 | 2,126 | 133,730 |
Как показано на Фигурах 26A и 26B, антитела A1 или A2 были использованы для обработки дифференцированных M2 макрофагов в течение 2 дней, и FACS-анализ показал уменьшение содержания CD163, маркера M2 макрофагов, и значительное увеличение содержания CD86, маркера M1 макрофагов. Обработку ЛПС/IFNγ в течение двух дней использовали в качестве положительного контроля. Обработка обоими антителами, A1 и A2, приводила к увеличению соотношения M1/M2. В частности, антитело A2 приводило к увеличению соотношения, близкому к тому, которое имело место в группе положительного контроля.
Затем, как показано на Фигуре 27, антитела A1 или A2 были использованы для обработки дифференцированных M2 макрофагов в течение 2 дней для изменения их поляризации в M1 макрофаги, и изменение продуцирования цитокинов и хемокинов в среде для культивирования определяли с использованием LEGENDplex™. Целью являлось подтверждение изменения поляризации M2 макрофагов в M1 макрофаги. Обработку ЛПС/IFNγ в течение двух дней использовали в качестве положительного контроля. В обеих группах, A1 и A2, наблюдали увеличение продуцирования цитокинов/хемокинов M1-типа (TNFα, IL6, IFNγ, IP-10 и IL12 p40) в сравнении с M2 макрофагами, в то время как продуцирование цитокинов/хемокинов M2-типа (IL-10, аргиназа, TARC и IL-1RA) уменьшалось. В частности, увеличение продуцирования TNFα и IL6 было сопоставимо с результатами в группе положительного контроля.
Кроме того, как показано на Фигуре 28, антитела A1 или A2 были использованы для обработки дифференцированных M2 макрофагов в течение 2 дней, и был проведен FACS-анализ для демонстрации уменьшения экспрессии CD163, маркера M2 макрофагов, и значительного увеличения экспрессии CD86, маркера M1 макрофагов. Обработку ЛПС/IFNγ в течение двух дней использовали в качестве положительного контроля.
Для дальнейшего подтверждения изменения поляризации M2 макрофагов в M1 макрофаги за счет антител A1 и A2, антитела A1 или A2 были использованы в разных концентрациях (5, 10 и 20 мкг/мл) для обработки дифференцированных M2 макрофагов в течение 2 дней, и было оценено продуцирование макрофагами цитокинов и хемокинов, как показано на Фигуре 29. Изменение продуцирования цитокинов/хемокинов в среде для культивирования определяли с использованием LEGENDplex™. Обработку ЛПС/IFNγ в течение двух дней использовали в качестве положительного контроля. В обеих группах, A1 и A2, наблюдали увеличение продуцирования TNFα, IL6 и IP-10, которые связаны с M1 макрофагами, и эта тенденция была особенно выражена, когда M2 макрофаги были обработаны антителом A2. Продуцирование аргиназы, которая связана с M2 макрофагами, уменьшалось независимо от концентрации антител.
Способность макрофагов к хемотаксису после превращения M2 макрофагов в M1 макрофаги за счет антитела A2 оценивали в анализе хемотаксиса. Используя 24-луночную камеру Transwell с размером пор 5 мкм (Corning, каталожный № CLS3421-48EA), в нижнюю камеру добавляли хемоаттрактант rhCCL19 (Biolegend, каталожный № 582104), который представляет собой хемокин M1-типа, в концентрации 100 нг/мл (объем 400 мкл), и в верхнюю камеру добавляли изменившие поляризацию M1 макрофаги в количестве 1,5~5×105 клеток/600 мкл, где применяли M2 или A2 в течение 2 дней. (Обработку ЛПС/IFNγ в течение двух дней использовали в качестве положительного контроля). После 4-часового периода инкубации при 37°C в атмосфере 5% CO2 100 мкл клеток из нижней камеры переносили в 96-луночный планшет. Затем в каждую лунку добавляли 10 мкл раствора CCK-8 (Dojindo, каталожный № CK04) и после инкубации в течение 1 часа измеряли поглощение (450 нм). Как показано на Фигуре 30, M1 макрофаги из группы A2 продемонстрировали способность к хемотаксису, что подтверждало превращение M2 в M1 макрофаги в результате воздействия антитела A2.
Проводили анализ с генной матрицей для определения изменений в генной экспрессии после превращения M2 макрофагов в M1 макрофаги за счет антител A2, как показано на Фигуре 42. M2 макрофаги обрабатывали антителами A2 и собирали клетки через два дня. (Macrogen, Agilent Human GE 8×60K V3). Анализ показал увеличение экспрессии маркера фенотипа M1 и цитокинов/хемокинов M1-типа, аналогично клеткам, обработанным ЛПС/IFNγ в качестве положительного контроля, и уменьшение экспрессии маркера фенотипа M2 и цитокинов/хемокинов M2-типа.
Пример 6: Противоопухолевые эффекты антител A1, A2, A1.3 и A2.3
Противоопухолевый эффект антител A1 и A2 оценивали с использованием гуманизированной мышиной модели. Человеческие CD34 клетки вводили инъекцией мышам NBSGW, после чего собирали образцы крови и количественно определяли человеческие CD45 клетки в МКПК для анализа гуманизации мышей в течение периода времени 12~14 недель. Клетки HCT-15 рака толстого кишечника вводили инъекцией в количестве 1×107 клеток/мышь гуманизированным мышам, и через 5 дней мышей распределяли в три группы, в каждой из которых животные получали инъекции hIgG (Sigma-Aldrich, каталожный № I4506), антитела A1 или антитела A2. Антитела вводили инъекцией каждые три дня, всего 5 инъекций, как схематически показано на Фигуре 31A. Измеряли объем опухолей и после умерщвления мышей использовали сыворотку крови для измерения IFNγ методом ELISA (Invitrogen, каталожный № 88-7316-88), а также использовали опухолевые образцы для анализа инфильтрированных лейкоцитов.
Как показано на Фигурах 31B и 31C, противоопухолевый эффект отсутствовал в случае антител A1, но в группе антител A2 наблюдали уменьшение размера опухолей и увеличение продуцирования IFNγ, что подтверждало противоопухолевый эффект антител A2.
Затем эффект превращения M2 макрофагов в M1 макрофаги за счет антитела A2 в контексте опухолевого роста оценивали in vivo. Как схематически изображено на Фигуре 32A, клетки SW480 рака толстого кишечника вводили инъекцией мышам (1×107 клеток/мышь), и после вырастания опухолей до определенного размера (~1000 мм3) вводили инъекцией дифференцированные M2 макрофаги (7×105 клеток/мышь) с hIgG или антителом A2. Антитела вводили инъекцией каждые 2 дня, всего 5 инъекцией, после первой инъекции образцы крови собирали в дни 4, 7 и 11 после инъекции опухолевых клеток, и образцы крови использовали для выделения сыворотки или МКПК для анализа изменения фенотипа макрофагов методом FACS.
В день 7 после инъекции опухолевых клеток наблюдали изменение фенотипа M1 макрофагов в группе антител A2, как показано на Фигуре 32B. При том, что отсутствовали изменения в CD163, маркере M2 макрофагов, экспрессия CD86 и HLA-DR, маркеров M1 макрофагов, была заметно увеличена в сравнении с группой hIgG, что подтверждает превращение M2 в M1 макрофаги в результате воздействия антитела A2, как показано на Фигуре 32C.
Затем был проведен анализ влияния превращения M2 в M1 макрофаги на опухолевый рост.
Как схематически показано на Фигуре 33A, смесь клеток HCT-15 рака толстого кишечника (8×106 клеток/мышь) и разные количества M2 макрофагов (2,5×105/5×105/1×106 клеток/мышь) вводили инъекцией мышам. Через 2 дня вводили инъекцией hIgG или антитело A2 каждые 3 дня, всего 5 инъекций.
Как показано на Фигуре 33B, антитело A2 уменьшало или замедляло рост опухоли зависимым от дозы образом в день 14 после инъекции опухолевых клеток в сравнении с контрольными мышами, получавшими hIgG, и этот эффект сохранялся в день 25 после инъекции опухолевых клеток.
Затем противоопухолевые эффекты антитела A2 в гуманизированной мышиной модели оценивали с использованием разных мышиных опухолевых моделей. Как схематически показано на Фигуре 34A, человеческие CD34 клетки вводили инъекцией мышам NBSGW, после чего собирали образцы крови и количественно определяли человеческие CD45 клетки в МКПК для анализа гуманизации мышей в течение периода времени 12~14 недель. Клетки SW480 рака толстого кишечника (1×107 клеток/мышь) вводили инъекцией мышам, и через 5 дней мышей распределяли в две группы, в каждой из которых животные получали инъекцию hIgG или антитела A2 (20 мг/кг). Антитела вводили инъекцией каждые 3 дня, всего 5 инъекций в каждой группе. Измеряли объем опухолей, и после умерщвления мышей использовали сыворотку крови для измерения IFNγ методом ELISA, а также использовали опухолевые образцы для анализа инфильтрированных лейкоцитов.
Противоопухолевый эффект отсутствовал в случае антител A1, однако, как показано на Фигурах 34B и 34C, в группе антитела A2 наблюдали уменьшение размера опухолей и увеличение продуцирования IFNγ, что дополнительно подтверждало противоопухолевый эффект антитела A2.
В целом, в группе животных, получавших инъекцию антитела A2, наблюдали меньший размер опухолей и увеличенное содержание IFNγ в сыворотке. Кроме того, как показано на Фигуре 34D, наблюдали увеличение содержания CD8+ T-клеток, в частности, секретирующих IFNγ CD8γ T-клеток. Как показано на Фигуре 34E, имело место уменьшение экспрессии CD93 и CD163 (маркеров M2 макрофагов) и увеличение экспрессии CD86 (маркера M1 макрофагов), при этом отсутствовало изменение в HLA-DR. Эти данные подтверждают, что антитело A2 опосредует цитотоксическую активность CD8+ T-клеток.
Затем сравнивали противоопухолевый эффект антител A2 и A2.3 в гуманизированной мышиной модели. Как схематически показано на Фигуре 35A, человеческие CD34 клетки вводили инъекцией мышам NBSGW, после чего собирали образцы крови и количественно определяли человеческие CD45 клетки в МКПК для анализа гуманизации мышей в течение периода времени 12~14 недель. Клетки HCT-15 рака толстого кишечника вводили инъекцией в количестве 1×107 клеток/мышь гуманизированным мышам, и после вырастания опухолей до определенного размера (~1000 мм3) мышей распределяли в три группы, в каждой из которых животные получали инъекции антител hIgG, A2 или A2.3 (20 мг/кг). Антитела вводили инъекцией каждые три дня, всего 5 инъекций. Измеряли объем опухолей, после первой инъекции образцы крови собирали в Д5 и Д13, и в сыворотке крови определяли воспалительные цитокины. Как показано на Фигуре 35B, оба антитела, A2 и A2.3, приводили к уменьшению размера опухолей.
Затем четыре анти-VSIG4 антитела, A1, A1.3, A2 и A2.3, оценивали в отношении их влияния на пролиферацию CD8+ T-клеток. Антитела A1, A1.3, A2 и A2.3 добавляли к макрофагам, полученным от донора, для превращения M2 макрофагов в M1 макрофаги, и проводили совместное культивирование с CD8+ T-клетками, выделенными из МКПК от того же донора, в анализе совместного культивирования. CD8+ T-клетки метили CFSE (Life technologies, каталожный № V12883) и совместно культивировали в покрытом анти-CD3 96-луночном планшете (BD Biocoat, каталожный № 354725) в соотношении 2:1 с макрофагами после превращения (CD8 T : макрофаг=2×105 клеток/лунку : 1×105 клеток/лунку). Через 5 дней собранные клетки окрашивали hCD8-V450 и анализировали методом FACS. Пролиферация CD8+ T-клеток была подтверждена фактом уменьшения уровней CFSE. При том, что M2 макрофаги отрицательно регулировали пролиферацию CD8+ T-клеток, совместное культивирование с антителами A1, A1.3, A2 и A2.3 приводило к превращению M2 макрофагов в M1 макрофаги и также приводило к увеличению пролиферации CD8+ T-клеток, как показано на Фигурах 36A и 36B.
Аналогичные эксперименты со сравнением эффектов антитела A2 и антител A2.3 проводили с использованием макрофагов и T-клеток, полученных от иных доноров, чем в описанном выше эксперименте (то есть, иных доноров, чем те, результаты для которых приведены на Фигуре 36). Антитела A2 и A2.3 добавляли к макрофагам для превращения M2 макрофагов в M1 макрофаги, и CD8+ T-клетки, выделенные из МКПК от того же донора использовали в анализе совместного культивирования. CD8 T-клетки метили CFSE (Life technologies, каталожный № V12883), и проводили совместное культивирование в покрытом анти-CD3 96-луночном планшете (BD Biocoat, каталожный № 354725) в соотношении 1:1 или 2:1 с макрофагами после превращения (CD8+ T : макрофаг=2×105 клеток/лунку : 2×105 клеток/лунку или 2×105 клеток/лунку : 1×105 клеток/лунку). Через 5 дней собранные клетки окрашивали hCD8-V450 и анализировали методом FACS. Пролиферация CD8+ T-клеток была подтверждена фактом уменьшения уровней CFSE. При том, что M2 макрофаги отрицательно регулировали пролиферацию CD8+ T-клеток, добавление антител A2 и A2.3 для превращения M2 макрофагов в M1 макрофаги приводило к увеличению пролиферации CD8+ T-клеток.
Затем использовали экспрессирующие hVSIG4 клетки HeLa (клетки HeLa-hVSIG4) для подтверждения влияния сигнализации VSIG4 на опосредованную антителом A2 и антителом A2.3 индукцию пролиферации CD8+ T-клеток.
CD8+ T-клетки выделяли из МКПК от здорового донора, метили CFSE и добавляли в покрытый анти-CD3 планшет (2×105 клеток/лунку). Через 1 день клетки HeLa или HeLa-hVSIG4 добавляли в лунки после облучения 30 Гр (рентгеновское излучение) (1×105 или 0,5×105 клеток/лунку). Через 5 дней пролиферацию CD8+ T-клеток анализировали путем измерения уровней CFSE методом FACS. CD8+ T-клетки также обрабатывали анти-CD3 (Miltenyi Biotech, каталожный № 130-093-387) в разных концентрациях, и через 1 день клетки HeLa или HeLa-hVSIG4 добавляли лунки после облучения 30 Гр (рентгеновское излучение) - (1×105 клеток/лунку). Через 5 дней 100 мкл культивируемых клеток переносили в отдельный 96-луночный планшет и в каждую лунку добавляли CCK-8 (10 мкл/лунку). Через 5 часов измеряли поглощение при 450 нм, подтверждая пролиферацию CD8+ T-клеток. Как показано на Фигурах 38A и 38B, HeLa-hVSIG4 отрицательно регулировали пролиферацию CD8+ T-клеток, при этом обработка A2 или A2.3 индуцировали пролиферацию T-клеток.
Панель с человеческой фосфокиназой использовали для изучения сигнального пути, посредством которого происходит изменение поляризации макрофагов под воздействием антитела A2. Как показано на Фигуре 39, превращение M2 макрофагов в M1 макрофаги за счет обработки антителом A2 приводило к значительному увеличению фосфорилирования JNK, MSK1/2 и p38a, при измерении с использованием панелей антител Proteome Profiler™ (R&D Systems, каталожный № ARY003B).
ИНФОРМАЦИЯ О ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЯХ АНТИТЕЛ И АФФИННОСТИ СВЯЗЫВАНИЯ
Информация о последовательностях антител и аффинности связывания для различных анти-VSIG4 антител, описанных в настоящем документе, приведена в Таблицах 5-12, ниже.
ТАБЛИЦА 5: Последовательности VH и VL антитела EU103.2
| Название Ат | Последовательность |
| EU103.2_VH (аминокислотная) | QVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCSFSGISLTTSGMGVGWIRQPPGKGLEWLADIFWDDNKYYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCVRVYYKNDGYFDVWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 2) |
| EU103.2_VL (аминокислотная) | EIVMTQSPATLSVSPGERATLSCRASKSVTTSGYSFMHWYQQKPGQAPRLLIYLASNLEPGIPARFSGSGSGTEFTLTISSLQSEDFAVYYCQHSRELPYTFGQGTKLEIK (SEQ ID NO: 4) |
ТАБЛИЦА 6: Последовательности VH и VL антитела EU103.3
| Название Ат | Последовательность |
| EU103.3_VH (hu6H8.3_VH) (аминокислотная) |
QVTLKESGPTLVKPTQTLTLTCTFSGISLTTSGMGVGWIRQPPGKALEWLADIFWDDNKYYNPSLKSRLTITKDTSKNQVVLTMTNMDPVDTATYYCVRVYYKNDGYFDVWGKGTTVTVSS (SEQ ID NO: 6) |
| EU103.3_VL (hu6H8.3_VL) (аминокислотная) |
DIVLTQSPLSLPVTLGQPASISCRASKSVTTSGYSFMHWYQQRPGQSPRLLIYLASNLEPGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCQHSRELPYTFGQGTKLEIK (SEQ ID NO: 8) |
ТАБЛИЦА 7: Последовательности VH и VL антитела A1
| Название Ат | Последовательность |
| A1_VH (аминокислотная) | QVTLKESGPTLVKPTQTLTLTCTFSGISLTTSGMGVGWIRQPPGKALEWLADIFWDDNKYYNPSLKSRLTITKDTSKNQVVLTMTNMDPVDTATYYCVRVYYKNDGYFDVWGKGTTVTVSS (SEQ ID NO: 6) |
| A1_VL (аминокислотная) | DIVLTQSPLSLPVTLGQPASISCRASKSVTTSGYSFMHWYQQRPGQSPRLLIYLASNLEPGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCQQSGELPYTFGQGTKLEIK (SEQ ID NO: 10) |
ТАБЛИЦА 8: Последовательности VH и VL антитела A2
| Название Ат | Последовательность |
| A2_VH (аминокислотная) | QVTLKESGPTLVKPTQTLTLTCTFSGISLTTSGMGVGWIRQPPGKALEWLADIFWDDNKYYNPSLKSRLTITKDTSKNQVVLTMTNMDPVDTATYYCVRVYYKNDGYFDVWGKGTTVTVSS (SEQ ID NO: 6) |
| A2_VL (аминокислотная) | DIVLTQSPLSLPVTLGQPASISCRASKSVTTSGYSFMHWYQQRPGQSPRLLIYLASNLEPGVPDRFSGSGSGTDFTLKIFRVEAEDVGVYYCQQSGELPYTFGQGTKLEIK (SEQ ID NO: 12) |
ТАБЛИЦА 9: Последовательности VH и VL антитела A1.3
| Название Ат | Последовательность |
| A1.3_VH (аминокислотная) | QVTLVESGPTLVKPGQTLTLTCTFSGISLTTSGMGVGWIRQPPGKALEWLADIFWDDNKYYNPSLKGRLTITKDTSKNQVYLTMTNMDPVDTATYYCVRVYYKNDGYFDVWGKGTTVTVSS (SEQ ID NO: 14) |
| A1.3_VL (аминокислотная) | DIVLTQSPLSLPVTLGQPASISCRASKSVTTSGYSFMHWYQQRPGQSPRLLIYLASNLEPGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCQQSGELPYTFGQGTKLEIK (SEQ ID NO: 10) |
ТАБЛИЦА 10: Последовательности VH и VL антитела A2.3
| Название Ат | Последовательность |
| A2.3_VH (аминокислотная) | QVTLVESGPTLVKPGQTLTLTCTFSGISLTTSGMGVGWIRQPPGKALEWLADIFWDDNKYYNPSLKGRLTITKDTSKNQVYLTMTNMDPVDTATYYCVRVYYKNDGYFDVWGKGTTVTVSS (SEQ ID NO: 16) |
| A2.3_VL (аминокислотная) | DIVLTQSPLSLPVTLGQPASISCRASKSVTTSGYSFMHWYQQRPGQSPRLLIYLASNLEPGVPDRFSGSGSGTDFTLKIFRVEAEDVGVYYCQQSGELPYTFGQGTKLEIK (SEQ ID NO: 12) |
ТАБЛИЦА 11: Последовательности CDR антител EU103.2, EU103.3, A1, A2, A1.3 и A2.3
| VH CDR1 | VH CDR2 | VH CDR3 | VL CDR1 | VL CDR2 | VL CDR3 | |
| EU103.2 | GISLTT (SEQ ID NO: 17) |
IFWDDNK (SEQ ID NO: 18) |
VRVYYKNDGYFDV (SEQ ID NO: 19) |
KSVTTS (SEQ ID NO: 20) |
LAS (SEQ ID NO: 21) |
QHSRELPYT (SEQ ID NO: 22) |
| EU103.3 | GISLTT (SEQ ID NO: 17) |
IFWDDNK (SEQ ID NO: 18) |
VRVYYKNDGYFDV (SEQ ID NO: 19) |
KSVTTS (SEQ ID NO: 20) |
LAS (SEQ ID NO: 21) |
QHSRELPYT (SEQ ID NO: 22) |
| A1 | GISLTT (SEQ ID NO: 17) |
IFWDDNK (SEQ ID NO: 18) |
VRVYYKNDGYFDV (SEQ ID NO: 19) |
KSVTTS (SEQ ID NO: 20) |
LAS (SEQ ID NO: 21) |
QQSGELPYT (SEQ ID NO: 23) |
| A2 | GISLTT (SEQ ID NO: 17) |
IFWDDNK (SEQ ID NO: 18) |
VRVYYKNDGYFDV (SEQ ID NO: 19) |
KSVTTS (SEQ ID NO: 20) |
LAS (SEQ ID NO: 21) |
QQSGELPYT (SEQ ID NO 23) |
| A1.3 | GISLTT (SEQ ID NO: 17) |
IFWDDNK (SEQ ID NO: 18) |
VRVYYKNDGYFDV (SEQ ID NO: 19) |
KSVTTS (SEQ ID NO: 20) |
LAS (SEQ ID NO: 21) |
QQSGELPYT (SEQ ID NO: 23) |
| A2.3 | GISLTT (SEQ ID NO: 17) |
IFWDDNK (SEQ ID NO: 18) |
VRVYYKNDGYFDV (SEQ ID NO: 19) |
KSVTTS (SEQ ID NO: 20) |
LAS (SEQ ID NO: 21) |
QQSGELPYT (SEQ ID NO: 23) |
ТАБЛИЦА 12: Аффинность связывания (KD) антител EU103.2, EU103.3, A1, A2, A1.3 и A2.3 для VSIG4
| Антитело | Ka (1/Мс) | Kd (1/с) | КD (М) |
| EU103.2 | 1,834E+5 | 0,01313 | 7,156E-8 |
| A1 | 3,779E+5 | 0,003283 | 8,688E-9 |
| A1.3 | 4,022E+5 | 0,003198 | 7,952E-9 |
| A2 | 3,604E+5 | 0,002964 | 8,226E-9 |
| A2.3 | 4,037E+5 | 0,003083 | 7,636E-9 |
ДРУГИЕ ВАРИАНТЫ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ
Следует понимать, что хотя изобретение предложено с его подробным описанием, вышеуказанное описание предназначено для иллюстрации, но не для ограничения объема изобретения, который определяется прилагаемой формулой изобретения. Другие аспекты, преимущества и модификации входят в объем следующей далее формулы изобретения.
--->
СПИСОК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
<110> ЮТАЙЛЕКС КО., ЛТД.
<120> АНТИТЕЛА ПРОТИВ VSIG4 ЧЕЛОВЕКА И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ
<130> 47683-0034WO1
<140> PCT/US2019/053824
<141> 2019-09-30
<150> 62/776,523
<151> 2018-12-07
<150> 62/738,255
<151> 2018-09-28
<160> 31
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<400> 1
000
<210> 2
<211> 121
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная
<220>
<223> синтетический полипептид
<400> 2
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ser Phe Ser Gly Ile Ser Leu Thr Thr Ser
20 25 30
Gly Met Gly Val Gly Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu
35 40 45
Trp Leu Ala Asp Ile Phe Trp Asp Asp Asn Lys Tyr Tyr Asn Pro Ser
50 55 60
Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe
65 70 75 80
Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr
85 90 95
Cys Val Arg Val Tyr Tyr Lys Asn Asp Gly Tyr Phe Asp Val Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 3
<400> 3
000
<210> 4
<211> 111
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная
<220>
<223> синтетический полипептид
<400> 4
Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Lys Ser Val Thr Thr Ser
20 25 30
Gly Tyr Ser Phe Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro
35 40 45
Arg Leu Leu Ile Tyr Leu Ala Ser Asn Leu Glu Pro Gly Ile Pro Ala
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser
65 70 75 80
Ser Leu Gln Ser Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln His Ser Arg
85 90 95
Glu Leu Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 5
<400> 5
000
<210> 6
<211> 121
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная
<220>
<223> синтетический полипептид
<400> 6
Gln Val Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Thr Leu Val Lys Pro Thr Gln
1 5 10 15
Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Phe Ser Gly Ile Ser Leu Thr Thr Ser
20 25 30
Gly Met Gly Val Gly Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Ala Leu Glu
35 40 45
Trp Leu Ala Asp Ile Phe Trp Asp Asp Asn Lys Tyr Tyr Asn Pro Ser
50 55 60
Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Thr Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val
65 70 75 80
Val Leu Thr Met Thr Asn Met Asp Pro Val Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr
85 90 95
Cys Val Arg Val Tyr Tyr Lys Asn Asp Gly Tyr Phe Asp Val Trp Gly
100 105 110
Lys Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 7
<400> 7
000
<210> 8
<211> 111
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная
<220>
<223> синтетический полипептид
<400> 8
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly
1 5 10 15
Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ala Ser Lys Ser Val Thr Thr Ser
20 25 30
Gly Tyr Ser Phe Met His Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ser Pro
35 40 45
Arg Leu Leu Ile Tyr Leu Ala Ser Asn Leu Glu Pro Gly Val Pro Asp
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser
65 70 75 80
Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Gln His Ser Arg
85 90 95
Glu Leu Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 9
<400> 9
000
<210> 10
<211> 111
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная
<220>
<223> синтетический полипептид
<400> 10
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly
1 5 10 15
Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ala Ser Lys Ser Val Thr Thr Ser
20 25 30
Gly Tyr Ser Phe Met His Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ser Pro
35 40 45
Arg Leu Leu Ile Tyr Leu Ala Ser Asn Leu Glu Pro Gly Val Pro Asp
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser
65 70 75 80
Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Gly
85 90 95
Glu Leu Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 11
<400> 11
000
<210> 12
<211> 111
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная
<220>
<223> синтетический полипептид
<400> 12
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly
1 5 10 15
Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ala Ser Lys Ser Val Thr Thr Ser
20 25 30
Gly Tyr Ser Phe Met His Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ser Pro
35 40 45
Arg Leu Leu Ile Tyr Leu Ala Ser Asn Leu Glu Pro Gly Val Pro Asp
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Phe
65 70 75 80
Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Gly
85 90 95
Glu Leu Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 13
<400> 13
000
<210> 14
<211> 121
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная
<220>
<223> синтетический полипептид
<400> 14
Gln Val Thr Leu Val Glu Ser Gly Pro Thr Leu Val Lys Pro Gly Gln
1 5 10 15
Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Phe Ser Gly Ile Ser Leu Thr Thr Ser
20 25 30
Gly Met Gly Val Gly Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Ala Leu Glu
35 40 45
Trp Leu Ala Asp Ile Phe Trp Asp Asp Asn Lys Tyr Tyr Asn Pro Ser
50 55 60
Leu Lys Gly Arg Leu Thr Ile Thr Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val
65 70 75 80
Tyr Leu Thr Met Thr Asn Met Asp Pro Val Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr
85 90 95
Cys Val Arg Val Tyr Tyr Lys Asn Asp Gly Tyr Phe Asp Val Trp Gly
100 105 110
Lys Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 15
<400> 15
000
<210> 16
<211> 121
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная
<220>
<223> синтетический полипептид
<400> 16
Gln Val Thr Leu Val Glu Ser Gly Pro Thr Leu Val Lys Pro Gly Gln
1 5 10 15
Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Phe Ser Gly Ile Ser Leu Thr Thr Ser
20 25 30
Gly Met Gly Val Gly Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Ala Leu Glu
35 40 45
Trp Leu Ala Asp Ile Phe Trp Asp Asp Asn Lys Tyr Tyr Asn Pro Ser
50 55 60
Leu Lys Gly Arg Leu Thr Ile Thr Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val
65 70 75 80
Tyr Leu Thr Met Thr Asn Met Asp Pro Val Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr
85 90 95
Cys Val Arg Val Tyr Tyr Lys Asn Asp Gly Tyr Phe Asp Val Trp Gly
100 105 110
Lys Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 17
<211> 6
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная
<220>
<223> синтетический полипептид
<400> 17
Gly Ile Ser Leu Thr Thr
1 5
<210> 18
<211> 7
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная
<220>
<223> синтетический полипептид
<400> 18
Ile Phe Trp Asp Asp Asn Lys
1 5
<210> 19
<211> 13
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная
<220>
<223> синтетический полипептид
<400> 19
Val Arg Val Tyr Tyr Lys Asn Asp Gly Tyr Phe Asp Val
1 5 10
<210> 20
<211> 6
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная
<220>
<223> синтетический полипептид
<400> 20
Lys Ser Val Thr Thr Ser
1 5
<210> 21
<211> 3
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная
<220>
<223> синтетический полипептид
<400> 21
Leu Ala Ser
1
<210> 22
<211> 9
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная
<220>
<223> синтетический полипептид
<400> 22
Gln His Ser Arg Glu Leu Pro Tyr Thr
1 5
<210> 23
<211> 9
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная
<220>
<223> синтетический полипептид
<400> 23
Gln Gln Ser Gly Glu Leu Pro Tyr Thr
1 5
<210> 24
<211> 399
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная
<220>
<223> синтетический полипептид
<400> 24
Met Gly Ile Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Gly His Leu Thr Val Asp
1 5 10 15
Thr Tyr Gly Arg Pro Ile Leu Glu Val Pro Glu Ser Val Thr Gly Pro
20 25 30
Trp Lys Gly Asp Val Asn Leu Pro Cys Thr Tyr Asp Pro Leu Gln Gly
35 40 45
Tyr Thr Gln Val Leu Val Lys Trp Leu Val Gln Arg Gly Ser Asp Pro
50 55 60
Val Thr Ile Phe Leu Arg Asp Ser Ser Gly Asp His Ile Gln Gln Ala
65 70 75 80
Lys Tyr Gln Gly Arg Leu His Val Ser His Lys Val Pro Gly Asp Val
85 90 95
Ser Leu Gln Leu Ser Thr Leu Glu Met Asp Asp Arg Ser His Tyr Thr
100 105 110
Cys Glu Val Thr Trp Gln Thr Pro Asp Gly Asn Gln Val Val Arg Asp
115 120 125
Lys Ile Thr Glu Leu Arg Val Gln Lys Leu Ser Val Ser Lys Pro Thr
130 135 140
Val Thr Thr Gly Ser Gly Tyr Gly Phe Thr Val Pro Gln Gly Met Arg
145 150 155 160
Ile Ser Leu Gln Cys Gln Ala Arg Gly Ser Pro Pro Ile Ser Tyr Ile
165 170 175
Trp Tyr Lys Gln Gln Thr Asn Asn Gln Glu Pro Ile Lys Val Ala Thr
180 185 190
Leu Ser Thr Leu Leu Phe Lys Pro Ala Val Ile Ala Asp Ser Gly Ser
195 200 205
Tyr Phe Cys Thr Ala Lys Gly Gln Val Gly Ser Glu Gln His Ser Asp
210 215 220
Ile Val Lys Phe Val Val Lys Asp Ser Ser Lys Leu Leu Lys Thr Lys
225 230 235 240
Thr Glu Ala Pro Thr Thr Met Thr Tyr Pro Leu Lys Ala Thr Ser Thr
245 250 255
Val Lys Gln Ser Trp Asp Trp Thr Thr Asp Met Asp Gly Tyr Leu Gly
260 265 270
Glu Thr Ser Ala Gly Pro Gly Lys Ser Leu Pro Val Phe Ala Ile Ile
275 280 285
Leu Ile Ile Ser Leu Cys Cys Met Val Val Phe Thr Met Ala Tyr Ile
290 295 300
Met Leu Cys Arg Lys Thr Ser Gln Gln Glu His Val Tyr Glu Ala Ala
305 310 315 320
Arg Ala His Ala Arg Glu Ala Asn Asp Ser Gly Glu Thr Met Arg Val
325 330 335
Ala Ile Phe Ala Ser Gly Cys Ser Ser Asp Glu Pro Thr Ser Gln Asn
340 345 350
Leu Gly Asn Asn Tyr Ser Asp Glu Pro Cys Ile Gly Gln Glu Tyr Gln
355 360 365
Ile Ile Ala Gln Ile Asn Gly Asn Tyr Ala Arg Leu Leu Asp Thr Val
370 375 380
Pro Leu Asp Tyr Glu Phe Leu Ala Thr Glu Gly Lys Ser Val Cys
385 390 395
<210> 25
<211> 287
<212> БЕЛОК
<213> Homo sapiens
<400> 25
Met Gly His Thr Arg Arg Gln Gly Thr Ser Pro Ser Lys Cys Pro Tyr
1 5 10 15
Leu Asn Phe Phe Gln Leu Leu Val Leu Ala Gly Leu Ser His Phe Cys
20 25 30
Ser Gly Val Ile His Val Thr Lys Glu Val Lys Glu Val Ala Thr Leu
35 40 45
Ser Cys Gly His Asn Val Ser Val Glu Glu Leu Ala Gln Thr Arg Ile
50 55 60
Tyr Trp Gln Lys Glu Lys Lys Met Val Leu Thr Met Met Ser Gly Asp
65 70 75 80
Met Asn Ile Trp Pro Glu Tyr Lys Asn Arg Thr Ile Phe Asp Ile Thr
85 90 95
Asn Asn Leu Ser Ile Val Ile Leu Ala Leu Arg Pro Ser Asp Glu Gly
100 105 110
Thr Tyr Glu Cys Val Val Leu Lys Tyr Glu Lys Asp Ala Phe Lys Arg
115 120 125
Glu His Leu Ala Glu Val Thr Leu Ser Val Lys Ala Asp Phe Pro Thr
130 135 140
Pro Ser Ile Ser Asp Phe Glu Ile Pro Thr Ser Asn Ile Arg Arg Ile
145 150 155 160
Ile Cys Ser Thr Ser Gly Gly Phe Pro Glu Pro His Leu Ser Trp Leu
165 170 175
Glu Asn Gly Glu Glu Leu Asn Ala Ile Asn Thr Thr Ser Gln Asp Pro
180 185 190
Glu Thr Glu Leu Tyr Ala Val Ser Ser Lys Leu Asp Phe Asn Met Thr
195 200 205
Thr Asn His Ser Phe Met Cys Leu Ile Lys Tyr Gly His Leu Arg Val
210 215 220
Asn Gln Thr Phe Asn Trp Asn Thr Thr Lys Gln Glu His Phe Pro Asp
225 230 235 240
Asn Leu Leu Pro Ser Trp Ala Ile Thr Leu Ile Ser Val Asn Gly Ile
245 250 255
Phe Val Ile Cys Cys Leu Thr Tyr Cys Phe Ala Pro Arg Cys Arg Glu
260 265 270
Arg Arg Arg Asn Glu Arg Leu Arg Arg Glu Ser Val Arg Pro Val
275 280 285
<210> 26
<211> 323
<212> БЕЛОК
<213> Homo sapiens
<400> 26
Met Gly Leu Ser Asn Ile Leu Phe Val Met Ala Phe Leu Leu Ser Gly
1 5 10 15
Ala Ala Pro Leu Lys Ile Gln Ala Tyr Phe Asn Glu Thr Ala Asp Leu
20 25 30
Pro Cys Gln Phe Ala Asn Ser Gln Asn Gln Ser Leu Ser Glu Leu Val
35 40 45
Val Phe Trp Gln Asp Gln Glu Asn Leu Val Leu Asn Glu Val Tyr Leu
50 55 60
Gly Lys Glu Lys Phe Asp Ser Val His Ser Lys Tyr Met Gly Arg Thr
65 70 75 80
Ser Phe Asp Ser Asp Ser Trp Thr Leu Arg Leu His Asn Leu Gln Ile
85 90 95
Lys Asp Lys Gly Leu Tyr Gln Cys Ile Ile His His Lys Lys Pro Thr
100 105 110
Gly Met Ile Arg Ile His Gln Met Asn Ser Glu Leu Ser Val Leu Ala
115 120 125
Asn Phe Ser Gln Pro Glu Ile Val Pro Ile Ser Asn Ile Thr Glu Asn
130 135 140
Val Tyr Ile Asn Leu Thr Cys Ser Ser Ile His Gly Tyr Pro Glu Pro
145 150 155 160
Lys Lys Met Ser Val Leu Leu Arg Thr Lys Asn Ser Thr Ile Glu Tyr
165 170 175
Asp Gly Ile Met Gln Lys Ser Gln Asp Asn Val Thr Glu Leu Tyr Asp
180 185 190
Val Ser Ile Ser Leu Ser Val Ser Phe Pro Asp Val Thr Ser Asn Met
195 200 205
Thr Ile Phe Cys Ile Leu Glu Thr Asp Lys Thr Arg Leu Leu Ser Ser
210 215 220
Pro Phe Ser Ile Glu Leu Glu Asp Pro Gln Pro Pro Pro Asp His Ile
225 230 235 240
Pro Trp Ile Thr Ala Val Leu Pro Thr Val Ile Ile Cys Val Met Val
245 250 255
Phe Cys Leu Ile Leu Trp Lys Trp Lys Lys Lys Lys Arg Pro Arg Asn
260 265 270
Ser Tyr Lys Cys Gly Thr Asn Thr Met Glu Arg Glu Glu Ser Glu Gln
275 280 285
Thr Lys Lys Arg Glu Lys Ile His Ile Pro Glu Arg Ser Asp Glu Ala
290 295 300
Gln Arg Val Phe Lys Ser Ser Lys Thr Ser Ser Cys Asp Lys Ser Asp
305 310 315 320
Thr Cys Phe
<210> 27
<211> 166
<212> БЕЛОК
<213> Homo sapiens
<400> 27
Met Ala Ser Leu Gly Gln Ile Leu Phe Trp Ser Ile Ile Ser Ile Ile
1 5 10 15
Ile Ile Leu Ala Gly Ala Ile Ala Leu Ile Ile Gly Phe Gly Ile Ser
20 25 30
Ala Phe Ser Met Pro Glu Val Asn Val Asp Tyr Asn Ala Ser Ser Glu
35 40 45
Thr Leu Arg Cys Glu Ala Pro Arg Trp Phe Pro Gln Pro Thr Val Val
50 55 60
Trp Ala Ser Gln Val Asp Gln Gly Ala Asn Phe Ser Glu Val Ser Asn
65 70 75 80
Thr Ser Phe Glu Leu Asn Ser Glu Asn Val Thr Met Lys Val Val Ser
85 90 95
Val Leu Tyr Asn Val Thr Ile Asn Asn Thr Tyr Ser Cys Met Ile Glu
100 105 110
Asn Asp Ile Ala Lys Ala Thr Gly Asp Ile Lys Val Thr Glu Ser Glu
115 120 125
Ile Lys Arg Arg Ser His Leu Gln Leu Leu Asn Ser Lys Ala Ser Leu
130 135 140
Cys Val Ser Ser Phe Phe Ala Ile Ser Trp Ala Leu Leu Pro Leu Ser
145 150 155 160
Pro Tyr Leu Met Leu Lys
165
<210> 28
<211> 273
<212> БЕЛОК
<213> Homo sapiens
<400> 28
Met Ile Phe Leu Leu Leu Met Leu Ser Leu Glu Leu Gln Leu His Gln
1 5 10 15
Ile Ala Ala Leu Phe Thr Val Thr Val Pro Lys Glu Leu Tyr Ile Ile
20 25 30
Glu His Gly Ser Asn Val Thr Leu Glu Cys Asn Phe Asp Thr Gly Ser
35 40 45
His Val Asn Leu Gly Ala Ile Thr Ala Ser Leu Gln Lys Val Glu Asn
50 55 60
Asp Thr Ser Pro His Arg Glu Arg Ala Thr Leu Leu Glu Glu Gln Leu
65 70 75 80
Pro Leu Gly Lys Ala Ser Phe His Ile Pro Gln Val Gln Val Arg Asp
85 90 95
Glu Gly Gln Tyr Gln Cys Ile Ile Ile Tyr Gly Val Ala Trp Asp Tyr
100 105 110
Lys Tyr Leu Thr Leu Lys Val Lys Ala Ser Tyr Arg Lys Ile Asn Thr
115 120 125
His Ile Leu Lys Val Pro Glu Thr Asp Glu Val Glu Leu Thr Cys Gln
130 135 140
Ala Thr Gly Tyr Pro Leu Ala Glu Val Ser Trp Pro Asn Val Ser Val
145 150 155 160
Pro Ala Asn Thr Ser His Ser Arg Thr Pro Glu Gly Leu Tyr Gln Val
165 170 175
Thr Ser Val Leu Arg Leu Lys Pro Pro Pro Gly Arg Asn Phe Ser Cys
180 185 190
Val Phe Trp Asn Thr His Val Arg Glu Leu Thr Leu Ala Ser Ile Asp
195 200 205
Leu Gln Ser Gln Met Glu Pro Arg Thr His Pro Thr Trp Leu Leu His
210 215 220
Ile Phe Ile Pro Ser Cys Ile Ile Ala Phe Ile Phe Ile Ala Thr Val
225 230 235 240
Ile Ala Leu Arg Lys Gln Leu Cys Gln Lys Leu Tyr Ser Ser Lys Asp
245 250 255
Thr Thr Lys Arg Pro Val Thr Thr Thr Lys Arg Glu Val Asn Ser Ala
260 265 270
Ile
<210> 29
<211> 290
<212> БЕЛОК
<213> Homo sapiens
<400> 29
Met Arg Ile Phe Ala Val Phe Ile Phe Met Thr Tyr Trp His Leu Leu
1 5 10 15
Asn Ala Phe Thr Val Thr Val Pro Lys Asp Leu Tyr Val Val Glu Tyr
20 25 30
Gly Ser Asn Met Thr Ile Glu Cys Lys Phe Pro Val Glu Lys Gln Leu
35 40 45
Asp Leu Ala Ala Leu Ile Val Tyr Trp Glu Met Glu Asp Lys Asn Ile
50 55 60
Ile Gln Phe Val His Gly Glu Glu Asp Leu Lys Val Gln His Ser Ser
65 70 75 80
Tyr Arg Gln Arg Ala Arg Leu Leu Lys Asp Gln Leu Ser Leu Gly Asn
85 90 95
Ala Ala Leu Gln Ile Thr Asp Val Lys Leu Gln Asp Ala Gly Val Tyr
100 105 110
Arg Cys Met Ile Ser Tyr Gly Gly Ala Asp Tyr Lys Arg Ile Thr Val
115 120 125
Lys Val Asn Ala Pro Tyr Asn Lys Ile Asn Gln Arg Ile Leu Val Val
130 135 140
Asp Pro Val Thr Ser Glu His Glu Leu Thr Cys Gln Ala Glu Gly Tyr
145 150 155 160
Pro Lys Ala Glu Val Ile Trp Thr Ser Ser Asp His Gln Val Leu Ser
165 170 175
Gly Lys Thr Thr Thr Thr Asn Ser Lys Arg Glu Glu Lys Leu Phe Asn
180 185 190
Val Thr Ser Thr Leu Arg Ile Asn Thr Thr Thr Asn Glu Ile Phe Tyr
195 200 205
Cys Thr Phe Arg Arg Leu Asp Pro Glu Glu Asn His Thr Ala Glu Leu
210 215 220
Val Ile Pro Glu Leu Pro Leu Ala His Pro Pro Asn Glu Arg Thr His
225 230 235 240
Leu Val Ile Leu Gly Ala Ile Leu Leu Cys Leu Gly Val Ala Leu Thr
245 250 255
Phe Ile Phe Arg Leu Arg Lys Gly Arg Met Met Asp Val Lys Lys Cys
260 265 270
Gly Ile Gln Asp Thr Asn Ser Lys Lys Gln Ser Asp Thr His Leu Glu
275 280 285
Glu Thr
290
<210> 30
<211> 534
<212> БЕЛОК
<213> Homo sapiens
<400> 30
Met Leu Arg Arg Arg Gly Ser Pro Gly Met Gly Val His Val Gly Ala
1 5 10 15
Ala Leu Gly Ala Leu Trp Phe Cys Leu Thr Gly Ala Leu Glu Val Gln
20 25 30
Val Pro Glu Asp Pro Val Val Ala Leu Val Gly Thr Asp Ala Thr Leu
35 40 45
Cys Cys Ser Phe Ser Pro Glu Pro Gly Phe Ser Leu Ala Gln Leu Asn
50 55 60
Leu Ile Trp Gln Leu Thr Asp Thr Lys Gln Leu Val His Ser Phe Ala
65 70 75 80
Glu Gly Gln Asp Gln Gly Ser Ala Tyr Ala Asn Arg Thr Ala Leu Phe
85 90 95
Pro Asp Leu Leu Ala Gln Gly Asn Ala Ser Leu Arg Leu Gln Arg Val
100 105 110
Arg Val Ala Asp Glu Gly Ser Phe Thr Cys Phe Val Ser Ile Arg Asp
115 120 125
Phe Gly Ser Ala Ala Val Ser Leu Gln Val Ala Ala Pro Tyr Ser Lys
130 135 140
Pro Ser Met Thr Leu Glu Pro Asn Lys Asp Leu Arg Pro Gly Asp Thr
145 150 155 160
Val Thr Ile Thr Cys Ser Ser Tyr Gln Gly Tyr Pro Glu Ala Glu Val
165 170 175
Phe Trp Gln Asp Gly Gln Gly Val Pro Leu Thr Gly Asn Val Thr Thr
180 185 190
Ser Gln Met Ala Asn Glu Gln Gly Leu Phe Asp Val His Ser Ile Leu
195 200 205
Arg Val Val Leu Gly Ala Asn Gly Thr Tyr Ser Cys Leu Val Arg Asn
210 215 220
Pro Val Leu Gln Gln Asp Ala His Ser Ser Val Thr Ile Thr Pro Gln
225 230 235 240
Arg Ser Pro Thr Gly Ala Val Glu Val Gln Val Pro Glu Asp Pro Val
245 250 255
Val Ala Leu Val Gly Thr Asp Ala Thr Leu Arg Cys Ser Phe Ser Pro
260 265 270
Glu Pro Gly Phe Ser Leu Ala Gln Leu Asn Leu Ile Trp Gln Leu Thr
275 280 285
Asp Thr Lys Gln Leu Val His Ser Phe Thr Glu Gly Arg Asp Gln Gly
290 295 300
Ser Ala Tyr Ala Asn Arg Thr Ala Leu Phe Pro Asp Leu Leu Ala Gln
305 310 315 320
Gly Asn Ala Ser Leu Arg Leu Gln Arg Val Arg Val Ala Asp Glu Gly
325 330 335
Ser Phe Thr Cys Phe Val Ser Ile Arg Asp Phe Gly Ser Ala Ala Val
340 345 350
Ser Leu Gln Val Ala Ala Pro Tyr Ser Lys Pro Ser Met Thr Leu Glu
355 360 365
Pro Asn Lys Asp Leu Arg Pro Gly Asp Thr Val Thr Ile Thr Cys Ser
370 375 380
Ser Tyr Arg Gly Tyr Pro Glu Ala Glu Val Phe Trp Gln Asp Gly Gln
385 390 395 400
Gly Val Pro Leu Thr Gly Asn Val Thr Thr Ser Gln Met Ala Asn Glu
405 410 415
Gln Gly Leu Phe Asp Val His Ser Val Leu Arg Val Val Leu Gly Ala
420 425 430
Asn Gly Thr Tyr Ser Cys Leu Val Arg Asn Pro Val Leu Gln Gln Asp
435 440 445
Ala His Gly Ser Val Thr Ile Thr Gly Gln Pro Met Thr Phe Pro Pro
450 455 460
Glu Ala Leu Trp Val Thr Val Gly Leu Ser Val Cys Leu Ile Ala Leu
465 470 475 480
Leu Val Ala Leu Ala Phe Val Cys Trp Arg Lys Ile Lys Gln Ser Cys
485 490 495
Glu Glu Glu Asn Ala Gly Ala Glu Asp Gln Asp Gly Glu Gly Glu Gly
500 505 510
Ser Lys Thr Ala Leu Gln Pro Leu Lys His Ser Asp Ser Lys Glu Asp
515 520 525
Asp Gly Gln Glu Ile Ala
530
<210> 31
<211> 302
<212> БЕЛОК
<213> Homo sapiens
<400> 31
Met Arg Leu Gly Ser Pro Gly Leu Leu Phe Leu Leu Phe Ser Ser Leu
1 5 10 15
Arg Ala Asp Thr Gln Glu Lys Glu Val Arg Ala Met Val Gly Ser Asp
20 25 30
Val Glu Leu Ser Cys Ala Cys Pro Glu Gly Ser Arg Phe Asp Leu Asn
35 40 45
Asp Val Tyr Val Tyr Trp Gln Thr Ser Glu Ser Lys Thr Val Val Thr
50 55 60
Tyr His Ile Pro Gln Asn Ser Ser Leu Glu Asn Val Asp Ser Arg Tyr
65 70 75 80
Arg Asn Arg Ala Leu Met Ser Pro Ala Gly Met Leu Arg Gly Asp Phe
85 90 95
Ser Leu Arg Leu Phe Asn Val Thr Pro Gln Asp Glu Gln Lys Phe His
100 105 110
Cys Leu Val Leu Ser Gln Ser Leu Gly Phe Gln Glu Val Leu Ser Val
115 120 125
Glu Val Thr Leu His Val Ala Ala Asn Phe Ser Val Pro Val Val Ser
130 135 140
Ala Pro His Ser Pro Ser Gln Asp Glu Leu Thr Phe Thr Cys Thr Ser
145 150 155 160
Ile Asn Gly Tyr Pro Arg Pro Asn Val Tyr Trp Ile Asn Lys Thr Asp
165 170 175
Asn Ser Leu Leu Asp Gln Ala Leu Gln Asn Asp Thr Val Phe Leu Asn
180 185 190
Met Arg Gly Leu Tyr Asp Val Val Ser Val Leu Arg Ile Ala Arg Thr
195 200 205
Pro Ser Val Asn Ile Gly Cys Cys Ile Glu Asn Val Leu Leu Gln Gln
210 215 220
Asn Leu Thr Val Gly Ser Gln Thr Gly Asn Asp Ile Gly Glu Arg Asp
225 230 235 240
Lys Ile Thr Glu Asn Pro Val Ser Thr Gly Glu Lys Asn Ala Ala Thr
245 250 255
Trp Ser Ile Leu Ala Val Leu Cys Leu Leu Val Val Val Ala Val Ala
260 265 270
Ile Gly Trp Val Cys Arg Asp Arg Cys Leu Gln His Ser Tyr Ala Gly
275 280 285
Ala Trp Ala Val Ser Pro Glu Thr Glu Leu Thr Gly His Val
290 295 300
<---
1. Выделенное гуманизированное анти-VSIG4 антитело, или его антигенсвязывающий фрагмент, содержащее:
a) CDR1 тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 17,
CDR2 тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 18,
CDR3 тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 19; и
b) CDR1 легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 20,
CDR2 легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 21, и
CDR3 легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 22 или SEQ ID NO: 23.
2. Антитело, или антигенсвязывающий фрагмент, по п.1, где антитело, или антигенсвязывающий фрагмент, содержит любое из следующего:
a) вариабельный домен тяжелой цепи, содержащий аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 14 или SEQ ID NO: 16;
b) вариабельный домен легкой цепи, содержащий аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10 или SEQ ID NO: 12; или
c) вариабельный домен тяжелой цепи, содержащий аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 14 или SEQ ID NO: 16, и
вариабельный домен легкой цепи, содержащий аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10 или SEQ ID NO: 12.
3. Антитело, или антигенсвязывающий фрагмент, по любому из пп.1, 2, где антитело, или антигенсвязывающий фрагмент, содержит любое из следующего:
a) вариабельный домен тяжелой цепи, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 14 или SEQ ID NO: 16;
b) вариабельный домен легкой цепи, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10 или SEQ ID NO: 12; или
c) вариабельный домен тяжелой цепи, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 14 или SEQ ID NO: 16, и
вариабельный домен легкой цепи, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10 или SEQ ID NO: 12.
4. Антитело, или антигенсвязывающий фрагмент, по п.1, где CDR3 легкой цепи антитела содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 23.
5. Антитело, или антигенсвязывающий фрагмент, по п.2, где антитело, или антигенсвязывающий фрагмент, содержит
вариабельный домен тяжелой цепи, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2, и
вариабельный домен легкой цепи, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4.
6. Антитело, или антигенсвязывающий фрагмент, по п.2, где антитело, или антигенсвязывающий фрагмент, содержит
вариабельный домен тяжелой цепи, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 6, и
вариабельный домен легкой цепи, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 8.
7. Антитело, или антигенсвязывающий фрагмент, по п.2, где антитело, или антигенсвязывающий фрагмент, содержит
вариабельный домен тяжелой цепи, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 6, и
вариабельный домен легкой цепи, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 10.
8. Антитело, или антигенсвязывающий фрагмент, по п.2, при этом антитело, или антигенсвязывающий фрагмент, содержит
вариабельный домен тяжелой цепи, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 6, и
вариабельный домен легкой цепи, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 12.
9. Антитело, или антигенсвязывающий фрагмент, по п.2, при этом антитело, или антигенсвязывающий фрагмент, содержит
вариабельный домен тяжелой цепи, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 14, и
вариабельный домен легкой цепи, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 10.
10. Антитело, или антигенсвязывающий фрагмент, по п.2, где антитело, или антигенсвязывающий фрагмент, содержит
вариабельный домен тяжелой цепи, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 16, и
вариабельный домен легкой цепи, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 12.
11. Антитело, или антигенсвязывающий фрагмент, по любому из пп.1-10, где антитело, или антигенсвязывающий фрагмент, имеет аффинность связывания (KD) в отношении молекулы V-набор и домен иммуноглобулина содержащего белка 4 (VSIG4) человека, составляющую 1×10-7-1×10-9.
12. Антитело, или антигенсвязывающий фрагмент, по любому из пп.1-11, где антитело, или антигенсвязывающий фрагмент, имеет аффинность связывания (KD) в отношении молекулы VSIG4, составляющую от примерно 7,156×10-8 до примерно 7,636×10-9.
13. Антитело, или антигенсвязывающий фрагмент, по любому из пп.1-11, где антитело, или антигенсвязывающий фрагмент, имеет аффинность связывания (KD) в отношении молекулы VSIG4, составляющую примерно 7,156×10-8, примерно 7,636×10-9, примерно 7,952×10-9, примерно 8,226×10-9 или примерно 8,688×10-9.
14. Молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая антитело, или антигенсвязывающий фрагмент, по любому из пп.1-13.
15. Рекомбинантный вектор для экспрессии антитела по любому из пп.1-13, содержащий молекулу нуклеиновой кислоты по п.14.
16. Рекомбинантный вектор по п.15, в котором молекула нуклеиновой кислоты по п.14 функционально связана с промотором.
17. Рекомбинантный вектор по п.15 или 16, который включает два отдельных вектора, каждый из которых содержит нуклеотидную последовательность, соответствующую тяжелой цепи и легкой цепи антитела, или антигенсвязывающего фрагмента.
18. Клетка-хозяин для получения антитела по любому из пп.1-13, содержащая молекулу нуклеиновой кислоты по п.14 или рекомбинантный вектор по любому из пп.15-17.
19. Клетка-хозяин по п.18, которая представляет собой клетку млекопитающего, дрожжевую клетку или бактериальную клетку.
20. Клетка-хозяин по п.19, которая представляет собой клетку, выбранную из группы, состоящей из E.coli, P.pastoris, Sf9, COS, HEK293, Expi293, CHO-S, CHO-DG44, CHO-K1 и лимфоцита млекопитающего.
21. Клетка-хозяин по п.20, которая представляет собой клетку Expi293.
22. Фармацевтическая композиция для лечения заболевания, обусловленного VSIG4, содержащая
антитело, или антигенсвязывающий фрагмент, по любому из пп.1-13, молекулу нуклеиновой кислоты по п.14, рекомбинантный вектор по любому из пп.15-17 или клетку-хозяина по любому из пп.18-21 и
фармацевтически приемлемый носитель.
23. Способ лечения заболевания, обусловленного VSIG4, у индивида, включающий этапы:
a) введения индивиду композиции, которая содержит или доставляет антитело, или антигенсвязывающий фрагмент, по любому из пп.1-13, молекулу нуклеиновой кислоты по п.14, рекомбинантный вектор по любому из пп.15-17 или клетку-хозяина по любому из пп.18-21, за счет чего происходит лечение заболевания или состояния.
24. Способ по п.23, где индивид страдает раком или у него имеется риск его развития.
25. Способ по п.24, где рак выбран из рака мочевого пузыря, рака молочной железы, рака шейки матки, рака толстого кишечника, рака эндометрия, рака пищевода, рака фаллопиевой трубы, рака желчного пузыря, рака желудочно-кишечного тракта, рака головы и шеи, гематологического рака, рака гортани, рака печени, рака легкого, лимфомы, меланомы, мезотелиомы, рака яичника, первичного рака брюшины, рака слюнных желез, саркомы, рака желудка, рака щитовидной железы, рака поджелудочной железы, почечноклеточного рака, глиобластомы и рака предстательной железы.
26. Способ по любому из пп.23-25, где индивид получал, или будет получать, один или несколько дополнительных видов противораковой терапии, выбранных из ионизирующей радиации, химиотерапевтического средства, лекарственного средства на основе антитела и клеточной терапии, так что индивид получает оба вида терапии.
27. Способ по п.26, где один или несколько дополнительных видов противораковой терапии включают использование ингибитора иммунных контрольных точек, IL-12, GM-CSF, анти-CD4 средства, цисплатина, фторурацила, доксорубицина, иринотекана, паклитаксела, ингибитора индоламин-2,3-диоксигеназы 1 (IDO1) или циклофосфамида.
28. Способ увеличения секреции цитокинов или хемокинов в M2 макрофагах, включающий:
a) создание контакта M2 макрофагов с антителом, или антигенсвязывающим фрагментом, по любому из пп.1-13.
29. Способ индукции пролиферации CD8+ T-клеток, включающий:
a) приведение M2 макрофага в контакт с антителом, или антигенсвязывающим фрагментом, по любому из пп.1-13; и
b) совместную инкубацию M2 макрофага с CD8+ T-клетками.
30. Способ превращения M2 макрофага в M1 макрофаг, включающий приведение M2 макрофага в контакт с антителом, или антигенсвязывающим фрагментом, по любому из пп.1-13.
