Антитело к рецептору тромбоцитарного фактора роста (pdgf) и его применение
Изобретение относится к области биотехнологии, в частности к антителу к рецептору антигена PDGF или его антигенсвязывающему фрагменту, а также к содержащей его композиции и конъюгату. Также раскрыта система доставки лекарственного препарата, содержащая вышеуказанное антитело или его фрагмент. Изобретение эффективно для профилактики, облегчения течения и лечения онкологических заболеваний, а также для профилактики, облегчения течения и лечения глазных неоваскулярных заболеваний. 10 н. и 16 з.п. ф-лы, 20 ил., 8 табл., 16 пр.
[Область техники]
Настоящее изобретение относится к антителу к рецептору тромбоцитарного фактора роста, конъюгату антитела, в котором химиотерапевтический агент конъюгирован с антителом к рецептору тромбоцитарного фактора роста, а также к профилактическому или терапевтическому применению при глазных неоваскулярных заболеваниях с использованием такого антитела.
[Предшествующий уровень техники]
Ангиогенез, также называемый неоваскуляризацией, содержит этап формирования протрузий из существующих кровеносных сосудов и их проникновение в окружающие ткани. Васкулогенез, связанный с этим процесс, содержит этап дифференциации эндотелиальных клеток и гемангиобластов, уже существующих в ткани в целом, с последующим формированием кровеносных сосудов по мере их соединения.
Ангиогенез часто можно наблюдать в процессе развития, а также при заживлении ран для восстановления кровотока к тканям после травмы даже в здоровом организме. Тем не менее, ангиогенез также связан с раком и образованием опухолей.
Во время различных глазных расстройств можно наблюдать изменения ангиогенеза. Например, диабетическая ретинопатия, одна из причин слепоты у взрослых, сопровождается избыточным ангиогенезом. Непролиферативная ретинопатия сопровождается избирательной потерей периваскулярных клеток сетчатки и расширением связанных с этим капилляров, в связи с чем возрастает кровоток. В расширенных капиллярах эндотелиальные клетки размножаются и образуют кистозные протрузии, которые превращаются в микроаневризмы, а прилегающие капилляры блокируются, вследствие чего не происходит перфузии в области сетчатки вокруг этих микроаневризм. По существу, шунтирующие кровеносные сосуды возникают между смежными микроаневризмами, и клиническим симптомом ранней диабетической ретинопатии, по-видимому, следует считать микроаневризмы и отсутствие перфузии в областях сетчатки. Происходит утечка с возможным разрушением капилляров в микроаневризмах, что может привести к выпоту и кровотечению. Пролиферативная диабетическая ретинопатия возникает в том случае, когда на некоторых участках сетчатки продолжается потеря капилляров и блокирование перфузии, что приводит к появлению новых кровеносных сосудов на дисках и других участках сетчатки. Такие новые кровеносные сосуды легко прорастают в стекловидное тело и зоны кровотока, вызывая преретинальное кровоизлияние. По мере развития пролиферативной диабетической ретинопатии чрезмерное кровотечение из стекловидного тела может заполнить большую часть стекловидной полости. Кроме того, образование новых кровеносных сосудов сопровождается пролиферацией волокнистой ткани, что может вызвать тракционное отслоение сетчатки.
Лечение макулярного отека и пролиферативной диабетической ретинопатии на ранних стадиях предотвращает слепоту в течение пяти лет у 95 % пациентов, однако отсроченное лечение предотвращает слепоту только у 50 % пациентов. Поэтому необходима ранняя диагностика и своевременное лечение.
Другим глазным расстройством, которое сопровождается ангиогенезом, является возрастная макулярная дегенерация (ВМД). Возрастную макулярную дегенерацию можно охарактеризовать рядом патологических изменений, происходящих в макуле центральной области сетчатки, она сопровождается проблемами со зрением, затрагивающими, в частности, центральное зрение. Пигментный эпителий сетчатки расположен на мембране Бруха, представляющей собой базальный мембранный комплекс, который утолщается и отверждается при возрастной макулярной дегенерации. Новые кровеносные сосуды могут возникать по мере своего прохождения через мембрану Бруха от нижней сосудистой оболочки, содержащей обильный слой кровеносных сосудов. Впоследствии эти кровеносные сосуды могут приводить к утечке жидкости или кровотечению между пигментным эпителием сетчатки и сенсорной сетчаткой, а также под пигментным эпителием сетчатки. Последующее образование фиброзного рубца приводит к потере центрального зрения, блокируя подачу питательных веществ к фоторецепторным клеткам и убивая эти клетки. Такой тип возрастной макулярной дегенерации называют «влажным типом» из-за утечки из кровеносных сосудов и субретинальных отеков или кровоизлияний. «Сухой тип» возрастной макулярной дегенерации сопровождается коллапсом пигментного эпителия сетчатки с потерей фоторецепторных клеток, расположенных над пигментным эпителием сетчатки. Такой сухой тип ухудшает зрение.
Среди этих регуляторов ангиогенеза изучают роль членов PDGF-B, принадлежащих к семейству сигнальных молекул тромбоцитарного фактора роста, поскольку считается, что они играют определенную роль в формировании, пролиферации и надлежащем функционировании париетальных клеток, таких как периваскулярные клетки, называемые сосудистыми гладкомышечными клетками или межсосудистыми клетками.
Семейство PDGF состоит из мономеров PDGF-A, PDGF-B, PDGF-C и PDGF-D, а также димеров PDGF-AA, PDGF-AB, PDGF-BB, PDGF-CC и PDGF-DD. После связывания димера PDGF, PDGF происходит связывание с PDGF-рецепторами α и β. Рецептор тромбоцитарного фактора роста (рецептор PDGF) представляет собой разновидность фермента тирозинкиназы и может образовывать три комбинации димеров αα, ββ и αβ. Внеклеточная область рецептора PDGF состоит из пяти иммуноглобулин-подобных областей, а внутриклеточная область содержит область фосфорилирования тирозина. Лигандсвязывающая область рецептора PDGF расположена в трех первых иммуноглобулин-подобных областях. Происходит связь PDGF с подобными иммуноглобулину доменами 2 и 3 рецептора PDGF, индуцируя димеризацию рецептора, и происходят прямые межрецепторные взаимодействия, в том числе иммуноглобулин-подобные домены 4 и 5 для дальнейшей стабилизации.
PDGF-CC специфически взаимодействует с рецептором PDGF-αα и рецептором PDGF-αβ, но не взаимодействует с PDGFR-ββ. Таким образом, он подобен PDGF-AB. PDGF-DD считают специфичным для PDGFR-ββ, поскольку он с высоким сродством образовывает связь с PDGFR-ββ и в гораздо меньшей степени – с рецептором PDGF-αβ. PDGF-AA образовывает связь только с рецептором PDGF-αα. PDGF-BB уникальным образом связывает все три комбинации рецепторов с высоким сродством.
Избыточная сигнализация между PDGF и рецептором PDGF играет важную роль при многих видах онкологии, таких как почечно-клеточная карцинома, рак легких, глиобластома, хроническая лимфоцитарная лейкемия и рак простаты. Рецептор PDGF стимулирует рост опухолей, способствуя их персистированию путем прямого воздействия на кровеносные сосуды, связанные с ростом опухолей, стромальные фибробласты (соматические фибробласты) и другим подобным эффектам.
Моноклональное антитело, воздействующее на сигнализацию PDGF и рецептора PDGF, под названием оларатумаб (IMC-3G3, LartruvoTM) представляет собой рекомбинантное антитело человека IgG1 к PDGFR-α, специфически связываемое с рецептором PDGF-α, блокирующее связывание PDGF-AA, PDGF-BB и PDGF-CC и активацию рецептора, и не вступающее в перекрестную реакцию с PDGFR-β. Оларатумаб был впервые одобрен для лечения рака в США в октябре 2016 года на основании результатов исследования стадии Ib/II поздней саркомы мягких тканей, которое показало, что сочетание оларатумаба и доксорубицина значительно повысило общую среднюю выживаемость по сравнению с применением только доксорубицина.
Конъюгаты антител с лекарственным препаратом (ADC) представляют собой терапевтические средства, содержащие нагруженные цитотоксичными препаратами моноклональные антитела и доставляющие токсичное вещество к опухолевым клеткам, экспрессирующим целевые антигены с минимальной побочной токсичностью.
При оптимизации конъюгата антитела с лекарственным препаратом необходимо учитывать множество факторов, такие как антитело, линкер, активный центр, тип опухоли, скорость экспрессии антигена, токсин, соотношение лекарственного препарата и антител и т. п. Например, активный центр влияет на скорость связывания, сродство и стабильность. Поскольку конъюгаты лекарственных средств интернализуются в клетки и высвобождают лекарственные средства, токсическое действие важно для оценки эффективности доставки лекарственных средств в клетки. Кроме того, эффективность интернализации различают для антител, которые прикрепляются к одному и тому же целевому антигену, расположенному на поверхности клетки. Таким образом, эффективный выбор интернализирующего антитела очень важен для эффективности комплекса антител с лекарственным препаратом. Поскольку существует множество факторов, в частности, рециклинг конъюгата антител с лекарственным препаратом к целевому антигену и внутриклеточный трафик, влияющий на цитотоксическое действие лекарств, то способ точного измерения уровня токсичности интернализированных антител может быть проверен после изготовления конъюгата антител с лекарственным препаратом. К сожалению, было потрачено много усилий и времени на разработку кандидатов конъюгатов антител с лекарственными препаратами, использующих различные типы антител.
Существующие в настоящее время терапевтические средства PDGFR-β делают основной упор на антагонистическом действии лиганда PDGF и не могут обеспечить эффективную интернализацию PDGFR-β. Соответственно, существует потребность в разработке антитела, способного эффективно интернализировать PDGFR-β для доставки антитела или конъюгата антитела с лекарственным препаратом в клетки, которые экспрессируют PDGFR-β.
[Раскрытие]
[Техническая задача]
Один из вариантов осуществления настоящего изобретения относится к антителу к рецептору антигена PDGF или антителу или его антигенсвязывающему фрагменту, распознающему рецептор PDGF, а именно рецептор PDGF-β.
Другой вариант осуществления настоящего изобретения относится к конъюгату антитела с лекарственным препаратом, в котором лекарственный препарат конъюгирован с антителом к рецептору антигена PDGF или антигенсвязывающим фрагментом антитела. Конъюгат антитела с лекарственным препаратом может представлять собой конъюгат, в котором лекарственный препарат связан с антителом к рецептору антигена PDGF через нековалентную или ковалентную связь.
Другой вариант осуществления настоящего изобретения представляет собой биспецифическое антитело, содержащее антитело к рецептору антигена PDGF или его антигенсвязывающий фрагмент, причем антитело или его антигенсвязывающий фрагмент специфически распознает гаптен, способный к конъюгации с лекарственным препаратом.
Антиген-cвязывающий фрагмент антитела представляет собой фрагмент антитела, содержащий, по меньшей мере, одну определяющую комплементарность область и может быть scFv, (scFv)2, scFv-Fc, Fab, Fab' или F(ab')2.
Один из вариантов осуществления настоящего изобретения относится к использованию системы доставки лекарственного препарата, предназначенной для доставки лекарственного препарата в клетки или ткани, экспрессирующие рецептор PDGF, в частности, рецептор PDGF-β на поверхности клетки, и содержащей антитело к рецептору антигена PDGF. Система доставки лекарственного препарата может представлять собой биспецифическое антитело, содержащее антитело к рецептору антигена PDGF или его антигенсвязывающий фрагмент, и антитело к гаптену или его антигенсвязывающий фрагмент для химиотерапевтического препарата. Если система доставки лекарственного препарата содержит антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, распознающий гаптен, лекарственный препарат может осуществлять связь с гаптеном, соединенным с антителом к рецептору антигена PDGF или его антигенсвязывающим фрагментом, и переходить к целевым клеткам или тканям. Лекарственный препарат, поставляемый в целевые клетки, может представлять собой препарат для профилактики, облегчения течения или лечения заболеваний, связанных с PDGF или рецептором PDGF, в частности, неоваскулярных заболеваний. Лекарственный препарат может представлять собой иммунотерапевтический или химиотерапевтический агент, а иммунотерапевтический агент может представлять собой антитело.
Один из вариантов осуществления настоящего изобретения относится к фармацевтической композиции для профилактики, облегчения течения или лечения неоваскулярных заболеваний, содержащей конъюгат антитела с лекарственным препаратом, в котором лекарственный препарат конъюгируют с антителом к рецептору антигена PDGF или его антигенсвязывающим фрагментом, или конъюгат антитела с лекарственным препаратом, в котором лекарственный препарат конъюгируют через гаптен с антителом к рецептору антигена PDGF или его антигенсвязывающим фрагментом.
Один из вариантов осуществления настоящего изобретения относится к способу лечения пациента с диагностированным неоваскулярным заболеванием или имеющим риск возникновения неоваскулярного заболевания, содержащему этап введения пациенту конъюгата антитела с лекарственным препаратом, в котором лекарственный препарат конъюгируют с антителом к рецептору антигена PDGF или его антигенсвязывающим фрагментом, или конъюгата антитела с лекарственным препаратом, в котором лекарственный препарат конъюгируют через гаптен с антителом к рецептору антигена PDGF или его антигенсвязывающим фрагментом, в достаточном количестве для предотвращения, облегчения течения или лечения заболевания пациента, в качестве первого терапевтического средства или вспомогательного терапевтического средства.
[Техническое решение]
Далее настоящее изобретение будет раскрыто в деталях.
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения предложено антитело или антигенсвязывающий фрагмент антитела, специфически распознающее или распознающий рецептор PDGF, в частности, рецептор PDGF-β (PDGFR-β).
Под антителом в смысле настоящего изобретения понимают вещество, полученное путем стимуляции антигеном. Примеры антител включают, но не ограничиваясь этим, антитела животных, гибридные антитела, гуманизированные или иные антитела.
Кроме того, изолированный антигенсвязывающий фрагмент также считают антителом согласно настоящему изобретению. Под определяющей комплементарность областью (CDR) понимают вариабельную область антитела, важную для специфичности антигена. Вышеуказанный антиген-cвязывающий фрагмент представляет собой фрагмент антитела, содержащий, по меньшей мере, одну определяющую комплементарность область и может иметь вид scFv, (scFv)2, scFv-Fc, Fab, Fab' and F(ab')2 или, предпочтительно, scFv. Антитело может представлять собой поликлональное или моноклональное антитело. Антитело может быть выбрано из ряда иммуноглобулинов всех подтипов (например, IgA, IgD, IgE, IgG (IgG1, IgG2, IgG3, IgG4), IgM, и т.д.). Антитело типа IgG можно отнести к подтипу IgG1, IgG2, IgG3 или IgG4, например, подтипу IgG1 или IgG2.
Согласно настоящему изобретению, антигенсвязывающий фрагмент цепи (тяжелой или легкой цепи) антитела или иммуноглобулина не содержит некоторых аминокислот по сравнению с полноразмерной цепью, но содержит часть антитела, способную осуществлять специфическую связь с антигеном. Такие антигенсвязывающие фрагменты могут быть биологически активны в смысле своей способности осуществлять специфическую связь с целевым антигеном или конкурировать с другими антителами или антигенсвязывающими фрагментами за связывание со специфическим эпитопом. В частности, антигенсвязывающий фрагмент представляет собой фрагмент антитела, содержащий одну или несколько определяющих комплементарность областей, и может быть выбран, например, из группы, в которую, например, могут входить, scFv, (scFv)2, scFv-Fc, Fab, Fab' и F(ab')2, но не ограничиваясь этим. Эти биологически активные фрагменты могут быть получены с помощью технологии рекомбинантной ДНК или, например, с помощью ферментативного или химического расщепления интактных антител. Иммунологически функциональные фрагменты иммуноглобулина не ограничены этим.
«Гуманизированные» формы не человеческих антител (например, курицы, мыши, крысы и т.д.) представляют собой специфические гибридные иммуноглобулины, иммуноглобулиновые цепи или их фрагменты, содержащие минимальные последовательности, полученные из не человеческих иммуноглобулинов (например, Fv, Fab, Fab', F(ab)2, или другие антигенсвязывающие продукты антитела). По существу, гуманизированное антитело представляет собой иммуноглобулин человека (реципиентное антитело), причем остатки, полученные из определяющей комплементарность области реципиентного антитела, заменяют остатками, обладающими нужной специфичностью, сродством и свойствами из определяющей комплементарность области не человеческого антитела (донорского антитела), например, мыши, крысы или кролика. В некоторых случаях остатки каркасной области Fv иммуноглобулинов человека заменяют соответствующими остатками каркасной области нечеловеческого происхождения. Кроме того, гуманизированное антитело может содержать остатки, не обнаруженные в последовательностях определяющей комплементарность области или каркасной области, введенной в реципиентное антитело. Эти модификации могут быть осуществлены для дальнейшего улучшения и оптимизации характеристик антител. По существу, все или почти все определяющие комплементарность области в гуманизированных антителах соответствуют областям не человеческого иммуноглобулина, и все или почти все остатки каркасной области могут содержать группу, по меньшей мере, из одного, а обычно двух остатков вариабельных доменов консенсусной последовательности иммуноглобулина человека. Гуманизированное антитело также оптимально содержит, по меньшей мере, часть константной области (Fc) иммуноглобулина, обычно, по меньшей мере, часть человеческого иммуноглобулина.
Настоящее изобретение относят к антителу к внеклеточному домену изоформы PDGFR-β. Рецептор PDGF представляет собой разновидность фермента тирозинкиназы и содержит две изоформы PDGFR-α и PDGFR-β, способные образовывать три типа комбинаций димеров αα, ββ и αβ. Структура рецептора PDGF содержит внеклеточную область, состоящую из пяти иммуноглобулин-подобных доменов, трансмембранную область и внутриклеточную область (область тирозинкиназы). Лигандсвязывающая область рецептора расположена перед тремя иммуноглобулин-подобными областями из пяти иммуноглобулин-подобных доменов внеклеточной области. Известно, что PDGF индуцирует димеризацию рецепторов путем связывания с иммуноглобулин-подобными доменами 2 и 3 рецептора PDGF и стимулирует межрецепторное взаимодействие, в том числе иммуноглобулин-подобные домены 4 и 5, для дополнительной стабилизации.
Согласно изобретению, антитела могут представлять собой человеческие антитела и фрагменты антител, полученные из генного репертуара вариабельных доменов (V) иммуноглобулина от неиммунизированных доноров в лабораторных условиях, с использованием технологии фагового дисплея (McCafferty et al.., (1990) Nature, 348: 552-553 - МакКаферти и др., (1990) «Природа», 348: 552-553).
Настоящее изобретение относят к выделенному антителу или его антигенсвязывающему фрагменту, который осуществляет специфическую связь с PDGFR-β, причем антителом или антигенсвязывающим фрагментом может быть полипептид, белок или антитело, или их антигенсвязывающий фрагмент, в том числе определяющую комплементарность область тяжелой цепи и определяющую комплементарность область легкой цепи, для специфической связи с PDGFR-β.
В качестве конкретного примера можно указать антитело к антигену PDGFR-β и его антигенсвязывающий фрагмент:
(i) по меньшей мере, одна определяющая комплементарность область тяжелой цепи, выбранная из группы, содержащей H-CDR1, H-CDR2 и H-CDR3, или вариабельная область тяжелой цепи, содержащая, по меньшей мере, одну область, определяющую комплементарность тяжелой цепи;
(ii) по меньшей мере, одна определяющая комплементарность область легкой цепи, выбранная из группы, содержащей L-CDR1, L-CDR2 и L-CDR3, или вариабельная область легкой цепи, содержащая, по меньшей мере, одну определяющую комплементарность область легкой цепи;
комбинация из, по меньшей мере, одной определяющей комплементарность области тяжелой цепи и, по меньшей мере, одной определяющей комплементарность области легкой цепи, описанных выше; или
комбинация вариабельного участка тяжелой цепи и вариабельного участка легкой цепи, описанных выше.
Кроме того, рассматривая вариабельную область тяжелой цепи, вариабельную область легкой цепи или комбинацию вариабельной области тяжелой цепи и вариабельной области легкой цепи, вариабельная область тяжелой цепи может содержать одну или несколько каркасных областей тяжелой цепи из группы, содержащей H-FR1, H-FR2, H-FR3 и H-FR4, а вариабельная область легкой цепи может содержать одну или несколько каркасных областей легкой цепи из группы, содержащей L-FR1, L-FR2, L-FR3 и L-FR4.
Определяющая комплементарность область тяжелой цепи (i) H-CDR1, H-CDR2 или H-CDR3 в соответствии с настоящим изобретением, представляет собой одну из аминокислотных последовательностей, сведенных в нижеприведенные таблицы 1 и 2, или содержит, по меньшей мере, одну аминокислотную последовательность, обладающую существенной идентичностью последовательности с выбранной аминокислотной последовательностью. Кроме того, (ii) определяющая комплементарность область легкой цепи L-CDR1, L-CDR2 или L-CDR3, представляет собой одну из аминокислотных последовательностей, сведенных в нижеприведенные таблицы 1 и 2, или содержит, по меньшей мере, одну аминокислотную последовательность, обладающую существенной идентичностью последовательности с выбранной аминокислотной последовательностью.
Согласно настоящему изобретению, одноцепочечная Fv представляет собой единую полипептидную цепь антигенсвязывающей области, причем вариабельная область тяжелой цепи и вариабельная область легкой цепи соединены непосредственно или через линкер, и может представлять собой, по меньшей мере, один из элементов группы, содержащей scFv вариабельной области тяжелой цепи и вариабельной области легкой цепи, связанный в единую цепь, димеры scFv (di-scFv) и scFv-Fc, причем вариабельная область тяжелой цепи, вариабельная область легкой цепи и Fc связаны в единую цепь. scFv может представлять собой вариабельную область тяжелой цепи и вариабельную область легкой цепи, соединенные между собой линкером, варианты которого, по существу, не ограничены, например, последовательностью линкера, содержащей аминокислотную последовательность с SEQ ID NO (идентификационным номером): 57, приведенную в таблице 2 (см. ниже).
Настоящим изобретением предложено антитело к бета-рецептору тромбоцитарного фактора роста (PDGFR-β) мыши или человека в качестве примера целевого антигена, и антитело scFv может быть использовано для получения биспецифического антитела. Например, scFv может представлять собой антитело, в котором тяжелая цепь, содержащая CDR1-CDR3, и легкая цепь, содержащая CDR1-CDR3 антитела, соединены линкером. Кроме того, в качестве биспецифического антитела гибридный белок (scFv антитела к антигену PDGFR-β)-Cκ-(scFv антитела к антигену котинина) может содержать три (3) определяющие комплементарность области тяжелой цепи и три (3) определяющие комплементарность области легкой цепи каждого антитела, связанные с Cκ, как показано в нижеприведенной таблице 2.
В конкретном случае специфическими примерами антител к мышиному PDGFR-β (mPDGFR-β) в качестве примера целевого антигена согласно настоящему изобретению являются PRb-CN01, PRb-CC01, PRb-CC02 и PRb-CC03, а их вариабельные области тяжелой цепи, вариабельные области легкой цепи и последовательности определяющих комплементарность областей этих цепей показаны в приведенной ниже таблице 1.
[Таблица 1]
| Клон/наименование | Часть | Аминокислотная последовательность (N->C) | SEQ ID NO |
| PRb-CN01 | CDR1-VH | GFTFSDRAMH | 1 |
| PRb-CN01 | CDR2-VH | LITNTGGSTNYGAAVKG | 2 |
| PRb-CN01 | CDR3-VH | GVGSWAHGGRIDA | 3 |
| PRb-CN01 | CDR1-VL | SGGSGSYG | 4 |
| PRb-CN01 | CDR2-VL | SNNQRPS | 5 |
| PRb-CN01 | CDR3-VL | GTRDSSYVGI | 6 |
| PRb-CN01 | VH | AVTLDESGGGLQTPGGALSLVCKASGFTFSDRAMHWVRQAPGKGLEWVGLITNTGGSTNYGAAVKGRATISRDNGQSTVRLQLNNLRAEDTGTYYCTRGVGSWAHGGRIDAWGHGTEVIVSS | 7 |
| PRb-CN01 | VL | LTQPSSVSANPGETVKITCSGGSGSYGWFQQKSPGSAPVTVIYSNNQRPSDIPSRFSGSKSGSTNTLTITGVQAEDEAIYYCGTRDSSYVGIFGAGTTLTVL | 8 |
| PRb-CC01 | CDR1-VH | SGFTFSSYNMG | 9 |
| PRb-CC01 | CDR2-VH | GISAADNSTAYGAAVDG | 10 |
| PRb-CC01 | CDR3-VH | GGGSIDA | 11 |
| PRb-CC01 | CDR1-VL | SGGGSYYG | 12 |
| PRb-CC01 | CDR2-VL | YNDKRPS | 13 |
| PRb-CC01 | CDR3-VL | GAWDNSAGYAG | 14 |
| PRb-CC01 | VH | AVTLDESGGGLQTPGGALSLVCKGSGFTFSSYNMGWVRQAPGKGLEFVAGISAADNSTAYGAAVDGRATISRDNGQSTVRLQLNNLRAEDTATYFCIRGGGSIDAWGHGTEVIVSS | 15 |
| PRb-CC01 | VL | LTQPSSVSANLGGTVKITCSGGGSYYGWYQQKSPGSAPVTLIYYNDKRPSDIPSRFSGSKSGSTGTLTITGVQAEDEAVYFCGAWDNSAGYAGFGAGTTLTVL | 16 |
| PRb-CC02 | CDR1-VH | GFTFSSYGMF | 17 |
| PRb-CC02 | CDR2-VH | GIDTGSGTNYGSAVKG | 18 |
| PRb-CC02 | CDR3-VH | GYAGTIDA | 19 |
| PRb-CC02 | CDR1-VL | SGGGGSYG | 20 |
| PRb-CC02 | CDR2-VL | YNDKRPS | 21 |
| PRb-CC02 | CDR3-VL | GSYNSSDSL | 22 |
| PRb-CC02 | VH | AVTLDESGGGLQTPGGALSLVCKASGFTFSSYGMFWVRQAPGKGLEWVAGIDTGSGTNYGSAVKGRATISRDNGQSTVRLQLNNLRAEDTGTYFCTRGYAGTIDAWGHGTEVIVSSTS | 23 |
| PRb-CC02 | VL | LTQPSSVSANPGETVKITCSGGGGSYGWYQQKSPGSAPVTVIYYNDKRPSDIPSRFSGSKSGSTGTLTITGVQAEDEAVYFCGSYNSSDSLFGAGTTLTVL | 24 |
| PRb-CC03 | CDR1-VH | GFTFSSYAMG | 25 |
| PRb-CC03 | CDR2-VH | GIDTAGGTAYGPAVKG | 26 |
| PRb-CC03 | CDR3-VH | SSYIDT | 27 |
| PRb-CC03 | CDR1-VL | SGGTYNYG | 28 |
| PRb-CC03 | CDR2-VL | WNDKRPS | 29 |
| PRb-CC03 | CDR3-VL | GSSDSSGLI | 30 |
| PRb-CC03 | VH | AVTLDESGGGLQTPGGTLSLVCKASGFTFSSYAMGWVRQAPGKGLEWVAGIDTAGGTAYGPAVKGRATISRDNGQSTVRLQLNNLRAEDTATYYCTRSSYIDTWGHGTEVIVSSTS | 31 |
| PRb-CC03 | VL | LTQPSSVSANPGETVKITCSGGTYNYGWYQQKSPGSAPVTVIYWNDKRPSDIPSRFSGSKSGSTGTLTITGVQAEDEAVYYCGSSDSSGLIFGAGTTLTVL | 32 |
В группе антител PRb-CN01, PRb-CC01, PRb-CC02 и PRb-CC03 антитела PRb-CC01, PRb-CC02 и PRb-CC03 конкурируют с mPDGF-BB, а активный центр представляет собой иммуноглобулин-подобный домен 2 или 3 рецептора PDGFR-β, однако PRb-CN01 не конкурирует с mPDGF-BB и, как ожидается, будет осуществлять связь с иммуноглобулин-подобным доменом 1, 4 или 5 рецептора PDGFR-β. Было подтверждено, что цитотоксичность PRb-CN01 и PRb-32 эквивалентна независимо от наличия или отсутствия mPDGF-BB, и что PRb-CN01 и PRb-32 представляют собой суррогатные антитела (фиг. 20а и 20b).
В соответствии с настоящим изобретением, новые антитела, такие как антитела PRb-CN01, PRb-CC01, PRb-CC02 и PRb-CC03, их фрагменты, смеси или производные обладают связывающей способностью в диапазоне от 1 x 10-7 М до 1 x 10-10 М для рецептора PDGF, если их используют для получения биспецифического антитела с антителом к антигену котинина.
Было подтверждено, что антитела PRb-CN01, PRb-CC02 и PRb-CC03 интернализировались в клетки через эндосомы, но PRb-CC01 не интернализировалось. Поскольку конъюгаты антител с лекарственными препаратами интернализируются в клетки и высвобождают лекарственные препараты, токсическое действие важно для оценки эффективности доставки лекарственных средств в клетки. Кроме того, эффективность интернализации различают для антител, которые прикрепляются к одному и тому же целевому антигену на поверхности клетки. Таким образом, эффективный выбор интернализирующего антитела очень важен для эффективности комплекса антител с лекарственным препаратом.
Кроме того, антитела PRb-CN01, PRb-CC01, PRb-CC02 и PRb-CC03 обладают цитотоксичными свойствами, причем наибольшей цитотоксичностью среди четырех антител обладает PRb-CN01, когда он образует комплекс с котинин-дуокармицином. Поэтому его можно считать наиболее эффективным проводником для таких лекарственных препаратов, как дуокармицин. Даже после добавления mPDGF-BB цитотоксичность биспецифического антитела, в том числе PRb-CN01, оставалась высокой в комплексе с кот-дуо или кот-дуо-кот. При этом при добавлении mPDGF-BB токсичность трех антител (PRb-CC01, PRb-CC02 и PRb-CC03) в комплексе с кот-дуо или кот-дуо-кот, конкурирующими с mPDGF-BB, несколько снизилась. Согласно настоящему изобретению, биспецифическое антитело, связанное с PRb-CN01, не конкурировало с PDGF-BB и индуцировало цитотоксичность независимо от наличия PDGF-BB (ФИГ. 5a-5b).
Примерами антител к человеческому PDGFR-β (hPDGFR-β), которые являются примерами целевых антигенов согласно настоящему изобретению, являются PRb-CN16, PRb-CN32 и PRb-CN26. Последовательности определяющих комплементарность областей этих антител приведены в таблице 2 (см. ниже).
[Таблица 2]
| Клон/наименование | Часть | Последовательность | SEQ ID NO |
| PRb-CN16 | CDR1-VH | GFTFSSFNMA | 33 |
| PRb-CN16 | CDR2-VH | EISNTAGSTFYAPAVKG | 34 |
| PRb-CN16 | CDR3-VH | AAGTCYSHSCTGYIDA | 35 |
| PRb-CN16 | CDR1-VL | SGSSSSYG | 36 |
| PRb-CN16 | CDR2-VL | ENNQRPS | 37 |
| PRb-CN16 | CDR3-VL | GNADRSNSAGT | 38 |
| PRb-CN16 | VH | AVTLDESGGGLQTPGTALSLVCKASGFTFSSFNMAWVRQAPGKGLEFVGEISNTAGSTFYAPAVKGRATISRDNGQSTVRLQLNNLRAEDTAIYYCAKAAGTCYSHSCTGYIDAWGHGTEVIVSSTS | 39 |
| PRb-CN16 | VL | LTQPSSVSANPGETVKITCSGSSSSYGWYQQKSPGSAPVTLIYENNQRPSNIPSRFSGSKSGSTGTLTITGVQAEDEAVYYCGNADRSNSAGTFGAGTTLTVL | 40 |
| PRb-CN32 | CDR1-VH | GFTFSSFNMF | 41 |
| PRb-CN32 | CDR2-VH | GISTTGRYTGYGSAVQG | 42 |
| PRb-CN32 | CDR3-VH | SAGSTYSYWDSDAGLIDA | 43 |
| PRb-CN32 | CDR1-VL | SGGSNAGSYYYG | 44 |
| PRb-CN32 | CDR2-VL | SNNQRPS | 45 |
| PRb-CN32 | CDR3-VL | GSGDSSSIAA | 46 |
| PRb-CN32 | VH | AVTLDESGGGLQTPRGTLSLVCKASGFTFSSFNMFWVRQAPGKGLEFVAGISTTGRYTGYGSAVQGRGTISRDNGQSTVRLQLNNLRAEDTGTYYCAKSAGSTYSYWDSDAGLIDAWGHGTEVIVSSTS | 47 |
| PRb-CN32 | VL | LTQPSSVSANLGETVKITCSGGSNAGSYYYGWYQQKSPGSAPVTVIYSNNQRPSDIPSRFSGSTSGSTSTLTITGVQVDDEAVYFCGSGDSSSIAAFGAGTTLTVL | 48 |
| PRb-CN26 | CDR1-VH | GFTFSDRGIH | 49 |
| PRb-CN26 | CDR2-VH | GIGNTGSYTAYAPAVKG | 50 |
| PRb-CN26 | CDR3-VH | RGFMDAGGIDA | 51 |
| PRb-CN26 | CDR1-VL | SGGGSYAGSYYYG | 52 |
| PRb-CN26 | CDR2-VL | DNTNRPS | 53 |
| PRb-CN26 | CDR3-VL | GGYDGISDTGI | 54 |
| PRb-CN26 | VH | AVTLDESGGGLQTPGGGLSLVCKASGFTFSDRGIHWVRQAPGKGLEWVAGIGNTGSYTAYAPAVKGRATISRDNGQSTVRLQLNNLRAEDTATYYCAKRGFMDAGGIDAWGHGTEVIVSSTS | 55 |
| PRb-CN26 | VL | LTQPSSVSANPGETVKITCSGGGSYAGSYYYGWYQQKSPGSAPVTVIYDNTNRPSNIPSRFSGSLSGSTDTLTITGVQAEDEAVYFCGGYDGISDTGIFGAGTTLTVL | 56 |
| Линкер (для получения scFv) |
VL-VH | GQSSRSSGGGGSSGGGGS | 57 |
| Константная область каппа (Ck) | * | RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSLPVTKSFNRGES | 58 |
| Линкер (для получения биспецифического антитела) |
scFv-Ck | (GGGGS)3 | 59 |
Антитела PRb-CN16, PRb-CN32 и PRb-CN26 не конкурируют с hPDGF-BB, поэтому они скорее всего будут вступать в связь с иммуноглобулин-подобными доменами 1, 4 или 5 рецептора hPDGFR-β. Подтверждено связывание всех антител PRb-CN16, PRb-CN32 и PRb-CN26 с рецепторами hPDGFR-β, mPDGFRβ, PDGFRβ резуса, PDGFRβ макаки-крабоеда и PDGFR-β кабана. Было подтверждено, что цитотоксичность PRb-CN01 и PRb-32 эквивалентна независимо от наличия или отсутствия mPDGF-BB, и что PRb-CN01 и PRb-32 представляют собой суррогатные антитела (фиг. 20а и 20b).
Новые антитела в соответствии с настоящим изобретением, такие как антитела PRb-CN16, PRb-CN32 и PRb-CN26, их фрагменты, смеси или производные обладают связывающей способностью в диапазоне от 1 x 10-7 М до 1 x 10-11 М для рецептора PDGF, если их используют для получения биспецифического антитела с антителом к антигену котинина.
Оценка эффективности клеточной интернализации антитела к человеческому PDGFR-β (hPDGFR-β) в качестве примера целевого антигена, согласно настоящему изобретению, в отсутствие hPDGF-BB показывает, что PRb-CN32 наиболее эффективно интернализуется в перициты человека, PRb-CN16 занимает второе место, а PRb-CN26 не интернализуется совсем. Кроме того, при оценке эффективности клеточной интернализации при введении hPDGF-BB все антитела PRb-CN16, PRb-CN32 и PRb-CN26 демонстрируют высокую клеточную интернализацию. При изготовлении конъюгата антитела с лекарственным препаратом конъюгат интернализуется в клетку и высвобождает лекарственный препарат. Таким образом, антитело hPDGFR-β согласно настоящему изобретению переходит в целевую клетку и в достаточной мере интернализуется. При изготовлении конъюгата антитела с лекарственным препаратом с использованием антитела, конъюгат интернализуется в клетку и высвобождает лекарственный препарат, что способствует повышению эффективности препарата. Пациенты с заболеваниями, связанными с возрастной макулярной дегенерацией влажного типа и PDGFR-β, имеют повышенный уровень экспрессии PDGFR-β и/или повышенный уровень экспрессии PDGF-BB, и эти повышенные уровни экспрессии, как правило, подавляют интернализацию или эффективность антител. В этом отношении антитело к антигену PDGFR-β, в соответствии с настоящим изобретением, имеет преимущество в том смысле, что уровень интернализации антитела не снижается или интернализация дополнительно растет даже в условиях повышения уровня экспрессии PDGF-BB.
Когда PRb-CN32 и PRb-CN26 из группы антител PRb-CN16, PRb-CN32 и PRb-CN26 образуют комплекс с котинин-дуокармицином, они проявляют наибольшую цитотоксичность. Поэтому его можно считать наиболее эффективным проводником для таких лекарственных препаратов, как дуокармицин.
Все антитела PRb-CN16, PRb-CN32 и PRb-CN26 показали более высокую цитотоксичность по сравнению с контролем антиген mCD154 x котинин scFv-Cκ-scFv в клеточных линиях, экспрессирующих PDGFR-β в присутствии hPDGF-BB или без него; в частности, более высокую цитотоксичность показали PRb-CN26 и PRb-CN32 (фиг. 14а и 14b). Кроме того, все антитела PRb-CN16, PRb-CN32 и PRb-CN26 обладают эквивалентной цитотоксичностью в клеточной линии, не экспрессирующей hPDGFR-β, по сравнению с контролем антиген mCD154 x котинин scFv-Cκ-scFv. Поэтому биспецифическое антитело-лекарственный препарат (IC50) отличается различной токсичностью в клеточных линиях, не экспрессирующих hPDGFR-β, и клеточных линиях, экспрессирующих hPDGFR-β; он проявляет токсичность в более низкой концентрации в клеточных линиях, экспрессирующих hPDGFR-β, и при такой концентрации демонстрирует более высокую токсичность в патологических клетках или тканях, экспрессирующих большое количество hPDGFR-β, и минимальную токсичность в нормальных клетках или тканях. Кроме того, у пациентов с возрастной макулярной дегенерацией влажного типа и PDGFR-β повышены уровни экспрессии PDGFR-β (C. Zehetner, R. Kirchmair, SB Neururer, MT Kralinger, NE Bechrakis, GF Kieselbach, Systemic upregulation of PDGF-B in patients with neovascular AMD, Invest Ophthalmol Vis Sci. 55 (2014) 337-44) - К. Зетнер и др., Исследовательская офтальмология и изучение зрения 55 (2014) 337-44) и/или уровни экспрессии PDGF-BB (К. Зетнер, Р. Кирчмэйр, С.Б. Нойрурер, М.Т. Кралингер, Н.Э. Бечракис, Г.Ф. Кизельбах, Системное повышение экспрессии PDGF-B у пациентов с неоваскулярной возрастной макулярной дегенерацией, Исследовательская офтальмология и изучение зрения 55 (2014) 337-44)), и такие повышенные уровни экспрессии имеют тенденцию к ингибированию интернализации или эффективности антител. В этом отношении антитело к антигену PDGFR-β, в соответствии с настоящим изобретением, имеет преимущество в том смысле, что уровень интернализации антитела не снижается или интернализация дополнительно растет даже в условиях повышения уровня экспрессии PDGF-BB.
Точнее говоря, антитело, согласно настоящему изобретению, осуществляет специфическую связь с бета-рецептором тромбоцитарного фактора роста (PDGFR-β) и может представлять собой антитело к рецептору антигена PDGF или его антигенсвязывающий фрагмент, содержащее или содержащий вариабельную область тяжелой цепи и вариабельную область легкой цепи,
причем в вариабельную область тяжелой цепи антитела к рецептору антигена PDGF входит VH-CDR1, содержащая аминокислотную последовательность с SEQ ID NO (идентификационным номером): 1, 9, 17, 25, 33, 41 или 49, VH-CDR2, содержащая аминокислотную последовательность с SEQ ID NO: 2, 10, 18, 26, 34, 42 или 50, и VH-CDR3, содержащая аминокислотную последовательность с SEQ ID NO: 3, 11, 19, 27, 35, 43 или 51, и
причем в вариабельную область легкой цепи антитела к рецептору антигена PDGF входит VL-CDR1, содержащая аминокислотную последовательность с SEQ ID NO: 4, 12, 20, 28, 36, 44 или 52, VL-CDR2, содержащая аминокислотную последовательность с SEQ ID NO: 5, 13, 21, 29, 37, 45 или 53, и VL-CDR3, содержащая аминокислотную последовательность с SEQ ID NO: 6, 14, 22, 30, 38, 46 или 54.
Антитело к рецептору антигена PDGF или его антигенсвязывающий фрагмент осуществляет неконкурентную связь с PDGF-BB и содержит, например, вариабельную область тяжелой цепи VH-CDR1, содержащую аминокислотную последовательность с SEQ ID NO: 1, 33, 41 или 49, VH-CDR2, содержащую аминокислотную последовательность с SEQ ID NO: 2, 34, 42 или 50, и VH-CDR3, содержащую аминокислотную последовательность с SEQ ID NO: 3, 35, 43 или 51, и
вариабельную область легкой цепи с VL-CDR1, содержащую аминокислотную последовательность с SEQ ID NO: 4, 36, 44 или 52, VL-CDR2, содержащую аминокислотную последовательность с SEQ ID NO: 5, 37, 45 или 53, VL-CDR3, содержащую аминокислотную последовательность с SEQ ID NO: 6, 38, 46 или 54.
Антитело к рецептору антигена PDGF или его антигенсвязывающий фрагмент могут быть интернализованы клеткой, экспрессирующей PDGFR-β, и содержать, например,
вариабельную область тяжелой цепи с VH-CDR1, содержащей аминокислотную последовательность с SEQ ID NO: 1, 17, 25, 33, 41 или 49, VH-CDR2, содержащей аминокислотную последовательность с SEQ ID NO: 2, 18, 26, 34, 42 или 50, и VH-CDR3, содержащей аминокислотную последовательность с SEQ ID NO: 3, 19, 27, 35, 43 или 51, и
вариабельную область легкой цепи с VL-CDR1, содержащей аминокислотную последовательность с SEQ ID NO: 4, 20, 28, 36, 44 или 52, VL-CDR2, содержащей аминокислотную последовательность с SEQ ID NO: 5, 21, 29, 37, 45 или 53, и VL-CDR3, содержащей аминокислотную последовательность с SEQ ID NO: 6, 22, 30, 38, 46 или 54.
Специфическое антитело к рецептору антигена PDGF или его антигенсвязывающий фрагмент, согласно настоящему изобретению, может содержать:
(a) VH-CDR1 - VH-CDR3, каждая из которых содержит аминокислотную последовательность с SEQ ID NO: 1-3, и VL-CDR1 - VL-CDR3, каждая из которых содержит аминокислотную последовательность с SEQ ID NO: 4-6,
(b) VH-CDR1 - VH-CDR3, каждая из которых содержит аминокислотную последовательность с SEQ ID NO: 9-11, и VL-CDR1 - VL-CDR3, каждая из которых содержит аминокислотную последовательность с SEQ ID NO: 12-14,
(c) VH-CDR1 - VH-CDR3, каждая из которых содержит аминокислотную последовательность с SEQ ID NO: 17-19, и VL-CDR1 - VL-CDR3, каждая из которых содержит аминокислотную последовательность с SEQ ID NO: 20-22,
(d) VH-CDR1 - VH-CDR3, каждая из которых содержит аминокислотную последовательность с SEQ ID NO: 25-27, и VL-CDR1 - VL-CDR3, каждая из которых содержит аминокислотную последовательность с SEQ ID NO: 28-30,
(e) VH-CDR1 - VH-CDR3, каждая из которых содержит аминокислотную последовательность с SEQ ID NO: 33-35, и VL-CDR1 - VL-CDR3, каждая из которых содержит аминокислотную последовательность с SEQ ID NO: 36-38,
(f) VH-CDR1 - VH-CDR3, каждая из которых содержит аминокислотную последовательность с SEQ ID NO: 41-43, и VL-CDR1 - VL-CDR3, каждая из которых содержит аминокислотную последовательность с SEQ ID NO: 44-46, или
(g) VH-CDR1 - VH-CDR3, каждая из которых содержит аминокислотную последовательность с SEQ ID NO: 49-50, и VL-CDR1 - VL-CDR3, каждая из которых содержит аминокислотную последовательность с SEQ ID NO: 52-54.
Один из вариантов осуществления настоящего изобретения относится к использованию системы доставки лекарственного препарата, предназначенной для доставки лекарственного препарата в клетки или ткани, содержащие рецептор PDGF, в частности, рецептор PDGF-β на поверхности клетки, и содержащей антитело к рецептору антигена PDGF. Антитело к рецептору антигена PDGF или его антигенсвязывающий фрагмент воздействует на целевую клетку, содержащую рецептор PDGF, и интернализуется внутрь целевой клетки с целью эффективной доставки веществ, конъюгированных с антителом или его антигенсвязывающим фрагментом, в целевую клетку. Доставляемый лекарственный препарат представляет собой препарат, способный осуществлять связь с антителом к рецептору антигена PDGF непосредственно или через линкер, с формированием конъюгата антитела с лекарственным препаратом или конъюгата гаптена с лекарственным препаратом для связывания с антителом к рецептору антигена PDGF через гаптен.
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения предложен комплекс, содержащий антитело к рецептору антигена PDGF или его антигенсвязывающий фрагмент, и способный создавать конъюгатные соединения, в частности, химиотерапевтический препарат, фермент, пептид, аптамер, токсин, аффинный лиганд или детекторную метку, а также конъюгатное соединение. В зависимости от типа конъюгатного соединения комплекс можно различным образом применять для диагностики или лечения заболевания.
Следующий вариант осуществления настоящего изобретения относят к конъюгату антитела с лекарственным препаратом, причем лекарственный препарат конъюгирован с антителом к рецептору антигена PDGF или антигенсвязывающим фрагментом антитела. Конъюгат антитела с лекарственным препаратом может представлять собой конъюгат, причем лекарственный препарат связан с антителом к рецептору антигена PDGF через нековалентную или ковалентную связь.
В настоящем документе под «конъюгирующим телом» или «конъюгатом» понимают антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, или другую раскрытую ниже молекулу, в частности, раскрытую ниже гибридную молекулу терапевтического агента. В конъюгате антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, согласно настоящему изобретению, физически связан с другой молекулой посредством ковалентной связи, физической силы Ван-дер-Ваальса, гидрофобного взаимодействия, инкапсуляции, встраивании или комбинации вышеперечисленных средств. В конъюгате, согласно одному из вариантов осуществления, антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, согласно настоящему изобретению, могут быть связаны пептидным линкером.
Другим вариантом осуществления настоящего изобретения может быть биспецифическое антитело, содержащее антитело к рецептору антигена PDGF или его антигенсвязывающий фрагмент, специфически распознающие гаптен, способный к конъюгации с лекарственным препаратом. Антиген-cвязывающий фрагмент антитела представляет собой фрагмент антитела, содержащий, по меньшей мере, одну определяющую комплементарность область и может иметь вид scFv, (scFv)2, scFv-Fc, Fab, Fab' и F(ab')2. Согласно настоящему изобретению, «мультиспецифический антигенсвязывающий белок» или «мультиспецифическое антитело» нацелено на два или более антигенов или эпитопов и содержит два и более антигенсвязывающих участков. Согласно настоящему изобретению, «биспецифический» или «двойной специфический» антигенсвязывающий белок или антитело является гибридным антигенсвязывающим белком или антителом, содержащим два различных антигенсвязывающих участков. Такое биспецифическое антитело представляет собой разновидность мультиспецифического антигенсвязывающего белка или мультиспецифического антитела и может быть получено различными известными методами, например, слиянием гибридом или соединением фрагментов Fab'.
Если система доставки лекарственного препарата, в соответствии с настоящим изобретением, содержит распознающее гаптен антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, лекарственный препарат может осуществлять связь с гаптеном, а затем с антителом к рецептору антигена PDGF или его антигенсвязывающим фрагментом через гаптен таким образом, чтобы воздействовать на клетки. Лекарственный препарат, доставляемый в целевую клетку, может представлять собой препарат для профилактики, облегчения течения или лечения заболеваний, связанных с PDGF или рецепторами PDGF, например, неоваcкулярных расстройств.
Одним из вариантов осуществления настоящего изобретения является фармацевтическая композиция для профилактики, облегчения течения или лечения неоваскулярных заболеваний, содержащая конъюгат антитела с лекарственным препаратом, причем лекарственный препарат конъюгируют с антителом к рецептору антигена PDGF или его антигенсвязывающим фрагментом, или конъюгат антитела с лекарственным препаратом, причем лекарственный препарат конъюгируют через гаптен с антителом к рецептору антигена PDGF или его антигенсвязывающим фрагментом.
Один из вариантов осуществления настоящего изобретения представляет собой способ лечения пациента с диагностированным неоваскулярным заболеванием или имеющего риск возникновения неоваскулярного заболевания, содержащий этап введения пациенту конъюгата антитела с лекарственным препаратом, в котором лекарственный препарат конъюгируют с антителом к рецептору антигена PDGF или его антигенсвязывающим фрагментом, или конъюгата антитела с лекарственным препаратом, в котором лекарственный препарат конъюгируют через гаптен с антителом к рецептору антигена PDGF или его антигенсвязывающим фрагментом, в достаточном количестве для предотвращения, облегчения течения или лечения заболевания пациента в качестве первого терапевтического средства или вспомогательного терапевтического средства.
В другом варианте осуществления фармацевтическая композиция, согласно настоящему изобретению, представляет собой средство для профилактики, облегчения течения, ингибирования или лечения неоваскулярных заболеваний глаз.
К глазным неоваскулярным заболеваниям, для лечения или ослабления которых можно использовать фармацевтическую композицию, согласно настоящему изобретению, относят ишемическую ретинопатию, неоваскуляризацию радужной оболочки, внутриглазную неоваскуляризацию, возрастную макулярную дегенерацию, неоваскуляризацию роговицы, неоваскуляризацию сетчатки, хороидальную неоваскуляризацию, диабетическую ретинальную ишемию или пролиферативную диабетическую ретинопатию.
В частности, животная модель с кислородно-индуцированной болезнью сетчатки представляет собой животную модель ретинопатии недоношенного ребенка (A. Hellström, LE Smith, D. Dammann, Retinopathy of prematurity, Lancet. 382 (2013) 1445-57 - A. Хелльстрём, Л.Э. Смит, Д. Дамманн, Ретинопатия недоношенных, Ланцет. 382 (2013) 1445-57). Животная модель с лазерно-индуцированной хороидальной неоваскуляризацией представляет собой животную моделью возрастной макулярной дегенерации влажного типа (V. Lambert, J. Lecomte, S. Hansen, S. Blacher, ML. Gonzalez, et al, Laser-induced choroidal neovascularization model to study age-related macular degeneration in mice, Nat Protoc. 8 (2013) 2197-211 - В. Ламберт, Я. Леком, С. Хансен, С. Блахер, М.Л. Гонзалес и др., Модель лазерно-индуцированной хороидальной неоваскуляризации для изучения возрастной макулярной дегенерации у мышей, Nat Protoc. 8 (2013) 2197-211). Оба заболевания вызваны важным механизмом ангиогенеза. Подобно пролиферативной диабетической ретинопатии, его также можно использовать в качестве терапевтического средства при таких заболеваниях, как пролиферативная диабетическая ретинопатия, причем важным механизмом является ангиогенез (Y. Qazi, Mediators of ocular angiogenesis, J. Genet. 88 (2009) 495-515) - Й. Квази, Медиаторы ангиогенеза глаз, Журнал генетики 88 (2009) 495-515)).
В другом варианте осуществления фармацевтическая композиция, согласно настоящему изобретению, представляет собой средство для профилактики, облегчения течения, ингибирования или лечения неоваскулярных заболеваний, в частности, рака или онкологических заболеваний. Под раком понимают связанный с PDGFR-β рак, в частности, ретинобластому, глиому, рак яичек, рак молочной железы, рак яичников, меланому, рак легких и рак предстательной железы, но не ограничиваясь этим.
Кроме того, к заболеваниям, связанным с PDGFR-β, проявляющим цитотоксичность в NIH3T3, экспрессирующих mPDGFRb, и перицитах человека, экспрессирующих hPDGFR-β, относят ретинобластому (ZK Goldsmith et al., Invest.Ophthalmol. Vis.Sci. 59 (2018) 4486-4495), glioma (I. Nazarenko et al., J. Med. Sci. 117 (2012) 99-112), colorectal cancer (S. Fujino et al., Oncol. Rep. 39 (2018) 2178-2184), testicular cancer (S. Basciani et al., Endocrinology. 149 (2008) 6226-35), breast cancer (J. Paulsson et al., J. Pathol) Clin.Res. 3 (2017) 38-43), ovarian cancer (S. Avril et al., Oncotarget. 8 (2017) 97851-97861), melanoma, lung cancer, prostate cancer (M. Raica et al., Pharmaceuticals (Basels). 3 (2010) 572-599) - З.К. Гольдсмит и др., Исследовательская офтальмология и изучение зрения 59 (2018) 4486-4495), глиому (И. Назаренко с др., Журнал медицинских наук 117 (2012) 99-112), колоректальный рак (С. Фуджино с др., Онкол. записки. 39 (2018) 2178-2184), рак яичек (С. Басциани с др., Эндокринология. 149 (2008) 6226-35), рак молочной железы (Дж. Полсон с др., Дж. Патол) Клин. исслед. 3 (2017) 38-43), рак яичников (С. Аврил с др., Онкотаргет. 8 (2017) 97851-97861), меланому, рак легких, рак предстательной железы (М. Райка с др., Фармацевтика (Базель). 3 (2010) 572-599), и пр.
В данном тексте термины «ангиогенез» и «неоваскуляризация» взаимозаменяемы. Ангиогенез и неоваскуляризация относятся к развитию новых кровеносных сосудов в клетках, тканях или органах. Регулирование ангиогенеза, как правило, изменяется в определенных состояниях заболевания, и во многих случаях патологическое повреждение, связанное с этим заболеванием, также обусловлено измененным, нерегулируемым или неконтролируемым ангиогенезом. Устойчивый и нерегулируемый ангиогенез возникает при ряде заболеваний, в том числе демонстрирующих аномальный рост эндотелиальных клеток, и поддерживает патологическое повреждение, наблюдаемое в этих условиях, в том числе разрушение и проницаемость кровеносных сосудов.
В настоящей заявке «глазное неоваскулярное заболевание» или «глазное неоваскулярное расстройство» относят к заболеванию, характеризующемуся неизменяющейся и неконтролируемой неоваскуляризацией в глазах пациента. В качестве примера глазного неоваскулярного заболевания можно назвать ишемическую ретинопатию, ангиогенез радужной оболочки глаза, внутриглазной ангиогенез, возрастную макулярную дегенерацию, ангиогенез роговицы, ангиогенез сетчатки, хороидальный ангиогенез, диабетическую ретинальную ишемию, пролиферативную диабетическую ретинопатию и тому подобное.
В настоящей заявке под «PDGF» или «тромбоцитарным фактором роста» понимают тромбоцитарный фактор роста млекопитающих, влияющий на процесс неоваскуляризации или ангиогенеза. В настоящей заявке «PDGF», как правило, относят к классу факторов роста, которые индуцируют синтез ДНК и митоз путем связывания и активации рецепторов тромбоцитарного фактора роста поверхности клеток (т.е. рецепторов PDGF) к типам реактивных клеток.
Согласно настоящему изобретению, наблюдается, что одноцепочечный вариабельный фрагмент (scFv) гибридного белка в составе антитела к бета-рецептору тромбоцитарного фактора роста (mPDGFR-β) и константной области каппа (Cκ)-scFv и котинин-дуокармицин образуют комплекс конъюгата антитела с лекарственным препаратом для индукции цитотоксичности к клеткам, экспрессирующим PDGFR-β. Улучшенный подход к отбору антител при изготовлении конъюгата антитела лекарственным препаратом содержит подготовку ряда кандидатов антител к антигену mPDGFR-β в формате биспецифического гибридного белка scFv-Cκ-scFv и тестирование их способности доставлять цитотоксичные препараты, связанные с котинином.
Один из вариантов осуществления настоящего изобретения относится к способу отбора антитела, эффективно доставляющего лекарственный препарат в целевую клетку с использованием конъюгата гаптена с лекарственным препаратом и биспецифического антитела.
Следующий вариант осуществления настоящего изобретения относится к конъюгату антитела с лекарственным препаратом, содержащему выбранное антитело и лекарственный препарат, или к комплексу, содержащему выбранное антитело и лекарственный препарат.
Конъюгат гаптена с лекарственным препаратом, используемый в способе, согласно настоящему изобретению, представляет собой конъюгат, в котором целевой лекарственный препарат, который должен быть доставлен в целевую клетку, и гаптен связаны между собой. Гаптен представляет собой вещество, отсутствующее в естественном состоянии организма для предотвращения связывания с клетками, не биосинтезируется вновь в организме, не вызывает физиологической активности и содержит химическую функциональную группу для эффективного связывания с веществом, с которым должно быть выполнено сопряжение. Виды гаптена, используемого в данном изобретении, по существу, не ограничены; в частности, можно использовать котинин, органические молекулы с малой молекулярной массой, такие как DNP (2,4-динитрофенол), TNP (2,4,6-тринитрофенол), биотин и дигоксигенин.
Котинин, как пример гаптена, представляет собой идеальный гаптен для использования в этой платформе, что обусловлено его экзогенностью, нетоксичностью и физиологической инертностью как основного метаболита никотина. Транс-4-котинин-карбоксильная кислота может осуществлять связь с несколькими веществами. Конъюгат котинина с лекарственным препаратом легко синтезируют, он имеет более высокую чистоту по сравнению с существующим конъюгатом антитела и лекарственного препарата и его можно синтезировать как конъюгат котинина с лекарственным препаратом, содержащий различные лекарственные препараты и линкеры. Кроме того, поскольку лекарственный препарат непосредственно не конъюгируется с антителом, он не влияет на сродство и стабильность антитела. Конъюгаты антител с лекарственными препаратами получают путем простой реакции биспецифического антитела с конъюгатом котинина с лекарственным препаратом.
Лекарственные препараты, которые можно использовать в настоящем изобретении, представляют собой вещества, которые должны быть доставлены к мишени с использованием антител, и, по существу, не ограничены; но например, к ним относятся ингибиторы синтеза ДНК (например, калихимицин, пирролбензодиазепин (PBD), производное дуокармицина, антрациклин/неморубицин, доксорубицин, иринотекан, аматоксин), ингибиторы микротрубочек (например, ауристатин, майтансин, тубулизин), ингибитор топоизомеразы (SN-38), фотосенсибилизатор (например, 5-аминолевулиновая кислота (ALA), производное бензопорфирина-монокислотное кольцо А (BPD-MA), хлорины, тетра (m-гидроксифенил)хлорин (mTHPC), лютеций тексафирин) и др. Фотосенсибилизирующий агент сам по себе не влияет на их эффективность, однако его доставляют локально или системно к целевым клеткам или тканям и используют для активации доставляемого лекарственного препарата путем облучения лазером в определенной области, например, в месте поражения, в частности, глазном яблоке или глазе, тем самым оказывая влияние на действие лекарственного препарата. Соответственно, фотосенсибилизирующий агент может быть конъюгирован с антителом и введен пациенту, после чего может быть дополнительно выполнен этап медицинского воздействия в виде облучения лазером.
Согласно настоящему изобретению, способ может использовать биспецифическое антитело, которое специфически связывается с целевым антигеном, присутствующим в целевой ткани или клетке, в которую доставляется препарат, а также может специфически связываться с гаптеном, входящим в конъюгат гаптена с лекарственным препаратом. Например, биспецифическое антитело, согласно настоящему изобретению, может иметь структуру «первое антитело-линкер-второе антитело», в котором первое и второе антитело представляют собой антитела, которые специфически связываются с гаптеном или целевым антигеном соответственно. Биспецифическое антитело со структурой «первое антитело-линкер-второе антитело» может представлять собой гибридный белок первого антитела (scFv)-Cκ(константная область каппы)-второе антитело (scFv). Например, оно может быть соединено в порядке VH-GQSSRSSGGGGSSGGGGS-VL от N-конца, а линкер соединяет C-конец VH с N-концом VL. Его структура может иметь вид (ScFv антитела к антигену PDGFR-β)-(GGGGS)3-Ck-(GGGGS)3-(scFv антитела к антигену котинина). Аминокислотная или нуклеотидная последовательность котинина, применимая к данному изобретению, широко известна в уровне техники и, например, упоминается в US8008448B.
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения, когда целевым антигеном является бета-рецептор тромбоцитарного фактора роста (PDGFR-β), а гаптен представляет собой котинин, биспецифическое антитело может представлять собой антитело, в котором антитело к целевому антигену (антитело к антигену PDGFR-β) и антитело к гаптену (антитело к антигену гаптена) связаны линкером, в частности, гибридный белок со структурой первое антитело (scFv антитело к антигену PDGFR-β)-Cκ-второе антитело (scFv антитела к антигену гаптена).
Авторы изобретения проверили осуществимость этой платформы на биспецифическом гибридном белке антитела (scFv антитела к бета-рецептору человеческого тромбоцитарного фактора роста (hPDGFRβ) x Cκ x (scFv антитела к антигену котинина). Авторами изобретения получен моновалентный или двухвалентный котинин-дуокармицин, называемый котинин-дуокармицином (кот-дуо) или котинин-дуокармицин-котинин (кот-дуо-кот) (фиг. 1b). Настоящее изобретение указывает на то, что платформу можно использовать для выбора оптимального сочетания антител и лекарственных препаратов для разработки конъюгата антитела с лекарственным препаратом по сравнению с обычной платформой.
Комплекс, содержащий биспецифическое антитело (например, гибридный белок в составе антигена PDGFRв x котинина scFv-Cк-scFv) и конъюгат гаптена с лекарственным препаратом (например, конъюгированный с котинином дуокармицин), проявляет специфическую цитотоксичность в клеточных линиях NIH3T3, экспрессирующих целевой антиген (например, mPDGFR-в). Настоящее изобретение можно использовать для выбора сочетания интернализующего антитела и лекарственного препарата при разработке конъюгата антитела с лекарственным препаратом. Примером могут служить четыре клона антител, связанных с mPDGFR-в и покрытых снизу в зависимости от дозировки (фиг. 3а), причем не обладающих реакционной способностью в отношении отрицательного контроля – человеческого белка Fc. Авторы изобретения подтвердили активность связывания отдельных клонов с клеточными линиями NIH3T3, экспрессирующими mPDGFRв, и обнаружили связывание биотин-mPDGF-BB с клетками с помощью проточной цитометрии (фиг. 4b).
Клоны антител (PRb-CC01, PRb-CC02 и PRb-CC03) к трем типам мышиных антигенов, согласно настоящему изобретению, могут осуществлять связь с доменом 2 или 3 mPDGFR-β, конкурируя с mPDGF-BB, который представляет собой лиганд mPDGFR-β. Один клон антитела (PRb-CN01) может быть связан с доменами 1, 4 или 5 вместо доменов 2 и 3, так как он не конкурирует с mPDGF-BB. Способность PRb-CC01, PRb-CC02 и PRb-CC03 к связыванию с mPDGFR-β ингибируется mPDGF-BB (фиг. 4а), а способность PRb-CN01 к связыванию не ингибируется mPDGF-BB. Авторы изобретения измерили способность каждого клона к связыванию клеток методом проточной цитометрии, когда в клетках NIH3T3, экспрессирующих mPDGFR-β, присутствовал mPDGF-BB. Авторы изобретения обнаружили, что с клетками связано биспецифическое антитело гибридного белка scFv-Cκ-scFv и биотин-mPDGF-BB. Аналогично иммуноферментному анализу конкурентов, только PRb-CN01 смогло осуществлять связь с mPDGFR-β в присутствии mPDGF-BB-биотина (фиг. 4b), а связывающая способность остальных трех клонов была заблокирована посредством mPDGF-BB.
Согласно настоящему изобретению, если антитела были экспрессированы в виде биспецифического антитела scFv-Cκ-scFv, биспецифические антитела получали способность осуществлять связь как с mPDGFR-β, так и с котинином. Кроме того, биспецифические антитела могут быть конъюгированы с несколькими котининовыми препаратами, такими как котинин-дуокармицин (кот-дуо) и котинин-дуокармицин-котинин (кот-дуо-кот). Тесты на токсичность, проводимые на таких комплексах, как кот-дуо и кот-дуо-кот, показали токсичность этих комплексов. Четыре биспецифических антитела гибридных белков scFv-Cκ-scFv (PRb-CC01, PRb-CN01, PRb-CC02, PRb-CC03) были способны одновременно осуществлять связь с mPDGFR- β и котинином, в отличие от контрольных биспецифических антител (ФИГ. 3d).
Для оценки токсичности четырех типов биспецифических антител scFv-Cκ-scFv и конъюгатов котинин-дуокармицина клетки NIH3T3 культивировали вместе с конъюгатами в двух условиях в присутствии mPDGF-BB или без него, а также проверяли на относительную жизнеспособность клеток с помощью внутриклеточного аденозинтрифосфата (АТФ). Токсичность PRb-CN01 и комплекса кот-дуо или PRb-CN01 и комплекса кот-дуо-кот также была высокой при добавлении mPDGF-BB, однако степень токсичности гибридных белков (PRb-CC01, PRb-CC02, PRb-CC03), конкурирующих с mPDGF-BB и комплексом кот-дуо или комплексом кот-дуо-кот, снизилась с добавлением mPDGF-BB (фиг. 5).
Согласно данному изобретению, для проведения теста на токсичность были приготовлен гибридный белок биспецифических антител scFv-Cκ-scFv и котинин-дуокармицин (кот-дуо) соответственно (фиг. 1b), а затем конъюгат биспецифических антител scFv-Cκ-scFv с котинин-дуокармицином (кот-дуо). В результате они показали характеристическую токсичность в перицитах человека, экспрессирующих hPDGFR-β. В результате применения настоящего изобретения возникает возможность выбора оптимального сочетания антител и лекарственных препаратов для получения конъюгатов антител с лекарственными препаратами по сравнению с обычными платформами.
Например, было обнаружено, что три клона антител, осуществляющие связь с hPDGFR-β примера целевого антигена, согласно настоящему изобретению, связаны с hPDGFR-β в зависимости от концентрации. Три гибридных белка в зависимости от концентрации связаны с hPDGFR-β с покрытием снизу (фиг. 12а), в то время как отрицательный контроль не осуществлял связи с покрытым человеческим белком Fc (фиг. 12b). Настоящим изобретением установлено, что способность каждого клона осуществлять связь с перицитами человека, экспрессирующими hPDGFR-β в присутствии hPDGF-BB, проанализированная с помощью проточного цитометра, привела к присоединению биотина-hPDGF-BB к клеткам (фиг. 13b).
Три типа клонов антител к hPDGFR-β, в соответствии с настоящим изобретением, (PRb-CN16, PRb-CN32, PRb-CN26) не конкурировали с hPDGF-BB лиганда hPDGFR-β, поэтому ожидалось, что они будут осуществлять связь с доменами 1, 4 или 5 вместо доменов 2 и 3. Способность PRb-CN16, PRb-CN32 и PRb-CN26 к связыванию с hPDGFR-β не была ингибирована hPDGF-BB (фиг. 13а).
Согласно настоящему изобретению, в присутствии hPDGF-BB в перицитах человека, экспрессирующих hPDGFR-β, методом проточной цитометрии измеряли способность каждого клона к связыванию клеток. Было подтверждено, что было связано биспецифическое антитело гибридного белка scFv-Cκ-scFv и биотин-mPDGF-BB. Подобно результату конкурентного метода иммуноферментного анализа три вида клонов антител (PRb-CN16, PRb-CN32, PRb-CN26) были способны осуществлять связь с hPDGFR-β в присутствии hPDGF-BB-биотина (фиг. 13b). Если антитело к целевому антигену, согласно настоящему изобретению, экспрессировано в виде биспецифического антитела scFv-Cκ-scFv, биспецифическое антитело может осуществлять связь как с целевым антигеном, так и с гаптеном. Кроме того, биспецифические антитела могут быть связаны с несколькими конъюгатами котинина с лекарственными препаратами, такими как котинин-дуокармицин (кот-дуо). Тесты на токсичность, проводимые на таких конъюгатах как кот-дуо, показали токсичность этих комплексов.
Три биспецифических антитела гибридных белков scFv-Cκ-scFv (PRb-CN16, PRb-CN32, PRb-CN26) к человеческому PDGFR-β, согласно настоящему изобретению, были способны одновременно осуществлять связь с hPDGFR-β и котинином, в отличие от контрольных биспецифических антител (фиг. 12d). Для оценки токсичности биспецифических антител scFv-Cκ-scFv и конъюгатов котинин-дуокармицина, изготовленных с использованием трех типов антител hPDGFR-β, человеческие перициты культивировали вместе с конъюгатами в двух разных условиях в присутствии hPDGF-BB или без него, а также проверяли на относительную жизнеспособность клеток с помощью внутриклеточного аденозинтрифосфата (АТФ). Токсичность комплексов, содержащих антитело к антигену hPDGFR-β из группы PRb-CN16, PRb-CN32, PRb-CN26 и кот-дуо, также была высокой при добавлении hPDGF-BB (ФИГ. 14a и 14b).
Авторы изобретения протестировали новую платформу для разработки конъюгата антитела с лекарственным препаратом, содержащего биспецифический белок scFv-Cκ-scFv и котинин-цитотоксичный препарат, которая упрощает процесс подбора антител и лекарственных препаратов для получения оптимального конъюгата антитела с лекарственным препаратом. В идеале, целесообразно подобрать антитела, обеспечивающие эффективную интернализацию и высвобождение цитотоксичных препаратов. Однако, поскольку производство индивидуальных специфических молекул конъюгатов антител с лекарственным препаратом с использованием кандидатов антител требует значительной работы по оптимизации и характеризации, в том числе соотношение лекарственного препарата и антитела (DAR), на начальном этапе скрининга выполняют скрининг антител по скорости и эффективности интернализации. Более того, по мере углубления рассмотрения процесса, посредством которого конъюгаты антител с лекарственными препаратами действуют на клетки, становится ясно, что интернализация антител не является единственным фактором, определяющим эффективность конъюгатов антител с лекарственными препаратами.
Котинин не токсичен и имеет значение LD50 4 ± 0,1 г/кг у крыс. Кроме того, у лиц, получавших до 1800 мг котинина в течение 4 дней подряд, не было выявлено побочных эффектов. Авторы изобретения отмечают незначительную разницу между цитотоксичностью свободного дуокармицина и конъюгатов котинин-дуокармицина вне организма. Формирование комплекса гибридного белка антитела к антигену HER2 x котинина scFv-Cκ-scFv и конъюгата котинин-дуокармицина снижает токсичность дуокармицина вне организма. Это означает, что биспецифическое антитело образует комплекс с лекарственным препаратом и уменьшает всасывание лекарственного препарата в клетку. В известных исследованиях сообщалось, что дуокармицин вызывал значительную потерю веса у мышей. Однако эксперименты на живых организмах с использованием тетравалентного биспецифического антитела, согласно настоящему изобретению, показали, что у мыши, которой вводили конъюгат котинин-дуокармицина, смешанный с отрицательным контролем IgG, не было выявлено значительной потери веса. Этот факт открывает возможность введения различных видов линкеров между котинином и токсичным препаратом (дуокармицином), а также выделения токсинов из котинина только в опухолевой среде, например, металлопротеазах. Поскольку конъюгат котинина с лекарственным средством высвобождается в опухолевой среде без деградации, он быстро выводится из кровотока, не повреждая нормальные клетки.
Даже после добавления mPDGF-BB цитотоксичность PRb-CN01, содержащего биспецифическое антитело в комплексе с кот-дуо или кот-дуо-кот, была высокой, но при добавлении mPDGF-BB, способствующего клеточной пролиферации, токсичность трех антител (PRb-CC01, PRb-CC02 и PRb-CC03), конкурирующих с mPDGF-BB в комплексе с кот-дуо или кот-дуо-кот, была несколько снижена. mPDGF-BB может усиливать интернализацию рецептора путем связывания с PDGFR-β, который уже был связан с PRb-CN01, тем самым способствуя развитию цитотоксического эффекта кот-дуо или кот-дуо-кот. Согласно настоящему изобретению, конструкция PRb-CN01 не конкурировала с PDGF-BB и индуцировала цитотоксичность независимо от PDGF-BB (ФИГ. 5a-5d). PDGFR-β тесно связан с ангиогенезом и преимущественно сверхэкспрессируется в перицитах.
[Технический эффект изобретения]
В антителе к рецептору PDGF, согласно настоящему изобретению, конъюгат антитела с лекарственным препаратом, в котором химиотерапевтический агент конъюгирован с антителом, и способе использования этого антитела и конъюгата для профилактики или лечения глазных неоваскулярных заболеваний, антитело к рецептору PDGF проявляет большую токсичность именно в определенной концентрации в отношении патологических клеток или тканей, экспрессирующих большое количество hPDGFR-β, причем проявляет минимальную токсичность в отношении нормальных клеток или тканей, что делает его пригодным для изготовления высококачественного терапевтического средства. Кроме того, антитело к рецептору PDGF имеет преимущество в том, что уровень интернализации антитела не подавляется или увеличивается, даже если повышается уровень экспрессии PDGFR-β и/или PDGF-BB.
[Краткое описание чертежей]
На фиг. 1а и 1b представлены схемы, иллюстрирующие биспецифическое антитело, связанное с антителом к антигену mPDGFR-β и котинин-дуокармицином, согласно одному из примеров настоящего изобретения.
На фиг. 2 показан результат электрофореза в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия биспецифического антитела, связанного с антителом к антигену mPDGFR-β, согласно настоящему изобретению. Трек 1, восстановленный PRb-CC03 x котинин; трек 2, невосстановленный PRb-CC03 x котинин; трек 3, восстановленный PRb-CC01 x котинин; трек 4, невосстановленный PRb-CC01 x котинин; трек 5, восстановленный PRb-CN01 x котинин; трек 6, невосстановленный PRb-CN01 x котинин; трек 7, восстановленный PRb-CC02 x котинин; трек 8, невосстановленный PRb-CC02 x котинин; трек 9, восстановленный анти-HER2 x котинин (контроль); трек 10, невосстановленный анти-HER2 x котинин (контроль). M: маркер молекулярного веса.
На фиг. 3а приведен график, иллюстрирующий способность к связыванию биспецифического антитела, связанного с антителом к антигену mPDGFR-β, в соответствии с вариантом осуществления настоящего изобретения, причем биспецифическое антитело PRb-CC01 (●), PRb-CN01 (■), PRb-CC02 (▲), PRb-CC03 (▼) и отрицательный контроль (◆) были инкубированы на планшете, покрытом гибридом mPDGFR-β. Каждая лунка реагировала с пероксидазой хрена-антителом к антигену человеческого Cκ и тетраметилбензидином. В результате получают среднее значение ± стандартную погрешность дублирующих экспериментов. На фиг. 3b изображена внеклеточная область рецептора TNF-α - гибридный белок человеческого Fc, используемые в качестве отрицательного контрольного антигена для иммуноферментного анализа. На фиг. 3с для подтверждения способности гибридного белка биспецифического антитела scFv-Cκ-scFv к связыванию с котинином биспецифическое антитело scFv-Cκ-scFv реагировало на планшете, покрытым котинин-бычьим сывороточным альбумином, и реагировало с пероксидазой хрена-антителом к антигену человеческого Cκ и тетраметилбензидином. На фиг. 3d для подтверждения способности гибридного белка биспецифического антитела scFv-Cκ-scFv к одновременному связыванию с котинином и mPDGFR-β гибрид mPDGFR-β реагировал на планшете, покрытым котинин-бычьим сывороточным альбумином, и была выполнена обработка пероксидазой хрена-антителом к антигену человеческого Cκ и тетраметилбензидином. В результате получают среднее значение ± стандартную погрешность трех повторяющихся экспериментов. ***p < 0,001 сравнивали с контрольной группой.
На фиг. 4а-4с представлены графики, подтверждающие конкуренцию и внутриклеточную интернализацию PDGF-BB и биспецифических антител, связанных с антителом к антигену mPDGFR-β. На фиг. 4а, планшет, покрытый гибридом PDGFR-β-Fc, реагировал с scFv-Cκ-scFv в отсутствие (слева) или в присутствии (справа) mPDGF-BB (100 нМ), после чего с помощью пероксидазы хрена-антитела к антигену человеческого Cκ и тетраметилбензидина измеряли связанный гибридный белок биспецифического антитела. На фиг. 4b в проточном цитометрическом буфере гибридный белок биспецифического антитела scFv-Cκ-scFv (100 нМ) реагировал с клетками NIH3T3, экспрессирующими mPDGFR-β, в присутствии mPDGF-BB-биотина или без него. Клетки были обработаны APC-антителом к антигену человеческого Cκ и стрептавидином-фикоэритрином. В качестве отрицательного контроля использовали гибридный белок биспецифического антитела anti-HER2 x котинин scFv-Cκ-scFv. Интернализация гибридного белка биспецифического антитела scFv-Cκ-scFv была визуализирована методом конфокальной микроскопии. После обработки клеток NIH3T3 гибридным белком были удалены антитела, связанные на поверхности клетки. После фиксации клеток гибридный белок был окрашен ФИТЦ-антителом к антигену человеческого Cκ (зеленым). Для визуализации ранних эндосом клетки были окрашены антителом анти-Rab5 и антителом козы Alexa Fluor 546, меченным кроличьим IgG (красным). Стрелкой обозначена увеличенная часть, в которой ко-локализована флуоресценция гибридного белка антитела PDGFR-β x котинина scFv-Cκ-scFv и исходная эндосома. ДНК была окрашена DAPI (синим) (шкала, 10 мкМ).
На фиг. 5а-5d представлены графики, подтверждающие цитотоксическую способность биспецифического антитела к антигену mPDGFR-β и комплексов котинин-дуокармицина к клеткам, экспрессирующим PDGFR-β. На фиг. 5а показано, что клетки NIH3T3 были обработаны гибридным белком биспецифического антитела scFv-Cκ-scFv и комплексом кот-дуо в отсутствие mPDGF-BB. Клеточный АТФ был измерен для оценки относительной жизнеспособности клеток. В качестве отрицательного контроля использовали гибридный белок биспецифического антитела anti-HER2 x котинин scFv-Cκ-scFv. На фиг. 5b эксперимент был повторен в присутствии mPDGF-BB. На фиг. 5c клетки NIH3T3 обрабатывали комплексом биспецифического антитела и кот-дуо-кот в отсутствие mPDGF-BB. На фиг. 5d эксперимент был повторен в присутствии mPDGF-BB. ДМСО применяли в качестве контроля растворителя для комплексов кот-дуо и кот-дуо-кот. В результате получают среднее значение ± стандартную погрешность трех повторяющихся экспериментов.
На фиг. 6 представлен график, иллюстрирующий результат проверки проточным цитометром способности биспецифического антитела, связанного с антителом к антигену mPDGFR-β, в соответствии с настоящим изобретением, к связыванию с клетками MOLT-4, не экспрессирующими PDGFR-β. Клетки MOLT-4 были обработаны биспецифическим антителом (100 нМ) и окрашены APC-антителом к антигену человеческого Cκ (клон TB28-2, BD Biosciences, Сан-Хосе, Калифорния, США).
На фиг. 7 изображен график, подтверждающий цитотоксическую способность биспецифического антитела, связанного с антителом к антигену mPDGFR-β и комплексами кот-дуо в клетках, не экспрессирующих PDGFR-β. На Фиг. 7a клетки MOLT-4 вступали в реакцию с биспецифическим антителом и комплексом кот-дуо (DAR4). Клеточный АТФ был измерен для оценки относительной жизнеспособности клеток. На Фиг. 7b клетки MOLT-4 вступали в реакцию с биспецифическим антителом и комплексом кот-дуо (DAR2). В качестве отрицательного контроля использовали биспецифическое антитело anti-HER2 x котинин scFv-Cκ-scFv. ДМСО применяли в качестве контроля растворителя для комплекса кот-дуо. В результате получают среднее значение ± стандартную погрешность трех повторяющихся экспериментов.
На фиг. 8 показан результат эксклюзионной хроматографии биспецифического антитела, содержащего антитело к антигену mPDGFR-β, в соответствии с настоящим изобретением. Анализ биспецифических антител, комплекса биспецифических антител и кот-дуо, комплекса биспецифических антител и кот-дуо-кот, предложенных настоящим изобретением, выполнен с применением эксклюзионной ВЭЖХ-хроматографии на приборе Dionex Ultimate 3000 с колонкой Sepax SRT-C SEC-300. Мобильную фазу использовали в качестве фосфатно-солевого буфера, а мобильный растворитель элюировали со скоростью 1 мл/мин в течение 15 минут. Ультрафиолетовый детектор настроен на длину волны 254 нМ, а результаты контролировались по мЕА. HMW означает «высокомолекулярные соединения».
На фиг. 9 изображен результат, показывающий, что биспецифическое антитело, связанное с антителом к антигену mPDGFR-β и комплексами кот-дуо, в соответствии с настоящим изобретением, ингибирует ангиогенез в животной модели с кислород-индуцированным заболеванием сетчатки глаза.
На фиг. 10 показано, что биспецифическое антитело, связанное с антителом к антигену mPDGFR-β и комплексами кот-дуо, в соответствии с настоящим изобретением, ингибирует ангиогенез в животной модели с индуцированной лазером хороидальной неоваскуляризацией.
На фиг. 11 показан результат электрофореза в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия гибридного белка scFv-Cκ-scFv как биспецифического антитела, связанного с антителом к антигену hPDGFR-β, согласно настоящему изобретению. Трек 1, восстановленный PRb-CN16 x котинин; трек 2, невосстановленный PRb-CN16 x котинин; трек 3, восстановленный PRb-CN26 x котинин; трек 4, невосстановленный PRb-CN26 x котинин; трек 5, восстановленный PRb-CN32 x котинин; трек 6, невосстановленный PRb-CN32 x котинин; трек 7, восстановленный anti-mCD154 x котинин (контроль); трек 8, невосстановленный anti-mCD154 x котинин (контроль); М, маркер молекулярного веса.
На фиг. 12а биспецифические антитела гибридного белка scFv-Cκ-scFv, в частности PRb-CN16 (●) PRb-CN32 (■) и PRb-CN26 (▲), отрицательный контроль (◆) и гибридный белок котинина scFv-Ck-ScFv вступали в реакцию в различных концентрациях на микротитрационных планшетах с гибридным покрытием hPDGFRβ. На фиг. 12b показан результат реакции антитела к HRP-антигена человека Cκ и TMB в каждой лунке, причем результаты отражены в виде средней величины ± стандартной погрешности дублирующих экспериментов. На фиг. 12c изображена внеклеточная область рецептора TNF-α - гибридный белок человеческого Fc, используемые в качестве отрицательного контрольного антигена для иммуноферментного анализа. На фиг. 12d с целью подтверждения способности к связыванию биспецифического антитела, связанного с антителом к антигену hPDGFR-β, в соответствии с настоящим изобретением, гибридный белок биспецифического антитела scFv-Cκ-scFv культивировали на пластине, покрытой котинин-бычьим сывороточным альбумином, и обрабатывали конъюгированным с пероксидазой хрена антителом к антигену человеческого Cκ и тетраметилбензидином. Для подтверждения одновременного связывания гибридных белков биспецифического scFv-Cκ-scFv с котинином и hPDGFR-β гибрид hPDGFRβ-Fc культивировали в микротитрационных лунках, покрытых котинин-бычьим сывороточным альбумином, и обрабатывали конъюгированным с пероксидазой хрена антителом к антигену человеческого Fc, а также тетраметилбензидином. Результаты отражены в виде среднего значения ± среднеквадратическое отклонение по трем повторяющимся экспериментам. ***p < 0,001 сравнивали с контролями.
На фиг. 13а-13d представлены графики, подтверждающие конкуренцию и клеточную интернализацию биспецифического антитела, связанного с антителом HPDGFRβ, в соответствии с настоящим изобретением, с PDGF-BB. На фиг. 13а на микротитрационных планшетах с покрытием гибридом hPDGFRβ-F инкубировали гибридные белки биспецифического scFv-Cκ-scFv в отсутствие (слева) или в присутствии (справа) hPDGF-BB (100 нМ), а количество связанного гибридного белка биспецифического антитела с помощью конъюгированного с пероксидазой хрена антитела к антигену человеческого Cκ и тетраметилбензидина. На фиг. 13b перициты человека, экспрессирующие hPDGFR-β, обрабатывали биспецифическими белками scFv-Cκ-scFv (100 нМ) в проточно-цитометрическом буфере в отсутствие hPDGF-BB-биотина или в его присутствии. Клетки были обработаны конъюгированным с APC антителом к антигену человеческого Cκ и стрептавидином-фикоэритрином. В качестве отрицательного контроля использовали гибридный белок биспецифического антитела mCD154 x котинин scFv-Cκ-scFv. На фиг. 13c интернализация гибридного белка биспецифического антитела scFv-Cκ-scFv была визуализирована методом конфокальной микроскопии. После инкубации перицитов человека с гибридными белками были удалены связанные c поверхностью антитела. После фиксации клеток гибридные белки были окрашены конъюгированным с ФИТЦ антителом к антигену человеческого Cκ (зеленым). Для визуализации ранней эндосомы клетки инкубировали с антителами anti-Rab5 и антителами козы Alexa Fluor 546, конъюгированными с кроличьим IgG (красными). Обозначена увеличенная часть, показывающая ко-локализацию гибридных белков антитела hPDGFR-β x котинина scFv-Cκ-scFv и ранних эндосом. ДНК была окрашена DAPI (синим). Изображения были объединены после первичной съемки. Шкала, 10 мкМ. На фиг. 3d анализ был повторен с добавлением hPDGF-BB.
На фиг. 14а и 14b представлены графики, иллюстрирующие анализы цитотоксичности биспецифического антитела, связанного с антителом к антигену hPDGFR-β, в соответствии с настоящим изобретением, с прибавлением комплекса кот-дуо на клетках, экспрессирующих PDGFR-β. На фиг. 14а перициты человека были обработаны биспецифическим гибридным белком scFv-Cκ-scFv и комплексом кот-дуо. На фиг. 14b анализ был повторен с добавлением hPDGF-BB. Клеточные уровни АТФ были измерены для определения относительной жизнеспособности клеток. В качестве отрицательного контроля использовали гибридный белок биспецифического антитела mCD154 x котинин scFv-Cκ-scFv. ДМСО применяли в качестве контроля растворителя для комплекса кот-дуо. Результаты отражены в виде среднего значения ± среднеквадратическое отклонение по трем повторяющимся экспериментам.
На фиг. 15 представлен график проточно-цитометрического анализа реакционной способности биспецифических антител, вступивших в реакцию с антителом к антигену hPDGFR-β, на клетках, не экспрессирующих hPDGFR-β. Клетки A-431 инкубировали с гибридными белками биспецифического антитела hPDGFR-β x котинина scFv-Cκ-scFv (100 нМ) и проверяли конъюгированным с APC антителом к антигену человеческого Cκ (клон TB28-2, BD Biosciences, Сан-Хосе, Калифорния, США).
На фиг. 16 изображен график, иллюстрирующий анализы цитотоксичности биспецифического антитела, связанного с антителом к антигену HPDGFR-β, с добавлением комплексов кот-дуо на клетках, не экспрессирующих hPDGFR-β. Клетки A-431 были обработаны гибридным белком антигена к hPDGFR-β x котинина и комплексом кот-дуо (DAR4). Клеточные уровни АТФ были измерены для определения относительной жизнеспособности клеток. В качестве отрицательного контроля использовали гибридный белок биспецифического антитела mCD154 x котинин scFv-Cκ-scFv. ДМСО применяли в качестве контроля растворителя для комплекса кот-дуо. Результаты отражены в виде среднего значения ± среднеквадратическое отклонение, полученное по результатам трех повторяющихся экспериментов.
На фиг. 17 представлен график, иллюстрирующий межвидовой тест на биспецифическое антитело, связанное с антителом к антигену HPDGFR-β. Рецепторы hPDGFR-β, mPDGFRβ, PDGFRβ резуса, PDGFRβ макаки-крабоеда, PDGFR-β кабана и контрольные микротитрационные планшеты с покрытием Fc инкубировали с биспецифическим антителом, содержащим антитело к антигену hPDGFRβ (100 нМ), а количество связанного гибридного белка биспецифического антитела определяли с помощью конъюгированного с пероксидазой хрена антитела к антигену человеческого Cκ и тетраметилбензидина.
На фиг. 18 показано, что гибридный белок биспецифического антитела scFv-Cκ-scFv (100 нМ) в проточном цитометрическом буфере инкубировали на клетках NIH3T3, экспрессирующих mPDGFR-β. Клетки были обработаны APC-антителом к антигену человеческого Cκ. В качестве отрицательного контроля использовали гибридный белок биспецифического антитела anti-HER2 x котинин scFv-Cκ-scFv.
На фиг. 19а-19b представлены результаты, подтверждающие конкуренцию суррогатного антитела PRb-CN01. На фиг. 19а на планшете, покрытом гибридным белком mPDGFR-β-hFc, показана реакция различных концентраций антитела кролика PRb-CN01 Fc (0,01 нМ-1 мкМ), контрольного антитела anti-HER2, антитела PRb-CN01 и биспецифического антитела PRb-CN32 scFv-Cκ-scFv (100 нМ), разбавленного 3 % бычьего сывороточного альбумина, растворенного в фосфатно-солевом буфере, причем реакция в каждой лунке протекала при 37 °C в течение 2 часов. После этого связанный белок кролика PRb-CN01 Fc измерили по пероксидазе хрена-антителу к антигену Fc кролика и 2,2'-азино-бис-(3-этилбензтиазолин)-6-сульфониевой кислоте. На фиг. 19b клетки NIH3T3, экспрессирующие mPDGFR-β, реагировали с кроличьим PRb-CN01 Fc (50 нМ) и контрольным антителом PRb-CN01, а также биспецифическим антителом PRb-CN32 scFv-Cκ-scFv (1 мкМ). Клетки были инкубированы ФИТЦ-антителом к антигену кролика Fc. В качестве отрицательного контроля использовали гибридный белок биспецифического антитела anti-HER2 x котинин scFv-Cκ-scFv.
На фиг. 20а-20b представлены графики, подтверждающие различие в цитотоксической активности биспецифических антител PRb-CN01 и PRb-CN32 и комплексов котинин-дуокармицина в клетках, экспрессирующих PDGFR-β. На фиг. 20а показано, что клетки NIH3T3 были обработаны гибридным белком биспецифического антитела scFv-Cκ-scFv и комплексом кот-дуо в отсутствие mPDGF-BB. Клеточный АТФ был измерен для оценки относительной жизнеспособности клеток. В качестве отрицательного контроля использовали гибридный белок биспецифического антитела anti-HER2 x котинин scFv-Cκ-scFv. На фиг. 20b эксперимент был повторен в присутствии mPDGF-BB.
[Принцип изобретения]
Далее в данном документе настоящее изобретение будет более подробно раскрыто со ссылкой на следующие примеры, причем настоящее изобретение не ограничивается следующими примерами.
Пример 1. Экспрессия и очистка гибридных белков mPDGFR-β и Cκ
Внеклеточная область mPDGFR-β представляет собой пептид, содержащий аминокислотную последовательность с SEQ ID NO: 60 в следующей таблице, и была подготовлена нуклеотидная последовательность, химически синтезированная путем добавления в конец нуклеотида участков распознавания эндонуклеазы SfiI (GenScript Biotech, Цзянсу, Китай). Она была усвоена ферментом SfiI и клонирована в вектор pCEP4 для получения рекомбинантного вектора экспрессии pCEP4, который был экспрессирован ранее описанным способом [Y. Lee, H. Kim et al., Exp. Mol. Med. 46 (2014) e114 - Ю. Ли, Х. Ким с др., Экспериментальная и молекулярная медицина 46 (2014) e114].
[Таблица 3]
| Наименование | Аминокислотная последовательность | SEQ ID NO |
| hPDGFR-β | MRLPGAMPALALKGELLLLSLLLLLEPQISQGLVVTPPGPELVLNVSSTFVLTCSGSAPVVWERMSQEPPQEMAKAQDGTFSSVLTLTNLTGLDTGEYFCTHNDSRGLETDERKRLYIFVPDPTVGFLPNDAEELFIFLTEITEITIPCRVTDPQLVVTLHEKKGDVALPVPYDHQRGFSGIFEDRSYICKTTIGDREVDSDAYYVYRLQVSSINVSVNAVQTVVRQGENITLMCIVIGNEVVNFEWTYPRKESGRLVEPVTDFLLDMPYHIRSILHIPSAELEDSGTYTCNVTESVNDHQDEKAINITVVESGYVRLLGEVGTLQFAELHRSRTLQVVFEAYPPPTVLWFKDNRTLGDSSAGEIALSTRNVSETRYVSELTLVRVKVAEAGHYTMRAFHEDAEVQLSFQLQINVPVRVLELSESHPDSGEQTVRCRGRGMPQPNIIWSACRDLKRCPRELPPTLLGNSSEEESQLETNVTYWEEEQEFEVVSTLRLQHVDRPLSVRCTLRNAVGQDTQEVIVVPHSLPFK | 60 |
| mPDGFR-β | LVITPPGPEFVLNISSTFVLTCSGSAPVMWEQMSQVPWQEAAMNQDGTFSSVLTLTNVTGGDTGEYFCVYNNSLGPELSERKRIYIFVPDPTMGFLPMDSEDLFIFVTDVTETTIPCRVTDPQLEVTLHEKKVDIPLHVPYDHQRGFTGTFEDKTYICKTTIGDREVDSDTYYVYSLQVSSINVSVNAVQTVVRQGESITIRCIVMGNDVVNFQWTYPRMKSGRLVEPVTDYLFGVPSRIGSILHIPTAELSDSGTYTCNVSVSVNDHGDEKAINISVIENGYVRLLETLGDVEIAELHRSRTLRVVFEAYPMPSVLWLKDNRTLGDSGAGELVLSTRNMSETRYVSELILVRVKVSEAGYYTMRAFHEDDEVQLSFKLQVNVPVRVLELSESHPANGEQTIRCRGRGMPQPNVTWSTCRDLKRCPRKLSPTPLGNSSKEESQLETNVTFWEEDQEYEVVSTLRLRHVDQPLSVRCMLQNSMGGDSQEVTVVPHSLPFK | 61 |
| Яванский макак PDGFR-β |
MRLPGAMPALALKGQLLLLPLLLLLEPQVSQGLVITPPGPELILNVSSTFVLTCSGSAPVVWERMSQELPQEMAKAQDNTFSSVLTLTNLTGLDTGEYFCTYNDSRGLEPDERKRLYIFVPDPTVGFLPNDAEELFIFLTEITEITIPCRVTDPQLVVTLHEKKGDIALPVPYDHQRGFSGIFEDRSYICKTTIGDREVDSDAYYVYRLQVSSINVSVNAVQTVVRQGENITLMCIVIGNEVVNFEWMYPRKESGRLVEPVTDFLLDMPYHIRSILHIPSAELEDSGTYTCNVTESVNDHQDEKAINITVVESGYVRLLGEVGALQFAELHRSRTLQVVFEAYPPPTVLWFKDNRTLGDSSAGEIALSTRNVSETRYVSELTLVRVKVAEAGHYTMRAFHEDAEVQLSFQLQINVPVRVLELSESHPDSGEQTVRCRGRGMPQPNIIWSACRDLKRCPRELPPMLLGNSSEEESQLETNVTYWEEEQEFEVVSTLRLQHVDRPLSVRCTLRNAVGQDMQEVIVVPHSLPFK | 62 |
| Кабан PDGFR-β | MQLPRAVPASVLIGQVLLLPPLLLLGPQASWGLVITPPGPELVLNLSSTFVLTCSGPAPVVWERMSQKPPQEMTGTQDGTFSSVLTLANVTGLDTGEYFCTYKGSPGLEASERKRLYIFVPDPAVGFLPVDPEELFIFLTEITETTIPCRVTDPRLVVTLHEKKVDVPLPISYDHQRGFSGTFEDKTYVCKTTIGDREVDSDAYYVYSLQVSSINVSVGAVQTVVRQGENITVMCIVTGNEVVNFEWTYPRLETGRLVEPVTDFLFEMPHIRSILHIPSAELGDSGTYICNVSESVSDHRDEKAINVTVVESGYVRLIGELDAVQFAELHRSRTLQVVFEAYPPPTVIWFKDNRTLGDSGAGEIALSTRNVSETRYVSELTLVRVKVAEAGRYTMRAFHEDAEAQISFQLQVNVPVRVLELSESHPASGEQTVRCRGRGMPQPHLTWSTCSDLKRCPRELPPTPLGNSSEEESQLETNVTYWPQEQEFEVVSTLRLRRVDQPLSVRCTLHNLLGHDAQEVTVVPHSLPFQ | 63 |
В частности, вектор экспрессии рекомбинантного pCEP4 был трансдуцирован в клеточную фетальную почечную линию 293F (Invitrogen, Карлсбад, Калифорния, США) с помощью полиэтиленимина (Polysciences, Уоррингтон, Пенсильвания, США) ранее описанным способом [S.E. Reed et al., J. Vriol. Methods. 138 (2006) 85-98 - С.Э. Рид и др., Журнал вирусологических методов 138 (2006) 85-98]. Трансдуцированные клетки культивировали в среде экспрессии GIBCO Freestyle 293, содержащей 10000 МЕ/л пенициллина и 100 мг/л стрептомицина [S. Yoon et al., J. Cancer. Res. Clin. Oncol. 140 (2014) 227-33 - С. Юн с др., Журнал исследований рака и клинической онкологии 140 (2014) 227-33]. Через шесть дней после трансдукции был собран культуральный супернатант, и гибридный белок mPDGFR-β-Cκ был очищен методом аффинной хроматографии с использованием смолы KappaSelect (GE Healthcare, Букингемшир, Великобритания), в соответствии с инструкциями производителя. В гибридном белке аминокислотная последовательность mPDGFR-β проходит от Leu на 32-м остатке до Lys на 530-м остатке mPDGFR-β, что соответствует внеклеточной области, и связана с Cκ на С-конце аминокислотной последовательности mPDGFR-β линкером-(GGGGS)3.
Пример 2. Экспрессия и очистка биспецифического антитела (scFv-Cк-scFv)
2-1. Подготовка комбинаторной scFv-фаг-дисплейной библиотеки и биопаннинга
Антитела к антигену mPDGFR-β отобраны из библиотеки фагов, экспрессирующих scFvs на поверхности, полученной из иммунизированных цыплят.
В общей сложности цыплят иммунизировали 4 раза гибридным белком mPDGFR-β-Cκ, полученным в примере 1 (см. выше). Сыворотка, полученная из крови, взятой из вен крыла до и во время иммунизации, использовалась для проверки иммунного состояния животного посредством иммуноферментного анализа и проточной цитометрии. Через неделю после четвертой иммунизации они были умерщвлены, селезенка, фабрициева сумка и костный мозг были собраны, а РНК была выделена с помощью реагента TRI (Invitrogen).
Используя выделенную РНК в качестве шаблона, кДНК синтезировали с помощью системы синтеза первой цепи Superscript® III (Invitrogen), после чего ранее раскрытым методом была получена библиотека фагов, экспрессирующих scFv [M.S. Lee et al., Hybridoma (Larchmt). 27 (2008) 18-24 - М.С. Ли с др., Гибридома (Larchmt)] 27 (2008) 18-24]. То есть было получено четыре библиотеки фагов, экспрессирующих 7,5 × 108, 6,9 × 108, 2,1 × 109 и 2,2 × 109 scFv, с использованием кДНК. Биопаннинг проводили суммарно пять раз на магнитных микроносителях, к которым привязана mPDGFR-β-Cκ с библиотекой [Y. Lee et al., Exp. Mol. Med. 46 (2014) e114 - Ю. Ли и др., Экспериментальная и молекулярная медицина 46 (2014) e114].
На 5-м выходном титре были случайным образом отобраны клоны scFv и выполнен иммуноферментный анализ фагированных ферментов на микротитрационных планшетах с покрытием mPDGFR-β-Cκ (3690; Corning Life Sciences, Корнинг, Нью-Йорк, США) [C.F. Barbas III, D.R. Burton, J.K. Scott, G.J. Silverman, Phage display- a laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, 2001 - С. Ф. Барбас III, Д.Р. Буртон, Дж.К. Скотт, Г.Дж. Сильверман, Фаговый дисплей - лабораторное руководство, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Нью-Йорк, 2001].
Клоны со способностью связывания с mPDGFR-β-Cκ (A405 > 1,5) были предложены компании Macrogen Inc. для выполнения анализа последовательности с помощью праймеров OmpSeq [W. Yang et al., Exp. Mol. Med. 49 (2017) e308 - В. Янг с др., Экспериментальная и молекулярная медицина 49 (2017) e308]. После анализа аминокислотной последовательности было выявлено 9 типов клонов антител (табл. 3). С учетом скорости экспрессии и способности к связыванию были выбраны четыре клона (PRb-CN01, PRb-CC01, PRb-CC02, PRb-CC03) для последующих экспериментов.
В таблице 4 (см. ниже) показана аминокислотная последовательность H-CDR3 клонов антитела mPDGFR-β scFv. VH и VL и их информация об аминокислотной последовательности CDR для полученных четырех клонов сведены в таблицу 1.
[Таблица 4]
| Клон | Последовательности H-CDR3 | SEQ ID NO |
| PRb-CN01 | GVGSWAHGGRIDA | 3 |
| PRb-CC01 | GGGSIDA | 11 |
| PRb-CC02 | GYAGTIDA | 19 |
| PRb-CC03 | SSYIDT | 27 |
2-2: Экспрессия и очистка биспецифического антитела (scFv-Cκ-scFv)
С помощью клона антитела mPDGFR-β scFv, полученного в примере 1, был подготовлен вектор экспрессии pCEP4, содержащий ген, кодирующий полученное биспецифическое антитело (анти-mPDGFR-β scFv)-Cκ-(анти-котинин scFv).
Специфическая структура подготовленного (анти-mPDGFR-β scFv)-Cκ-(анти-котинин scFv) биспецифического антитела и активные центры каждого линкера показаны на ФИГ. 1a. В частности, анти-mPDGFR-β scFv и анти-котинин scFv соединены в порядке VL- GQSSRSSGGGGSSGGGGS (SEQ ID NO: 57 в таблице 2)-VH от N-конца, т.е. C-конец VL и N- конец VH соединены. От N-конца анти-mPDGFR-β scFv, Ck и анти-котинин scFv соединены посредством каждого линкера, соединяющий scFv линкер обозначен как (GGGGS)3 с SEQ ID NO: 59 в таблице 2, а аминокислоты Ck показаны с SEQ ID NO: 58 в таблице 2.
В качестве специфического метода получения гибридного белка биспецифического антитела ген, кодирующий анти-mPDGFR-β scFv и ген, кодирующий анти-котинин scfv, были преобразованы с SfiI, AgeI и NotI (New England Biolabs) и лигированы до вектора экспрессии. Ген, кодирующий анти-mPDGFR-βscFv, сцеплен от N-конца к С-концу в порядке «VL-линкер-VH» согласно таблице 1, а линкер представлял собой пептид, полученный с помощью последовательности с SEQ ID NO:: 57 в таблице 2, для получения кодирующей его нуклеотидной последовательности. Ген, кодирующий анти-котинин scfv, получен на основе содержимого, описанного в US8008448B, а полученная аминокислотная последовательность котинина показана в следующей таблице.
[Таблица 5]
| Часть | Аминокислотная последовательность | SEQ ID NO: |
| CDR1-VH | GHLRRRDWM | 64 |
| CDR2-VH | IGRSGDT | 65 |
| CDR3-VH | IPYFGWNNGDI | 66 |
| CDR1-VL | QSSQSPYSNEWLS | 67 |
| CDR2-VL | RISTLAS | 68 |
| CDR3-VL | AGGYNFGLFLFG | 69 |
| VH | EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGHLRRRDWMNWVRQAPGKGLEWVAAIGRSGDTYYATWAKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSRIPYFGWNNGDIWGQGTLVTVSS | 70 |
| VL | DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQSSQSPYSNEWLSWYQQKPGKAPKLLIYRISTLASGVPSRFSGSRSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCAGGYNFGLFLFGQGTKVEIK | 71 |
Трастузумаб scFv был клонирован в вектор экспрессии в качестве контроля за антителом mPDGFR-β scFv. Цистеин в С-конце участка Cκ был исключен для устранения димеризации дисульфидными связями. После переноса полученной конструкции ДНК в клетки HEK293F был получен гибридный белок scFv-Cκ-scFv, а биспецифическое антитело (scFv-Cκ-scFv) было очищено методом афинной хроматографии с использованием смолы KappaSelect.
Для подтверждения чистоты белка экспрессированных биспецифических антител был выполнен электрофорез в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия с использованием геля NuPage 4-12 % Bis-Tris (Invitrogen), в соответствии с инструкциями производителя. 1 мкг белка добавили в буфер пробы додецилсульфата лития с восстановителем или без него, а затем проводили реакцию при 95 °C в течение 10 минут. После этого выполнили электрофорез, и гель окрасили окрашивающим раствором Ezway Protein-Blue II (Koma Biotech, Сеул, Корея) для визуализации белка. Был выполнен электрофорез в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия (фиг. 2). Фотография результата электрофореза приведена на фиг. 2.
Как показано на ФИГ. 2, белок, восстановленный с помощью восстановителя, составил 67 кДа, а невосстановленный белок был окрашен при 60 кДа. Молекулярная масса гибридного белка, рассчитанная с помощью компьютера, составила 66,77 кДа. Мультимерные полосы не выявлены. Ожидалось, что невосстановленный белок движется быстрее восстановленного, потому что невосстановленный белок менее устойчив к движению на геле из-за своей плотной внутренней морфологии.
По данным эксклюзионной ВЭЖХ (ФИГ. 8), то есть по результатам эксклюзионной хроматографии биспецифического антитела, содержащего антитело к mPDGFR-β, в соответствии с одним из вариантов осуществления настоящего изобретения, PRb-CC01, PRb-CC02 и PRb-CC03 показали мономерную и тримерную полосы в отличие от PRb-CN01. При образовании их конъюгатов с комплексом кот-дуо наблюдали большое количество высокомолекулярных соединений для PRb-CC01, PRb-CC02 и PRb-CC03. В случае PRb-CN01 наблюдали небольшое количество высокомолекулярных соединений. Кот-дуо-кот не показал образование высокомолекулярных соединений для всех четырех клонов.
Пример 3. Анализ связывающей способности антитела к mPDGFR-β и котинина (иммуноферментный анализ)
100 нг гибрида mPDGFR-β-Fc или внеклеточного домена рецептора TNF-α -гибридного белка человеческого Fc, который содержался в покрывающем буфере (0,1 М бикарбоната натрия, рН 8,6), нанесли на микротитрационный планшет при 4 °C на всю ночь. Каждую лунку блокировали 150 мкл 3 % (м/об) бычьего сывороточного альбумина, растворенного в фосфатно-солевом буфере и служащего блокирующим агентом, при температуре 37 °C в течение 1 часа. Различные концентрации (1:500-1:62500) куриной сыворотки, разбавленной 3 % бычьего сывороточного альбумина, растворенного в фосфатно-солевом буфере, обрабатывали и инкубировали при температуре 37 °C в течение 2 часов. Микротитрационный планшет промывали 3 раза в 0,05 % фосфатно-солевого буфера с твином, обрабатывали пероксидазой хрена (HRP)-антителом к антигену IgY курицы (Millipore, Биллерика, Массачусетс, США), и инкубировали при температуре 37 °C в течение 1 часа. Микротитрационный планшет снова промыли в 0,05 % фосфатно-солевого буфера с твином, а затем культивировали с использованием растворов 2,2'-азино-бис-(3-этилбензтиазолин)-6-сульфониевой кислоты (Pierce, Рокфорд, Иллинойс, США). После этого измерили поглощение при 405 нМ с помощью прибора Multiscan Ascent microplate (Labsystems, Хельсинки, Финляндия).
100 нг гибрида mPDGFR-β-Fc в покрывающем буфере или внеклеточного домена рецептора TNF-α -гибридного белка человеческого Fc нанесли на микротитрационный планшет при 4 °C на всю ночь. Каждую лунку блокировали 150 мкл 3 % (м/об) бычьего сывороточного альбумина, растворенного в фосфатно-солевом буфере и служащего блокирующим агентом, при температуре 37 °C в течение 1 часа. После обработки различными концентрациями биспецифических антител (0,06 нМ-1 мкМ), разбавленных в 3 % бычьего сывороточного альбумина, растворенного в фосфатно-солевом буфере, их инкубировали при температуре 37 °C в течение 2 часов. Планшет промыли три раза фосфатно-солевым буфером с твином и инкубировали при температуре 37 °C в течение 1 часа с использованием пероксидазы хрена-антитела к антигену человеческого Cκ (Millipore). После трехкратного промывания планшета фосфатно-солевым буфером с твином протекала реакция раствора субстрата 3,3',5,5'-тетраметилбензидина (GenDEPO, Баркер, Техас, США). После этого измерили поглощение при 650 нМ с помощью прибора Multiscan Ascent microplate (Labsystems, Хельсинки, Финляндия).
Для подтверждения конкуренции между биспецифическим антителом, в соответствии с настоящим изобретением, и mPDGF-BB микротитрационный планшет покрыли упомянутым выше гибридом mPDGFR-β-Fc, а затем заблокировали. Микротитрационный планшет обрабатывали различными концентрациями биспецифического антитела (0,06 нМ-1 мкМ) с добавлением или без добавления mPDGF-BB (100 нМ), а затем инкубировали при температуре 37 °C в течение 2 часов. Промывка, инкубация и детектирование проводились аналогично описанному выше иммуноферментному анализу.
Для подтверждения способности одновременного связывания биспецифического антитела гибридного белка scFv-Cκ-scFv с mPDGFR-β и котинином был выполнен иммуноферментный анализ. Четыре вида биспецифических антител осуществляли связь не с контролем-белком человеческого Fc (фиг. 3b), а с гибридным белком mPDGFR-β-Fc в зависимости от концентрации (фиг. 3а).
Биспецифическое антитело, содержащее антитело к антигену mPDGFR-β, согласно настоящему изобретению, обладало способностью к связыванию с котинин-бычьим сывороточным альбумином, но в случае гибридного белка anti-HER2 x котинина scFv-Cκ-scFv, который использовался в качестве контрольного биспецифического антитела, способности к связыванию не наблюдалось (фиг. 3c).
Для подтверждения способности биспецифического антитела к одновременному связыванию с котинином и mPDGFR-β гибридный белок антитела mPDGFR-β x котинина scFv-Cκ-scFv реагировал в лунках, покрытых котинин-бычьим сывороточным альбумином. Для каждого процесса проводили промывку, а также последовательную инкубацию гибридного белка mPDGFR-β-Fc и пероксидазы хрена-антитела к антигену человеческого Fc. В отличие от других контрольных групп, четыре типа биспецифических антител scFv-Cκ-scFv (PRb-CC01, PRb-CN01, PRb-CC02, PRb-CC03) одновременно связаны с mPDGFR-β и котинином (ФИГ. 3d).
Для изучения влияния mPDGF-BB на связывающую способность гибридного белка антитела mPDGFR-β x котинина scFv-Cκ-scFv был разработан конкурентный иммуноферментный анализ. Последовательно разбавленные биспецифические антитела (анти-mPDGFR-β scFv-Cκ-котинин scFv) инкубировали в лунках, покрытых гибридным белком mPDGFR-β-Fc в присутствии mPDGF-BB или без него. Конъюгированное с пероксидазой хрена антитело к антигену человеческого Cκ инкубировали, после чего добавили тетраметилбензидин. Способность PRb-CC01, PRb-CC02 и PRb-CC03 к связыванию с mPDGFR-β была ингибирована в присутствии mPDGF-BB (фиг. 4а). Однако способность PRb-CN01 к связыванию не была ингибирована, что подтвердило связывание PRb-CN01 с mPDGFR-β неконкурентно с mPDGF-BB.
Пример 4. Анализ интернализации антител (конфокальная микроскопия)
Гибридный белок биспецифического антитела scFv-Cκ-scFv проанализирован методом конфокальной микроскопии для визуализации интернализации. Клетки NIH3T3 обрабатывали биспецифическим антителом scFv-Cκ-scFv (10 мкг/мл), разбавленным в питательной среде Игла, модифицированной по Дульбекко и содержащей 10 % фетальной бычьей сыворотки, и интернализованным при 37 °C в течение 30 минут. После трехкратного промывания клеток холодным фосфатно-солевым буфером, кислый буфер (0,2 М уксусная кислота, 0,5 М хлорид натрия) наносили на 5 минут при комнатной температуре, чтобы удалить антитело, связанное с поверхностью клетки. Клетки дважды промывали холодным фосфатно-солевым буфером, фиксировали 4 % параформальдегидом в течение 10 минут, после чего подвергали иммунофлуоресцентному окрашиванию, как описано выше [J.M. Lim et al., J. Cell. Biol. 210 (2015) 23 - Дж.М. Лим и др., Журнал клеточной биологии 210 (2015) 23].
Резюмируя, для блокирования антител с неспецифической реакцией клетки инкубировали в фосфатно-солевом буфере, содержащем 5 % лошадиной сыворотки и 0,1 % тритона Х-100, в течение 30 минут, и 2 мкг/мл ФИТЦ-антитела к антигену человеческого Cκ (TB28 -2, BD Biosciences) добавляли при комнатной температуре на 30 минут. Для визуализации исходных эндосом клетки три раза промывали фосфатно-солевым буфером, инкубировали с фосфатно-солевым буфером, содержащим 5 % лошадиной сыворотки и 0,1 % тритона Х-100 в течение 30 минут, а затем инкубировали с антителом ati-Rab5, разбавленным до 1:200 (C8B1, Cell Signaling Technology, Данверс, Массачусетс, США). Антитело козы Alexa Fluor 546, меченное кроличьим IgG (A-11035, Invitrogen) обрабатывали последовательно. Клетки были обработаны 0,2 мкг/мл DAPI для обнаружения ДНК. Результаты конфокальной микроскопии были получены с помощью микроскопа Zeiss LSM 880 и проанализированы с помощью программного обеспечения Zen (Carl Zeiss, Торнвуд, Нью-Йорк, США).
Подтвердилось, что три типа гибридного белка антитела hPDGFR-β x котинина scFv-Cκ-scFv интернализуются в клетки через эндосомы.
Для измерения клеточной интернализации биспецифического антитела scFv-Cκ-scFv гибридный белок антитела mPDGFR-β x котинина scFv-Cκ-scFv инкубировали в клетках NIH3T3, а затем обрабатывали ФИТЦ-антителом к антигену человеческого Cκ и эндосомно-специфическим антителом. Визуализация выполнена с помощью конфокального микроскопа. Внутриклеточная флуоресценция выявлена только в клетках, культивированных с PRb-CN01, PRb-CC02 и PRb-CC03 (фиг. 4c). PRb-CC01 не было интернализовано. После слияния изображений авторам изобретения удалось подтвердить, что флуоресценция трех клонов антител и эндосомно-специфического антитела была ко-локализована.
Пример 5. Анализ способности биспецифического антитела к связыванию с mPDGFR-β и котинином (проточно-цитометрический анализ)
Клетки NIH3T3 инкубировали с куриной сывороткой, разбавленной в соотношении 1:100 в проточном цитометрическом буфере (1 % [м/об] бычьего сывороточного альбумина, растворенного в фосфатно-солевом буфере, в 0,05 % [м/об] азида натрия) при 4 °C в течение 1 часа и дважды промывали проточным цитометрическим буфером. Клетки обрабатывали куриным антителом к антигену IgY, меченным Alexa Fluor 488 (703-545-155, Иммуно-исследовательский центр Джексона, Уэст-Гроув, Пенсильвания, США) в проточном цитометрическом буфере. После промывания его классифицировали и проанализировали с помощью прибора FACS Canto II (BD Biosciences, Сан-Хосе, Калифорния, США). Для каждого измерения было использовано 10 000 клеток, результаты анализировали в FlowJo (Tree Star, Эшленд, Орегон, США). Клетки NIH3T3 были приготовлены, приобретая в Корейском банке клеток, и инкубированы в питательной среде Игла, модифицированной по Дульбекко (DMEM; Welgene, Сеул, Корея) и содержащей 10 % фетальной бычьей сыворотки (FBS; GIBCO, Гранд-Айленд, Нью-Йорк, США), 1 % пенициллина и стрептомицина [S. Park et el., Exp. Mol. Med. 44 (2012) 554-61 - С. Парк с др., Экспериментальная и молекулярная медицина 44 (2012) 554-61].
mPDGF-BB подвергли биотинированию с использованием микроразмерного набора для маркировки белка биотина ххх (Invitrogen), в соответствии с инструкциями производителя. Клетки NIH3T3 культивировали при 4 °C в течение 1 часа с помощью биспецифического антитела гибридного белка scFv-Cκ-scFv (100 нМ) при двух различных условиях с mPDGF-BB-биотином (100 нМ) или без него. Клетки четыре раза промывали проточным цитометрическим буфером и культивировали аллофикоцианином (APC) - антителом к антигену человеческого Cκ (клон TB28-2; BD Biosciences, Сан-Хосе, Калифорния, США) и стрептавидин-фикоэритрином (12-4317-87; eBioscience, ThermoFisher). После промывания его классифицировали и проанализировали с помощью прибора FACS Canto II (BD Biosciences, Сан-Хосе, Калифорния, США). Для каждого измерения было использовано 10 000 клеток, результаты анализировали в FlowJo (Tree Star, Эшленд, Орегон, США). Аналогично результату иммуноферментного анализа, только PRb-CN01 был связан с PDGFR-β, присутствующим на поверхности клетки (ФИГ. 4B), при добавлении mPDGF-BB (ФИГ. 4b). Способность к связыванию трех остальных клонов была ингибирована mPDGF-BB.
Авторы изобретения способом проточного цитометрического анализа проверили связывающую способность биспецифического антитела гибридных белков scFv-Cκ-scFv в клетках MOLT-4, не экспрессирующих mPDGFR-β. Клетки MOLT-4 культивировали с биспецифическим антителом гибридного белка scFv-Cκ-scFv (100 нМ) при температуре 4 °C в течение 1 часа. После описанного выше промывания детектирование проводили путем обработки APC-антителом к антигену человеческого Cκ. Клетки MOLT-4 были приобретены в Корейском банке клеток и приготовлены путем культивирования в среде RPMI-1640 (Welgene, Сеул, Корея) с добавлением 10 % фетальной бычьей сыворотки, 1 % пенициллина и стрептомицина. Подтверждено, что ни PRb-CN01, ни биспецифическое антитело аnti-HER2 гибридного антитела scFv-Cκ-scFv не осуществляет связи с соответствующими клетками (фиг. 6).
Пример 6. Образование комплексов биспецифических антител и котинин-дуокармицина (кот-дуо)
6-1: синтез конъюгата котинин-дуокармицина
Настоящим изобретением предложен валин-цитруллин-PAB-дуокармицин, валин-цитруллин-PAB-монометилауристатин E (MMAE) или валин-цитруллин-PAB-малеимидометил циклогексан-1-карбоксил (mcc) мертансин (DM1), которые были конъюгированы с котинином. Настоящим изобретением, по результатам испытаний котинин-цитотоксических препаратов DAR1 и DAR4, было подтверждено, что котинин-цитотоксический препарат DAR4 обладает большим потенциалом, чем DAR1, а также что дуокармицин обладает наибольшей силой при связывании с котинином. По этой причине в эксперименте использовали котинин-дуокармицин.
Транс-4-котинин-карбонил(GSK)4-пептид синтезирован способом синтеза твердофазного пептида Fmoc 9SPSS с использованием автопептидного синтезатора ASP48S на Peptron (Тэджон, Корея). Транс-4-котинин-карбоновая кислота (Sigma-Aldrich, Сент-Луис, Миссури, США) прикреплена к N-концу пептида способом аминокислотного соединения Fmoc.
По завершении синтеза сырой продукт отделяли от смолы путем обработки TFA/EDT/тиоанизол/TIS/DW (объем 90/2,5/2,5/2,5/2,5) в течение 2 часов. Раствор осаждали путем центрифугирования с использованием холодного эфира. Остатки высушили на воздухе. Очистку сырого продукта осуществляли способом обращенно-фазовой ВЭЖХ с колонкой обращенной фазы ACE 10 C18-300 (250 мм x 21,2 мм, 10 мкМ). Элюирование выполнили с водно-ацетонитрильным линейным градиентом (10-75 % (об/об) ацетонитрила), содержащим 0,1 % (об/об) трифторуксусной кислоты (Alfa Aesar, Варм-Хилл, Массачусетс, США). Очищенный пептид (кот-(GSK)4 пептид) собрали и высушили.
Диметиламиноэтил дуокармицин, связанный с валин-цитруллин р-аминобензилоксикарбонилом (PAB), связан с четырьмя свободными аминокислотами лизина в котинин-(GSK)4 производства Levena Biopharma (Сан-Диего, Калифорния, США). Кот-(GSK)4-пептид (3,5 мг, 2 мкмоль) растворили в ацетонитриле/воде (6/4, об/об, 1 мл). После этого последовательно добавили сложный NHS-эфир с PAB-диметиламиноэтил дуокармицина, PEG3-валин-цитруллина и 9 мкл насыщенного водного NaHCO3. Смесь смешивали при комнатной температуре в течение 4 часов и очищали способом обращенно-фазовой ВЭЖХ с использованием колонки Phenomenex Gemini® C18-100Å (100 мм x 2 мм x 5 мкМ). Комплекс (котинин[GSK(дуокармицин)]4, DAR4) был обозначен как «кот-дуо». Бивалент-котинин(GSK)4K связали с дуокармицином описанным выше способом [J. Jin et al., Exp. Mol. Med. 50 (2018) 67 - Дж. Джин с др., Эксперим. и молекул. мед. 50 (2018) 67]. Вкратце, две молекулы транс-4-котинин-карбоксильной кислоты от Peptron были связаны со свободной аминокислотой на N-конце GSKGSKGSKGSKK и эпсилон аминокислотой на С-конце лизина с помощью базового способа соединения аминокислот Fmoc. В Levena Biopharma четыре PAB-дуокармицина были связаны с бивалентными котинин-GSKGSKGSKK пептидами, формируя комплекс под названием котинин[GSK(дуокармицин)]4K-котинин (DAR2) или кот-дуо-кот. На фиг. 1а показан гибридный белок биспецифического антитела и конъюгата котинин-дуокармицина (кот-дуо, кот-дуо-кот), а на фиг. 1b – химические структуры кот-дуо и кот-дуо-кот. «R» обозначает валин-цитруллин PAB-связанный диметил-аминоэтил дуокармицин.
6-2: Образование комплекса с биспецифическим антителом
Гибридный белок антигена PDGFR-β x котинина scFv-Cκ-scFv (15 мкМ), растворенный в фосфатно-солевом буфере, полученном в примере 2, смешали в соотношении 1:1 с комплексом кот-дуо (15 мкМ), растворенным в ДМСО, и в соотношении 2:1 с комплексом кот-дуо-кот (7,5 мкМ). После образования комплексов в течение 30 минут при комнатной температуре их разбавили в 5 раз в питательной среде Игла, модифицированной по Дульбекко и содержащей 10 % фетальной бычьей сыворотки и 1 % пенициллина/стрептомицина (25,6 пМ-2 мкМ).
6-3: Подтверждение образования комплекса с биспецифическим антителом
Для подтверждения образования комплекса Y-Biologics (Тэджон, Корея) проанализировала конъюгаты биспецифических антител и котинин-дуокармицина (анти-mPDGFR-β scFv)-Cκ-(анти-котинин scFv), полученные в Примере 2, используя эксклюзионную хроматографию и ВЭЖХ.
Для анализа был использован прибор Dionex Ultimate 3000 (Thermo Fisher Scientific Inc., Массачусетс, США) с колонкой Sepax SRT-C SEC-300 (7,8 x 300 мм), заполненной порами размером 300 Е в частицах размером 5 мкм. В качестве мобильной фазы использовали фосфатно-солевой буфер, вводили 20 мкл образца (1 мг/мл), после чего элюат элюировали со скоростью 1 мл/мин в течение 15 минут. Элюат из колонки контролировали ультрафиолетовым детектором на 254 нМ со значениями мЕА.
На фиг. 8 показан результат эксклюзионной хроматографии биспецифического антитела, содержащего антитело к антигену mPDGFR-β, в соответствии с настоящим изобретением. Анализ биспецифических антител, комплекса биспецифических антител и кот-дуо, комплекса биспецифических антител и кот-дуо-кот, предложенных настоящим изобретением, выполнен с применением эксклюзионной ВЭЖХ-хроматографии на приборе Dionex Ultimate 3000 с колонкой Sepax SRT-C SEC-300. Мобильную фазу использовали в качестве фосфатно-солевого буфера, а мобильный растворитель элюировали со скоростью 1 мл/мин в течение 15 минут. Ультрафиолетовый детектор настроен на длину волны 254 нМ, а результаты контролировались по мЕА. HMW означает «высокомолекулярные соединения».
Пример 7. Антипролиферативный анализ в клеточных линиях, экспрессирующих PDGFR-β (тест на цитотоксичность)
Клетки NIH3T3 добавили в 50 мкл питательной среды Игла, модифицированной по Дульбекко, с добавлением 10 % фетальной бычьей сыворотки и 1 % пенициллина/стрептомицина, поместили на 96-луночный планшет (CLS3595, Corning) и инкубировали на ночь в 5 % СО2 при температуре 37 °C. В каждую лунку, содержащую 50 мкл клеток, было добавлено 50 мкл 50 гибридного белка антигена PDGFR- β x котинина scFv-Cκ-scFv (25,6 мкМ-2 мкМ), дополненного комплексом кот-дуо или кот-дуо-кот, полученным в экспериментальном примере 10, после чего полученную смесь выдерживали в инкубаторе в течение 72 часов в 5 % CO2 при температуре 37 °C. Для оценки влияния mPDGF-BB на токсичность комплекса биспецифического антитела scFv-Cκ-scFv и комплекса котинин-дуокармицин, mPDGF-BB (2 нМ) добавили вместе с 50 мкл биспецифического антитела scFv-Cκ-scFv и комплекса котинин-дуокармицин. Смешанные комплексы добавили к 50 мкл клеток NIH3T3.
В качестве контроля использовали биспецифическое антитело anti-HER2 x котинин scFv-Cκ-scFv. После 72 часов инкубации в клетках 100 мкл реагентов Cell Titer-Glo (Promega Corp., Мадисон, Висконсин, США) добавили во все лунки в соответствии с инструкциями производителя, и люминесценцию измеряли с помощью люминометра (PerkinElmer, Уолтем, Массачусетс, США). Эксперимент повторили три раза. Относительную жизнеспособность рассчитывали по следующей формуле: [% выживаемость = (люминесценция экспериментальной лунки - люминесценция фоновой лунки)/(люминесценция контроля-люминесценция фоновой лунки) х 100]. В качестве фоновых лунок использовали лунки, содержащие только новую среду.
Было подтверждено, что комплекс гибридного антитела к антигену mPDGFR-β x котинина scFv-Cκ-scFv и котинин-дуокармицина (кот-дуо, кот-дуо-кот) оказывает антипролиферативное действие на мышиные фибробласты, экспрессирующие PDGFR-β.
Для оценки токсичности комплекса биспецифического антитела к антигену mPDGFR-B x котинина scFv-Cκ-scFv и котинин-дуокармицина (кот-дуо, кот-дуо-кот) комплексы были добавлены к клеткам NIH3T3 в присутствии/отсутствии mPDGF-BB. АТФ клеток измерили для определения относительной жизнеспособности клеток. Токсичность гибридного биспецифического антитела scFv-Cκ-scFv отражена по IC50 в табл. 6 и на фиг. 5. В нижеприведенной таблице 6 приведены IC50 титра в пробирке и 95 % доверительный интервал комплекса антиген mPDGFR-β x котинин scFv-Cκ-scFv гибридного антитело с котинин-дуокармицином.
[Таблица 6]
| Кот-дуо | Кот-дуо-кот | |||
| Биспецифическое антитело mPDGFRв x анти-котинин scFv-Ck | IC50 (нМ) | 95 % доверительный интервал | IC50 (нМ) | 95 % доверительный интервал |
| PRb-CC01 | ||||
| с mPDGF-BB | 27,1 | 19,1 - 38,5 | 67,2 | 52,0 - 86,9 |
| без mPDGF-BB | 25,0 | 18,1 - 34,7 | 87,6 | 54,4 - 141,1 |
| PRb-CN01 | ||||
| с mPDGF-BB | 9,7 | 8,4 - 11,1 | 30,5 | 25,1 - 37,1 |
| без mPDGF-BB | 6,3 | 5,1 - 7,9 | 20,1 | 13,8 - 29,4 |
| PRb-CC02 | ||||
| с mPDGF-BB | 20,6 | 16,2 - 26,3 | 69,0 | 54,2 - 87,9 |
| без mPDGF-BB | 20,1 | 15,2 - 26,5 | 125,4 | 47,4 - 328,7 |
| PRb-CC03 | ||||
| с mPDGF-BB | 20,7 | 15,7 - 27,3 | 50,2 | 39,5 - 63,9 |
| без mPDGF-BB | 27,3 | 8,9 - 84,3 | 67,3 | 39,0 - 116,2 |
| Anti-HER2 | ||||
| с mPDGF-BB | 23,2 | 17,4 - 31,0 | 60,8 | 48,4 - 76,4 |
| без mPDGF-BB | 36,7 | 27,9 - 48,3 | 93,7 | 55,3 - 158,9 |
| Конъюгаты котинин-дуокармицина | ||||
| с mPDGF-BB | 22,8 | 16,6 - 31,4 | 56,7 | 44,3 - 72,6 |
| без mPDGF-BB | 15,5 | 11,7 - 20,3 | 45,4 | 29,8 - 69,2 |
| Свободный дуокармицин | ||||
| с mPDGF-BB | 23,8 | 18,2 - 31,0 | 60,3 | 41,1 - 88,5 |
| без mPDGF-BB | 9,7 | 7,3 - 12,9 | 35,7 | 23,4 - 54,4 |
Из четырех протестированных антител PRb-CN01 обладало наибольшей токсичностью в присутствии mPDGF-BB или без него по сравнению с контрольной группой anti-HER2 x котинин scFv-Cκ-scFv (p<0,01; фиг. 5). PRb-CC02 и PRb-CC03 показали токсичность по сравнению с контрольным антителом и неинтернализующим антителом (PRb-CC01), но не показали статистической значимости. Однако в присутствии mPDGF-BB котинин-дуокармицин был значительно токсичнее свободного дуокармицина при смешивании с PRb-CN01 (p < 0,01). В качестве контрольного эксперимента были проведены тесты токсичности на клетках MOLT-4, не экспрессирующих mPDGFR-β, с гибридным белком биспецифического антитела scFv-Cκ-scFv и комплексом кот-дуо. Токсичность PRb-CN01 была одинаковой по сравнению с контрольным антителом anti-HER2 x гибридного белка котинина scFv-Cκ-scFv (ФИГ. 7).
Как показано на Фиг. 5, scFv-Ck-scFv не убивал клетки даже при увеличении концентрации антител, поэтому рассчитать значение IC50 было невозможно. В таблице 6 приведены результаты добавления комплекса кот-дуо или кот-дуо-кот вместо одного IC50 scFv-Ck-scFv. Кроме того, поскольку клетки MOLT-4 не экспрессируют mPDGFR-β, нет никакой разницы в токсичности между комплексом лекарственный препарат-PRb-CN01 и контрольным комплексом антитело-лекарственный препарат.
Пример 8. Анализ неоваскуляризации в организме
Было подтверждено, что комплекс гибридного антитела к антигену mPDGFR-β x котинина scFv-Cκ-scFv, конъюгированный с комплексом кот-дуо, ингибировал неоваскуляризацию в организме.
8-1: Эксперимент на животных с кислород-индуцированной болезнью сетчатки глаза
Мыши C57BL/6 на 7-й день после рождения выращивались в камере с высокой концентрацией кислорода (75 %) в течение 5 дней, а на 12-й день переводились в условия с обычным содержанием кислорода, чтобы создать условия для ретинопатии недоношенных.
На 14-й день после рождения в стекловидную полость в концентрации 1 нМ и 10 нМ ввели по 1 мкл биспецифического антитела scFv-Cκ-scFv и комплекса гибридного белка биспецифического антитела scFv-Cκ-scFv и кот-дуо, соответственно. Для маркировки кровеносных сосудов изолектин В4-594 (1:100; 121413, Invitrogen) обрабатывали на плоской панели сетчатки.
В животной модели кислород-индуцированного заболевания сетчатки комплекс гибридного антитела PRb-CN01 x котинина scFv-Cκ-scFv кот-дуо ингибирует неоваскуляризацию в зависимости от концентрации (ФИГ. 9).
8-2: Животная модель с лазер-индуцированной хороидальной неоваскуляризацией
После обезболивания сетчатку мыши облучали лазером непрямого офтальмоскопа (ILOODA) с пятном размером 300 мкМ, интенсивностью 400 мВт, длительностью 50 мс и длиной волны 810 нМ, чтобы вызвать разрушение мембраны Бруха.
На 4-й день после облучения лазером в стекловидную полость в концентрации 10 нМ ввели по 1 мкл биспецифического антитела scFv-Cκ-scFv и комплекса гибридного белка биспецифического антитела scFv-Cκ-scFv и кот-дуо. После 7 дней лазерного облучения глаза удаляли для получения эпителиально-хороидно-склеральной ткани сетчатки, а иммунофлюоресцентное окрашивание проводили конъюгированным с Alexa Fluor 594 антителом изолектина В4 для определения протяженности хороидальной неоваскулярной мембраны. Подтверждена способность гибридного белка scFv-Cκ-scFv и комплекса cot-duo к ингибированию неоваскуляризации. Для количественного анализа протяженности хороидальной неоваскулярной мембраны использовали программу ImageJ (NIH).
В животной модели хороидальной неоваскуляризации, индуцированной лазером, комплекс гибридного антитела PRb-CN01 x котинин scFv-Cκ-scFv кот-дуо ингибировал неоваскуляризацию (ФИГ. 10).
Токсичность биспецифического антитела scFv-Cκ-scFv рассчитывали как IC50 (50 % от максимальной ингибирующей способности), а статистический анализ проводили с помощью непарных критериев Стьюдента или одностороннего дисперсионного анализа. Апостериорный критерий множественных сравнений Тьюки был использован для определения статистической значимости биспецифических антител scFv-Cκ-scFv. Значение P, равное 0,05 и менее, признано статистически значимым. Все анализы проводили с использованием Prism v5.0 (GraphPad Software, Inc., Сан-Диего, Калифорния, США).
Пример 9. Экспрессия и очистка гибридного белка hPDGFR-β-Cκ
Аминокислотные последовательности для внеклеточных областей рецепторов hPDGFR-β, PDGFR-β макаки-крабоеда и PDGFR-β кабана показаны в последовательностях с SEQ ID NO: 61, 62 и 63 в таблице 3 (см. выше), при этом рецептор PDGFR-β резуса доступен на рынке и приобретается в качестве антигенов (кат.: 90215-C02H). Приготовленные нуклеотидные последовательности (Ginscript Biotag, Чан Ён, Китай) синтезировали с добавлением SfiI-последовательности ограничительного распознавания в конце подготовленной нуклеотидной последовательности, оценивали по ферменту SfiI и клонировали в вектор pCEP4. Затем белки были экспрессированы в виде Cκ или hFc ранее описанным способом [Y. Lee, H. Kim et al., Exp. Mol. Med. 46 (2014) e114, S. Park, D. Lee et al., Clin Chim Acta 411 (2010) 1238 - Ю. Ли, Х. Ким с др., Экспериментальная и молекулярная медицина 46 (2014) e114, С. Парк, Д. Ли с др., Международный журнал клинической химии 411 (2010) 1238].
Белки трансфицировали и очищали тем же способом mPDGFR-β в примере 1, но модифицировали для очистки гибридного белка hFc с помощью гель-афинной хроматографии белка A, в соответствии с инструкциями производителя (Repligen Corp., Кембридж, Массачусетс). Гибридный белок имеет структуру, при которой Cκ связан с С-концом аминокислотной последовательности hPDGFR-β через линкер-(GGGGS)3.
Пример 10. Экспрессия и очистка биспецифических антител (scFv-Cκ-scFv)
10-1: Подготовка комбинаторной фаг-дисплейной библиотеки scFv и биопаннинга по способу подготовки комбинаторной фаг-дисплейной библиотеки scFv и биопаннинга в примере 2, причем библиотеку фагов, экспрессирующих anti-HPDGFR-в scFv, получили с использованием гибридного белка hPDGFR-в-Cк в примере 9, и выполнили биопаннинг.
На 5-м выходном титре были случайным образом отобраны клоны scFv и выполнен фаговый иммуноферментный анализ на микротитрационных планшетах с покрытием mPDGFR-β-Cκ. После анализа аминокислотной последовательности было выявлено 3 типа клонов антител (табл. 7). В таблице 7 (см. ниже) перечислены H-CDR3-последовательности клонов антител HPDGFR-β scFv. В таблице 2 перечислены VH и VL и их информация об аминокислотной последовательности CDR для полученных трех клонов.
[Таблица 7]
| Клон | Аминокислотная последовательность VH-CDR3 | SEQ ID NO |
| PRb-CN16 | AAGTCYSHSCTGYIDA | 35 |
| PRb-CN32 | SAGSTYSYWDSDAGLIDA | 43 |
| PRb-CN26 | RGFMDAGGIDA | 51 |
10-2: Экспрессия и очистка биспецифического антитела гибридного белка scFv-Cκ-scFv
С помощью клона антитела hPDGFR-β scFv, полученного в примере 9 (анти-hPDGFR-β scFv)-Cκ-(анти-котинин scFv), был подготовлен вектор экспрессии pCEP4, содержащий ген, кодирующий биспецифическое антитело, полученное аналогично антителу mPDGFR-β scFv в примере 2.
Специфическая структура подготовленного (анти-hPDGFR-β scFv)-Cκ-(анти-котинин scFv) биспецифического антитела и активные центры каждого линкера показаны на ФИГ. 1a. В частности, анти-hPDGFR-β scFv и анти-котинин scFv соединены в порядке VL- GQSSRSSGGGGSSGGGGS (SEQ ID NO: 57 в таблице 2)-VH от N-конца, т.е. C-конец VL и N- конец VH соединены. От N-конца анти-hPDGFR-β scFv, Ck и анти-котинин scFv соединены посредством каждого линкера, соединяющий scFv линкер обозначен как (GGGGS)3 с SEQ ID NO: 59 в таблице 2, а аминокислоты Ck показаны с SEQ ID NO: 58 в таблице 2.
Специфический способ получения гибридного белка биспецифического антитела, очистка и измерение чистоты экспрессированных биспецифических антител были выполнены в основном аналогично примеру 2. Результат электрофореза в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия показан на фиг. 11. На фиг. 11 показан результат электрофореза в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия гибридного белка scFv-Cκ-scFv как биспецифического антитела, связанного с антителом к антигену hPDGFR-β, согласно настоящему изобретению.
Как показано на фиг. 11, белок, восстановленный восстановителем в треке 1 (PRb-CN16 x котинин- биспецифическое антитело), треке 3 (PRb-CN26 x котинин-биспецифическое антитело) и треке 5 (PRb-CN32 x котинин-биспецифическое антитело) был окрашен при 69,0 кДа, восстановленный белок был окрашен при 67 кДа, а невосстановленный белок – при 60 кДа. Размер гибридного белка, рассчитанный компьютером, составил 66,77 кДа. Мультимерные полосы не выявлены.
Пример 11. Анализ связывающей способности биспецифических антител к hPDGFR-β и котинину
100 нг гибрида hPDGFR-β-Fc или внеклеточного домена рецептора TNF-α -гибридного белка человеческого Fc, содержащегося в покрывающем буфере (0,1 М бикарбоната натрия, рН 8,6), нанесли на микротитрационный планшет при 4 °C на всю ночь. Каждую лунку блокировали 150 мкл 3 % (м/об) бычьего сывороточного альбумина, растворенного в фосфатно-солевом буфере и служащего блокирующим агентом, при температуре 37 °C в течение 1 часа. Различные концентрации (1:500-1:62500) куриной сыворотки, разбавленной в 3 % бычьего сывороточного альбумина, растворенного в фосфатно-солевом буфере, обрабатывали и инкубировали при температуре 37 °C в течение 2 часов, а затем анализировали в соответствии с тем же способом протоколирования для проверки способности иммунной куриной сыворотки к связыванию антигена mPDGFR-β.
100 нг гибрида hPDGFR-β-Fc в покрывающем буфере или внеклеточного домена рецептора TNF-α -гибридного белка человеческого Fc нанесли на микротитрационный планшет при 4 °C на всю ночь. Каждую лунку блокировали 150 мкл 3 % (м/об) бычьего сывороточного альбумина, растворенного в фосфатно-солевом буфере и служащего блокирующим агентом, при температуре 37 °C в течение 1 часа. После обработки различными концентрациями биспецифических антител гибридного белка scFv-Cκ-scFv (0,01 нМ- 1 мкМ) анализ проводили в том же протоколе связывающей способности гибридного белка антитела mPDGFR-β scFv-Cκ-scFv в зависимости от концентрации.
Для подтверждения конкуренции между биспецифическим антителом scFv-Cκ-scFv и hPDGF-BB, как в примере 3, гибрид hPDGFR-β-Fc нанесли на микротитрационный планшет, после чего блокировали. Микротитрационный планшет обрабатывали различными концентрациями биспецифического антитела (0,01 нМ-1 мкМ) с добавлением или без добавления hPDGF-BB (100 нМ; 220-BB; R&D systems), а затем инкубировали при температуре 37 °C в течение 2 часов. Промывка, инкубация и детектирование проводились аналогично описанному выше иммуноферментному анализу. Способность PRb-CN16, PRb-CN32 и PRb-CN26 к связыванию с hPDGFR-β не была ингибирована в присутствии hPDGF-BB (фиг. 12а).
100 нг рецепторов hPDGFR-β, mPDGFR-β, PDGFR-β резуса (90215-C02H, Sino Biological Inc. Beijing, Китай), PDGFR-β макаки-крабоеда, гибрида PDGFR-β кабана с Fc или внеклеточного домена рецептора TNF-α-гибридного белка человеческого Fc нанесли при температуре 4 °C на всю ночь. После блокировки лунок последовательное культивирование гибридного белка антитела hPDGFR-β scFv-Cκ-scFv и конъюгированного с пероксидазой хрена антитела к антигену человеческого Cκ выполняли аналогично примеру 3.
Для подтверждения способности одновременного связывания биспецифического антитела гибридного белка scFv-Cκ-scFv с hPDGFR-β и котинином был выполнен иммуноферментный анализ. Четыре вида биспецифических антител осуществляли связь не с контролем-белком человеческого Fc (фиг. 12b), а с гибридным белком hPDGFR-β-Fc в зависимости от концентрации (фиг. 12а).
Гибридный белок антитела hPDGFR-β x котинина scFv-Cκ-scFv и контрольное биспецифическое антитело к антигену mCD154 x котинина scFv-Cκ-scFv обладали способностью осуществлять связь с котинин-бычьим сывороточным альбумином (фиг. 12с). Для определения способности к одновременному связыванию котинина и hPDGFR-β гибридный белок антитела hPDGFR-β x котинина scFv-Cκ-scFv культивировали в лунках, покрытых котинин-бычьим сывороточным альбумином. Для каждого процесса проводили промывку, а также последовательную инкубацию гибридного белка hPDGFR-β-Fc и пероксидазы хрена-антитела к антигену человеческого Fc. Три вида биспецифических антител гибридного белка scFv-Cκ-scFv одновременно связаны с hPDGFR-β и котинином (фиг. 12d).
Подтверждено, что гибридный белок антитела hPDGFR-β x котинина scFv-Cκ-scFv может одновременно осуществлять связь с hPDGFR-β и котинином даже в присутствии hPDGF-BB (фиг. 13а).
Иммуноферментный анализ был использован для тестирования межвидового связывания гибридного белка антитела hPDGFR-β x котинина scFv-Cκ-scFv. Все три клона, кроме контроля х гибридного белка котинина scFv-Cκ-scFv, успешно связаны с hPDGFR-β, mPDGFR-β, PDGFR-β резуса, PDGFR-β макаки-крабоеда и PDGFR-β кабана (фиг. 17).
На фиг. 17 изображен график, иллюстрирующий экспериментальную межвидовую реакцию биспецифического антитела с антителом к антигену hPDGFR-β, в соответствии с настоящим изобретением. На микротитрационных планшетах с покрытием рецепторами hPDGFR-β, mPDGFRβ, PDGFRβ резуса, PDGFRβ макаки-крабоеда и PDGFR-β кабана, и контроле с покрытием Fc, осуществили реакцию биспецифического антитела, содержащего антитело к антигену HPDGFR-β, согласно настоящему изобретению (100 нМ), а количество связанного биспецифического антитела измеряли с помощью конъюгированного с пероксидазой хрена антитела к антигену человеческого Cκ и тетраметилбензидина.
Пример 12. Анализ интернализации биспецифического антитела
Перициты человека обрабатывали разбавленным биспецифическим антителом scFv-Cκ-scFv (10 мкг/мл) в среде роста перицитов, дополненной 10 % фетальной бычьей сывороткой, и интернализовали при температуре 37 °C в течение 30 минут. Анализ проводили аналогичным образом, в соответствии с протоколом конфокального микроскопа для гибридного белка антитела mPDGFR-β x котинина scFv-Cκ-scFv, согласно примеру 4. После добавления hPDGF-BB (50 нг/мл) к гибридному белку биспецифического антитела scFv-Cκ-scFv была выполнена конфокальная микроскопия по тому же протоколу.
Подтверждено, что гибридный белок антитела hPDGFR-β x котинин scFv-Cκ-scFv интернализуется в клетки через эндосомы.
Была визуализирована интернализация гибридного белка биспецифического антитела scFv-Cκ-scFv. После обработки перицитов человека гибридным белком были удалены антитела, связанные с поверхностью клетки. После фиксации клеток гибридный белок был окрашен ФИТЦ-антителом к антигену человеческого Cκ (зеленым). Для визуализации ранних эндосом клетки были окрашены антителом анти-Rab5 и антителом козы Alexa Fluor 546, меченным кроличьим IgG (красным). Стрелкой обозначена увеличенная часть, в которой ко-локализована флуоресценция гибридного белка антитела hPDGFR-β x котинина scFv-Cκ-scFv и исходная эндосома. ДНК была окрашена DAPI (синим) (шкала, 10 мкМ). Фиг. 13d была повторена с hPDGF-BB.
Для измерения клеточной интернализации биспецифического антитела scFv-Cκ-scFv гибридный белок антитела hPDGFR-β x котинина scFv-Cκ-scFv инкубировали в перицитах человека, а затем обрабатывали ФИТЦ-антителом к антигену человеческого Cκ и эндосомно-специфическим антителом. Визуализация выполнена с помощью конфокального микроскопа. Внутриклеточная флуоресценция выявлена только в клетках, культивированных с PRb-CN32 и PRb-CN16 (фиг. 13c). После слияния изображений авторам изобретения подтверждено, что флуоресценция двух клонов антител и эндосомно-специфического антитела была ко-локализована. При обработке PRb-CN32, PRb-CN16 и PRb-CN26 посредством hPDGF-BB они были ко-локализованы с эндосомно-специфическими антителами (фиг. 13d). PRb-CN26 было интернализовано в большом количестве в течение 30 минут, когда одновременно обрабатывали PDGF-BB. Интернализация антител очень важна для доставки лекарственного препарата в целевую клетку. В случае повышения уровня PDGF-BB при некоторых заболеваниях даже повышение уровня PDGF-BB не влияло на интернализацию антитела, в соответствии с настоящим изобретением. Поэтому он полезен для внутриклеточной доставки лекарственного препарата больным с заболеваниями.
Пример 13. Анализ связывающей способности биспецифического антитела к hPDGFR-β и котинину
Перициты человека инкубировали с куриной сывороткой, разбавленной в соотношении 1:100 в проточном цитометрическом буфере (1 % [м/об] бычьего сывороточного альбумина, растворенного в фосфатно-солевом буфере, в 0,05 % [м/об] азида натрия) при 4 °C в течение 1 часа и четыре раза промывали проточным цитометрическим буфером. Эксперимент проводили по тому же протоколу, что и тестирование антител mPDGFR-β в примере 4. Перициты человека были приобретены у PromoCell (Хайдельберг, Германия) и культивированы в питательной среде Игла, модифицированной по Дульбекко (DMEM; Welgene, Сеул, Корея) с добавлением 10 % фетальной бычьей сыворотки (FBS; GIBCO, Гранд-Айленд, Нью-Йорк, США), 1 % пенициллина и стрептомицина [S. Park et el., Exp. Mol. Med. 44 (2012) 554-61 - С. Парк с др., Экспериментальная и молекулярная медицина 44 (2012) 554-61].
Перициты человека культивировали при 4 °C в течение 1 часа с помощью биспецифического антитела гибридного белка scFv-Cκ-scFv (100 нМ) при двух различных условиях с hPDGF-BB-биотином (100 нМ; BT220; R&D systems) и без него. Клетки четыре раза промывали проточным цитометрическим буфером и культивировали аллофикоцианином (APC) - антителом к антигену человеческого Cκ (клон TB28-2; BD Biosciences, Сан-Хосе, Калифорния, США) и стрептавидин-фикоэритрином (12-4317-87; eBioscience, ThermoFisher). После промывания его классифицировали и проанализировали с помощью прибора FACS Canto II (BD Biosciences, Сан-Хосе, Калифорния, США). Для каждого измерения было использовано 10 000 клеток, результаты анализировали в FlowJo (Tree Star, Эшленд, Орегон, США).
Биспецифическое антитело гибридного белка scFv-Cκ-scFv (100 нМ) инкубировали при температуре 4 °C в течение 1 часа в клетках A-431. После описанного выше промывания детектирование проводили путем обработки APC-антителом к антигену человеческого Cκ. Клетки A-431 были приобретены в Корейском банке клеток и приготовлены путем культивирования в питательной среде Игла, модифицированной по Дульбекко (DMEM; Welgene, Сеул, Корея) с добавлением 10 % фетальной бычьей сыворотки (GIBCO), 1 % пенициллина и стрептомицина.
Авторы изобретения способом проточного цитометрического анализа проверили связывающую способность каждого клона в перицитах человека в присутствии hPDGF-BB и подтвердили, что гибридный белок антитела hPDGFR-β x котинина scFv-Cκ-scFv и hPDGF-BB-биотин осуществляют связь с клетками. При добавлении hPDGF-BB все три клона были привязаны к PDGFR-β, присутствующему на поверхности клетки, аналогично способу иммуноферментного анализа (фиг. 13b). Авторы изобретения подтвердили способность биспецифического антитела гибридных белков scFv-Cκ-scFv к связыванию с клетками A-431, не экспрессирующими hPDGFR-β, с помощью проточной цитометрии, и отсутствие связывания всех гибридных белков антитела hPDGFR-β x котинина scFv-Cκ-scFv и контрольного биспецифического антитела гибридного белка антитела mCD154 x котинина scFv-Cκ-scFv с соответствующими клетками (фиг. 15).
Пример 14. Образование комплексов биспецифических антител и котинин-дуокармицина (кот-дуо)
Эксперимент проводили, по существу, аналогично примеру 6, за исключением использования вместо биспецифического антитела, содержащего антитело к антигену mPDGFR-β, биспецифического антитела, связанного с антителом к антигену hPDGFR-β и полученного в примере 10. Как описано в части подготовке и трансдукции гибридного белка антитела mPDGFR-β x котинина scFv-Cκ-scFv в примере 6, таким же образом были трансдуцированы клетки HEK293F. Биспецифическое антитело гибридного белка scFv-Cκ-scFv очищено от супернатанта способом аффинной хроматографии и подвергнуто электрофорезу в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия (ФИГ. 11).
Пример 15. Антипролиферативный анализ в клеточных линиях, экспрессирующих PDGFR-β (тест на цитотоксичность)
Перициты человека добавили в 50 мкл питательной среды Игла, модифицированной по Дульбекко, с добавлением 10 % фетальной бычьей сыворотки и 1 % пенициллина/стрептомицин, поместили на 96-луночный планшет (CLS3595, Corning) и инкубировали на ночь в 5 % СО2 при температуре 37 °C. В каждую лунку, содержащую 50 мкл клеток, было добавлено 50 мкл 50 гибридного белка антигена hPDGFR-β x котинина scFv-Cκ-scFv (25,6 пМ-2 мкМ) кот-дуо, после чего полученную смесь выдержали в инкубаторе в течение 72 часов в 5 % CO2 при температуре 37 °C.
Для оценки влияния hPDGF-BB на токсичность комплекса биспецифического антитела scFv-Cκ-scFv и кот-дуо, hPDGF-BB (2 нМ) добавили вместе с 50 мкл комплекса биспецифического антитела scFv-Cκ-scFv и кот-дуо. Смешанные комплексы добавили к 50 мкл раствора, содержащего клетки. В качестве контроля использовали биспецифическое антитело анти-mCD154 x котинин scFv-Cκ-scFv. Другие экспериментальные способы осуществляли аналогично протоколу гибридного белка антитела mPDGFR-β x котинина scFv-Cκ-scFv в примере 7.
Для оценки токсичности гибридного белка антигена hPDGFR-β x котинин scFv-Cκ-scFv и комплекса кот-дуо, комплекс вводили в перициты человека в присутствии hPDGF-BB или без него, после чего клетки обрабатывали аденозинтрифосфатом для измерения относительной жизнеспособности. Токсичность гибридного белка биспецифического антитела к антигену hPDGFR-β x котинина scFv-Cκ-scFv и комплекса кот-дуо показана с посредством IC50 (табл. 8). В нижеприведенной таблице 8 приведены экстракорпоральные титры с 95 % доверительным интервалом для комплекса гибридного антитела к антигену mPDGFR-β x котинина scFv-Cκ-scFv с котинин-дуокармицином.
[Таблица 8]
| антитело hPDGFRв x антитело котинина scFv-Ck-scFv | Кот-дуо | |
| IC50 (нМ) | 95 % доверительный интервал | |
| PRb-CN16 | ||
| Без hPDGF-BB | 2,39 | 2,12-2,71 |
| С hPDGF-BB | 1,82 | 1,58-2,10 |
| PRb-CN32 | ||
| Без hPDGF-BB | 0,78 | 0,75-0,81 |
| С hPDGF-BB | 0,67 | 0,58-0,76 |
| PRb-CN26 | ||
| Без hPDGF-BB | 0,90 | 0,84-0,98 |
| С hPDGF-BB | 0,87 | 0,78-0,96 |
| Контроль | ||
| Без hPDGF-BB | 4,47 | 6,73-13,87 |
| С hPDGF-BB | 3,48 | 3,05-3,97 |
| - | ||
| Без hPDGF-BB | 13,70 | 12,58-14,93 |
| С hPDGF-BB | 12,42 | 10,42-14,80 |
Как видно из результатов в таблице 8, все три протестированных антитела (PRb-CN16, PRb-CN32, PRb-CN26) показали более высокую токсичность по сравнению с контролями анти-mCD154 x котинин scFv-Cκ-scFv в присутствии hPDGF-BB или без него (p < 0,05; фиг. 14а и 14b). В качестве контрольного эксперимента были проведены тесты токсичности на клетках A-431, не экспрессирующих hPDGFR-β, с гибридным белком биспецифического антитела scFv-Cκ-scFv и комплексом кот-дуо. Все гибридные белки антитела hPDGFR-β x котинина scFv-Cκ-scFv имели токсичность не выше токсичности контрольного антитела гибридного белка анти-mCD154 x котинина scFv-Cκ-scFv (ФИГ. 16). Таким образом, в результате антипролиферативного анализа биспецифическое антитело/комплекс кот-дуо обладали более высокой цитотоксичностью в линиях перицитов человека, экспрессирующих hPDGFR-β, по сравнению с контролем антиген mCD154 x котинин scFv-Cκ-scFv, при этом цитотоксичность в A-431, не экспрессирующих hPDGFR-β, не отличалась от контроля антиген mCD154 x котинин scFv-Cκ-scFv. Такой результат цитотоксичности обусловлен действием дуокармицина, поставляемого hPDGFR-β, что предполагает, что биспецифическое антитело scFv-Cκ-scFv эффективно доставляет комплекс гаптен-лекарственный препарат (кот-дуо) в целевые клетки и эффективно высвобождает лекарственный препарат внутри клеток.
Пример 16
Сначала, используя PRb-CN01 scFv, подготовленный в примере 2, был сконструирован вектор экспрессии pCEP4, содержащий ген, кодирующий кроличье антитело scFv-Fc. Аминокислотная последовательность антитела кролика Fc, использованного в эксперименте, показана под SEQ ID NO: 72 в перечне последовательностей.
В частности, он был связан с Fc кролика посредством шарнирного участка (QEPKSSDKTHTSPPSP: SEQ ID NO: 73) на С-конце scFv антитела mPDGFR-β. В качестве специфического способа получения кроличьего scFv-Fc ген, кодирующий антитело mPDGFR-β, был преобразован с помощью SfiI (New England Biolabs) и лигирован к вектору экспрессии. Трансфицирование и очистку выполняли аналогично mPDGFR-β в примерах, но модификацию для очистки гибридного белка кроличьего hFc выполняли с помощью гель-афинной хроматографии белка A, в соответствии с инструкциями производителя (Repligen Corp., Кембридж, Массачусетс).
По существу, тем же способом, что и проточная цитометрия для определения способности связывания антител в примере 5, было подтверждено, что биспецифические антитела PRb-CN01 и PRb-CN32 scFv-Cκ-scFv осуществляют связь с клетками NIH3T3 (ФИГ. 18). В частности, гибридный белок биспецифического антитела scFv-Cκ-scFv (100 нМ) в проточном цитометрическом буфере культивировали на клетках NIH3T3, экспрессирующих mPDGFR-β. Клетки были обработаны APC-антителом к антигену человеческого Cκ. В качестве отрицательного контроля использовали гибридный белок биспецифического антитела anti-HER2 x котинин scFv-Cκ-scFv.
Осуществление практически соответствовало иммуноферментному анализу способности антител к связыванию в примере 3, за исключением того, что гибридный белок mPDGFR-β-hFc наносили на всю ночь на микротитрационный планшет при температуре 4 °C. После инкубации блокирующего агента в каждой лунке различные концентрации антитела кролика PRb-CN01 Fc (0,01 нм-1 мкМ) и PRb-CN01, контрольного антитела anti-HER2 и биспецифического PRb-CN32 scFv-Cκ-scFv (100 нМ), разбавленного в 3 % бычьего сывороточного альбумина, растворенного в фосфатно-солевом буфере, вступали в реакцию в каждой лунке при температуре 37 °C в течение 2 часов. После трехкратного промывания планшета фосфатно-солевым буфером с твином пероксидаза хрена-антитело кролика Fc реагировали при температуре 37° C в течение 1 часа, а после промывания реакцию проводили в присутствии 2,2'-азино-бис-(3-этилбензтиазолин)-6-сульфониевой кислоты. После этого измерили поглощение при 405 нМ с помощью прибора Multiscan Ascent microplate (Labsystems, Хельсинки, Финляндия) (ФИГ. 19A). На фиг. 19а представлены результаты, подтверждающие конкуренцию суррогатного антитела PRb-CN01. Как показано на фиг. 19a, способность к связыванию гибридного белка mPDGFR-β-hFc и кроличьего PRb-CN01 Fc была ингибирована биспецифическим антителом scFv-Cκ-scFv для PRb-CN01 и PRb-CN32.
Аналогично примеру 5, на клетках NIH3T3 в течение 1 часа культивировали кроличий PRb-CN01-Fc (50 нМ) и PRb-CN01, контрольное антитело, биспецифическое антитело PRb-CN32 scFv-Cκ-scFv (1 мкМ). После промывания реакция с ФИТЦ-антителом к кроличьему антигену Fc (172-1506, KPL, Гайтерсбург, Мэриленд, США) протекала при температуре 4 °C в течение 1 часа. После промывания его классифицировали и проанализировали с помощью прибора FACS Canto II (BD Biosciences, Сан-Хосе, Калифорния, США). Для каждого измерения было идентифицировано 10 000 клеток. Результаты были проанализированы FlowJo (Tree Star, Ашленд, Орегон, США) (фиг. 19b).
Как показано на фиг. 19b, способность к связыванию присутствующих на поверхности клетки mPDGFR-β и кроличьего PRb-CN01 Fc была ингибирована биспецифическим антителом scFv-Cκ-scFv для PRb-CN01 и PRb-CN32.
Проверка проводилась аналогично примеру 7, за исключением того, что использовали биспецифическое антитело, связанное с антителом к антигену mPDGFR-β, и биспецифическое антитело, связанное с антителом к антигену hPDGFR-β, полученное в примере 10. На фиг. 20а-20b представлены графики, иллюстрирующие разницу в цитотоксической активности биспецифических антител PRb-CN01 и PRb-CN32 и комплексов котинин-дуокармицина в клетках, экспрессирующих PDGFR-β. На фиг. 20b эксперимент был повторен в присутствии mPDGF-BB.
Как показано на фиг. 20а и 20b, оба протестированных антитела (PRb-CN01, PRb-32) показали эквивалентную цитотоксичность независимо от наличия/отсутствия mPDGF-BB. Таким образом, было подтверждено, что PRb-CN01 и PRb-32 представляют собой суррогатные антитела.
--->
<110> СЕУЛ НЭШНЛ ЮНИВЕРСИТИ РиДБ ФАУНДЕЙШН
ЕВХА ЮНИВЕРСИТИ-ИНДАСТРИ КОЛЛАБОРЕЙШН ФАУНДЕЙШН
<120> Антитела к рецептору тромбоцитарного фактора роста (PDGF) и их применение
<130> OPP20193834KR
<150> US 62/741,733
<151> 2018-10-05
<160> 73
<170> koPatentIn 3.0
<210> 1
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CDR1-VH of PRb-CN01
<400> 1
Gly Phe Thr Phe Ser Asp Arg Ala Met His
1 5 10
<210> 2
<211> 17
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CDR2-VH of PRb-CN01
<400> 2
Leu Ile Thr Asn Thr Gly Gly Ser Thr Asn Tyr Gly Ala Ala Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 3
<211> 13
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CDR3-VH of PRb-CN01
<400> 3
Gly Val Gly Ser Trp Ala His Gly Gly Arg Ile Asp Ala
1 5 10
<210> 4
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CDR1-VL of PRb-CN01
<400> 4
Ser Gly Gly Ser Gly Ser Tyr Gly
1 5
<210> 5
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CDR2-VL of PRb-CN01
<400> 5
Ser Asn Asn Gln Arg Pro Ser
1 5
<210> 6
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CDR3-VL of PRb-CN01
<400> 6
Gly Thr Arg Asp Ser Ser Tyr Val Gly Ile
1 5 10
<210> 7
<211> 122
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> VH of PRb-CN01
<400> 7
Ala Val Thr Leu Asp Glu Ser Gly Gly Gly Leu Gln Thr Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ala Leu Ser Leu Val Cys Lys Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Arg
20 25 30
Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly Leu Ile Thr Asn Thr Gly Gly Ser Thr Asn Tyr Gly Ala Ala Val
50 55 60
Lys Gly Arg Ala Thr Ile Ser Arg Asp Asn Gly Gln Ser Thr Val Arg
65 70 75 80
Leu Gln Leu Asn Asn Leu Arg Ala Glu Asp Thr Gly Thr Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Arg Gly Val Gly Ser Trp Ala His Gly Gly Arg Ile Asp Ala Trp
100 105 110
Gly His Gly Thr Glu Val Ile Val Ser Ser
115 120
<210> 8
<211> 102
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> VL of PRb-CN01
<400> 8
Leu Thr Gln Pro Ser Ser Val Ser Ala Asn Pro Gly Glu Thr Val Lys
1 5 10 15
Ile Thr Cys Ser Gly Gly Ser Gly Ser Tyr Gly Trp Phe Gln Gln Lys
20 25 30
Ser Pro Gly Ser Ala Pro Val Thr Val Ile Tyr Ser Asn Asn Gln Arg
35 40 45
Pro Ser Asp Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Lys Ser Gly Ser Thr
50 55 60
Asn Thr Leu Thr Ile Thr Gly Val Gln Ala Glu Asp Glu Ala Ile Tyr
65 70 75 80
Tyr Cys Gly Thr Arg Asp Ser Ser Tyr Val Gly Ile Phe Gly Ala Gly
85 90 95
Thr Thr Leu Thr Val Leu
100
<210> 9
<211> 11
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CDR1-VH of PRb-CC01
<400> 9
Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Asn Met Gly
1 5 10
<210> 10
<211> 17
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CDR2-VH of PRb-CC01
<400> 10
Gly Ile Ser Ala Ala Asp Asn Ser Thr Ala Tyr Gly Ala Ala Val Asp
1 5 10 15
Gly
<210> 11
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CDR3-VH of PRb-CC01
<400> 11
Gly Gly Gly Ser Ile Asp Ala
1 5
<210> 12
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CDR1-VL of PRb-CC01
<400> 12
Ser Gly Gly Gly Ser Tyr Tyr Gly
1 5
<210> 13
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CDR2-VL of PRb-CC01
<400> 13
Tyr Asn Asp Lys Arg Pro Ser
1 5
<210> 14
<211> 11
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CDR3-VL of PRb-CC01
<400> 14
Gly Ala Trp Asp Asn Ser Ala Gly Tyr Ala Gly
1 5 10
<210> 15
<211> 116
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> VH of PRb-CC01
<400> 15
Ala Val Thr Leu Asp Glu Ser Gly Gly Gly Leu Gln Thr Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ala Leu Ser Leu Val Cys Lys Gly Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Asn Met Gly Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Phe Val
35 40 45
Ala Gly Ile Ser Ala Ala Asp Asn Ser Thr Ala Tyr Gly Ala Ala Val
50 55 60
Asp Gly Arg Ala Thr Ile Ser Arg Asp Asn Gly Gln Ser Thr Val Arg
65 70 75 80
Leu Gln Leu Asn Asn Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys
85 90 95
Ile Arg Gly Gly Gly Ser Ile Asp Ala Trp Gly His Gly Thr Glu Val
100 105 110
Ile Val Ser Ser
115
<210> 16
<211> 103
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> VL of PRb-CC01
<400> 16
Leu Thr Gln Pro Ser Ser Val Ser Ala Asn Leu Gly Gly Thr Val Lys
1 5 10 15
Ile Thr Cys Ser Gly Gly Gly Ser Tyr Tyr Gly Trp Tyr Gln Gln Lys
20 25 30
Ser Pro Gly Ser Ala Pro Val Thr Leu Ile Tyr Tyr Asn Asp Lys Arg
35 40 45
Pro Ser Asp Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Lys Ser Gly Ser Thr
50 55 60
Gly Thr Leu Thr Ile Thr Gly Val Gln Ala Glu Asp Glu Ala Val Tyr
65 70 75 80
Phe Cys Gly Ala Trp Asp Asn Ser Ala Gly Tyr Ala Gly Phe Gly Ala
85 90 95
Gly Thr Thr Leu Thr Val Leu
100
<210> 17
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CDR1-VH of PRb-CC02
<400> 17
Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Gly Met Phe
1 5 10
<210> 18
<211> 16
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CDR2-VH of PRb-CC02
<400> 18
Gly Ile Asp Thr Gly Ser Gly Thr Asn Tyr Gly Ser Ala Val Lys Gly
1 5 10 15
<210> 19
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CDR3-VH of PRb-CC02
<400> 19
Gly Tyr Ala Gly Thr Ile Asp Ala
1 5
<210> 20
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CDR1-V of PRb-CC02
<400> 20
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Tyr Gly
1 5
<210> 21
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CDR2-VL of PRb-CC02
<400> 21
Tyr Asn Asp Lys Arg Pro Ser
1 5
<210> 22
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CDR3-VL of PRb-CC02
<400> 22
Gly Ser Tyr Asn Ser Ser Asp Ser Leu
1 5
<210> 23
<211> 118
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> VH of PRb-CC02
<400> 23
Ala Val Thr Leu Asp Glu Ser Gly Gly Gly Leu Gln Thr Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ala Leu Ser Leu Val Cys Lys Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Gly Met Phe Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Gly Ile Asp Thr Gly Ser Gly Thr Asn Tyr Gly Ser Ala Val Lys
50 55 60
Gly Arg Ala Thr Ile Ser Arg Asp Asn Gly Gln Ser Thr Val Arg Leu
65 70 75 80
Gln Leu Asn Asn Leu Arg Ala Glu Asp Thr Gly Thr Tyr Phe Cys Thr
85 90 95
Arg Gly Tyr Ala Gly Thr Ile Asp Ala Trp Gly His Gly Thr Glu Val
100 105 110
Ile Val Ser Ser Thr Ser
115
<210> 24
<211> 101
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> VL of PRb-CC02
<400> 24
Leu Thr Gln Pro Ser Ser Val Ser Ala Asn Pro Gly Glu Thr Val Lys
1 5 10 15
Ile Thr Cys Ser Gly Gly Gly Gly Ser Tyr Gly Trp Tyr Gln Gln Lys
20 25 30
Ser Pro Gly Ser Ala Pro Val Thr Val Ile Tyr Tyr Asn Asp Lys Arg
35 40 45
Pro Ser Asp Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Lys Ser Gly Ser Thr
50 55 60
Gly Thr Leu Thr Ile Thr Gly Val Gln Ala Glu Asp Glu Ala Val Tyr
65 70 75 80
Phe Cys Gly Ser Tyr Asn Ser Ser Asp Ser Leu Phe Gly Ala Gly Thr
85 90 95
Thr Leu Thr Val Leu
100
<210> 25
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CDR1-VH of PRb-CC03
<400> 25
Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Ala Met Gly
1 5 10
<210> 26
<211> 16
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CDR2-VH of PRb-CC03
<400> 26
Gly Ile Asp Thr Ala Gly Gly Thr Ala Tyr Gly Pro Ala Val Lys Gly
1 5 10 15
<210> 27
<211> 6
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CDR3-VH of PRb-CC03
<400> 27
Ser Ser Tyr Ile Asp Thr
1 5
<210> 28
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CDR1-VL of PRb-CC03
<400> 28
Ser Gly Gly Thr Tyr Asn Tyr Gly
1 5
<210> 29
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CDR2-VL of PRb-CC03
<400> 29
Trp Asn Asp Lys Arg Pro Ser
1 5
<210> 30
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CDR3-VL of PRb-CC03
<400> 30
Gly Ser Ser Asp Ser Ser Gly Leu Ile
1 5
<210> 31
<211> 116
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> VH of PRb-CC03
<400> 31
Ala Val Thr Leu Asp Glu Ser Gly Gly Gly Leu Gln Thr Pro Gly Gly
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Val Cys Lys Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Gly Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Gly Ile Asp Thr Ala Gly Gly Thr Ala Tyr Gly Pro Ala Val Lys
50 55 60
Gly Arg Ala Thr Ile Ser Arg Asp Asn Gly Gln Ser Thr Val Arg Leu
65 70 75 80
Gln Leu Asn Asn Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Thr
85 90 95
Arg Ser Ser Tyr Ile Asp Thr Trp Gly His Gly Thr Glu Val Ile Val
100 105 110
Ser Ser Thr Ser
115
<210> 32
<211> 101
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> VL of PRb-CC03
<400> 32
Leu Thr Gln Pro Ser Ser Val Ser Ala Asn Pro Gly Glu Thr Val Lys
1 5 10 15
Ile Thr Cys Ser Gly Gly Thr Tyr Asn Tyr Gly Trp Tyr Gln Gln Lys
20 25 30
Ser Pro Gly Ser Ala Pro Val Thr Val Ile Tyr Trp Asn Asp Lys Arg
35 40 45
Pro Ser Asp Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Lys Ser Gly Ser Thr
50 55 60
Gly Thr Leu Thr Ile Thr Gly Val Gln Ala Glu Asp Glu Ala Val Tyr
65 70 75 80
Tyr Cys Gly Ser Ser Asp Ser Ser Gly Leu Ile Phe Gly Ala Gly Thr
85 90 95
Thr Leu Thr Val Leu
100
<210> 33
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CDR1-VH of PRb-CN16
<400> 33
Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe Asn Met Ala
1 5 10
<210> 34
<211> 17
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CDR2-VH of PRb-CN16
<400> 34
Glu Ile Ser Asn Thr Ala Gly Ser Thr Phe Tyr Ala Pro Ala Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 35
<211> 16
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CDR3-VH of PRb-CN16
<400> 35
Ala Ala Gly Thr Cys Tyr Ser His Ser Cys Thr Gly Tyr Ile Asp Ala
1 5 10 15
<210> 36
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CDR1-VL of PRb-CN16
<400> 36
Ser Gly Ser Ser Ser Ser Tyr Gly
1 5
<210> 37
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CDR2-VL of PRb-CN16
<400> 37
Glu Asn Asn Gln Arg Pro Ser
1 5
<210> 38
<211> 11
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CDR3-VL of PRb-CN16
<400> 38
Gly Asn Ala Asp Arg Ser Asn Ser Ala Gly Thr
1 5 10
<210> 39
<211> 127
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> VH of PRb-CN16
<400> 39
Ala Val Thr Leu Asp Glu Ser Gly Gly Gly Leu Gln Thr Pro Gly Thr
1 5 10 15
Ala Leu Ser Leu Val Cys Lys Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe
20 25 30
Asn Met Ala Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Phe Val
35 40 45
Gly Glu Ile Ser Asn Thr Ala Gly Ser Thr Phe Tyr Ala Pro Ala Val
50 55 60
Lys Gly Arg Ala Thr Ile Ser Arg Asp Asn Gly Gln Ser Thr Val Arg
65 70 75 80
Leu Gln Leu Asn Asn Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Ala Ala Gly Thr Cys Tyr Ser His Ser Cys Thr Gly Tyr Ile
100 105 110
Asp Ala Trp Gly His Gly Thr Glu Val Ile Val Ser Ser Thr Ser
115 120 125
<210> 40
<211> 103
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> VL of PRb-CN16
<400> 40
Leu Thr Gln Pro Ser Ser Val Ser Ala Asn Pro Gly Glu Thr Val Lys
1 5 10 15
Ile Thr Cys Ser Gly Ser Ser Ser Ser Tyr Gly Trp Tyr Gln Gln Lys
20 25 30
Ser Pro Gly Ser Ala Pro Val Thr Leu Ile Tyr Glu Asn Asn Gln Arg
35 40 45
Pro Ser Asn Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Lys Ser Gly Ser Thr
50 55 60
Gly Thr Leu Thr Ile Thr Gly Val Gln Ala Glu Asp Glu Ala Val Tyr
65 70 75 80
Tyr Cys Gly Asn Ala Asp Arg Ser Asn Ser Ala Gly Thr Phe Gly Ala
85 90 95
Gly Thr Thr Leu Thr Val Leu
100
<210> 41
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CDR1-VH of PRb-CN32
<400> 41
Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe Asn Met Phe
1 5 10
<210> 42
<211> 17
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CDR2-VH of PRb-CN32
<400> 42
Gly Ile Ser Thr Thr Gly Arg Tyr Thr Gly Tyr Gly Ser Ala Val Gln
1 5 10 15
Gly
<210> 43
<211> 18
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CDR3-VH of PRb-CN32
<400> 43
Ser Ala Gly Ser Thr Tyr Ser Tyr Trp Asp Ser Asp Ala Gly Leu Ile
1 5 10 15
Asp Ala
<210> 44
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CDR1-VL of PRb-CN32
<400> 44
Ser Gly Gly Ser Asn Ala Gly Ser Tyr Tyr Tyr Gly
1 5 10
<210> 45
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CDR2-VL of PRb-CN32
<400> 45
Ser Asn Asn Gln Arg Pro Ser
1 5
<210> 46
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CDR3-VL of PRb-CN32
<400> 46
Gly Ser Gly Asp Ser Ser Ser Ile Ala Ala
1 5 10
<210> 47
<211> 129
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> VH of PRb-CN32
<400> 47
Ala Val Thr Leu Asp Glu Ser Gly Gly Gly Leu Gln Thr Pro Arg Gly
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Val Cys Lys Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe
20 25 30
Asn Met Phe Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Phe Val
35 40 45
Ala Gly Ile Ser Thr Thr Gly Arg Tyr Thr Gly Tyr Gly Ser Ala Val
50 55 60
Gln Gly Arg Gly Thr Ile Ser Arg Asp Asn Gly Gln Ser Thr Val Arg
65 70 75 80
Leu Gln Leu Asn Asn Leu Arg Ala Glu Asp Thr Gly Thr Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Ser Ala Gly Ser Thr Tyr Ser Tyr Trp Asp Ser Asp Ala Gly
100 105 110
Leu Ile Asp Ala Trp Gly His Gly Thr Glu Val Ile Val Ser Ser Thr
115 120 125
Ser
<210> 48
<211> 106
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> VL of PRb-CN32
<400> 48
Leu Thr Gln Pro Ser Ser Val Ser Ala Asn Leu Gly Glu Thr Val Lys
1 5 10 15
Ile Thr Cys Ser Gly Gly Ser Asn Ala Gly Ser Tyr Tyr Tyr Gly Trp
20 25 30
Tyr Gln Gln Lys Ser Pro Gly Ser Ala Pro Val Thr Val Ile Tyr Ser
35 40 45
Asn Asn Gln Arg Pro Ser Asp Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Thr
50 55 60
Ser Gly Ser Thr Ser Thr Leu Thr Ile Thr Gly Val Gln Val Asp Asp
65 70 75 80
Glu Ala Val Tyr Phe Cys Gly Ser Gly Asp Ser Ser Ser Ile Ala Ala
85 90 95
Phe Gly Ala Gly Thr Thr Leu Thr Val Leu
100 105
<210> 49
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CDR1-VH of PRb-CN26
<400> 49
Gly Phe Thr Phe Ser Asp Arg Gly Ile His
1 5 10
<210> 50
<211> 17
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CDR2-VH of PRb-CN26
<400> 50
Gly Ile Gly Asn Thr Gly Ser Tyr Thr Ala Tyr Ala Pro Ala Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 51
<211> 11
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CDR3-VH of PRb-CN26
<400> 51
Arg Gly Phe Met Asp Ala Gly Gly Ile Asp Ala
1 5 10
<210> 52
<211> 13
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CDR1-VL of PRb-CN26
<400> 52
Ser Gly Gly Gly Ser Tyr Ala Gly Ser Tyr Tyr Tyr Gly
1 5 10
<210> 53
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CDR2-VL of PRb-CN26
<400> 53
Asp Asn Thr Asn Arg Pro Ser
1 5
<210> 54
<211> 11
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CDR3-VL of PRb-CN26
<400> 54
Gly Gly Tyr Asp Gly Ile Ser Asp Thr Gly Ile
1 5 10
<210> 55
<211> 122
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> VH of PRb-CN26
<400> 55
Ala Val Thr Leu Asp Glu Ser Gly Gly Gly Leu Gln Thr Pro Gly Gly
1 5 10 15
Gly Leu Ser Leu Val Cys Lys Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Arg
20 25 30
Gly Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Gly Ile Gly Asn Thr Gly Ser Tyr Thr Ala Tyr Ala Pro Ala Val
50 55 60
Lys Gly Arg Ala Thr Ile Ser Arg Asp Asn Gly Gln Ser Thr Val Arg
65 70 75 80
Leu Gln Leu Asn Asn Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Arg Gly Phe Met Asp Ala Gly Gly Ile Asp Ala Trp Gly His
100 105 110
Gly Thr Glu Val Ile Val Ser Ser Thr Ser
115 120
<210> 56
<211> 108
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> VL of PRb-CN26
<400> 56
Leu Thr Gln Pro Ser Ser Val Ser Ala Asn Pro Gly Glu Thr Val Lys
1 5 10 15
Ile Thr Cys Ser Gly Gly Gly Ser Tyr Ala Gly Ser Tyr Tyr Tyr Gly
20 25 30
Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Pro Gly Ser Ala Pro Val Thr Val Ile Tyr
35 40 45
Asp Asn Thr Asn Arg Pro Ser Asn Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Leu Ser Gly Ser Thr Asp Thr Leu Thr Ile Thr Gly Val Gln Ala Glu
65 70 75 80
Asp Glu Ala Val Tyr Phe Cys Gly Gly Tyr Asp Gly Ile Ser Asp Thr
85 90 95
Gly Ile Phe Gly Ala Gly Thr Thr Leu Thr Val Leu
100 105
<210> 57
<211> 18
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Linker for VL-VH in scFv
<400> 57
Gly Gln Ser Ser Arg Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ser Gly Gly Gly
1 5 10 15
Gly Ser
<210> 58
<211> 107
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Kappa constant (Ck)
<400> 58
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
1 5 10 15
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
20 25 30
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
35 40 45
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
50 55 60
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
65 70 75 80
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Leu
85 90 95
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Ser
100 105
<210> 59
<211> 15
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Linker for scFv-Ck
<400> 59
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
<210> 60
<211> 255
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> hPDGFR-beta Extracellular domain
<400> 60
Met Arg Leu Pro Gly Ala Met Pro Ala Leu Ala Leu Lys Gly Glu Leu
1 5 10 15
Leu Leu Leu Ser Leu Leu Leu Leu Leu Glu Pro Gln Ile Ser Gln Gly
20 25 30
Leu Val Val Thr Pro Pro Gly Pro Glu Leu Val Leu Asn Val Ser Ser
35 40 45
Thr Phe Val Leu Thr Cys Ser Gly Ser Ala Pro Val Val Trp Glu Arg
50 55 60
Met Ser Gln Glu Pro Pro Gln Glu Met Ala Lys Ala Gln Asp Gly Thr
65 70 75 80
Phe Ser Ser Val Leu Thr Leu Thr Asn Leu Thr Gly Leu Asp Thr Gly
85 90 95
Glu Tyr Phe Cys Thr His Asn Asp Ser Arg Gly Leu Glu Thr Asp Glu
100 105 110
Arg Lys Arg Leu Tyr Ile Phe Val Pro Asp Pro Thr Val Gly Phe Leu
115 120 125
Pro Asn Asp Ala Glu Glu Leu Phe Ile Phe Leu Thr Glu Ile Thr Glu
130 135 140
Ile Thr Ile Pro Cys Arg Val Thr Asp Pro Gln Leu Val Val Thr Leu
145 150 155 160
His Glu Lys Lys Gly Asp Val Ala Leu Pro Val Pro Tyr Asp His Gln
165 170 175
Arg Gly Phe Ser Gly Ile Phe Glu Asp Arg Ser Tyr Ile Cys Lys Thr
180 185 190
Thr Ile Gly Asp Arg Glu Val Asp Ser Asp Ala Tyr Tyr Val Tyr Arg
195 200 205
Leu Gln Val Ser Ser Ile Asn Val Ser Val Asn Ala Val Gln Thr Val
210 215 220
Val Arg Gln Gly Glu Asn Ile Thr Leu Met Cys Ile Val Ile Gly Asn
225 230 235 240
Glu Val Val Asn Phe Glu Trp Thr Tyr Pro Arg Lys Glu Ser Gly
245 250 255
<210> 61
<211> 255
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> mPDGFR-beta Extracellular domain
<400> 61
Leu Val Ile Thr Pro Pro Gly Pro Glu Phe Val Leu Asn Ile Ser Ser
1 5 10 15
Thr Phe Val Leu Thr Cys Ser Gly Ser Ala Pro Val Met Trp Glu Gln
20 25 30
Met Ser Gln Val Pro Trp Gln Glu Ala Ala Met Asn Gln Asp Gly Thr
35 40 45
Phe Ser Ser Val Leu Thr Leu Thr Asn Val Thr Gly Gly Asp Thr Gly
50 55 60
Glu Tyr Phe Cys Val Tyr Asn Asn Ser Leu Gly Pro Glu Leu Ser Glu
65 70 75 80
Arg Lys Arg Ile Tyr Ile Phe Val Pro Asp Pro Thr Met Gly Phe Leu
85 90 95
Pro Met Asp Ser Glu Asp Leu Phe Ile Phe Val Thr Asp Val Thr Glu
100 105 110
Thr Thr Ile Pro Cys Arg Val Thr Asp Pro Gln Leu Glu Val Thr Leu
115 120 125
His Glu Lys Lys Val Asp Ile Pro Leu His Val Pro Tyr Asp His Gln
130 135 140
Arg Gly Phe Thr Gly Thr Phe Glu Asp Lys Thr Tyr Ile Cys Lys Thr
145 150 155 160
Thr Ile Gly Asp Arg Glu Val Asp Ser Asp Thr Tyr Tyr Val Tyr Ser
165 170 175
Leu Gln Val Ser Ser Ile Asn Val Ser Val Asn Ala Val Gln Thr Val
180 185 190
Val Arg Gln Gly Glu Ser Ile Thr Ile Arg Cys Ile Val Met Gly Asn
195 200 205
Asp Val Val Asn Phe Gln Trp Thr Tyr Pro Arg Met Lys Ser Gly Arg
210 215 220
Leu Val Glu Pro Val Thr Asp Tyr Leu Phe Gly Val Pro Ser Arg Ile
225 230 235 240
Gly Ser Ile Leu His Ile Pro Thr Ala Glu Leu Ser Asp Ser Gly
245 250 255
<210> 62
<211> 255
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PDGFR-beta of Cynomolgus monkey
<400> 62
Met Arg Leu Pro Gly Ala Met Pro Ala Leu Ala Leu Lys Gly Gln Leu
1 5 10 15
Leu Leu Leu Pro Leu Leu Leu Leu Leu Glu Pro Gln Val Ser Gln Gly
20 25 30
Leu Val Ile Thr Pro Pro Gly Pro Glu Leu Ile Leu Asn Val Ser Ser
35 40 45
Thr Phe Val Leu Thr Cys Ser Gly Ser Ala Pro Val Val Trp Glu Arg
50 55 60
Met Ser Gln Glu Leu Pro Gln Glu Met Ala Lys Ala Gln Asp Asn Thr
65 70 75 80
Phe Ser Ser Val Leu Thr Leu Thr Asn Leu Thr Gly Leu Asp Thr Gly
85 90 95
Glu Tyr Phe Cys Thr Tyr Asn Asp Ser Arg Gly Leu Glu Pro Asp Glu
100 105 110
Arg Lys Arg Leu Tyr Ile Phe Val Pro Asp Pro Thr Val Gly Phe Leu
115 120 125
Pro Asn Asp Ala Glu Glu Leu Phe Ile Phe Leu Thr Glu Ile Thr Glu
130 135 140
Ile Thr Ile Pro Cys Arg Val Thr Asp Pro Gln Leu Val Val Thr Leu
145 150 155 160
His Glu Lys Lys Gly Asp Ile Ala Leu Pro Val Pro Tyr Asp His Gln
165 170 175
Arg Gly Phe Ser Gly Ile Phe Glu Asp Arg Ser Tyr Ile Cys Lys Thr
180 185 190
Thr Ile Gly Asp Arg Glu Val Asp Ser Asp Ala Tyr Tyr Val Tyr Arg
195 200 205
Leu Gln Val Ser Ser Ile Asn Val Ser Val Asn Ala Val Gln Thr Val
210 215 220
Val Arg Gln Gly Glu Asn Ile Thr Leu Met Cys Ile Val Ile Gly Asn
225 230 235 240
Glu Val Val Asn Phe Glu Trp Met Tyr Pro Arg Lys Glu Ser Gly
245 250 255
<210> 63
<211> 255
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PDGFR-beta of Sus scrofa
<400> 63
Met Gln Leu Pro Arg Ala Val Pro Ala Ser Val Leu Ile Gly Gln Val
1 5 10 15
Leu Leu Leu Pro Pro Leu Leu Leu Leu Gly Pro Gln Ala Ser Trp Gly
20 25 30
Leu Val Ile Thr Pro Pro Gly Pro Glu Leu Val Leu Asn Leu Ser Ser
35 40 45
Thr Phe Val Leu Thr Cys Ser Gly Pro Ala Pro Val Val Trp Glu Arg
50 55 60
Met Ser Gln Lys Pro Pro Gln Glu Met Thr Gly Thr Gln Asp Gly Thr
65 70 75 80
Phe Ser Ser Val Leu Thr Leu Ala Asn Val Thr Gly Leu Asp Thr Gly
85 90 95
Glu Tyr Phe Cys Thr Tyr Lys Gly Ser Pro Gly Leu Glu Ala Ser Glu
100 105 110
Arg Lys Arg Leu Tyr Ile Phe Val Pro Asp Pro Ala Val Gly Phe Leu
115 120 125
Pro Val Asp Pro Glu Glu Leu Phe Ile Phe Leu Thr Glu Ile Thr Glu
130 135 140
Thr Thr Ile Pro Cys Arg Val Thr Asp Pro Arg Leu Val Val Thr Leu
145 150 155 160
His Glu Lys Lys Val Asp Val Pro Leu Pro Ile Ser Tyr Asp His Gln
165 170 175
Arg Gly Phe Ser Gly Thr Phe Glu Asp Lys Thr Tyr Val Cys Lys Thr
180 185 190
Thr Ile Gly Asp Arg Glu Val Asp Ser Asp Ala Tyr Tyr Val Tyr Ser
195 200 205
Leu Gln Val Ser Ser Ile Asn Val Ser Val Gly Ala Val Gln Thr Val
210 215 220
Val Arg Gln Gly Glu Asn Ile Thr Val Met Cys Ile Val Thr Gly Asn
225 230 235 240
Glu Val Val Asn Phe Glu Trp Thr Tyr Pro Arg Leu Glu Thr Gly
245 250 255
<210> 64
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CDR1-VH of anti-Cotinine antibody
<400> 64
Gly His Leu Arg Arg Arg Asp Trp Met
1 5
<210> 65
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CDR2-VH of anti-Cotinine antibody
<400> 65
Ile Gly Arg Ser Gly Asp Thr
1 5
<210> 66
<211> 11
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CDR3-VH of anti-Cotinine antibody
<400> 66
Ile Pro Tyr Phe Gly Trp Asn Asn Gly Asp Ile
1 5 10
<210> 67
<211> 13
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CDR1-VL of anti-Cotinine antibody
<400> 67
Gln Ser Ser Gln Ser Pro Tyr Ser Asn Glu Trp Leu Ser
1 5 10
<210> 68
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CDR2-VL of anti-Cotinine antibody
<400> 68
Arg Ile Ser Thr Leu Ala Ser
1 5
<210> 69
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CDR3-VL of anti-Cotinine antibody
<400> 69
Ala Gly Gly Tyr Asn Phe Gly Leu Phe Leu Phe Gly
1 5 10
<210> 70
<211> 119
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> VH of anti-Cotinine antibody
<400> 70
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly His Leu Arg Arg Arg Asp
20 25 30
Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Ala Ile Gly Arg Ser Gly Asp Thr Tyr Tyr Ala Thr Trp Ala Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ser
85 90 95
Arg Ile Pro Tyr Phe Gly Trp Asn Asn Gly Asp Ile Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 71
<211> 110
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> VL of anti-Cotinine antibody
<400> 71
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ser Ser Gln Ser Pro Tyr Ser Asn
20 25 30
Glu Trp Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu
35 40 45
Leu Ile Tyr Arg Ile Ser Thr Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu
65 70 75 80
Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala Gly Gly Tyr Asn Phe
85 90 95
Gly Leu Phe Leu Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 72
<211> 214
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Antibody to rabbit Fc
<400> 72
Pro Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys
1 5 10 15
Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val
20 25 30
Val Val Asp Val Ser Gln Asp Asp Pro Glu Val Gln Phe Thr Trp Tyr
35 40 45
Ile Asn Asn Glu Gln Val Arg Thr Ala Arg Pro Pro Leu Arg Glu Gln
50 55 60
Gln Phe Asn Ser Thr Ile Arg Val Val Ser Thr Leu Pro Ile Ala His
65 70 75 80
Gln Asp Trp Leu Arg Gly Lys Glu Phe Lys Cys Lys Val His Asn Lys
85 90 95
Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Arg Gly Gln
100 105 110
Pro Leu Glu Pro Lys Val Tyr Thr Met Gly Pro Pro Arg Glu Glu Leu
115 120 125
Ser Ser Arg Ser Val Ser Leu Thr Cys Met Ile Asn Gly Phe Tyr Pro
130 135 140
Ser Asp Ile Ser Val Glu Trp Glu Lys Asn Gly Lys Ala Glu Asp Asn
145 150 155 160
Tyr Lys Thr Thr Pro Ala Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Tyr Phe Leu
165 170 175
Tyr Ser Lys Leu Ser Val Pro Thr Ser Glu Trp Gln Arg Gly Asp Val
180 185 190
Phe Thr Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln
195 200 205
Lys Ser Ile Ser Arg Ser
210
<210> 73
<211> 16
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Hinge of linking rabbit Fc and anti-PDGFR-beta antibody
<400> 73
Gln Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Ser Pro Pro Ser Pro
1 5 10 15
<---
1. Антитело к рецептору антигена PDGF или его антигенсвязывающий фрагмент, которое специфически связывается с бета-рецептором тромбоцитарного фактора роста (PDGFR-β) и содержит вариабельную область тяжелой цепи и вариабельную область легкой цепи,
причем антитело к рецептору антигена PDGF или его антигенсвязывающий фрагмент содержит:
(a) VH-CDR1 - VH-CDR3, каждая из которых содержит аминокислотную последовательность с SEQ ID NO: 1-3, и VL-CDR1 - VL-CDR3, каждая из которых содержит аминокислотную последовательность с SEQ ID NO: 4-6,
(b) VH-CDR1 - VH-CDR3, каждая из которых содержит аминокислотную последовательность с SEQ ID NO: 9-11, и VL-CDR1 - VL-CDR3, каждая из которых содержит аминокислотную последовательность с SEQ ID NO: 12-14,
(c) VH-CDR1 - VH-CDR3, каждая из которых содержит аминокислотную последовательность с SEQ ID NO: 17-19, и VL-CDR1 - VL-CDR3, каждая из которых содержит аминокислотную последовательность с SEQ ID NO: 20-22,
(d) VH-CDR1 - VH-CDR3, каждая из которых содержит аминокислотную последовательность с SEQ ID NO: 25-27, и VL-CDR1 - VL-CDR3, каждая из которых содержит аминокислотную последовательность с SEQ ID NO: 28-30,
(e) VH-CDR1 - VH-CDR3, каждая из которых содержит аминокислотную последовательность с SEQ ID NO: 33-35, и VL-CDR1 - VL-CDR3, каждая из которых содержит аминокислотную последовательность с SEQ ID NO: 36-38,
(f) VH-CDR1 - VH-CDR3, каждая из которых содержит аминокислотную последовательность с SEQ ID NO: 41-43, и VL-CDR1 - VL-CDR3, каждая из которых содержит аминокислотную последовательность с SEQ ID NO: 44-46, или
(g) VH-CDR1 - VH-CDR3, каждая из которых содержит аминокислотную последовательность с SEQ ID NO: 49-51, и VL-CDR1 - VL-CDR3, каждая из которых содержит аминокислотную последовательность с SEQ ID NO: 52-54.
2. Антитело к рецептору антигена PDGF или его антигенсвязывающий фрагмент по п. 1, причем антитело к рецептору антигена PDGF или его антигенсвязывающий фрагмент специфически связывается с внеклеточной областью PDGFR-β.
3. Антитело к рецептору антигена PDGF или его антигенсвязывающий фрагмент по п. 1, причем антитело к рецептору антигена PDGF или его антигенсвязывающий фрагмент осуществляет неконкурентную связь с PDGF-ВВ.
4. Антитело к рецептору антигена PDGF или его антигенсвязывающий фрагмент по п. 1, причем антитело к рецептору антигена PDGF или его антигенсвязывающий фрагмент содержит:
вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность с SEQ ID NO: 7, и вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность с SEQ ID NO: 8,
вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность с SEQ ID NO: 15, и вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность с SEQ ID NO: 16,
вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность с SEQ ID NO: 23, и вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность с SEQ ID NO: 24,
вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность с SEQ ID NO: 31, и вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность с SEQ ID NO: 32,
вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность с SEQ ID NO: 39, и вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность с SEQ ID NO: 40,
вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность с SEQ ID NO: 47, и вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность с SEQ ID NO: 48, или
вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность с SEQ ID NO: 55, и вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность с SEQ ID NO: 56.
5. Антитело к рецептору антигена PDGF или его антигенсвязывающий фрагмент по п. 1, причем антитело к рецептору антигена PDGF или его антигенсвязывающий фрагмент интернализуется клеткой, экспрессирующей PDGFR-β.
6. Антитело к рецептору антигена PDGF или его антигенсвязывающий фрагмент по п. 1, причем антитело к рецептору антигена PDGF представляет собой интактное антитело в форме IgG1, IgG2, IgG3 или IgG4.
7. Антитело к рецептору антигена PDGF или его антигенсвязывающий фрагмент по п. 1, причем антигенсвязывающий фрагмент антитела выбирают из группы, состоящей из scFv, (scFv)2, scFv-Fc, Fab, Fab' и F(ab')2.
8. Антитело к рецептору антигена PDGF или его антигенсвязывающий фрагмент по п. 7, причем антигенсвязывающий фрагмент антитела представляет собой scFv, последовательно содержащий вариабельную область (VL) легкой цепи, линкер и вариабельную область (VH) тяжелой цепи в направлении от N-конца к С-концу.
9. Конъюгат, специфически связывающийся с бета-рецептором тромбоцитарного фактора роста (PDGFR-β), содержащий антитело к рецептору антигена PDGF или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп. 1-8, конъюгированные с котинином.
10. Конъюгат по п. 9, дополнительно содержащий химиотерапевтический препарат.
11. Конъюгат по п. 10, причем котинин специфически связывается с упомянутым химиотерапевтическим препаратом.
12. Биспецифическое антитело, специфически связывающееся с PDGFR-β и котинином, содержащее антитело к рецептору антигена PDGF или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп. 1-8, специфически связывающееся с бета-рецептором тромбоцитарного фактора роста (PDGFR-β), и антитело к котинину или его антигенсвязывающий фрагмент для химиотерапевтического препарата.
13. Биспецифическое антитело по п. 12, содержащее антигенсвязывающий фрагмент антитела к рецептору антигена PDGF и антигенсвязывающий фрагмент антитела, связывающего котинин.
14. Биспецифическое антитело по п. 13, причем антигенсвязывающий фрагмент к рецептору антигена PDGF представляет собой scFv антитела к рецептору антигена PDGF и его антигенсвязывающий фрагмент к котинину для химиотерапевтического препарата представляет собой scFv антитела к котинину для химиотерапевтического препарата, и
scFv антитела к рецептору антигена PDGF и scFv антитела к котинину для химиотерапевтического препарата соединены непосредственно или через первый линкер.
15. Биспецифическое антитело по п. 14, причем С-конец scFv антитела к рецептору антигена PDGF и N-конец scFv антитела к котинину для химиотерапевтического препарата соединены через первый линкер.
16. Биспецифическое антитело по п. 15, причем scFv антитела к рецептору антигена PDGF, в котором вариабельная область тяжелой цепи и вариабельная область легкой цепи антитела к рецептору антигена PDGF соединены вторым линкером, и scFv, в котором вариабельная область тяжелой цепи и вариабельная область легкой цепи антитела к котинину соединены третьим линкером, соединены первым линкером.
17. Биспецифическое антитело по п. 12, причем в качестве химиотерапевтического препарата используют дуокармицин, калихимицин, пирролбензодиазепин, антрациклин, неморубицин, доксорубицин, иринотекан, аматоксин, ауристатин, майтансин, тубулизин, SN-38, 5-аминолевулиновую кислоту, производное бензопорфирина-монокислотное кольцо А, хлорины, тетра (m-гидроксифенил)хлорин (mTHPC) или лютеций тексафирин.
18. Система доставки лекарственного препарата для доставки лекарственного препарата к клеткам, экспрессирующим рецептор PDGF, в которой лекарственный препарат представляет собой иммунотерапевтический агент или химиотерапевтический агент, содержащая антитело к рецептору антигена PDGF или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп. 1-8 и лекарственный препарат, представляющий собой иммунотерапевтический агент или химиотерапевтический агент.
19. Система доставки лекарственного препарата по п. 18, дополнительно содержащая антитело к котинину или его антигенсвязывающий фрагмент для химиотерапевтического препарата.
20. Фармацевтическая композиция для профилактики, глазных неоваскулярных заболеваний, содержащая антитело к рецептору антигена PDGF или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп. 1-8, или биспецифическое антитело, специфически связывающееся с рецептором PDGF и котинином и содержащее антитело к рецептору антигена PDGF или его антигенсвязывающий фрагмент, а также антитело к котинину или его антигенсвязывающий фрагмент для химиотерапевтического препарата по любому из пп. 12-16; и лекарственный препарат.
21. Фармацевтическая композиция для облегчения течения глазных неоваскулярных заболеваний, содержащая антитело к рецептору антигена PDGF или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп. 1-8, или биспецифическое антитело, специфически связывающееся с рецептором PDGF и котинином и содержащее антитело к рецептору антигена PDGF или его антигенсвязывающий фрагмент, а также антитело к котинину или его антигенсвязывающий фрагмент для химиотерапевтического препарата по любому из пп. 12-16; и лекарственный препарат.
22. Фармацевтическая композиция для лечения глазных неоваскулярных заболеваний, содержащая антитело к рецептору антигена PDGF или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп. 1-8, или биспецифическое антитело, специфически связывающееся с рецептором PDGF и котинином и содержащее антитело к рецептору антигена PDGF или его антигенсвязывающий фрагмент, а также антитело к котинину или его антигенсвязывающий фрагмент для химиотерапевтического препарата по любому из пп. 12-16; и лекарственный препарат.
23. Фармацевтическая композиция по любому из пп. 20-22, причем глазное неоваскулярное заболевание представляет собой ишемическую ретинопатию, неоваскуляризацию радужной оболочки, внутриглазную неоваскуляризацию, возрастную макулярную дегенерацию, неоваскуляризацию роговицы, неоваскуляризацию сетчатки, хороидальную неоваскуляризацию, диабетическую ретинальную ишемию или пролиферативную диабетическую ретинопатию.
24. Фармацевтическая композиция для профилактики онкологических заболеваний, содержащая антитело к рецептору антигена PDGF или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп. 1-8, или биспецифическое антитело, специфически связывающееся с рецептором PDGF и котинином и содержащее антитело к рецептору антигена PDGF или его антигенсвязывающий фрагмент, а также антитело к котинину или его антигенсвязывающий фрагмент для химиотерапевтического препарата по любому из пп. 12-16; и химиотерапевтический препарат.
25. Фармацевтическая композиция для облегчения течения онкологических заболеваний, содержащая антитело к рецептору антигена PDGF или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп. 1-8, или биспецифическое антитело, специфически связывающееся с рецептором PDGF и котинином и содержащее антитело к рецептору антигена PDGF или его антигенсвязывающий фрагмент, а также антитело к котинину или его антигенсвязывающий фрагмент для химиотерапевтического препарата по любому из пп. 12-16; и химиотерапевтический препарат.
26. Фармацевтическая композиция для лечения онкологических заболеваний, содержащая антитело к рецептору антигена PDGF или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп. 1-8, или биспецифическое антитело, специфически связывающееся с рецептором PDGF и котинином и содержащее антитело к рецептору антигена PDGF или его антигенсвязывающий фрагмент, а также антитело к котинину или его антигенсвязывающий фрагмент для химиотерапевтического препарата по любому из пп. 12-16; и химиотерапевтический препарат.
