Новые молочнокислые бактерии и их применение
Владельцы патента RU 2778773:
НАВИФАРМ КО., ЛТД. (KR)
ЮНИВЕРСИТИ-ИНДАСТРИ КООПЕРЭЙШН ГРУП ОФ КЁН ХИ ЮНИВЕРСИТИ (KR)
Группа изобретений относится к штамму Lactobacillus mucosae и его применению. Предложен штамм Lactobacillus mucosae NK41 KCCM12091P, подавляющий экспрессию белка p16 как фактора старения. Эффективное количество указанного штамма, его термоинактивированного пробиотика или его культуры используют в составе фармацевтической композиции для применения для предотвращения или лечения нарушения памяти и неспособности к обучению или фармацевтической композиции для применения для лечения или предотвращения психического расстройства или фармацевтической композиции для применения для предотвращения или лечения воспалительного заболевания. Также предложена пищевая композиция, содержащая указанный штамм, его термоинактивированный пробиотик или его культуру. Также предложено применение композиций, содержащих указанный штамм, его термоинактивированный пробиотик или его культуру, для введения пациенту для предотвращения, облегчения или лечения нарушения памяти и неспособности к обучению или для предотвращения, облегчения или лечения психического расстройства или для предотвращения, облегчения или лечения воспалительного заболевания. Изобретения обеспечивают восстановление памяти, снижают тревожное поведение, обладают эффектом ингибирования воспалительного ответа. 11 н. и 5 з.п. ф-лы, 8 табл., 6 пр., 12 ил.
Область техники
Настоящее изобретение относится к Lactobacillus mucosae и Bifidobacterium longum в качестве новых молочнокислых бактерий. В частности, настоящее изобретение относится к композиции, содержащей новые молочнокислые бактерии, для ингибирования экспрессии белка p16 как фактора старения и ингибирования экспрессии воспалительного фактора, и, таким образом, эффективной для предотвращения и лечения нарушения памяти, неспособности к обучению или психического расстройства (нарушения), а также для предотвращения и лечения воспалительных заболеваний.
Уровень техники
Среди заболеваний, вызываемых ростом популяции пожилых людей, нарушение памяти, включая деменцию, является наиболее сложным. Согласно ежегодному отчету Центрального центра лечения деменции при Министерстве здравоохранения и социального обеспечения, каждые 12 минут появляется один пациент с деменцией, и деменцией страдают 650 000 человек. В частности, деменция, которая, как известно, встречается в основном у пожилых людей в возрасте 70 лет и старше, в последнее время все чаще встречается у молодых людей из-за хронических заболеваний, внешних травм, генетических факторов и плохого образа жизни.
Нарушение памяти, включая деменцию, может с трудом поддаваться лечению. При возникновении нарушения памяти пожизненная боль и бремя возлагаются не только на пациента, но и на его семью. Таким образом, обусловленные этим проблемы находятся на серьезном уровне.
Кроме того, коммерчески доступные средства для лечения деменции ограничены в использовании из-за вызываемых ими побочных эффектов, связанных с пищеварительной системой, таких как тошнота, рвота, потеря аппетита и боль в животе, и таких побочных эффектов, как покраснение кожи и зуд.
По итогам исследования с использованием натуральных (природных) продуктов в публикации заявки на патент Кореи №10-2016-0110767 раскрыта пищевая композиция для улучшения памяти с использованием экстракта хурмы обыкновенной. Тем не менее нет исследований эффективных молочнокислых бактерий, способных лечить нарушение памяти, включая деменцию.
Раскрытие
Техническая задача
Настоящее изобретение было создано в поисках средства лечения, способного эффективно восстанавливать память. Авторы настоящего изобретения установили, что новая молочнокислая бактерия, выделенная из человеческих фекалий, обладает эффектами улучшения памяти и снижения тревожного поведения, и поэтому может быть использована для предотвращения и лечения нарушения памяти, неспособности к обучению и психического расстройства. Таким образом, авторами было создано настоящее изобретение. Кроме того, авторы установили, что новые молочнокислые бактерии, выделенные из человеческих фекалий, могут подавлять воспалительные факторы и, таким образом, могут быть использованы для предотвращения и лечения воспалительного заболевания, а также нарушения памяти, неспособности к обучению и психического расстройства, связанных с воспалительными факторами.
Техническое решение
Задачей настоящего изобретения является обеспечение Lactobacillus mucosae и Bifidobacterium longum в качестве новых молочнокислых бактерий.
Еще одна задача согласно настоящему изобретению состоит в создании композиции для предотвращения или лечения нарушения памяти, неспособности к обучению или психического расстройства, содержащей новые молочнокислые бактерии, подавляющие экспрессию белка р16 как фактора старения.
Еще одна задача согласно настоящему изобретению состоит в создании композиции для предотвращения или лечения воспалительных заболеваний, содержащей новые молочнокислые бактерии.
ПОЛОЖИТЕЛЬНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ
Новые молочнокислые бактерии Lactobacillus mucosae NK41 и Bifidobacterium longum NK46 согласно настоящему изобретению обладают эффектом подавления экспрессии белка p16 как фактора старения и оказывают эффект восстановления памяти, а также снижают тревожное поведение. Соответственно, новые молочнокислые бактерии согласно настоящему изобретению могут применяться в качестве композиции для предотвращения или лечения нарушения памяти, неспособности к обучению или психического расстройства.
Кроме того, новые молочнокислые бактерии согласно настоящему изобретению обладают эффектом ингибирования воспалительного ответа, и поэтому можно включать в композиции для предотвращения или лечения воспалительных заболеваний, и, в частности, эффективны для предотвращения и лечения колита.
ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ
ФИГ. 1 представляет собой график, показывающий, что поведение спонтанного чередования восстанавливается до уровня нормальной группы (NOR) в тесте с Y-образным лабиринтом в результате введения новой молочнокислой бактерии Lactobacillus mucosae NK41 (LM), Bifidobacterium longum NK46 (BL) или смеси в соотношении 1:1 (ML) на модельном животном пожилого возраста (Ag).
ФИГ. 2 представляет собой график, показывающий, что количество раз, которое субъект касается нового объекта в тесте распознавания объектов, восстанавливается до уровня нормальной группы (NOR) в результате введения новой молочнокислой бактерии Lactobacillus mucosae NK41 (LM), Bifidobacterium longum NK46 (BL) или их смеси в соотношении 1:1 (ML) на модельном животном пожилого возраста (Ag).
ФИГ. 3 представляет собой график, показывающий, что поведение спонтанного чередования восстанавливается до уровня нормальной группы (NOR) в тесте с Y-образным лабиринтом в результате введения новой молочнокислой бактерии Lactobacillus mucosae NK41 (LM) или Bifidobacterium longum NK46 (BL) на модельном животном с болезнью Альцгеймера (Tg).
ФИГ. 4 представляет собой график, показывающий, что в тесте пассивного избегания латентный период восстанавливается до уровня нормальной группы (NOR) в результате введения новой молочнокислой бактерии Lactobacillus mucosae NK41 (LM) или Bifidobacterium longum NK46 (BL) на модельном животном с болезнью Альцгеймера (Tg).
ФИГ. 5 представляет собой график, показывающий, что в тесте с водным лабиринтом время, проведенное в целевом квадранте, восстанавливается до уровня нормальной группы (NOR) в результате введения новой молочнокислой бактерии Lactobacillus mucosae NK41 (LM) или Bifidobacterium longum NK46 (BL) на модельном животном с болезнью Альцгеймера (Tg).
ФИГ. 6 представляет собой диаграмму, показывающую, что активность NF-kB в гиппокампе ингибируется, и экспрессия нейротрофического фактора мозга (BDNF) повышается в результате введения новой молочнокислой бактерии Lactobacillus mucosae NK41 (LM) или Bifidobacterium longum NK46 (BL) на модельном животном с болезнью Альцгеймера (Tg).
(Слева) Контрольная группа; модельное животное с болезнью Альцгеймера; группа, получавшая LM; и группа, получавшая BL.
ФИГ. 7 представляет собой график, показывающий, что как время, проведенное в открытом рукаве (OT), так и заход в открытый рукав (OE) восстанавливаются до уровня нормальной группы (NOR) в результате введения новой молочнокислой бактерии Lactobacillus mucosae NK41 (LM) или Bifidobacterium longum NK46 (BL) на модельном животном с депрессией.
ФИГ. 8 представляет собой график, показывающий, что в тесте принудительного плавания уменьшается неподвижность, что приводит к снижению тревожного поведения и симптомов депрессии, в результате введения новой молочнокислой бактерии Lactobacillus mucosae NK41 (LM) или Bifidobacterium longum NK46 (BL) на модельном животном с депрессией.
ФИГ. 9 представляет собой график, показывающий, что в тесте подвешивания за хвост уменьшается неподвижность, что приводит к снижению тревожного поведения и симптомов депрессии, в результате введения новой молочнокислой бактерии Lactobacillus mucosae NK41 (LM) или Bifidobacterium longum NK46 (BL) на модельном животном с депрессией.
ФИГ. 10 представляет собой диаграмму, показывающую, что активность NF-kB в гиппокампе ингибируется, и экспрессия нейротрофического фактора мозга (BDNF) повышается путем введения новой молочнокислой бактерии Lactobacillus mucosae NK41 (LM) или Bifidobacterium longum NK46 (BL) на модельном животном с депрессией.
ФИГ. 11 представляет собой график, показывающий значительное снижение уровня кортикостерона в крови в результате введения новой молочнокислой бактерии Lactobacillus mucosae NK41 (LM) или Bifidobacterium longum NK46 (BL) на модельном животном с депрессией.
ФИГ. 12 представляет собой диаграмму, показывающую, что активность Iba1-положительной микроглии значительно снижается в результате введения новой молочнокислой бактерии Lactobacillus mucosae NK41 (LM) или Bifidobacterium longum NK46 (BL) на модельном животном с депрессией.
ВАРИАНТЫ РЕАЛИЗАЦИИ изобретения
В одном из аспектов для достижения задачи в настоящем изобретении предложена Lactobacillus mucosae NK41 (депозитарий: Корейский центр культур микроорганизмов, дата депонирования: 4 августа 2017 г., регистрационный номер: KCCM12091P).
Lactobacillus mucosae NK41 согласно настоящему изобретению представляет собой новую молочнокислую бактерию Lactobacillus mucosae, выделенную и идентифицированную из человеческих фекалий.
Последовательность оснований рДНК 16S для идентификации и классификации Lactobacillus mucosae NK41 согласно настоящему изобретению является такой же, как SEQ ID NO: 1, приложенная к настоящему описанию. Соответственно, Lactobacillus mucosae NK41 согласно настоящему изобретению может содержать рДНК 16S, представленную SEQ ID NO: 1.
Со ссылкой на результат анализа последовательности оснований рДНК 16S, представленной SEQ ID NO: 1, последовательность оснований рДНК 16S , представленная SEQ ID NO: 1, обладает 99% гомологией известным штаммам Lactobacillus mucosae и, таким образом, обладает высочайшим молекулярным родством Lactobacillus mucosae. Таким образом, молочнокислая бактерия была идентифицирована как Lactobacillus mucosae, названа Lactobacillus mucosae NK41 и депонирована в Корейском центре культур микроорганизмов 4 августа 2017 г. (регистрационный номер KCCM12091P).
Lactobacillus mucosae NK41 согласно настоящему изобретению представляет собой грамположительную бактерию, и ее клеточной формой является Bacilli. Более конкретно, физиологические свойства Lactobacillus mucosae NK41 могут быть исследованы в соответствии с общепринятыми в данной области техники методами, и результаты приведены ниже в таблице 2. В частности, Lactobacillus mucosae NK41 в качестве источников углерода может использовать L-арабинозу, D-рибозу, D-ксилозу, D-галактозу, D-глюкозу, амигдалин, эскулин, мальтозу, лактозу, мелибиозу, сахарозу, рафинозу, генциобиозу и глюконат.
В еще одном аспекте для решения задачи в настоящем изобретении предложена Bifidobacterium longum NK46 (депозитарий: Корейский центр культур микроорганизмов, дата депонирования: 4 августа 2017 г., регистрационный номер: KCCM12087P).
Bifidobacterium longum NK46 согласно настоящему изобретению представляет собой новую молочнокислую бактерию Bifidobacterium longum, выделенную и идентифицированную из человеческих фекалий.
Последовательность оснований рДНК 16S для идентификации и классификации Bifidobacterium longum NK46 согласно настоящему изобретению является такой же, как SEQ ID NO: 2, приложенная к настоящему описанию. Соответственно, Bifidobacterium longum NK46 согласно настоящему раскрытию может содержать рДНК 16S , представленную SEQ ID NO: 2.
Со ссылкой на результат анализа последовательности оснований рДНК 16S, представленной SEQ ID NO: 2, последовательность оснований рДНК 16S , представленная SEQ ID NO: 2, обладает 99% гомологией известным штаммам Bifidobacterium longum и обладает высочайшим молекулярным филогенетическим родством Bifidobacterium longum. Таким образом, молочнокислая бактерия была идентифицирована как Bifidobacterium longum, названа Bifidobacterium longum NK46 и депонирована в Корейском центре культур микроорганизмов 4 августа 2017 г. (регистрационный номер KCCM12087P).
Bifidobacterium longum NK46 согласно настоящему изобретению представляет собой грамположительную бактерию, и ее клеточной формой является Bacilli. Физиологические свойства Bifidobacterium longum NK46 могут быть проанализированы в соответствии с общепринятыми в данной области техники методами, и результаты приведены ниже в таблице 3. В частности, Bifidobacterium longum NK46 в качестве источников углерода может использовать L-арабинозу, D-ксилозу, D-галактозу, D-глюкозу, D-фруктозу, D-маннозу, маннит, сорбит, α-метил-D-глюкозид, эскулин, салицин, мальтозу, лактозу, мелибиозу, сахарозу, рафинозу и D-туранозу.
В еще одном аспекте для решения задачи в настоящем изобретении предложена фармацевтическая композиция для предотвращения или лечения нарушения памяти, неспособности к обучению или психического расстройства, содержащая Lactobacillus mucosae NK41 KCCM12091P, Bifidobacterium longum NK46 KCCM12087P или их смесь.
«Lactobacillus mucosae NK41» согласно настоящему изобретению является такой же, как описано выше.
В частности, Lactobacillus mucosae NK41, содержащаяся в фармацевтической композиции согласно настоящему изобретению, может быть ее живым пробиотиком, ее термоинактивированным пробиотиком, ее культурой, ее лизатом или ее экстрактом. Может быть использована любая форма Lactobacillus mucosae NK41, которая может достигать эффекта предотвращения или лечения нарушения памяти, неспособности к обучению или психического расстройства, без ограничений.
«Bifidobacterium longum NK46» согласно настоящему изобретению является такой же, как описано выше.
В частности, Bifidobacterium longum NK46, содержащаяся в фармацевтической композиции согласно настоящему изобретению, может быть ее живым пробиотиком, ее термоинактивированным пробиотиком, ее культурой, ее лизатом или ее экстрактом. Может быть использована любая форма Bifidobacterium longum NK46, которая может достигать эффекта предотвращения или лечения нарушения памяти, неспособности к обучению или психического расстройства, без ограничений.
Термин «культура» в настоящем изобретении относится к веществу, полученному путем культивирования молочнокислых бактерий в известной жидкой среде или твердой среде, и представляет собой концепцию, включающую новые молочнокислые бактерии, описанные в настоящем документе.
Нарушение памяти и неспособность к обучению согласно настоящему изобретению могут представлять собой одно любое или более из группы, состоящей из старения, болезни Альцгеймера, шизофрении, болезни Паркинсона, болезни Хантингтона, болезни Пика, болезни Крейтцфельдта-Якоба, старения, травмы головы, забывчивости, ухудшения памяти, черепно-мозговой травмы, эпилепсии, склероза гиппокампа, головной боли, сенильного заболевания головного мозга, деменции и потери памяти.
В одном из вариантов осуществления согласно настоящему изобретению было установлено, что при обработке нейрона Lactobacillus mucosae NK41 или Bifidobacterium longum NK46 вместе с гормоном стресса кортикостероном активность NF-kB, который, как известно, вызывает нарушение памяти, такое как болезнь Альцгеймера и неспособность к обучению, подавляется, и одновременно повышается экспрессия нейротрофического фактора мозга (BDNF), который, как известно, характеризуется сниженным уровнем экспрессии при старении и деменции (таблица 5). Кроме того, в одном из вариантов осуществления согласно настоящему изобретению было установлено, что при введении Lactobacillus mucosae NK41, Bifidobacterium longum NK46 или их смеси модельному животному пожилого возраста и модельному животному с болезнью Альцгеймера достигается эффект восстановления памяти, экспрессия p16 как фактора старения в гиппокампе подавляется, активность NF-kB подавляется, а экспрессия нейротрофического фактора мозга повышается (пример 4). В частности, было установлено, что смесь Lactobacillus mucosae NK41 и Bifidobacterium longum NK46 показывает лучший эффект, чем при использовании Lactobacillus mucosae NK41 или Bifidobacterium longum NK46 по отдельности. Таким образом, было установлено, что фармацевтическая композиция, содержащая Lactobacillus mucosae NK41, Bifidobacterium longum NK46 или их смесь, может быть эффективна для предотвращения и лечения нарушения памяти и неспособности к обучению.
Соответственно, фармацевтическая композиция согласно настоящему изобретению, содержащая Lactobacillus mucosae NK41 KCCM12091P, Bifidobacterium longum NK46 KCCM12087P или их смесь, может подавлять экспрессию фактора старения p16.
p16 является репрезентативным белком фактора старения, экспрессируемым геном CDKN2A человека. Таким образом, по мере повышения экспрессии p16 стимулируется старение.
Психическое расстройство согласно настоящему изобретению может представлять собой любое одно или более из группы, состоящей из тревожности, симптомов депрессии, расстройств настроения, бессонницы, бредового расстройства, обсессивно-компульсивного расстройства, мигрени, стресса, когнитивного расстройства и расстройства внимания.
В одном варианте осуществления согласно настоящему изобретению было установлено, что тревожное поведение, вызванное стрессом, значительно снижается при введении Lactobacillus mucosae NK41, Bifidobacterium longum NK46 или их смеси на модельном животном, у которого был вызван стресс (таблица 8). Таким образом, было установлено, что фармацевтическая композиция, содержащая Lactobacillus mucosae NK41, Bifidobacterium longum NK46 или их смесь, может быть эффективна для предотвращения и лечения психических расстройств.
В еще одном аспекте для решения задачи в настоящем изобретении предложена фармацевтическая композиция для предотвращения или лечения воспалительного заболевания, содержащая Lactobacillus mucosae NK41 KCCM12091P, Bifidobacterium longum NK46 KCCM12087P или их смесь.
«Lactobacillus mucosae NK41» и «Bifidobacterium longum NK46» согласно настоящему изобретению являются такими же, как описано выше.
Воспалительные заболевания согласно настоящему изобретению могут представлять собой любое одно или более из группы, состоящей из артрита, подагры, гепатита, астмы, ожирения, кератита, гастрита, энтерита, нефрита, колита, диабета, туберкулеза, бронхита, плеврита, перитонита, спондилита, панкреатита, воспалительной боли, уретрита, цистита, вагинита, атеросклероза, сепсиса, ожогов, дерматита, пародонтита и гингивита.
В одном из вариантов осуществления согласно настоящему изобретению было установлено, что воспалительный ответ значительно ингибируется при введении Lactobacillus mucosae NK41 или Bifidobacterium longum NK46 вместе с липополисахаридом в качестве вещества, вызывающего воспалительный ответ, макрофагу, выделенному из мыши (таблица 4). Таким образом, было установлено, что фармацевтическая композиция, содержащая Lactobacillus mucosae NK41 и Bifidobacterium longum NK46, может быть эффективна для предотвращения и лечения воспалительных заболеваний.
В частности, воспалительное заболевание может представлять собой колит.
В одном варианте осуществления согласно настоящему изобретению было установлено, что, когда Lactobacillus mucosae NK41, Bifidobacterium longum NK46 или их смесь вводят модельному животному с колитом, вызванным стрессом, длина толстой кишки, которая является показателем колита, восстанавливается до нормального уровня, а экспрессия и активность показателя колита снижается (таблица 6). Таким образом, было установлено, что фармацевтическая композиция, содержащая Lactobacillus mucosae NK41, Bifidobacterium longum NK46 или их смесь, может быть эффективна для предотвращения и лечения воспалительных заболеваний, в частности, колита.
Фармацевтическая композиция для предотвращения или лечения нарушения памяти, неспособности к обучению или психического расстройства согласно настоящему изобретению, или фармацевтическая композиция для предотвращения или лечения воспалительного заболевания может быть включена в состав фармацевтических препаратов с использованием способов, хорошо известных в данной области техники, с обеспечением быстрого, замедленного или отсроченного высвобождения активного ингредиента после введения препарата млекопитающему. При получении препарата фармацевтическая композиция согласно настоящему раскрытию может дополнительно содержать фармацевтически приемлемый носитель в диапазоне, который не ингибирует активность новых молочнокислых бактерий.
Фармацевтически приемлемые носители включают, не ограничиваясь перечисленным, обычно используемые носители, такие как лактоза, декстроза, сахароза, сорбит, маннит, ксилит, эритрит, мальтит, крахмал, гуммиарабик, альгинат, желатин, фосфат кальция, силикат кальция, целлюлоза, метилцеллюлоза, микрокристаллическая целлюлоза, поливинилпирролидон, вода, метилгидроксибензоат, пропилгидроксибензоат, тальк, стеарат магния и минеральное масло, и тому подобные. Кроме того, фармацевтическая композиция согласно настоящему изобретению может содержать разбавители или вспомогательные вещества, такие как наполнители, увеличители массы, связующие вещества, смачивающие агенты, разрыхлители, поверхностно-активные вещества и другие фармацевтически приемлемые добавки.
Дозировка фармацевтической композиции согласно настоящему изобретению должна представлять собой фармацевтически эффективное количество. «Фармацевтически эффективное количество» означает количество, достаточное для предотвращения или лечения нарушения памяти, неспособности к обучению, психического расстройства или воспалительного заболевания при разумном соотношении польза/риск, применимом к медицинскому лечению. Специалист в данной области выбирает различные уровни эффективной дозы в соответствии с такими факторами, как способ получения препарата, состояние и масса тела пациента, пол пациента, возраст, тяжесть заболевания, лекарственная форма, способ и продолжительность введения, скорость экскреции и чувствительность ответа. Эффективное количество может варьировать в зависимости от способа лечения, применения вспомогательных веществ и возможности применения с другими агентами, как известно специалистам в данной области техники. Однако для достижения желаемого эффекта при пероральном введении композиции согласно настоящему изобретению композицию обычно вводят взрослому человеку в количестве от 0,0001 до 100 мг на 1 кг массы тела в сутки, предпочтительно от 0,001 до 100 мг на 1 кг массы тела в сутки. Введение может быть осуществлено раз в сутки и может быть разделено на несколько раз. Дозировка никоим образом не ограничивает объем настоящего изобретения.
Фармацевтическая композиция для предотвращения или лечения нарушения памяти, неспособности к обучению или психического расстройства согласно настоящему изобретению или фармацевтическая композиция для предотвращения или лечения воспалительного заболевания может быть введена млекопитающим, таким как мыши, домашний скот и люди, различными способами. В частности, фармацевтическая композиция согласно настоящему изобретению может вводиться или парентерально (например, применяться или вводиться внутривенно, подкожно или внутрибрюшинно). Однако предпочтительно пероральное введение. Твердые препараты для перорального введения могут включать порошки, гранулы, таблетки, капсулы, мягкие капсулы, пилюли и тому подобное. Жидкие препараты для перорального введения могут включать суспендирующие агенты, растворы, эмульсии, сиропы, аэрозоли и т.д. Помимо воды и жидкого парафина, которые обычно применяются в качестве простого разбавителя, в них содержатся различные вспомогательные вещества, такие как смачивающие агенты, подсластители, ароматизаторы и консерванты. Препараты для парентерального введения готовят в форме препаратов для наружного применения, таких как водные растворы, жидкости, неводные растворители, суспензии, эмульсии, глазные капли, глазные мази, сиропы, суппозитории, аэрозоли и т.д., и стерильных инъекционных препаратов, стерилизованных в соответствии с общепринятыми способами. Предпочтительно может быть приготовлена и использована фармацевтическая композиция, такая как крем, гель, пластырь, спрей, мазь, лейкопластырь, лосьон, жидкая мазь, глазная мазь, глазные капли, паста или припарка. Однако настоящее изобретение ими не ограничено. Препараты для местного применения могут быть безводными или водными, в зависимости от клинического режима. В качестве неводных растворителей и суспензий можно применять пропиленгликоль, полиэтиленгликоль, растительное масло, такое как оливковое масло, сложные эфиры для инъекций, такие как этилолеат. В качестве основы для суппозиториев можно использовать витепсол, макрогол, твин 61, масло какао, лауриновое масло, глицерожелатин и тому подобное.
В еще одном аспекте для решения задачи в настоящем изобретении предложен способ предотвращения или лечения нарушения памяти, неспособности к обучению или психического расстройства, включающий введение субъекту Lactobacillus mucosae NK41, Bifidobacterium longum NK46 или их смеси.
Термины «Lactobacillus mucosae NK41», «Bifidobacterium longum NK46», «введение», «расстройство памяти, неспособность к обучению или психическое расстройство» в настоящем описании являются такими же, как описано выше.
Субъект относится к животному и может быть млекопитающим, на которое лечение новыми молочнокислыми бактериями согласно настоящему изобретению может оказать благотворное действие. Предпочтительные примеры таких субъектов включают приматов, таких как люди. Кроме того, субъекты, обладающие экспрессией белка p16 как фактора старения, симптомами нарушения памяти, неспособности к обучению или психического расстройства, а также субъекты, подверженные риску возникновения таких симптомов, могут быть включены в число субъектов согласно настоящему изобретению.
В еще одном аспекте для решения задачи в настоящем изобретении предложен способ лечения или предотвращения воспалительных заболеваний, включающий введение субъекту Lactobacillus mucosae NK41, Bifidobacterium longum NK46 или их смеси.
В настоящем изобретении термины «Lactobacillus mucosae NK41» и «Bifidobacterium longum NK46», «введение» и «воспалительный» являются такими же, как описано выше.
Субъект относится к животному и может быть млекопитающим, на которое может быть оказан благоприятный эффект посредством лечения новыми молочнокислыми бактериями согласно настоящему изобретению. Предпочтительные примеры таких субъектов включают приматов, таких как люди. Эти субъекты включают всех субъектов, имеющих повышенную активность миелопероксидазы, повышенные уровни экспрессии цитокинов TNF-α и IL-17 или повышенную активность NF-kB или активность COX-2. Кроме того, в настоящее изобретение могут быть включены все субъекты, имеющие симптом воспаления или риск возникновения такого симптома. В частности, субъект может быть субъектом, имеющим симптом колита, но не ограничен им.
В еще одном аспекте в настоящем изобретении предложен функциональный оздоровительный пищевой продукт для предотвращения или облегчения нарушения памяти, неспособности к обучению или психического расстройства, содержащий Lactobacillus mucosae NK41 KCCM12091P, Bifidobacterium longum NK46 KCCM12087P или их смесь.
В еще одном аспекте в настоящем изобретении предложен функциональный оздоровительный пищевой продукт для предотвращения или облегчения воспалительного заболевания, содержащий Lactobacillus mucosae NK41 KCCM12091P, Bifidobacterium longum NK46 KCCM12087P или их смесь.
Термины «Lactobacillus mucosae NK41» и «Bifidobacterium longum NK46», «введение», а также «нарушение памяти, неспособность к обучению или психическое расстройство» и «воспалительное заболевание» согласно настоящему изобретению являются такими же, как описано выше.
Функциональный оздоровительный пищевой продукт усиливает биорегуляционную функцию пищи. Функциональный оздоровительный пищевой продукт имеет дополнительный эффект оказания действия и экспрессии с определенной целью, с использованием физических, биохимических и биотехнологических методов. Компоненты этих функциональных оздоровительных пищевых продуктов разрабатываются и обрабатываются таким образом, чтобы в достаточной степени оказывать на живой организм функции контроля организма, связанные с биозащитой и контролем ритма организма, предотвращением и лечением заболеваний. В них могут содержаться пищевые добавки или подсластители, или функциональное сырье.
Когда Lactobacillus mucosae NK41 или Bifidobacterium longum NK46 согласно настоящему изобретению содержится в функциональном оздоровительном пищевом продукте (или функциональной оздоровительной добавке для напитков), новые молочнокислые бактерии могут быть добавлены в исходном виде, или могут быть использованы с другими пищевыми продуктами или ингредиентами, или могут быть подходящим образом использованы в соответствии с общепринятыми способами. Добавляемое количество Lactobacillus mucosae NK41 или Bifidobacterium longum NK46 может быть соответствующим образом определено в соответствии с целью их использования (предотвращение, оздоровление или улучшение, терапевтическое лечение).
Функциональные оздоровительные пищевые продукты включают различные питательные вещества, витамины, минералы (электролиты), вкусоароматические добавки, такие как синтетические вкусоароматические добавки и натуральные вкусоароматические добавки, красители и усилители (сыр, шоколад и т.д.), пектиновую кислоту и ее соли, органические кислоты, защитные коллоидные загустители, регуляторы уровня рН, стабилизаторы, консерванты, глицерин, спирт, насыщенные углекислотой агенты, используемые в газированных напитках, и тому подобное. Кроме того, функциональные оздоровительные пищевые продукты согласно настоящему изобретению могут содержать мякоть для получения фруктовых и овощных напитков. Эти компоненты могут быть использованы по отдельности или в комбинации друг с другом. Содержание этих добавок обычно может быть выбрано из диапазона от 0,001 до 50 мас.ч. в расчете на общую массу композиции.
Нет никаких особых ограничений в отношении типов функциональных оздоровительных пищевых продуктов. Пищевые продукты, в которые могут быть добавлены Lactobacillus mucosae NK41 или Bifidobacterium longum NK46, могут включать колбасу, мясо, хлеб, шоколад, закуски, конфеты, кондитерские изделия, рамен, пиццу, другую лапшу, жевательные резинки, молочные продукты, включая мороженое, различные супы, напитки, чаи, питье, алкогольные напитки, витаминные комплексы и тому подобное. Когда пищевой продукт входит в состав напитка, жидкие компоненты, добавляемые в него помимо новых молочнокислых бактерий, могут включать, как в обычных напитках, различные вкусоароматические добавки или натуральные углеводы, но не могут быть ограничены перечисленным. Природные углеводы, как описано выше, включают моносахариды (например, глюкозу, фруктозу и т.д.), дисахариды (например, мальтозу, сахарозу и т.д.) и полисахариды (например, обычные сахара, такие как декстрин, циклодекстрин и т.д.) и сахарные спирты, такие как ксилит, сорбит, эритрит и т.д.
Численные значения, описанные в настоящем описании, следует интерпретировать как включающие вплоть до эквивалентного диапазона, если не указано иное.
ПРИМЕРЫ
Далее представлен предпочтительный вариант осуществления, чтобы помочь пониманию настоящего изобретения. Тем не менее следующие примеры предоставлены специалисту в данной области техники только для того, чтобы помочь пониманию настоящего изобретения, и объем настоящего изобретения ими не ограничен.
Пример 1. Выделение и идентификация молочнокислых бактерий
(1) Выделение молочнокислых бактерий из человеческих фекалий
Человеческие фекалии суспендировали в бульоне GAM (Nissui Pharmaceutical, Япония). Затем из них отбирали супернатант и пересаживали в агаровую среду BL (Nissui Pharmaceutical, Япония), после чего культивировали в анаэробных условиях при 37°C в течение приблизительно 48 часов для образования колоний. Затем выделяли штаммы.
(2) Выделение молочнокислых бактерий из кимчи
Кимчи из китайской капусты, кимчи из редьки или кимчи из зеленого лука, соответственно, измельчали, и из них отбирали измельченный супернатант, который затем пересаживали в агаровую среду MRS (Difco, США) и культивировали в анаэробных условиях при 37°C в течение приблизительно 48 часов для образования колоний. Затем выделяли штаммы.
(3) Идентификация выделенных молочнокислых бактерий
Физиологические характеристики и последовательности рДНК 16S штаммов, выделенных из человеческих фекалий или кимчи, были проанализированы для идентификации вида, к которому относился штамм. Затем штамму было присвоено название. Присвоенные названия штаммов молочнокислых бактерий приведены ниже в таблице 1. В частности, молочнокислые бактерии, выделенные из кимчи, включали 5 типов Lactobacillus plantarum (идентификационные номера 1-5 в таблице 1), 5 типов Lactobacillus brevis (идентификационные номера 6-10 в таблице 1), 5 типов Lactobacillus sakei (идентификационные номера 11-15 в таблице 1) и 5 типов Lactocacillus curvatus (идентификационные номера 16-20 в таблице 1). Молочнокислые бактерии, выделенные из человеческих фекалий, включали 5 типов Lactobacillus rhamnosus (идентификационные номера 21-25 в таблице 1), 5 типов Lactobacillus plantarum (идентификационные номера 26-30 в таблице 1), 5 типов Lactobacillus reuteri (идентификационные номера 31-35 в таблице 1), 4 типа Lactobacillus johnsonii (идентификационные номера 36-39 в таблице 1), 3 типа Lactobacillus mucosae (идентификационные номера 40-42 в таблице 1), 3 типа Bifidobacterium adolescentis (идентификационные номера 43-45 в таблице 1) и 5 типов Bifidobacterium longum (идентификационные номера 46-50 в таблице 1).
Таблица 1
| № ID | Название штамма | № ID | Название штамма |
| 1 | Lactobacillus plantarum NK1 | 26 | Lactobacillus plantarum NK26 |
| 2 | Lactobacillus plantarum NK2 | 27 | Lactobacillus plantarum NK27 |
| 3 | Lactobacillus plantarum NK3 | 28 | Lactobacillus plantarum NK28 |
| 4 | Lactobacillus plantarum NK4 | 29 | Lactobacillus plantarum NK29 |
| 5 | Lactobacillus plantarum NK5 | 30 | Lactobacillus plantarum NK30 |
| 6 | Lactobacillus brevis NK6 | 31 | Lactobacillus reuteri NK31 |
| 7 | Lactobacillus brevis NK7 | 32 | Lactobacillus reuteri NK32 |
| 8 | Lactobacillus brevis NK8 | 33 | Lactobacillus reuteri NK33 |
| 9 | Lactobacillus brevis NK9 | 34 | Lactobacillus reuteri NK34 |
| 10 | Lactobacillus brevis NK10 | 35 | Lactobacillus reuteri NK35 |
| 11 | Lactobacillus sakei NK11 | 36 | Lactobacillus johnsonii NK36 |
| 12 | Lactobacillus sakei NK12 | 37 | Lactobacillus johnsonii NK37 |
| 13 | Lactobacillus sakei NK13 | 38 | Lactobacillus johnsonii NK38 |
| 14 | Lactobacillus sakei NK14 | 39 | Lactobacillus johnsonii NK39 |
| 15 | Lactobacillus sakei NK15 | 40 | Lactobacillus mucosae NK40 |
| 16 | Lactocacillus curvatus NK16 | 41 | Lactobacillus mucosae NK41 |
| 17 | Lactocacillus curvatus NK17 | 42 | Lactobacillus mucosae NK42 |
| 18 | Lactocacillus curvatus NK18 | 43 | Bifidobacterium adolescentis NK43 |
| 19 | Lactocacillus curvatus NK19 | 44 | Bifidobacterium adolescentis NK44 |
| 20 | Lactocacillus curvatus NK20 | 45 | Bifidobacterium adolescentis NK45 |
| 21 | Lactobacillus rhamnosus NK21 | 46 | Bifidobacterium longum NK46 |
| 22 | Lactobacillus rhamnosus NK22 | 47 | Bifidobacterium longum NK47 |
| 23 | Lactobacillus rhamnosus NK23 | 48 | Bifidobacterium longum NK48 |
| 24 | Lactobacillus rhamnosus NK24 | 49 | Bifidobacterium longum NK49 |
| 25 | Lactobacillus rhamnosus NK25 | 50 | Bifidobacterium longum NK50 |
(4) Физиологические свойства новой молочнокислой бактерии Lactobacillus mucosae NK41
Среди штаммов, описанных в таблице 1, Lactobacillus mucosae NK41 (регистрационный номер KCCM12091P) был идентифицирован как грамположительные Bacilli. Кроме того, рДНК 16S Lactobacillus mucosae NK41 имела последовательность оснований, представленную SEQ ID NO: 1. При анализе последовательности оснований рДНК 16S Lactobacillus mucosae NK41 с использованием поиска BLAST было установлено, что штамм Lactobacillus mucosae, имеющий такую же последовательность оснований рДНК 16S, не обнаружен, и последовательность оснований рДНК 16S Lactobacillus mucosae NK41 обладала 99% гомологией последовательности рДНК 16S известного штамма Lactobacillus mucosae.
В числе физиологических свойств Lactobacillus mucosae NK41 анализировали использование источника углерода с помощью теста на ферментацию сахара с использованием набора API 50 CHL. Результаты приведены ниже в таблице 2. В следующей таблице 2 «+» обозначает случай, когда использование источника углерода является положительным, а «-» обозначает случай, когда использование источника углерода является отрицательным.
Таблица 2
| Источник углерода | NK41 | Источник углерода | NK41 |
| КОНТРОЛЬ | - | Эскулин | + |
| Глицерин | - | Салицин | - |
| Эритрит | - | Целлобиоза | - |
| D-арабиноза | - | Мальтоза | + |
| L-арабиноза | + | Лактоза | ± |
| D-рибоза | + | Мелибиоза | ± |
| D-ксилоза | + | Сахароза | + |
| L-ксилоза | - | Трегалоза | - |
| D-адонит | - | Инулин | - |
| Метил-β-D-ксилопиранозид | - | Мелицитоза | - |
| D-галактоза | ± | Рафиноза | + |
| D-глюкоза | + | Крахмал | - |
| D-фруктоза | - | Гликоген | - |
| D-манноза | - | Ксилит | - |
| L-сорбоза | - | Генциобиоза | ± |
| Рамноза | - | D-тураноза | - |
| Дульцит | - | D-ликсоза | - |
| Инозитол | - | D-тагатоза | - |
| Маннит | - | D-фукоза | - |
| Сорбит | - | L-фукоза | - |
| α-метил-D-маннозид | - | D-арабит | - |
| α-метил-D-глюкозид | - | L-арабит | - |
| N-ацетилглюкозамин | - | Глюконат | ± |
| Амигдалин | ± | 2-кетоглюконат | - |
| Арбутин | - | 5-кетоглюконат | - |
(5) Физиологические свойства новой молочнокислой бактерии Bifidobacterium longum NK46
Среди штаммов, описанных в таблице 1, Bifidobacterium longum NK46 (регистрационный номер KCCM12087P) был идентифицирован как грамположительные Bacilli. Кроме того, рДНК 16S Bifidobacterium longum NK46 имела последовательность оснований, представленную SEQ ID NO: 2. При анализе последовательности оснований рДНК 16S Bifidobacterium longum NK46 с использованием поиска BLAST было установлено, что штамм Bifidobacterium longum, имеющий такую же последовательность оснований рДНК 16S, не обнаружен, и последовательность оснований рДНК 16S Bifidobacterium longum NK46 обладала 99% гомологией последовательности рДНК 16S известного штамма Bifidobacterium longum.
В числе физиологических свойств Bifidobacterium longum NK46 анализировали использование источника углерода с помощью теста на ферментацию сахара с использованием набора API 50 CHL. Результат приведен в следующей таблице 3. В следующей таблице 3 «+» обозначает случай, когда использование источника углерода является положительным, а «-» обозначает случай, когда использование источника углерода является отрицательным.
Таблица 3
| Источник углерода | NK46 | Источник углерода | NK46 |
| КОНТРОЛЬ | - | Эскулин | + |
| Глицерин | - | Салицин | + |
| Эритрит | - | Целлобиоза | - |
| D-арабиноза | - | Мальтоза | + |
| L-арабиноза | + | Лактоза | + |
| D-рибоза | - | Мелибиоза | + |
| D-ксилоза | + | Сахароза | + |
| L-ксилоза | - | Трегалоза | - |
| D-адонит | - | Инулин | - |
| Метил-β-D-ксилопиранозид | - | Мелицитоза | - |
| D-галактоза | + | Рафиноза | + |
| D-глюкоза | + | Крахмал | - |
| D-фруктоза | + | Гликоген | - |
| D-манноза | + | Ксилит | - |
| L-сорбоза | - | Генциобиоза | - |
| Рамноза | - | D-тураноза | + |
| Дульцит | - | D-ликсоза | - |
| Инозитол | - | D-тагатоза | - |
| Маннит | + | D-фукоза | - |
| Сорбит | + | L-фукоза | - |
| α-метил-D-маннозид | - | D-арабит | - |
| α-метил-D-глюкозид | ± | L-арабит | - |
| N-ацетилглюкозамин | - | Глюконат | - |
| Амигдалин | - | 2-кетоглюконат | - |
| Арбутин | - | 5-кетоглюконат | - |
Пример 2. Сравнение активности выделенных молочнокислых бактерий
(1) Антиоксидантная активность (in vitro)
Для приготовления раствора DPPH (2,2-дифенил-1-пикрилгидразил) его растворяли в этаноле до концентрации 0,2 мМ. Суспензию молочнокислых бактерий (1×106 КОЕ/мл) или раствор витамина С (1 г/мл) добавляли к 0,1 мл раствора DPPH и культивировали при 37°С в течение 20 минут. Культуральный раствор центрифугировали в течение 5 минут при 3000 об/мин для получения супернатанта. Затем измеряли поглощение супернатанта при 517 нм для расчета антиоксидантной активности выделенных молочнокислых бактерий. Антиоксидантная активность каждой молочнокислой бактерии приведена ниже в таблице 4.
(2) Измерение показателя воспаления в макрофагах
2 мл стерильного 4% тиогликолята вводили в брюшную полость мыши C57BL/6 (самец в возрасте 6 недель, 20-23 г). Через 96 часов мышь анестезировали и в ее брюшную полость вводили 8 мл среды RPMI 1640. Через 5-10 минут среду RPMI (макрофаги) в брюшной полости мыши экстрагировали, центрифугировали в течение 10 минут при 1000 g и дважды снова промывали средой RPMI 1640. Макрофаги помещали в 24-луночные планшеты в количестве 0,5×106 на лунку. Макрофаги обрабатывали выделенными молочнокислыми бактериями (конечная концентрация обработки: 1×104 КОЕ/мл, в дальнейшем применяли такую же концентрацию обработки) и веществом, вызывающим воспалительный ответ, - липополисахаридом (LPS), в течение 2 часов или 24 часов, после чего получали супернатант и клетки. Полученные клетки помещали в буфер RIPA (Gibco) и гомогенизировали. Уровни экспрессии цитокинов TNF-α и IL-10 измеряли в культуральном супернатанте, обработанном в течение 24 часов, с использованием метода иммуноблоттинга. Уровни экспрессии p65 (NF-kB), p-p65 (фосфо-NF-kB) и β измеряли в клетках, полученных обработкой в течение 2 часов, с использованием метода иммуноблоттинга. Уровень экспрессии показателя воспаления для каждой молочнокислой бактерии приведен ниже в таблице 4.
(В измерениях активности в таблице 4: +++ относится к > 90% (очень сильный); ++ относится к > 60-90% (сильный); + относится к > 20-60% (слабый); - относится к < 20% (неэффективно), эти же обозначения применимы к таблице 5)
Таблица 4
| № ID | Название штамма | Антиоксидантная активность | Ингибирование TNF-α | Увеличение уровня экспрессии IL-10 | Ингибирование NF-kB |
| 1 | Lactobacillus plantarum NK1 | + | + | + | + |
| 2 | Lactobacillus plantarum NK2 | + | ++ | + | + |
| 3 | Lactobacillus plantarum NK3 | +++ | +++ | +++ | +++ |
| 4 | Lactobacillus plantarum NK4 | + | + | + | ++ |
| 5 | Lactobacillus plantarum NK5 | ++ | ++ | ++ | ++ |
| 6 | Lactobacillus brevis NK6 | + | + | + | + |
| 7 | Lactobacillus brevis NK7 | + | + | + | + |
| 8 | Lactobacillus brevis NK8 | + | + | + | + |
| 9 | Lactobacillus brevis NK9 | + | + | + | + |
| 10 | Lactobacillus brevis NK10 | - | + | + | + |
| 11 | Lactobacillus sakei NK11 | + | + | + | + |
| 12 | Lactobacillus sakei NK12 | - | ++ | + | + |
| 13 | Lactobacillus sakei NK13 | - | ++ | ++ | + |
| 14 | Lactobacillus sakei NK14 | - | + | + | + |
| 15 | Lactobacillus sakei NK15 | + | + | + | + |
| 16 | Lactocacillus curvatus NK16 | + | + | + | + |
| 17 | Lactocacillus curvatus NK17 | + | + | + | + |
| 18 | Lactocacillus curvatus NK18 | + | + | + | + |
| 19 | Lactocacillus curvatus NK19 | + | + | + | + |
| 20 | Lactocacillus curvatus NK20 | + | + | + | + |
| 21 | Lactobacillus rhamnosus NK21 | + | + | + | + |
| 22 | Lactobacillus rhamnosus NK22 | + | + | + | + |
| 23 | Lactobacillus rhamnosus NK23 | + | + | + | + |
| 24 | Lactobacillus rhamnosus NK24 | ++ | + | + | + |
| 25 | Lactobacillus rhamnosus NK25 | ++ | ++ | ++ | ++ |
| 26 | Lactobacillus plantarum NK26 | + | + | + | + |
| 27 | Lactobacillus plantarum NK27 | + | + | + | + |
| 28 | Lactobacillus plantarum NK28 | + | + | + | + |
| 29 | Lactobacillus plantarum NK29 | + | + | + | + |
| 30 | Lactobacillus plantarum NK30 | + | + | + | + |
| 31 | Lactobacillus reuteri NK31 | + | + | + | + |
| 32 | Lactobacillus reuteri NK32 | ++ | ++ | ++ | ++ |
| 33 | Lactobacillus reuteri NK33 | +++ | ++ | ++ | ++ |
| 34 | Lactobacillus reuteri NK34 | + | + | + | + |
| 35 | Lactobacillus reuteri NK35 | + | + | + | + |
| 36 | Lactobacillus johnsonii NK36 | ++ | ++ | ++ | + |
| 37 | Lactobacillus johnsonii NK37 | ++ | ++ | ++ | ++ |
| 38 | Lactobacillus johnsonii NK38 | + | + | + | + |
| 39 | Lactobacillus johnsonii NK39 | + | + | + | + |
| 40 | Lactobacillus mucosae NK40 | ++ | ++ | ++ | ++ |
| 41 | Lactobacillus mucosae NK41 | ++ | ++ | +++ | +++ |
| 42 | Lactobacillus mucosae NK42 | + | + | + | + |
| 43 | Bifidobacterium adolescentis NK43 | + | + | + | + |
| 44 | Bifidobacterium adolescentis NK44 | ++ | ++ | ++ | ++ |
| 45 | Bifidobacterium adolescentis NK45 | + | + | + | + |
| 46 | Bifidobacterium longum NK46 | +++ | ++ | +++ | +++ |
| 47 | Bifidobacterium longum NK47 | ++ | ++ | ++ | ++ |
| 48 | Bifidobacterium longum NK48 | + | + | + | + |
| 49 | Bifidobacterium longum NK49 | +++ | +++ | +++ | +++ |
| 50 | Bifidobacterium longum NK50 | + | + | + | + |
(3) Эффект экспрессии белка ZO-1 в клетках Caco2
Клетки колоректального рака, Caco2, были получены из Корейского банка клеточных линий и инкубированы в среде RPMI 1640 в течение 48 часов, а затем клетки Caco2 вносили в 12-луночные планшеты в количестве 2×106 на лунку. Каждую лунку обрабатывали 1 мкг LPS по отдельности или 1 мкг LPS и 1×104 КОЕ молочнокислых бактерий, и затем культивировали в течение 24 часов. После этого из каждой лунки отбирали культивируемые в ней клетки и измеряли уровень экспрессии ZO-1 в качестве белка плотных контактов, используя метод иммуноблоттинга. Уровень экспрессии ZO-1 для каждой молочнокислой бактерии приведен ниже в таблице 5.
(4) Эффект экспрессии нейротрофического фактора мозга (BDNF) и эффект активности NF-kB в клетках SH-SY5Y
Нервные клетки SH-SY5Y были получены из Корейского банка клеточных линий и культивированы в среде DMEM с добавкой 10% ФБС и 1% антибиотиков, и их вносили в 12-луночные планшеты по 2×106 клеток на лунку. Затем в каждую лунку добавляли молочнокислые бактерии (1×104 КОЕ/мл) и кортикостерон в концентрации 300 мг/мл с последующей инкубацией. Затем уровни экспрессии NF-kB (p65, p-p65) и нейротрофического фактора мозга (BDNF) измеряли с использованием метода иммуноблоттинга. Уровень экспрессии BDNF и уровень активности NF-kB для каждой молочнокислой бактерии приведены ниже в таблице 5.
Таблица 5
| № ID | Название штамма | Увеличение уровня экспрессии ZO-1 | Увеличение уровня экспрессии BDNF | Ингибирование активности NF-kB |
| 1 | Lactobacillus plantarum NK1 | + | + | + |
| 2 | Lactobacillus plantarum NK2 | + | + | + |
| 3 | Lactobacillus plantarum NK3 | ++ | + | ++ |
| 4 | Lactobacillus plantarum NK4 | + | + | + |
| 5 | Lactobacillus plantarum NK5 | ++ | + | ++ |
| 6 | Lactobacillus brevis NK6 | + | + | + |
| 7 | Lactobacillus brevis NK7 | + | + | + |
| 8 | Lactobacillus brevis NK8 | + | + | + |
| 9 | Lactobacillus brevis NK9 | + | + | + |
| 10 | Lactobacillus brevis NK10 | - | - | - |
| 11 | Lactobacillus sakei NK11 | + | + | + |
| 12 | Lactobacillus sakei NK12 | - | - | - |
| 13 | Lactobacillus sakei NK13 | + | + | + |
| 14 | Lactobacillus sakei NK14 | + | + | + |
| 15 | Lactobacillus sakei NK15 | + | + | + |
| 16 | Lactocacillus curvatus NK16 | + | + | + |
| 17 | Lactocacillus curvatus NK17 | + | + | + |
| 18 | Lactocacillus curvatus NK18 | + | + | + |
| 19 | Lactocacillus curvatus NK19 | + | + | + |
| 20 | Lactocacillus curvatus NK20 | + | + | + |
| 21 | Lactobacillus rhamnosus NK21 | + | - | + |
| 22 | Lactobacillus rhamnosus NK22 | + | - | + |
| 23 | Lactobacillus rhamnosus NK23 | + | - | + |
| 24 | Lactobacillus rhamnosus NK24 | ++ | + | ++ |
| 25 | Lactobacillus rhamnosus NK25 | + | + | ++ |
| 26 | Lactobacillus plantarum NK26 | + | + | + |
| 27 | Lactobacillus plantarum NK27 | + | + | + |
| 28 | Lactobacillus plantarum NK28 | + | + | + |
| 29 | Lactobacillus plantarum NK29 | + | + | + |
| 30 | Lactobacillus plantarum NK30 | + | + | + |
| 31 | Lactobacillus reuteri NK31 | + | + | + |
| 32 | Lactobacillus reuteri NK32 | ++ | + | ++ |
| 33 | Lactobacillus reuteri NK33 | ++ | ++ | ++ |
| 34 | Lactobacillus reuteri NK34 | + | + | + |
| 35 | Lactobacillus reuteri NK35 | + | + | + |
| 36 | Lactobacillus johnsonii NK36 | + | ++ | + |
| 37 | Lactobacillus johnsonii NK37 | ++ | + | ++ |
| 38 | Lactobacillus johnsonii NK38 | + | + | + |
| 39 | Lactobacillus johnsonii NK39 | + | - | + |
| 40 | Lactobacillus mucosae NK40 | ++ | + | ++ |
| 41 | Lactobacillus mucosae NK41 | ++ | ++ | +++ |
| 42 | Lactobacillus mucosae NK42 | + | + | + |
| 43 | Bifidobacterium adolescentis NK43 | + | + | + |
| 44 | Bifidobacterium adolescentis NK44 | ++ | ++ | ++ |
| 45 | Bifidobacterium adolescentis NK45 | + | + | + |
| 46 | Bifidobacterium longum NK46 | ++ | ++ | +++ |
| 47 | Bifidobacterium longum NK47 | + | ++ | ++ |
| 48 | Bifidobacterium longum NK48 | + | + | + |
| 49 | Bifidobacterium longum NK49 | + | + | ++ |
| 50 | Bifidobacterium longum NK50 | + | + | + |
(5) Результат теста
При оценке активности выделенных молочнокислых бактерий было установлено, что из выделенных молочнокислых бактерий новые молочнокислые бактерии Lactobacillus mucosae NK41 и Bifidobacterium longum NK46 повышали уровень экспрессии белка плотных контактов ZO-1, в то же время демонстрируя превосходную антиоксидантную активность и противовоспалительное действие. В частности, было установлено, что новые молочнокислые бактерии Lactobacillus mucosae NK41 и Bifidobacterium longum NK46 ингибировали активность NF-kB, который, как известно, вызывает связанные со старением заболевания, такие как болезнь Альцгеймера, и, в то же время, повышали экспрессию нейротрофического фактора мозга, продуцирующий нервы головного мозга, которые сокращаются при старении и деменции (таблица 4 и таблица 5).
Пример 3. Противовоспалительное и уменьшающее колит действия новых молочнокислых бактерий
(1) Подготовка модельного животного с колитом и введение ему молочнокислых бактерий
6 мышей C57BL/6 (самцы, 21-23 г, в возрасте 6 недель) составили одну группу, которую адаптировали к помещению для испытаний в течение 1 недели. Одну группу использовали в качестве нормальной группы, а другая группа получала 2,4,6-тринитробензолсульфоновую кислоту (TNBS) для индукции колита. А именно, после того, как подопытных животных анестезировали эфиром, 0,1 мл раствора TNBS, смешанного с 50% этанолом, вводили в толстую кишку через задний проход, используя шприц на 1 мл с круглым наконечником, и подопытных животных поднимали в вертикальное положение на 30 секунд, чтобы вызвать воспаление. В это же время 0,1 мл физиологического раствора вводили перорально нормальной группе. После введения новую молочнокислую бактерию Lactobacillus mucosae NK41, Bifidobacterium longum NK46 или их смесь в соотношении 1:1 суспендировали в физиологическом растворе, который, в свою очередь, вводили мышам перорально в количестве 1×109 КОЕ раз в сутки в течение 3 дней, начиная со следующего дня. На следующий день после завершения введения молочнокислых бактерий подопытное животное умерщвляли и удаляли часть толстой кишки от слепой кишки до места непосредственно перед задним проходом, а затем измеряли ее длину. Затем на основе длины были определены различные последующие показатели. С другой стороны, подопытным животным в нормальной группе перорально вводили 1% раствор декстрозы в виде суспензии молочнокислых бактерий вместо новых молочнокислых бактерий. Кроме того, подопытному животному из группы положительного контроля вместо новых молочнокислых бактерий перорально давали препарат для лечения колита сульфасалазин в количестве 50 мг/кг.
(2) Измерение активности миелопероксидазы
200 мкл 10 мМ калий-фосфатного буфера (рН 7,0), содержащего 0,5% гексадецилтриметиламмонийбромида, добавляли к 100 мг ткани толстой кишки и гомогенизировали. Супернатант получали центрифугированием в течение 10 минут при 4°С и 10000 g. 50 мкл супернатанта добавляли к 0,95 мл реакционного раствора (содержащего 1,6 мМ тетраметилбензидина и 0,1 мМ H2O2) и измеряли поглощение во времени при 650 нм при реакции при 37°С. Активность миелопероксидазы (MPO) рассчитывали, принимая 1 мкмоль/мл H2O2, образовавшегося в качестве реагента, за одну единицу.
(3) Измерение показателя воспаления
Методы вестерн-блоттинга использовали для измерения веществ-показателей воспалительного ответа, таких как p-p65, p65, COX-2 и IL-17. А именно, 50 мкг супернатанта получали таким же образом, как в тесте измерения активности миелопероксидазы (MPO), как описано выше, и подвергали иммуноблоттингу. Кроме того, уровень экспрессии цитокинов в нем измеряли с использованием набора для ELISA (иммуноферментный анализ).
(4) Результат теста
Результаты вышеуказанного теста приведены ниже в таблице 6.
Таблица 6
| Испытуемая группа | Изменение массы тела г |
Длина толстой кишки см |
Активность MPO мкЕд/мг |
TNF-α пг/мг |
IL-17 пг/мг |
Активность NF-kB p-p65/p65 |
Активность COX-2 |
| Нормальная группа | 0,6 | 6,5 | 0,36 | 22 | 9 | 0,11 | 0,21 |
| Группа с индуцированным колитом | -2,5 | 4,3 | 1,79 | 185 | 52 | 0,34 | 0,56 |
| LM NK41 | -0,8 | 4,6 | 0,82 | 85 | 42 | 0,24 | 0,35 |
| BL NK46 | -0,3 | 4,8 | 0,78 | 68 | 38 | 0,27 | 0,31 |
| NK41+NK46 | -0,5 | 5,1 | 0,79 | 82 | 39 | 0,24 | 0,32 |
| Группа положительного контроля | -0,54 | 4,7 | 0,98 | 75 | 41 | 0,29 | 0,41 |
В частности, было установлено, что в группе, получавшей Lactobacillus mucosae NK41, Bifidobacterium longum NK46 или их смесь, токсичности не наблюдалось, поскольку изменение массы тела было небольшим. Кроме того, при индукции колита длина толстой кишки стала меньше. Однако было установлено, что в группе, получавшей новые молочнокислые бактерии, длина толстой кишки была восстановлена. Кроме того, в группе, получавшей новые молочнокислые бактерии, повышение активности миелопероксидазы из-за индукции колита может быть снижено. Было установлено, что уровни экспрессии цитокинов TNF-α и IL-17 были подавлены, и что активность NF-kB и активность COX-2 были подавлены.
Таким образом, было установлено, что новая молочнокислая бактерия была эффективна в предотвращении и лечении колита без проявления токсичности.
Пример 4. Идентификация эффекта улучшения памяти с использованием новых молочнокислых бактерий против нарушения памяти из-за старения
(1) Тест с Y-образным лабиринтом
Установка Y-образного лабиринта, использованная в тесте, имела три рукава, вытянутые в форме буквы Y, и каждый рукав имел длину 25 см, высоту 14 см и ширину 5 см. Угол между соседними рукавами составлял 120 градусов. Установку использовали в тесте для оценки кратковременной памяти.
А именно, голову подопытного животного направляли к концу одного из рукавов Y-образного лабиринта. Испытуемому животному позволяли свободно перемещаться по рукавам в течение 8 минут. Движение животного регистрировали. Когда задняя лапа животного попадала в рукав, это считали входом в рукав. Движение животных было представлено количеством альтераций. Одну альтерацию определяли как один раз, когда животное последовательно проходило через три рукава. Поведение спонтанного чередования (альтерации) (Спонт. чередование) было выражено в процентах между фактическим количеством альтераций и максимально возможным количеством альтераций (т.е. общее количество альтераций минус 2).
(2) Тест пассивного избегания
Был проведен тест пассивного избегания для оценки долговременной памяти. А именно, мышь помещали в ярко освещенный отсек (лампочка на 50 Вт), позволяли осмотреть отсек в течение 10 секунд, а затем открывали подъемную дверцу (5×5 см), ведущую в темный отсек (Gemini Avoidance System; Сан-Диего, США). Измеряли продолжительность времени, по прошествии которого мышь входила в темный отсек после открытия подъемной дверцы. Это рассматривали как испытание с обучением. Как только все четыре лапы мыши оказывались в темном отсеке, подъемную дверцу закрывали. Через сетку на полу наносили удар электрическим током силой 0,5 мА в течение 3 секунд, чтобы мышь запомнила эту ситуацию. Чтобы идентифицировать эффекты новых молочнокислых бактерий, через 24 часа после окончания испытания с обучением проводили тест пассивного избегания. Время, необходимое для того, чтобы все четыре лапы мыши оказались в темном отсеке после 10-секундного периода осмотра и после открытия подъемной дверцы, измеряли и определяли как латентный период. Несмотря на то что максимальный латентный период был установлен равным 300 секундам, был измерен фактический латентный период (испытание сохранения в памяти).
Согласно интерпретации известного результата теста, чем больше фактический латентный период, тем лучше память.
(3) Тест с водным лабиринтом
Чтобы протестировать долговременную память и способность к пространственному восприятию, проводили тест с водным лабиринтом (тест с водным лабиринтом Морриса) в круглом резервуаре для воды, содержащем 500 мл молока, соответствующего глубине 30 см, при слабом освещении при 20±1°C. Круглый резервуар для воды имел диаметр 90 см и высоту 45 см. В частности, резервуар для воды был разделен на четыре виртуальные области, и в одном из четырех квадрантов была установлена платформа диаметром 6 см, причем расстояние между поверхностью воды и платформой составляло 1 см. То есть платформа имела уровень по вертикали, равный 29 см от дна резервуара. В первый день обучения проводили обучение плаванию в течение 60 секунд без платформы, а затем, в течение оставшихся 4 дней, проводили обучение по поиску платформы четыре раза в день (испытание с обучением). Мыши давали оставаться на платформе в течение 10 секунд. Когда мышь не могла найти платформу в течение 60 секунд, ей давали отдохнуть на платформе в течение 10 секунд. После окончания обучения подопытное животное сушили под ультрафиолетовой лампой. Обучение повторяли каждые 30 секунд. Время, необходимое для поиска платформы, измеряли с помощью видеокамеры. В последнем испытании платформу удаляли из резервуара для воды, после чего помещали туда подопытное животное. Затем измеряли время, проведенное в целевом квадранте, в котором была установлена платформа (испытание с поиском).
(4) Тест распознавания объектов (тест с новыми объектами)
Тест распознавания объектов проводили в коробке (40×40×40 см), изготовленной таким образом, чтобы изнутри нее не было видно, что находится снаружи. Объекты (A, A') одинаковой формы и размера были неподвижно расположены в коробке, и мышь помещали в центр коробки. Количество раз, которое мышь коснулась двух объектов, регистрировали в течение 10 минут. Через 24 часа один из двух объектов заменяли новым объектом (A, B). Затем количество раз (время исследования), которое мышь касалась исходного и нового объектов, регистрировали и рассчитывали в процентах.
(5) Эффект улучшения памяти на модельном животном пожилого возраста
Мышь C57BL/6 (Ag, самец, 19 месяцев) в качестве модельного животного пожилого возраста была приобретена у компании Raon Bio для выявления эффектов ингибирования экспрессии белка p16 как фактора старения с использованием новых молочнокислых бактерий и улучшения памяти с использованием новых молочнокислых бактерий.
А именно, Lactobacillus mucosae NK41, Bifidobacterium longum NK46 или их смесь в соотношении 1:1 вводили мыши в концентрации 1×109 КОЕ/мышь/сут в течение 4 недель, соответственно. Затем проводили тест с Y-образным лабиринтом и тест распознавания объектов из примера 3, а также тест измерения фактора, связанного с памятью, в гиппокампе.
Со ссылкой на результаты теста, было установлено, что на модельном животном пожилого возраста без добавления молочнокислых бактерий поведение спонтанного чередования было снижено по сравнению с нормальной группой; но в группе (Ag+LM), получавшей Lactobacillus mucosae NK41, группе (Ag+BL), получавшей Bifidobacterium longum NK46, и группе (Ag+ML), получавшей их смесь, поведение спонтанного чередования было восстановлено до уровня нормальной группы (ФИГ. 1). Кроме того, было установлено, что в группе (Ag+ML), получавшей Lactobacillus mucosae NK41, в группе (Ag+BL), получавшей Bifidobacterium longum NK46, и в группе (Ag+ML), получавшей их смесь, количество касаний нового объекта было восстановлено до уровня нормальной группы (ФИГ. 2). Было установлено, что в группе, получавшей молочнокислые бактерии, была подавлена экспрессия фактора старения p16, была ингибирована активность воспалительного фактора NF-kB, а также была повышена экспрессия нейротрофического фактора мозга по сравнению с модельным животным пожилого возраста (таблица 7). В частности, было установлено, что смесь Lactobacillus mucosae NK41 и Bifidobacterium longum NK46 показала лучший эффект, чем молочнокислая бактерия по отдельности.
Таблица 7
| P16/β-актин | BDNF/β-актин | p-p65/p65 | |
| Нормальная группа | 0,21 | 0,43 | 0,21 |
| Ag | 0,45 | 0,28 | 0,33 |
| Ag+LM | 0,34 | 0,34 | 0,28 |
| Ag+BL | 0,30 | 0,37 | 0,29 |
| Ag+ML | 0,29 | 0,38 | 0,27 |
Таким образом, было установлено, что новые молочнокислые бактерии Lactobacillus mucosae NK41, Bifidobacterium longum NK46 и их смесь обладают превосходным эффектом улучшения памяти на модельном животном пожилого возраста.
(6) Эффект улучшения памяти на модельном животном с болезнью Альцгеймера
Трансгенная (Tg) мышь, выступавшая в качестве модельного животного с болезнью Альцгеймера [мыши с AD, штамм B6C3-Tg (APPswe, PSEN1dE9) 85Dbo/J (Jackson Laboratory, Бар Харбор, штат Мэн, США)] в возрасте 4 месяца была приобретена и адаптирована в течение 2 месяцев. Здоровая мышь C57BL/6 (Orient, Сеул, Корея) в возрасте 6 месяцев была приобретена в качестве нормальной группы и адаптирована в течение 2 месяцев. Tg-мышам вводили новую молочнокислую бактерию Lactobacillus mucosae NK41 или Bifidobacterium longum NK46 в концентрации 1×109 КОЕ/мышь/сут в течение 8 недель, соответственно (в субботу и воскресенье новую молочнокислую бактерию не вводили).
Затем проводили тест с Y-образным лабиринтом, тест пассивного избегания и тест с водным лабиринтом согласно примеру 3, а также тест измерения фактора, связанного с памятью, в гиппокампе.
Со ссылкой на результаты теста, в тесте с Y-образным лабиринтом поведение спонтанного чередования Tg-мыши, которой не вводили молочнокислые бактерии, было снижено по сравнению с нормальной группой. Латентный период в тесте пассивного избегания первой был снижен по сравнению с последней, а латентный период в тесте с водным лабиринтом первой был увеличен по сравнению с последней. Однако в группе (Tg+LM), получавшей Lactobacillus mucosae NK41, и в группе (Tg+BL), получавшей Bifidobacterium longum NK46, поведение спонтанного чередования и латентный период были восстановлены до уровней нормальной группы (ФИГ. 3-ФИГ. 5). Кроме того, было установлено, что в группе, получавшей молочнокислые бактерии, была ингибирована активность NF-kB, воспалительного фактора, и была повышена экспрессия нейротрофического фактора мозга по сравнению с Tg-мышами (ФИГ. 6).
Таким образом, было установлено, что новая молочнокислая бактерия Lactobacillus mucosae NK41, Bifidobacterium longum NK46 и их смесь обладают превосходным эффектом улучшения памяти на модельном животном с болезнью Альцгеймера.
Пример 5. Влияние новых молочнокислых бактерий на улучшение психического расстройства
(1) Подготовка модельного животного с вызванным психическим расстройством - иммобилизационный стресс (IS)
Чтобы вызвать психические расстройства, такие как синдром тревоги, депрессивное заболевание или стресс, мышь иммобилизовали в устройстве для иммобилизационного стресса цилиндрической формы размером 3×10 см. Иммобилизационный стресс повторяли 5 раз, устанавливая мышь в вертикальном положении так, чтобы ее голова была направлена вверх, один раз в 2 дня. Затем измеряли тревожное поведение.
(2) Тест с приподнятым крестообразным лабиринтом (EPM)
Приподнятый крестообразный лабиринт (EPM) представляет собой экспериментальную установку для измерения степени психических расстройств, таких как стресс или тревожное расстройство. Установка приподнятого крестообразного лабиринта, использованная в этом тесте, относится к устройству из черного плексигласа, имеющему два открытых рукава (каждый рукав размером 30×7 см) и два закрытых рукава (каждый рукав размером 30×7 см) с бортами высотой 20 см, причем рукава приподняты на высоту 50 см от пола и вытянуты на 7 см от центральной платформы. В этом тесте измеряли движение мыши, помещенной в приподнятый крестообразный лабиринт, в комнате с видеокамерой при яркости освещения 20 лк, расположенной в ее верхней части.
А именно, мышь C57BL/6 (самец, 19-22 г) помещали в середину приподнятого крестообразного лабиринта, с головой, направленной к открытому рукаву. Измеряли время и количество раз, проведенных в открытом и закрытом рукавах в течение 5 минут. Вход в рукав засчитывали, когда все четыре лапы оказывались в рукаве.
Время, проведенное в открытом рукаве (ОТ) в течение всей продолжительности испытания, рассчитывали как [время, проведенное в открытом рукаве / (время, проведенное в открытом рукаве + время, проведенное в закрытом рукаве)] × 100. Вход в открытый рукав (OE) рассчитывали как [вход в открытый рукав / (вход в открытый рукав + вход в закрытый рукав)] × 100). После каждого теста поведения оставшийся запах удаляли 70% этанолом.
Согласно известной интерпретации результатов теста, когда время, проведенное в открытом рукаве (OT), и вход в открытый рукав (OE) снижались, считали, что появились симптомы психического расстройства, такие как синдром тревоги или симптомы депрессии.
(3) Результат теста
Со ссылкой на результат теста, после оказания иммобилизационного стресса на мышь (IS), которой не вводили молочнокислую бактерию, время, проведенное в открытом рукаве (OT), и вход в открытый рукав (OE) в тесте с приподнятым крестообразным лабиринтом было снижено по сравнению с нормальной группой (NOR). Однако было установлено, что в группе, которой вводили Lactobacillus mucosae NK41 (IS+LM), в группе, которой вводили Bifidobacterium longum NK46 (IS+BL), или в группе, которой вводили их смесь в соотношении 1:1 (IS+LM+BL), время, проведенное в открытом рукаве (OT), и вход в открытый рукав (OE), было увеличено (таблица 8).
Таблица 8
| Время, проведенное в открытом рукаве (OT), % | Вход в открытый рукав (OE), % | |
| NOR | 15,2 | 36,2 |
| IS | 4,5 | 17,5 |
| IL+LM | 16,1 | 34,6 |
| IS+BL | 14,5 | 32,1 |
| IS+LM+BL | 16,5 | 35,8 |
Таким образом, новые молочнокислые бактерии Lactobacillus mucosae NK41 и Bifidobacterium longum NK46 были идентифицированы как обладающие превосходными эффектами улучшения психических расстройств, таких как тревожное расстройство, депрессия и стресс.
Пример 6. Эффект улучшения депрессивного синдрома с использованием новых молочнокислых бактерий
(1) Подготовка модельной мыши с депрессией
Для того, чтобы вызвать депрессивное заболевание, мышь фиксировали в устройстве для иммобилизационного стресса цилиндрической формы размером 3×10 см, и иммобилизовали мышь в течение 12 часов в день в течение 2 дней, в результате чего была получена модельная мышь с депрессией. После этого начиная со следующего дня ей вводили Lactobacillus mucosae NK41 (LM), Bifidobacterium longum NK46 (BL) или их смесь в соотношении 1:1 (ML) в течение 5 дней, а затем измеряли показатели депрессивного поведения на следующий день после последнего дня введения.
(2) Тест с приподнятым крестообразным лабиринтом (EPM)
В этом тесте использовали испытательную установку приподнятого крестообразного лабиринта, представлявшую собой устройство из черного плексигласа, имеющее два открытых рукава (каждый рукав размером 30×7 см) и два закрытых рукава (каждый рукав размером 30×7 см) с бортами высотой 20 см, причем рукава приподняты на высоту 50 см от пола и вытянуты на 7 см от центральной платформы. В этом тесте измеряли движение мыши, помещенной в приподнятый крестообразный лабиринт, в комнате с видеокамерой при яркости освещения 20 лк, расположенной в ее верхней части.
А именно, мышь C57BL/6 (самец, 19-22 г) помещали в середину приподнятого крестообразного лабиринта, с головой, направленной к открытому рукаву. Измеряли время и количество раз, проведенных в открытом и закрытом рукавах в течение 5 минут. Вход в рукав засчитывали, когда все четыре лапы оказывались в рукаве.
Время, проведенное в открытом рукаве (ОТ) в течение всей продолжительности испытания, рассчитывали как [время, проведенное в открытом рукаве / (время, проведенное в открытом рукаве + время, проведенное в закрытом рукаве)] × 100. После каждого теста поведения оставшийся запах удаляли 70% этанолом.
(3) Тест вынужденного плавания (FST)
На основе способа, описанного в Porsolts RM, Le Pichon M, Jalfre M, Nature 266: 730-732 (1977) [Depression: a new animal model sensitive to antidepressants], воду температурой 25±1°C заливали в резервуар для воды, имеющий диаметр 20 см и высоту 40 см, чтобы высота воды составляла 30 см. Затем каждую мышь для теста помещали в резервуар для воды. Первые 2 минуты из в общей сложности 6 минут были временем адаптации, в течение которого измерения не проводили. Затем измеряли продолжительность неподвижности подопытного животного в течение следующих 4 минут. Под неподвижным состоянием подразумевается состояние плавания на поверхности воды, стоя в вертикальном положении с минимальным количеством движений, необходимым только для удержания головы на поверхности. При снижении депрессивного состояния наблюдалось снижение неподвижности.
(4) Тест подвешивания за хвост (TST)
Основываясь на методе, описанном в Steru, L. et al., Psychopharmacology, (1985) 85, 367-370, [The tail suspension test: a new method for screening antidepressants in mice.], устанавливали фиксирующее устройство на расстоянии 1 см от кончика хвоста мыши. Мышь подвешивали в вертикальном положении на расстоянии 50 см от земли и измеряли продолжительность неподвижности подопытных животных в течение в общей сложности 6 минут.
(5) Измерение маркеров тревожности и симптомов депрессии
Как и в приведенном выше пункте (1), модельную мышь с депрессией подготавливали путем оказания на мышь иммобилизационного стресса. Ей вводили Lactobacillus mucosae NK41 (LM), Bifidobacterium longum NK46 (BL) или их смесь в соотношении 1:1 (ML) в течение 5 дней, а затем измеряли маркеры тревожности и симптомов депрессии на следующий день после последнего дня введения.
Кортикостерон в крови мышей измеряли с помощью набора для иммуноферментного анализа (ELISA) (Ebioscience, Сан-Диего, Калифорния). BDNF (нейротрофический фактор мозга) и NF-kB (p-p65, p65) измеряли с использованием метода иммуноблоттинга.
А именно, хирургическим путем удаляли гиппокамп. К нему добавляли лизирующий буфер RIPA, содержащий 1% коктейль ингибиторов протеаз и коктейль ингибиторов фосфатаз. Равномерно проводили гомогенизацию с последующим центрифугированием (13200×g, 10 мин, 4°С) с получением супернатанта. Супернатант подвергали электрофорезу в 12% SDS (додецилсульфат натрия-полиакриламид) геле, а затем переносили на нитроцеллюлозную мембрану, после чего блокировали белком обезжиренного молока и промывали. Затем промытый продукт обрабатывали антителами к BDNF, p65, p-p65 и β-актину, которые были с ним связаны. Затем обработанный продукт промывали и обрабатывали вторичным антителом, содержащим пероксидазу хрена. Затем белки идентифицировали с использованием набора для детекции с помощью усиленной хемилюминесценции.
(6) Флуоресцентное иммуноокрашивание
Срезы головного мозга фиксировали на предметном стекле и обрабатывали антителом к Iba1 (ионизированный кальций-связывающий адаптер 1) (1:100, Abcam) или DAPI (4',6-диамидино-2-фенилиндол) в соответствии со способом, раскрытым Lee et al. Микроглию идентифицировали с помощью конфокального микроскопа.
(7) Результат теста
Как показано на ФИГ. 7, после индукции депрессивного заболевания у мышей (DC) без дополнительного введения молочнокислых бактерий время, проведенное в открытом рукаве (OT), и вход в открытый рукав (OE) в тесте с приподнятым крестообразным лабиринтом уменьшились по сравнению с нормальной группой (NOR). Однако было установлено, что в группе (DC+LM), получавшей Lactobacillus mucosae NK41, группе (DC+BL), получавшей Bifidobacterium longum NK46, или группе (DC+ML), получавшей их смесь в соотношении 1:1, время, проведенное в открытом рукаве (OT), и вход в открытый рукав (OE) увеличились.
Таким образом, новые молочнокислые бактерии Lactobacillus mucosae NK41, Bifidobacterium longum NK46 и их смесь были идентифицированы как обладающие превосходным эффектом уменьшения симптомов депрессии.
Как показано на ФИГ. 8, было установлено, что тревожное поведение и симптомы депрессии, вызванные иммобилизационным стрессом, в тесте вынужденного плавания были снижены из-за снижения неподвижности в группе (DC+LM), получавшей Lactobacillus mucosae NK41, в группе (DC+BL), получавшей Bifidobacterium longum NK46, или группе (DC+ML), получавшей их смесь в соотношении 1:1.
Как показано на ФИГ. 9, было установлено, что тревожное поведение и симптомы депрессии, вызванные иммобилизационным стрессом, в тесте подвешивания за хвост были уменьшены из-за снижения неподвижности в группе (DC+LM), получавшей Lactobacillus mucosae NK41, в группе (DC+BL), получавшей Bifidobacterium longum NK46, или группе (DC+ML), получавшей их смесь в соотношении 1:1.
Как показано на ФИГ. 10, в гиппокампе модельной мыши с депрессией, вызванной иммобилизационным стрессом, экспрессия нейротрофического фактора мозга (BDNF) была снижена, и была индуцирована активность NF-kB. С другой стороны, было установлено, что экспрессия нейротрофического фактора мозга (BDNF) была повышена, и активность NF-kB была ингибирована в группе (DC+LM), получавшей Lactobacillus mucosae NK41, в группе (DC+BL), получавшей Bifidobacterium longum NK46, или группе (DC+ML), получавшей их смесь в соотношении 1:1.
Кроме того, как показано на ФИГ. 11, при измерении уровня кортикостерона в крови на модельной мыши с депрессией уровень кортикостерона был значительно повышен. Однако было установлено, что уровень кортикостерона в крови был значительно снижен в группе (DC+LM), получавшей Lactobacillus mucosae NK41, группе (DC+BL), получавшей Bifidobacterium longum NK46, или группе (DC+ML), получавшей их смесь в соотношении 1:1.
Кроме того, при наблюдении Iba1-положительной активированной микроглии в гиппокампе, как показано на ФИГ. 12, на модельной мыши с депрессией наблюдалась активация Iba1-положительной микроглии как в области CA1, так и в области CA3 гиппокампа. Однако было установлено, что активация Iba1 и микроглии, наблюдаемая как в области CA1, так и в области CA3 гиппокампа, была значительно снижена в группе (DC+LM), получавшей Lactobacillus mucosae NK41, в группе (DC+BL), получавшей Bifidobacterium longum NK46, или группе (DC+ML), получавшей их смесь в соотношении 1:1.
Исходя из приведенных выше результатов, новые молочнокислые бактерии Lactobacillus mucosae NK41 и Bifidobacterium longum NK46 были идентифицированы как обладающие превосходным эффектом уменьшения симптомов депрессии и симптомов тревожности.
Информация о депонировании молочнокислых бактерий
Авторы настоящего изобретения депонировали Lactobacillus mucosae NK41 для целей патентной процедуры 4 августа 2017 г. в Корейском центре культур микроорганизмов в качестве аккредитованного депозитария (адрес: Yurim Building, 45, 2-ga-gil, Hongjenae, Seodaemun-gu, Сеул, Корея), и таким образом ей присвоен регистрационный номер KCCM12091P.
Кроме того, авторы настоящего изобретения депонировали Bifidobacterium longum NK46 для целей патентной процедуры 4 августа 2017 г. в Корейском центре культур микроорганизмов в качестве аккредитованного депозитария (адрес: Yurim Bldg, 45, 2-ga-gil, Hongjenae, Seodaemun-gu, Сеул, Корея), и таким образом ей присвоен регистрационный номер KCCM12087P.
Наименование депозитария: Корейский центр культур микроорганизмов (зарубежный)
Регистрационный номер: KCCM12087P
Дата депонирования: 4 августа 2017 г.
Наименование депозитария: Корейский центр культур микроорганизмов (зарубежный)
Регистрационный номер: KCCM12091P
Дата депонирования: 4 августа 2017 г.
--->
Перечень последовательностей
<110> UNIVERSITY-INDUSTRY COOPERATION GROUP OF KYUNG HEE UNIVERSITY
<120> Новые молочнокислые бактерии и их применение
<130> 18OP3111PCT
<150> KR 10-2017-0155078
<151> 2017-11-20
<150> KR 10-2018-0142811
<151> 2018-11-19
<160> 2
<170> KoPatentIn 3.0
<210> 1
<211> 1513
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> 16s рДНК NK41
<400> 1
agattcaccc taatcatctg ccccacctta ggcggctagc tccccgaagg gttaccccac 60
cgactttggg tgttgcaaac tctcatggtg tgacgggcgg tgtgtacaag gccccgggaa 120
cgtatttcca cccgggcatg ctgatccgcg attactagcg attccgactt cgtgcaggcg 180
agttgcagcc tgcagtccga actgagaacg gttttaagag attagcttgc cctcgcgagt 240
tcgcgactcg ttgtaccgtc cattgtagca cgtgtgtagc ccaggtcata aggggcatga 300
tgatctgacg tcgtccccac cttcctccgg tttgtcaccg gcagtctcac tagagtgccc 360
aactgaatgc tggcaactag taacaagggt tgcgctcgtt gcgggactta acccaacatc 420
tcacgacacg agctgacgac gaccatgcac cacctgtcat tgcgttcccg aaggaaacgc 480
cctatctcta gggttggcgc aagatgtcaa gacctggtaa ggttcttcgc gtagcttcga 540
attaaaccac atgctccacc gcttgtgcgg gcccccgtca attcctttga gtttcaacct 600
tgcggtcgta ctccccaggc ggagtgctta atgcgttagc tgcggcactg aagggcggaa 660
accctccaac acctagcact catcgtttac ggcatggact accagggtat ctaatcctgt 720
tcgctaccca tgctttcgag cctcagcgtc agttgcagac cagacagccg ccttcgccac 780
tggtgttctt ccatatatct acgcattcca ccgctacaca tggagttcca ctgtcctctt 840
ctgcactcaa gtctgacagt ttccgatgca cttctttggt taagccaaag gctttcacat 900
cagacttatc aaaccgcctg cgctcgcttt acgcccaata aatccggata acgcttgcca 960
cctacgtatt accgcggctg ctggcacgta gttagccgtg actttctggt tagataccgt 1020
cactgcgtga acagttgctc tcacgcacgt tcttctctaa caacagagct ttacgagccg 1080
aaacccttct tcactcacgc ggtgttgctc catcaggctt gcgcccattg tggaagattc 1140
cctactgctg cctcccgtag gagtatggac cgtgtctcag ttccattgtg gccgatcagt 1200
ctctcaactc ggctacgcat cacagccttg gtaggccgtt accctaccaa caagctaatg 1260
cgccgcaggt ccatcccaaa gtgatagccg aagccatctt ttaaatttga atcatgcgat 1320
tcaaattgtt atgcggtatt agcatctgtt tccaaatgtt atcccccgct ttggggcagg 1380
ttacctacgt gttactcacc cgtccgccac tcgctggtaa accaacgtca agtccgtgca 1440
agcacgttca atcagttggg ccaacgcgtt cgacttgcat gtattaggca caccgccggc 1500
gttcatcctg agc 1513
<210> 2
<211> 1469
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> 16s рДНК NK46
<400> 2
tttacccctg ttacgactta gtcccaatca cgagcctcac cttagacggc tccatcccac 60
aaggggttag gccaccggct tcgggtgctg cccactttca tgacttgacg ggcggtgtgt 120
acaaggcccg ggaacgcatt caccgcgacg ttgctgattc gcgattacta gcgactccgc 180
cttcacgcag tcgagttgca gactgcgatc cgaactgaga ccggttttca gggatccgct 240
ccgcgtcgcc gcgtcgcatc ccgttgtacc ggccattgta gcatgcgtga agccctggac 300
gtaaggggca tgatgatctg acgtcatccc caccttcctc cgagttaacc ccggcggtcc 360
cccgtgagtt cccggcataa tccgctggca acacggggcg agggttgcgc tcgttgcggg 420
acttaaccca acatctcacg acacgagctg acgacgacca tgcaccacct gtgaacccgc 480
cccgaaggga agccgcatct ctacgaccgt cgggaacatg tcaagcccag gtaaggttct 540
tcgcgttgca tcgaattaat ccgcatgctc cgccgcttgt gcgggccccc gtcaatttct 600
ttgagtttta gccttgcggc cgtactcccc aggcgggatg cttaacgcgt tagctccgac 660
acggaacccg tggaacgggc cccacatcca gcatccaccg tttacggcgt ggactaccag 720
ggtatctaat cctgttcgct ccccacgctt tcgctcctca gcgtcagtaa cggcccagag 780
acctgccttc gccattggtg ttcttcccga tatctacaca ttccaccgtt acaccgggaa 840
ttccagtctc ccctaccgca ctcaagcccg cccgtacccg gcgcggatcc accgttaagc 900
gatggacttt cacaccggac gcgacgaacc gcctacgagc cctttacgcc caataattcc 960
ggataacgct tgcaccctac gtattaccgc ggctgctggc acgtagttag ccggtgctta 1020
ttcaacgggt aaactcactc tcgcttgctc cccgataaaa gaggtttaca acccgaaggc 1080
ctccatccct cacgcggcgt cgctgcatca ggcttgcgcc cattgtgcaa tattccccac 1140
tgctgcctcc cgtaggagtc tgggccgtat ctcagtccca atgtggccgg tcgccctctc 1200
aggccggcta cccgtcgaag ccacggtggg ccgttacccc gccgtcaagc tgataggacg 1260
cgaccccatc ccataccgcg aaagctttcc cagaagacca tgcgatcaac tggagcatcc 1320
ggcattacca cccgtttcca ggagctattc cggtgtatgg ggcaggtcgg tcacgcatta 1380
ctcacccgtt cgccactctc accaccaagc aaagcctgat ggatcccgtt cgacttgcat 1440
gtgttaagca cgccgccagc gttcatcct 1469
<---
1. Штамм Lactobacillus mucosae NK41 KCCM12091P, подавляющий экспрессию белка p16 как фактора старения.
2. Штамм Lactobacillus mucosae NK41 KCCM12091P по п. 1, содержащий последовательность оснований рДНК 16S согласно SEQ ID NO: 1.
3. Фармацевтическая композиция для применения для предотвращения или лечения нарушения памяти и неспособности к обучению, содержащая эффективное количество штамма Lactobacillus mucosae NK41 KCCM12091P, его термоинактивированного пробиотика или его культуры, причем нарушение памяти и неспособность к обучению представляет собой по меньшей мере одно выбранное из группы, состоящей из старения, болезни Альцгеймера, шизофрении, болезни Паркинсона, болезни Хантингтона, болезни Пика, болезни Крейтцфельдта-Якоба, травмы головы, забывчивости, ухудшения памяти, черепно-мозговой травмы, эпилепсии, склероза гиппокампа, сенильного заболевания головного мозга, деменции и потери памяти.
4. Фармацевтическая композиция для применения для лечения или предотвращения психического расстройства, содержащая эффективное количество штамма Lactobacillus mucosae NK41 KCCM12091P, его термоинактивированного пробиотика или его культуры; причем психическое расстройство представляет собой по меньшей мере одно выбранное из группы, состоящей из тревожного расстройства, симптомов депрессии, расстройств настроения, бессонницы, бредового расстройства, обсессивно-компульсивного расстройства, мигрени, стресса, когнитивного расстройства и расстройства внимания.
5. Фармацевтическая композиция по п. 3, дополнительно содержащая штамм Bifidobacterium longum NK46 KCCM12087P, его термоинактивированный пробиотик или его культуру.
6. Фармацевтическая композиция по п. 4, дополнительно содержащая штамм Bifidobacterium longum NK46 KCCM12087P, его термоинактивированный пробиотик или его культуру.
7. Фармацевтическая композиция для применения для предотвращения или лечения воспалительного заболевания, содержащая эффективное количество штамма Lactobacillus mucosae NK41 KCCM12091P, его термоинактивированного пробиотика или его культуры, причем воспалительное заболевание представляет собой по меньшей мере одно, выбранное из группы, состоящей из гастрита, энтерита, нефрита, колита и панкреатита.
8. Фармацевтическая композиция по п. 7, дополнительно содержащая штамм Bifidobacterium longum NK46 KCCM12087P, его термоинактивированный пробиотик или его культуру.
9. Пищевая композиция, содержащая штамм Lactobacillus mucosae NK41 KCCM12091P, его термоинактивированный пробиотик или его культуру.
10. Пищевая композиция по п. 9, дополнительно содержащая штамм Bifidobacterium longum NK46 KCCM12087P, его термоинактивированный пробиотик или его культуру.
11. Пищевая композиция для применения для предотвращения или облегчения нарушения памяти и неспособности к обучению, содержащая штамм Lactobacillus mucosae NK41 KCCM12091P, его термоинактивированный пробиотик или культуру, причем нарушение памяти и неспособность к обучению представляет собой по меньшей мере одно выбранное из группы, состоящей из старения, болезни Альцгеймера, шизофрении, болезни Паркинсона, болезни Хантингтона, болезни Пика, болезни Крейтцфельдта-Якоба, травмы головы, забывчивости, ухудшения памяти, черепно-мозговой травмы, эпилепсии, склероза гиппокампа, сенильного заболевания головного мозга, деменции и потери памяти.
12. Пищевая композиция для применения для предотвращения или облегчения психического расстройства, содержащая Lactobacillus mucosae NK41 KCCM12091P, его термоинактивированный пробиотик или культуру, причем психическое расстройство представляет собой по меньшей мере одно выбранное из группы, состоящей из тревожного расстройства, симптомов депрессии, расстройств настроения, бессонницы, бредового расстройства, обсессивно-компульсивного расстройства, мигрени, стресса, когнитивного расстройства и расстройства внимания.
13. Пищевая композиция для применения для предотвращения или облегчения воспалительного заболевания, содержащая штамм Lactobacillus mucosae NK41 KCCM12091P, его термоинактивированный пробиотик или его культуру, причем воспалительное заболевание представляет собой по меньшей мере одно выбранное из группы, состоящей из гастрита, энтерита, нефрита, колита и панкреатита.
14. Применение композиции, содержащей штамм Lactobacillus mucosae NK41 KCCM12091P, его термоинактивированный пробиотик или его культуру, для введения пациенту для предотвращения, облегчения или лечения нарушения памяти и неспособности к обучению, причем нарушение памяти или неспособность к обучению представляет собой по меньшей мере одно выбранное из группы, состоящей из старения, болезни Альцгеймера, шизофрении, болезни Паркинсона, болезни Хантингтона, болезни Пика, болезни Крейтцфельдта-Якоба, травмы головы, забывчивости, ухудшения памяти, черепно-мозговой травмы, эпилепсии, склероза гиппокампа, сенильного заболевания головного мозга, деменции и потери памяти.
15. Применение композиции, содержащей штамм Lactobacillus mucosae NK41 KCCM12091P, его термоинактивированный пробиотик или его культуру, для введения пациенту для предотвращения, облегчения или лечения психического расстройства, причем психическое расстройство представляет собой по меньшей мере одно выбранное из группы, состоящей из тревожного расстройства, симптомов депрессии, расстройств настроения, бессонницы, бредового расстройства, обсессивно-компульсивного расстройства, мигрени, стресса, когнитивного расстройства и расстройства внимания.
16. Применение композиции, содержащей штамм Lactobacillus mucosae NK41 KCCM12091P, его термоинактивированный пробиотик или его культуру, для введения пациенту для предотвращения, облегчения или лечения воспалительного заболевания, причем воспалительное заболевание представляет собой по меньшей мере одно выбранное из группы, состоящей из гастрита, энтерита, нефрита, колита и панкреатита.
