Устройство для определения удельной плотности биомассы живых клеток бактерий в культуральной жидкости в процессе ферментации

Изобретение относится к биотехнологии, в частности микробиологической, дрожжевой и спиртовой промышленности, и предназначено для оперативного определения динамики прироста, количества и состояние биомассы живых бактерий в культуральной жидкости в процессе ферментации. Техническим результатом изобретения является возможность в процессе культивирования биомассы бактерий в биореакторе, для оптимизации технологического процесса, оперативно определять состояние и количество живой биомассы бактерий, а также ее прирост на разных стадиях ферментации. 6 з.п. ф-лы, 3 ил., 1 пр.

 

Заявляемое техническое решение относится к микробиологической, дрожжевой и спиртовой промышленности и предназначено для оперативного определения динамики прироста, количества и состояние биомассы живых бактерий в культуральной жидкости в процессе ферментации. В процессе культивирования биомассы бактерий в биореакторе возникает необходимость, для оптимизации технологического процесса, оперативно определять состояние и количество живой биомассы бактерий, а также ее прирост, на разных стадиях ферментации.

В настоящее время в литературе описаны несколько способов определения биомассы бактерий, в культуральной жидкости, например:

Определение концентрации клеток при культивировании дрожжей с использованием камеры Горяева, метод заключается в подсчете клеток под микроскопом в специальной камере снабженной калибровочной сеткой, число клеток по формуле: X=А× 50000× В (5.7),

где А - сумма клеток в пяти больших квадратах;

В - разведение суспензии дрожжей;

50000 - коэффициент пересчета объема пяти больших квадратов на 1 см³.

Определение биомассы бактерий весовым методом. Из ферментера пипеткой отбирают 10 см³ культуральной жидкости, помещают в центрифугу. Обрабатывают 10 мин при скорости 5000 об/мин. Затем сливают надосадочную жидкость и дистиллированной водой из цилиндра (5 см³) стеклянной палочкой промывают осадок, оставшиеся 5 см³ воды используют для смыва находящихся на палочке дрожжей (количественный метод). После этого снова центрифугируют 10 мин при скорости 5000 об/мин. Далее дрожжи мерно, как указано выше, переносят в бюкс с известной массой. Бюкс помещают в сушильный шкаф и сушат до постоянной массы при 105°С в течение не менее 10 ч, потом взвешивают.

Определение количества биомассы по оптической плотности, с помощью колориметра-нефелометра. Мутность микробной взвеси может быть определена путем измерения оптической плотности при определенной длине волны. Интенсивность пучка света, проходящего через пробу, уменьшается за счет рассеивания (нефелометрия) или поглощения света (турбидиметрия). Светорассеяние и светопоглощение зависят не только от количества клеток в суспензии, но также от их размеров и формы. Действие нефелометра основано на сравнении интенсивности света, рассеянного испытуемой средой, с интенсивностью рассеяния эталона. При испытании пробу ярко освещают, а затем измеряют интенсивность прошедшего излучения или излучения, рассеянного под определенным углом. Для определения количества клеток в среде используют калибровочный график, отображающий зависимость между величиной светорассеяния и числом клеток в единице объема взвеси. Для построения калибровочного графика измеряют величину светорассеяния в ряде проб с известным содержанием клеток. Калибровочные графики индивидуальны для каждого микроорганизма.

Определение количества биомассы путем ее выращивания на питательных среда в чашках Петри. Сущность метода заключается в посеве определенного объема из серии десятикратных разведений суспензии исследуемых микроорганизмов на плотную питательную среду, инкубации и подсчете образовавшихся колоний, учитывая, что каждая колония - результат размножения одной жизнеспособной клетки микроорганизма.

К недостаткам вышеперечисленных методов можно отнести -трудность в разделении живых и мертвых клеток бактерий, при определении общей биомассы бактерий,

- длительное время анализа иногда более 40 часов,

- сложность аппаратурного оформления,

- необходимость в соответствующей квалификации лаборантов.

Наиболее близким к заявляемому решению, является способ определения количества живой биомассы дрожжей в исследуемых образцах по интенсивности скорости снижения рН, описанный в материалах научной конференции «Неделя науки СПбПУ 13-19 ноября 2017 г., Санкт-Петербург издательство политехнического университета». Суть метода заключается в скорости изменения рН культуральной жидкости при добавлении в среду 20%-ого раствора глюкозы и сахарозы. Снижение значения внеклеточного рН вызывается выделением дрожжами ионов Н+. Уровень спонтанного подкисления является индикатором содержания гликогена, а индуцированный глюкозой уровень подкисления является индикатором скорости прохождения гликолитического пути. Чем больше разница между начальным и конечным значениями рН, тем выше активность дрожжей.

К недостаткам данного метода можно отнести

- не достаточную проработку аппаратурного оформления

- данная методика не проверена для определения биомассы на других культурах

- не возможность расчета удельной плотности биомассы, так как объемы культуральной жидкости разные.

Предлагаемое техническое решение позволяет быстро, в течение нескольких минут определить количество, состояние и динамику прироста живых клеток бактерий, в исследуемой культуральной жидкости, в процессе ферментации, на разных ее стадиях, при этом не требуется высокая квалификация лабораторного персонала.

Технический результат заявляемое техническое решение заключается в создании устройства позволяющего быстро, в течение нескольких минут определить количество, состояние и динамику прироста живой биомассы бактерий, в культуральной жидкости в процессе ферментации, на разных ее стадиях.

Технический результат достигается тем, что культура бактерий, попав в стерильную питательную среду, через некоторое время начинает изменять окислительно-восстановительный потенциал питательной среды.

Устройство состоит из термостатирующей аналитической ячейки снабженной датчиком еН измеряющим окислительно-восстановительный потенциал питательной среды и датчиком температуры, преобразователя рН, узла вычисления производной, водяного термостата, поддерживающего постоянную температуру в аналитической ячейке и двухканального самописца.

Устройство состоит из аналитической ячейки (1) снабженной датчиком еН (2), датчиком температуры (3), преобразователя рН (4), преобразователя температуры (5), узла вычисления производной(6), водяного термостата (7) поддерживающего постоянную температуру в аналитической ячейке, двухканального самописца (8).

Аналитическая ячейка Фиг. 1 представляет собой термостатирующую емкость объемом 50 миллилитров с водяной рубашкой (12), в емкость заливается стерильная питательная среда (13), емкость снабжена крышкой (9), в которую вмонтирована электродная пара еН (2), состоящая из измерительного электрода и электрода сравнения, в крышке имеются два отверстия, одно с заглушкой диаметром 6 мм (10) для ввода пробы, другое для выравнивания атмосферного давления диаметром 1 мм. (11). Через рубашку (12) аналитической ячейки постоянно циркулирует вода с постоянной температурой, из водяного термостата (7).

Электродная пара (2) подключена к преобразователю рН (4), выходной сигнал рН метра подключен к узлу RC цепочки (6) вычисления производной из функции выходного сигнала преобразователя рН, сигнал от RC цепочки поступает на двухканальный самописец (8). В место RC цепочки может быть подключен микропроцессорный контроллер (14) Фиг. 2, с алгоритмом вычисления производной из функции входного сигнала преобразователя рН, при этом преобразователь температуры (5) не монтируется, сигнал от датчика температуры (3) подключен к микропроцессорному контроллеру (14), выходные сигналы от контроллера подключаются к двухканальному самописцу (8). На Фиг. 1, Фиг. 2 изображено устройство, для определения удельной плотности биомассы живых клеток бактерий в культуральной жидкости на стадии ферментации где:

1. - аналитическая ячейка

2. - электродная система еН

3. - датчик температуры

4. - преобразователь рН

5. - преобразователь температуры

6. - RC цепочка вычисления производной из функции выходного сигнала

7. - термостат

8. - двухканальный самописец

9. - крышка

10. - отверстие для ввода проб

11. - отверстие для выравнивания атмосферного давления

12. - водяная рубашка

13. - питательный раствор

14. - микропроцессорный контроллер.

Устройство работает следующим образом.

В аналитическую ячейку (1) заливают питательный раствор (13) от объема ячейки, включают термостат (7), ждут, пока температура питательного раствора не стабилизируется, контроль ведется по показаниям двухканального самописца (8) и изменению окислительно-восстановительного потенциала (еН) среды, еН должен стабилизироваться. После стабилизации температуры открывают пробку и в отверстие (10) вводят 5 миллилитров исследуемой культуральной жидкости, после чего пробку закрывают. Вследствие химического изменения окислительно-восстановительного потенциала питательной среды (13), после ввода пробы, изменяется выходной сигнал преобразователя рН (4) и как следствие на выходе потенциометра RC цепочки (6) формируется сигнал производной от функции изменения выходного сигнала преобразователя рН, на самописце (8) отражается пик прямо пропорциональный величине производной от изменения еН. После чего сигнал на выходе преобразователя рН (4) стабилизируется, и производная становится равна «0», самописец пишет стабильную нулевую линию. Через некоторое время культура живых бактерий, попав в питательную среду, начинает изменять ее окислительно-восстановительный потенциал, сигнал на выходе преобразователя рН (4) снова начинает изменяться, а на выходе RC цепочки (6) снова формируется сигнал производной, прямо пропорциональный изменению выходного сигнала преобразователя рН (4), сигнал производной отображается на экране самописца, амплитуда сигнала прямо пропорциональна количеству живой биомассы бактерий в пробе, а время, прошедшее между первым и вторым пиком производной, обратно пропорционально количеству живой биомассы в пробе, что отображено на Фиг. 3. Ниже приведена формула, по которой рассчитывается удельная плотность биомассы, чтобы формула получила размерность необходимо откалибровать показания самописца по нескольким пробам, имеющим конкретный титр (количество бактерий в единице объема).

А - удельная плотность биомассы

t - время между вводом пробы и откликом биомассы

h - амплитуда производной.

1. Устройство для определения удельной плотности биомассы живых клеток бактерий в культуральной жидкости в процессе ферментации состоит из термостатирующей аналитической ячейки, снабженной электродной системой еН и датчиком температуры, преобразователем рН, к которому подключена электродная система еН, RC цепочки узла вычисления производной, преобразователя температуры, к которому подключен датчик температуры, водяного термостата для поддержания постоянной температуры в аналитической ячейке, двухканального самописца для регистрации производной от изменения еН и температуры в аналитической ячейке.

2. Устройство по п. 1, отличается тем, что аналитическая ячейка снабжена крышкой, в которой имеется отверстие, заглушенное пробкой для ввода пробы.

3. Устройство по п. 2 отличается тем, что в крышке имеется небольшое отверстие для выравнивания атмосферного давления.

4. Устройство по п. 1 отличается тем, что узел RC вычисления производной подключен с одной стороны к выходу преобразователя рН, а с другой стороны к одному из входов двухканального самописца.

5. Устройство по п. 1 отличается тем, что в место RC узла вычисления производной подключен микропроцессорный контроллер с алгоритмом вычисления производной из функции.

6. Устройство по п. 1 отличается тем, что один из входов микропроцессорного контроллера подключен к выходу преобразователя рН, а один из аналоговых выходов микропроцессорного контроллера, подключен к одному из входов двухканального самописца для регистрации производной еН.

7. Устройство по п. 1 отличается тем, что, если устанавливается микропроцессорный контроллер, преобразователь температуры не монтируется, а датчик температуры подключен к одному из входов микропроцессорного контроллера, а один из аналоговых выходов микропроцессорного контроллера подключен к одному из входов двухканального самописца для регистрации температуры.