Комплекс для усиления иммунного ответа

Группа изобретений относится к фармацевтической промышленности, а именно к продукту для потенцирования иммунного ответа. Комбинированный продукт для потенцирования иммунного ответа, содержащий полиинозиновую-полицитидиловую кислоту (PIC), катионный стабилизатор и растворимую соль кальция в жидкой реакционной системе; при этом катионный стабилизатор представляет собой привитой сополимер олигосахарида хитозана и метоксиполиэтиленгликоля (COS-g-MPEG), где олигосахарид хитозана характеризуется молекулярным весом, составляющим 5 кДа или меньше; полиинозиновая-полицитидиловая кислота предварительно нагрета при температуре от 88 до 90°С в течение от 70 до 120 минут, соотношение PIC к COS-g-MPEG в комбинированном продукте составляет от 1:0,8 до 1:6,4. Комплекс для потенцирования иммунного ответа, содержащий комбинированный продукт. Нетерапевтическое применение комплекса в качестве иммунного адъюванта. Применение комплекса для получения антитела. Применение комплекса для получения вакцинного состава или вакцинной композиции. Применение комплекса для получения адъюванта для вакцины. Вакцинная композиция, содержащая комплекс и по меньшей мере один антиген. Применение комплекса для регуляции активности иммунных клеток, где применение осуществляется in vivo или in vitro. Применение комплекса для получения лекарственных средств для лечения и/или предупреждения опухолей. Применение комплекса для получения противовирусных лекарственных средств. Применение комплекса для получения антибактериальных лекарственных средств. Применение комплекса для получения противогрибковых лекарственных средств. Применение комплекса для получения противопаразитарных лекарственных средств. Применение комплекса для получения лекарственных средств, стимулирующих иммунный ответ на антиген в организме. Фармацевтическая композиция для лечения рака и инфекции, содержащая комплекс, где фармацевтическая композиция дополнительно содержит одно или более из лекарственного средства для терапии иммунными клетками, лекарственного средства для терапии антителами, химического лекарственного средства, вещества, которое способствует поглощению иммунологически активных средств слизистой оболочкой или адгезии на слизистой оболочке, иммуномодулятора, антигена патогена, лиганда паттерн-распознающего рецептора и фармацевтически приемлемого вспомогательного вещества, где химическое лекарственное средство представляет собой одно или более из средств, выбранных из группы, состоящей из алкилирующего средства, антиметаболического средства, противоопухолевого антибиотика, противоопухолевого лекарственного средства растительного происхождения, гормонального лекарственного средства и другого лекарственного средства; где другое лекарственное средство выбрано из группы, состоящей из L-аспарагиназы, цисплатина, карбоплатина, оксалиплатина, дакарбазина, лекарственных средств на основе гексаметилмеламина и производных вышеупомянутых лекарственных средств. Способ стимуляции иммунного ответа на антиген в организме in vivo, включающий введение в организм комплекса, или вакцинной композиции, или фармацевтической композиции, если антиген представляет собой вирусный, бактериальный, грибковый или паразитарный антиген, комплекс, или вакцинную композицию, или фармацевтическую композицию вводят в дозе, составляющей 1-8 мг/кг, при каждом введении; в качестве альтернативы вводят один раз в день, один раз в 2 дня, один раз в 3 дня или один раз в 4 дня; если антиген представляет собой опухолевый антиген, комплекс, или вакцинную композицию, или фармацевтическую композицию вводят в дозе, составляющей 1-10 мг/кг, при каждом введении и вводят в течение по меньшей мере 360 дней, по меньшей мере 180 дней, по меньшей мере 60 дней или по меньшей мере 30 дней. Способ регуляции и потенцирования активности иммунных клеток в организме, включающий введение в организм комплекса, или вакцинной композиции, или фармацевтической композиции, если антиген представляет собой вирусный, бактериальный, грибковый или паразитарный антиген, комплекс, или вакцинную композицию, или фармацевтическую композицию вводят в дозе, составляющей 1-8 мг/кг, при каждом введении; в качестве альтернативы вводят один раз в день, один раз в 2 дня, один раз в 3 дня или один раз в 4 дня; если антиген представляет собой опухолевый антиген, комплекс, или вакцинную композицию, или фармацевтическую композицию вводят в дозе, составляющей 1-10 мг/кг, при каждом введении и вводят в течение по меньшей мере 360 дней, по меньшей мере 180 дней, по меньшей мере 60 дней или по меньшей мере 30 дней. Продукт и комплекс на его основе обладает средней вязкостью и молекулярным весом, является удобным для применения в фармацевтическом производстве; обладает стабильными химическими свойствами, практически не деградирует при длительном хранении, безопасен для применения, значительно усиливает неспецифический иммунный ответ организма и достигает улучшенной противоопухолевой, противовирусной и противо(сверх)бактериальной эффективности. 17 н. и 31 з.п. ф-лы, 35 ил., 3 табл., 16 пр.

 

ПЕРЕКРЕСТНАЯ ССЫЛКА НА РОДСТВЕННУЮ ЗАЯВКУ

Настоящая заявка испрашивает приоритет заявки на патент Китая № 201810700708.6, поданной 29 июня 2018 года в патентное ведомство Китая под названием «КОМПЛЕКСЫ ДЛЯ ПОТЕНЦИРОВАНИЯ ИММУННОГО ОТВЕТА», и заявки на патент Китая № 201810698033.6, поданной 29 июня 2018 года в патентное ведомство Китая под названием «СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ КОМПЛЕКСОВ ДЛЯ ПОТЕНЦИРОВАНИЯ ИММУННОГО ОТВЕТА», полное содержание которых включено в настоящий документ посредством ссылки во всей своей полноте.

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ

Настоящее изобретение относится к области биомедицины и, в частности, к комплексу для потенцирования иммунного ответа.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Адъюванты на основе двухцепочечной РНК (dsRNA), которые в настоящее время и обычно считаются содержащими PIC (полирибоинозиновая-полирибоцитидиловая кислота), PICLC (PIC с поли-L-лизином и карбоксиметилцеллюлозой), PIC₁₂U (PIC с уридиловой кислотой в определенном интервале, коммерческое название амплиген) и PICKCa (PIC-канамицин-CaCl2), представляют собой лиганды различных паттерн-распознающих рецепторов (PRR) и функционируют, возможно, с одной стороны посредством потенцирования иммунного ответа, а с другой стороны посредством изменения типов иммунитета для получения терапевтических вакцин из профилактических вакцин.

PIC (полиинозиновая-полицитидиловая кислота) была разработана компанией Merck (США) в 1960-х годах. У мышей PIC представляет собой индуктор IFN-α с противовирусной активностью. PIC способна защищать мышей от летальных инфекций в носовой полости и легких. Однако из-за деградации PIC нуклеазами сыворотки крови приматов и человека PIC характеризуется пониженной стабильностью структуры с продуцированием незначительного количества IFN-α и без противоопухолевой активности.

PICLC (полиинозиновая-полицитидиловая кислота с поли-L-лизином и карбоксиметилцеллюлозой), конъюгат PIC, полилизина (поли-L-лизин, относительный молекулярный вес составляет 27000) и карбоксиметилцеллюлозы (CMC, относительный молекулярный вес составляет 700000), который был разработан Levy HB в 1970-х годах, характеризуется большим относительным молекулярным весом и устойчивостью к гидролизу нуклеазами, которая в 5-10 раз выше, чем у PIC, и продуцирует значительное количество интерферона (15) у обезьян. Предварительные клинические исследования PICLC продемонстрировали, что реакция от умеренной до тяжелой, такая как лихорадка (100%), миалгия (50%), гипотензия (50%), значительное снижение количества белых клеток крови и т. п., могут быть вызваны только при терапевтической дозе. Это приводит к неправильному пониманию того, что больший молекулярный вес приводит к большей токсичности.

PIC₁₂U, в котором урациловые нуклеотиды вставлены в положение в цепи PIC, был разработан в университете Джона Хопкинса в середине 1970-х годов и обладает эффективностью, аналогичной эффективности PIC, но меньшей токсичностью. В августе 2012 года биофармацевтическая компания Hemispherx представила дополнительные оригинальные данные клинических исследований; однако PIC₁₂U не был одобрен Управлением по контролю за качеством пищевых продуктов и медикаментов США (FDA) из-за недостаточных данных по безопасности и эффективности.

PICKCa содержит антибиотик, т. е. канамицин. Канамицин обладает умеренной ототоксичностью, и его количество в вакцине превышает стандарт, установленный национальной фармакопеей.

Можно видеть, что PIC отдельно нельзя использовать в случае приматов и более продвинутых животных, чем приматы, включая людей, PIC₁₂U был отклонен FDA США по причине его слабого эффекта, а PICLC действительно характеризуется сильными побочными эффектами.

Ввиду этого настоящим представлено настоящее изобретение.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ

Настоящее изобретение относится к новому комплексу, и получение, применение и т. п. комплекса было изучено.

В предыдущей работе автора изобретения PIC канамицин и хлорид кальция использовали для получения адъювантов для вакцин (коммерческое название: адъювант PIKA). Канамицин применяют по причине того, что он содержит 4 аминогруппы, которые будут связываться с фосфатной группой в PIC для стабилизации его структуры. Однако применение продукта в вакцинах ограничено по причине включения антибиотика.

Кроме того, авторы настоящего изобретения обнаружили, что замена канамицина на хитозан (гидрохлорид) также может действовать как катионный стабилизатор; однако хитозан (гидрохлорид) характеризуется большим молекулярным весом и плохо усваивается человеком, поэтому трудно получить желаемую эффективность.

Следовательно, в настоящем изобретении предусмотрен комплекс для потенцирования иммунного ответа. Комплекс получают из по меньшей мере следующих компонентов в подходящих условиях: полиинозиновая-полицитидиловая кислота, по меньшей мере катионный стабилизатор и растворимая соль кальция.

Комплекс получают из по меньшей мере следующих компонентов в подходящих условиях: полиинозиновая-полицитидиловая кислота, по меньшей мере катионный стабилизатор, растворимая соль кальция и/или соль марганца.

При этом катионный стабилизатор представляет собой водорастворимое аминосоединение, отличное от антибиотика, характеризующееся молекулярным весом, составляющим 5 кДа или меньше, или привитой сополимер, образованный из водорастворимого аминосоединения, отличного от антибиотика, и одного или более из метоксиполиэтиленгликоля, полиэтиленгликоля, полиэтиленимина, фолиевой кислоты и галактозы.

По сравнению с предшествующим уровнем техники комплекс обладает средней вязкостью и молекулярным весом, легко превращается в лекарственное средство, обладает стабильными химическими свойствами, устойчив к деградации при длительном хранении и безопасен при применении. Комплекс способен в значительной степени потенцировать неспецифический иммунный ответ в организме и достигать цели предупреждения и лечения заболевания при использовании отдельно и способен обеспечивать лучшую противоопухолевую, противовирусную и противобактериальную эффективность, а также легко усваивается пациентом при применении в комбинации с другими лекарственными средствами.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ

Для более четкой иллюстрации технических решений в соответствии с вариантами осуществления настоящего изобретения или предшествующим уровнем техники далее кратко представлены сопроводительные графические материалы для описания вариантов осуществления или предшествующего уровня техники. Очевидно, что сопроводительные графические материалы в следующем далее описании представляют собой только некоторые варианты осуществления настоящего изобретения, и специалисты в данной области техники могут получить другие графические материалы из сопроводительных графических материалов без творческих усилий.

Фиг. 1 представляет собой схематическую диаграмму структуры комплекса Pamica; A: схематическая диаграмма структуры поли-I: комплекс C-COS-Ca²⁺; B: схематическая диаграмма структуры частицы комплекса антигенов (Ag) +; C: схематическая диаграмма структуры поли-I: комплекс C-COS-Ca²⁺ + Ag.

Фиг. 2 представляет собой электрофореграмму молекулярного веса PIC после нагревания в течение различных периодов времени.

Фиг. 3 представляет собой кривую ферментативной деградации комплекса Pamica в соответствии с вариантом осуществления настоящего изобретения.

Фиг. 4 представляет собой кривую плавления комплекса Pamica в соответствии с вариантом осуществления настоящего изобретения.

Фиг. 5 представляет собой спектр поглощения при сканировании соответствующих веществ при 240-260 нм в соответствии с вариантом осуществления настоящего изобретения.

Фиг. 6 представляет собой полученное с помощью трансмиссионного электронного микроскопа изображение комплекса PIC-COS-CaCl₂ в соответствии с вариантом осуществления настоящего изобретения; масштабный отрезок = 500 нм.

Фиг. 7 представляет собой полученное с помощью трансмиссионного электронного микроскопа изображение комплекса PIC-COS-CaCl₂ в соответствии с вариантом осуществления настоящего изобретения; масштабный отрезок = 200 нм.

Фиг. 8 представляет собой полученное с помощью трансмиссионного электронного микроскопа изображение комплекса PIC-COS-g-MPEG-CaCl₂ в соответствии с вариантом осуществления настоящего изобретения; масштабный отрезок = 200 нм.

Фиг. 9 представляет собой полученное с помощью трансмиссионного электронного микроскопа изображение комплекса PIC-COS-g-MPEG-CaCl₂ в соответствии с вариантом осуществления настоящего изобретения; масштабный отрезок = 100 нм.

Фиг. 10 представляет собой полученное с помощью трансмиссионного электронного микроскопа изображение наночастиц, образованных из комплекса PIC-COS-CaCl₂ и TPP в соответствии с вариантом осуществления настоящего изобретения; масштабный отрезок = 1000 нм.

Фиг. 11 представляет собой полученное с помощью трансмиссионного электронного микроскопа изображение наночастиц, образованных из комплекса PIC-COS-CaCl₂ и TPP в соответствии с вариантом осуществления настоящего изобретения; масштабный отрезок = 200 нм.

Фиг. 12 представляет собой график выявления антител IgG, выявленных с помощью способа Elisa в сыворотке крови мышей на 21-й день после иммунизации алюминиевым адъювантом/rHBsAg (CHO), ADV20/rHBsAg (CHO) и Pamica/rHBsAg (CHO) соответственно, в соответствии с вариантом осуществления настоящего изобретения.

Фиг. 13 представляет собой гуморальный иммунитет мышей на 21-й день после иммунизации алюминиевым адъювантом/rHBsAg (CHO), ADV20/rHBsAg (CHO) и Pamica/rHBsAg (CHO) соответственно, в соответствии с вариантом осуществления настоящего изобретения; ордината демонстрирует припухлость подушечек лап: увеличение в мм.

Фиг. 14 представляет собой сравнение эффектов комплекса Pamica и полного адъюванта Фрейнда при получении антитела к антигену MYO в соответствии с вариантом осуществления настоящего изобретения.

Фиг. 15 представляет собой сравнение эффектов комплекса Pamica и полного адъюванта Фрейнда при получении антитела к антигену MYO в соответствии с вариантом осуществления настоящего изобретения.

Фиг. 16 представляет собой иллюстративное изображение эксперимента, в котором группа, получающая Pamica, стимулирует фагоцитарную функцию макрофагов в соответствии с вариантом осуществления настоящего изобретения;

Фиг. 17 представляет собой иллюстративное изображение эксперимента, в котором контрольная группа, получающая PBS, не стимулирует фагоцитарную функцию макрофагов в соответствии с вариантом осуществления настоящего изобретения;

Фигуры 18-21 представляют собой экспериментальные результаты противораковых эффектов иммунного состава для слизистой оболочки Pamica на мышиной модели рака легкого LL2 с опухолью в соответствии с вариантом осуществления настоящего изобретения.

Фиг. 18: кривые изменений объема опухоли при обработке различными лекарственными средствами.

Фиг. 19: вес опухоли при обработках различными лекарственными средствами (контрольная группа, которую обрабатывали средой-носителем, имела объем опухоли, составляющий 2201,09 ± 68,01 мм³ на 14-й день после введения, и эксперимент завершился на 14-й день после введения).

Фиг. 20: A: контроль со средой-носителем, которую вводили с помощью назальной капельницы один раз в два дня; B: цисплатин (5 мг/кг) вводили путем инъекции в хвостовую вену один раз в неделю; C Pamica-1 (т. е. Pamica) вводили в дозе 200 мкг/мышь с помощью назальной капельницы один раз в два дня; D: Pamica-1 вводили в дозе 200 мкг/мышь с помощью назальной капельницы (вводили непосредственно после инокуляции) один раз в два дня; E: Pamica-1 вводили в дозе 150 мкг/мышь с помощью назальной капельницы один раз в два дня; F: Pamica-1 вводили в дозе 200 мкг/мышь путем внутримышечной инъекции один раз в два дня; G: Pamica-1 + цисплатин вводили в дозе 200 мкг/мышь + 5 мг/кг с помощью назальной капельницы + путем инъекции в хвостовую вену один раз в два дня + один раз в неделю; масштабный отрезок = 1 см.

Фиг. 21: степень подавления опухоли с помощью мышиного антитела к PD-1.

На фиг. 22-35 показаны противоопухолевые эффекты Pamica in vivo на мышиной модели рака молочной железы 4T1-luc in-situ в соответствии с вариантом осуществления настоящего изобретения.

Фиг. 22: Кривые изменений объема опухоли.

Фиг. 23: Кривые изменений веса тела мышей.

Фиг. 24: эффекты обработок различными лекарственными средствами в отношении веса опухоли.

Фиг. 25: фотография опухолей под воздействием различных лекарственных средств.

Фиг. 26: эффекты обработок различными лекарственными средствами в отношении веса селезенки.

Фиг. 27: фотография передней части легких под воздействием различных лекарственных средств.

Фиг. 28: фотография задней части легких под воздействием различных лекарственных средств.

Фиг. 29-35: фотографии участка локализации опухоли и интенсивности биолюминесценции метастазов, полученные с помощью устройства для визуализации мелких животных.

Фиг. 29: биолюминесценция мышей в группе с раком на поздней стадии и введением Pamica в день 7.

Фиг. 30: биолюминесценция мышей в группе с введением Pamica в день 0.

Фиг. 31: биолюминесценция мышей в группе с введением среды-носителя.

Фиг. 32: биолюминесценция мышей в группе с введением Pamica в дозе 200 мкг/мышь с помощью назальной капельницы.

Фиг. 33: биолюминесценция мышей в группе с введением Pamica в дозе 300 мкг/мышь с помощью назальной капельницы.

Фиг. 34: биолюминесценция мышей в группе с введением Pamica в дозе 200 мкг/мышь путем внутримышечной инъекции.

Фиг. 35: биолюминесценция мышей в группе с введением Pamica в дозе 300 мкг/мышь путем внутримышечной инъекции.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ВАРИАНТОВ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ

Настоящее изобретение может стать более очевидным благодаря следующему описанию некоторых его вариантов осуществления и подробному содержанию примеров, включенных в данный документ.

Перед дальнейшим описанием настоящего изобретения следует понимать, что настоящее изобретение не ограничивается конкретными вариантами осуществления, поскольку эти варианты осуществления обязательно являются разнообразными. Также следует понимать, что термины, используемые в данном описании, предназначены только для иллюстрации конкретных вариантов осуществления, а не для ограничения, поскольку объем настоящего изобретения будет определяться только в прилагаемой формуле изобретения.

Определение терминов

Прежде чем излагать подробности настоящего изобретения, следует разъяснить несколько терминов, используемых в настоящем описании.

Термин «Pamica» обычно относится к комплексу, полученному из полиинозиновой-полицитидиловой кислоты, катионного стабилизатора и растворимой соли кальция (ионы кальция), независимо от конкретных физической характеристики и иммуногенности комплекса.

«Полиинозиновая-полицитидиловая кислота» также известна как полиинозин-цитидин, полицитидиловая кислота-полиинозиновая кислота, цитозиновый нуклеотид полиинозиновой кислоты, полиинозиновая кислота-полицитидиловая кислота, PIC или поли-I:C.

Используемый в настоящем описании термин «потенцирование иммунореакции» относится к индукции или потенцированию иммунного ответа на антигенное вещество в организме, или к потенцированию функции иммунных клеток, или к стимуляции высвобождения провоспалительных факторов или цитокинов из клеток иммунной системы, или к усилению устойчивости к патогенному веществу в организме.

Термин «индукция иммунного ответа» относится к стимуляции, инициации или развитию иммунного ответа.

«Потенцирование иммунного ответа» относится к улучшению, развитию, дополнению, расширению, повышению и расширению существующего иммунного ответа.

Выражение «потенцирование иммунного ответа» или подобные выражения означают, что по сравнению с предыдущим состоянием иммунного ответа иммунный ответ усиливается, улучшается или повышается, что является благоприятным для хозяина. Предыдущее состояние иммунного ответа, например, является состоянием предыдущего иммунного ответа до введения иммуногенной композиции по настоящему изобретению.

Термин «индивидуум» используется в данном документе взаимозаменяемо с «хозяином», «субъектом» и «животным» и включает людей и всех сельскохозяйственных животных (например, домашних животных и комнатных животных), а также диких животных и птиц, включая без ограничения крупный рогатый скот, лошадь, дойную корову, свинью, овцу, козу, крысу, мышь, собаку, кошку, кролика, верблюда, осла, оленя, норку, курицу, утку, гуся, индейку, бойцового петуха и т п.

Термин «антитело» включает поликлональные антитела и моноклональные антитела, а также фрагменты этих антител, связывающие антигенное соединение, включая Fab, F(ab’)₂, Fd, Fv, scFv, биспецифические антитела и минимальную распознающую единицу антител, а также одноцепочечные производные этих антител и фрагментов. Тип антитела может быть выбран из IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgM, IgE и IgD. Кроме того, термин «антитело» включает встречающиеся в природе антитела и не встречающиеся в природе антитела, включая, например, химерные, бифункциональные и гуманизированные антитела и родственные синтетические изоформы. Термин «антитело» может использоваться взаимозаменяемо с «иммуноглобулином».

Используемый в настоящем описании термин «антигенное соединение» относится к любым веществам, которые могут распознаваться иммунной системой (например, связываться с антителом или подвергаться процессингу для индукции клеточного иммунного ответа) при соответствующих обстоятельствах.

Применяемый в настоящем описании термин «антиген» включает без ограничения клетки, клеточные экстракты, белки, липопротеины, гликопротеины, нуклеопротеины, полипептиды, пептиды, полисахариды, конъюгаты полисахаридов, пептидные имитаторы полисахаридов, жиры, гликолипиды, сахариды, вирусы, вирусные экстракты, бактерию, бактериальные экстракты, грибы, грибковые экстракты, многоклеточные организмы, такие как паразиты, и аллергены. Антигены могут быть экзогенными (например, из другого источника, кроме индивидуума, которому вводят антиген, например, от другого вида) или эндогенными (например, из организма-хозяина, такие как факторы заболеваний, раковые антигены, антигены, продуцируемые клетками, инфицированными вирусами в организме и т. п.). Антигены могут быть природными (например, встречающимися в природе), синтетическими или рекомбинантными. Антигены включают клеточные экстракты, интактные клетки и очищенные антигены, где термин «очищенный» означает, что антиген представлен в более обогащенной форме по сравнению с формой в среде, в которой обычно существует антиген, и/или по сравнению с таковой в форме неочищенного экстракта (например, форма антигена из культуры клеток).

Используемый в настоящем описании термин «вакцинная композиция» относится к комбинации двух или более веществ (таких как антигены и адъюванты), которые будут совместно стимулировать иммунный ответ при введении хозяину.

Термины «полипептид», «пептид», «олигопептид» и «белок» и т. п. используются взаимозаменяемо в настоящем описании и означают полимерную форму аминокислот любой длины. Полимерная форма может содержать кодируемые и некодируемые аминокислоты, химически или биохимически модифицированные или полученные аминокислоты и полипептиды, имеющие модифицированный пептидный остов.

Термин «иммунный ответ» относится к любым ответам иммунной системы позвоночного индивидуума на антигенное или иммуногенное соединение. Типичные иммунные ответы включают без ограничения местные и системные клеточные и гуморальные иммунные ответы, такие как ответы с участием цитотоксических Т-лимфоцитов (CTL), включая антигенспецифическую индукцию CD8 +CTL, ответы с участием хелперных Т-клеток, включая ответы, заключающиеся в пролиферации Т-клеток и высвобождении цитокинов и иммунные ответы с участием B-клеток, включая ответы с участием антител.

Используемый в данном документе термин «адъювант» относится к любому веществу или смеси веществ, которые повышают или изменяют иммунный ответ на антигенное соединение в организме.

Используемый в настоящем описании термин «лечение» обычно относится к достижению требуемой фармакологической и/или физиологической эффективности. Эффективность может иметь профилактический характер с точки зрения полного и/или частичного предупреждения заболеваний или их симптомов, и/или эффекты могут иметь медицинский характер с точки зрения полной и/или частичной стабилизации или лечения заболеваний и/или негативных эффектов, вызванных заболеваниями. Используемый в настоящем описании термин «лечение» охватывает любые виды лечения заболеваний у индивидуума (особенно у индивидуума, представляющего собой млекопитающего и, в частности, человека), и включает: (a) предупреждение развития заболевания или его симптома у индивидуума, который может быть предрасположен к развитию заболевания, но оно еще не было диагностировано; (b) подавление симптома заболевания, например, предупреждение развития симптома заболевания; или облегчение симптома заболевания, например, ослабление заболевания или симптомов; (c) снижение уровня продуктов, образованных из-инфекционного вещества, образующегося при заболевании (например, токсины, антигены и т. п.); (d) снижение интенсивности неблагоприятных физиологических реакций (таких как лихорадка, отек тканей и т. п), вызываемых инфекционными веществами, образующимися при заболевании.

Химическое вещество, представляющее собой «фармацевтически приемлемую соль», означает, что соль является фармацевтически приемлемой и обладает требуемой фармакологической активностью исходного соединения. Эти соли включают: (1) соли, образованные совместно из неорганических кислот, из которых синтезируют соли, таких как хлористоводородная кислота, бромистоводородная кислота, серная кислота, азотная кислота, фосфорная кислота и т. п.; или соли, образованные совместно с органическими кислотами и т. п., такими как уксусная кислота, пропионовая кислота, капроновая кислота, циклопентапропионовая кислота, гликолевая кислота, пировиноградная кислота, молочная кислота, малоновая кислота, янтарная кислота, яблочная кислота, малеиновая кислота, фумаровая кислота, винная кислота, лимонная кислота, бензойная кислота, 3-(4-гидроксибензоил)бензойная кислота, коричная кислота, миндальная кислота, метансульфоновая кислота, этансульфоновая кислота, 1,2-этандисульфоновая кислота, 2-гидроксиэтансульфоновая кислота, бензолсульфоновая кислота, 4-хлорбензолсульфоновая кислота, 2-нафталинсульфоновая кислота, 4-толуолсульфоновая кислота, камфорсульфоновая кислота, глюкогептоновая кислота, 4,4’-метиленбис(3-гидрокси-2-ен-1-карбоновая кислота), 3-фенилпропионовая кислота, триметилуксусная кислота, трет-бутилмолочная кислота, лаурилсерная кислота, глюконовая кислота, глутаминовая кислота, гидроксинафтойная кислота, салициловая кислота, стеариновая кислота, муконовая кислота и т. п.; или (2) соли, образующиеся, если протоны кислоты, присутствующие в исходном соединении, заменяются на ионы металлов щелочной группы, ионы металлов щелочноземельной группы или ионы алюминия, или координируются с органическими соединениями, такими как этаноламин, диэтаноламин, триэтаноламин, трометамин, N-метилглюкамин и т. п.

Иллюстративные варианты осуществления настоящего изобретения

Один аспект настоящего изобретения относится к комбинированному продукту для потенцирования иммунного ответа, содержащему полиинозиновую-полицитидиловую кислоту, по меньшей мере катионный стабилизатор и растворимую соль кальция;

при этом катионный стабилизатор представляет собой водорастворимое аминосоединение, отличное от антибиотика, характеризующееся молекулярным весом, составляющим 5 кДа или меньше, или привитой сополимер, образованный из водорастворимого аминосоединения, отличного от антибиотика, и одного или более из метоксиполиэтиленгликоля, полиэтиленгликоля, полиэтиленимина, фолиевой кислоты и галактозы.

Важное преимущество заключается в том, что используемый отдельно Pamica способен значительно потенцировать неспецифический иммунный ответ в организме и способен более эффективно инициировать специфический гуморальный иммунный ответ и клеточный иммунный ответ, усиливая защитный иммунитет; можно достичь лучших эффектов при использовании в комбинации с антигенным веществом.

Важное преимущество заключается в том, что Pamica способен проходить «Тест на аномальную токсичность 1141» из 4-го тома ФАРМАКОПЕИ КИТАЙСКОЙ НАРОДНОЙ РЕСПУБЛИКИ 2015 года, и может безопасно применяться в организме человека. Комплексы (такие как PIC-аминосоединение-адъювант CaCl₂ или PIC-аминосоединение-адъювантная вакцина на основе CaCl₂), полученные с PIC, характеризующейся молекулярным весом, которая не была обработана нагреванием, не могут пройти тест на аномальную токсичность.

Важное преимущество заключается в том, что Pamica характеризуется лучшей химической и/или физической стабильностью, что облегчает его хранение.

Важное преимущество заключается в том, что Pamica может способствовать апоптозу опухолевых клеток посредством сигнального пути, а также способен стимулировать иммунные клетки для экспрессии различных цитокинов и изменения микроокружения, в котором присутствуют опухолевые клетки, позволяя иммунным клеткам атаковать патогенные вещества, такие как опухолевые клетки, вирусы, бактерию и т. п.

Важное преимущество заключается в том, что Pamica легче абсорбируется хозяином или поглощается клеткой-хозяином, что, в свою очередь, может дополнительно доставлять больше антигенов в клетки, таким образом потенцируя иммунные ответы, вызванные белками и пептидами.

Важное преимущество заключается в том, что Pamica оказывает явное анальгезирующее действие на пациента с болью, вызванной раком.

Важное преимущество заключается в том, что Pamica способен изменять титр вируса у людей, инфицированных HPV, с сильно позитивного на негативный.

Важное преимущество заключается в том, что Pamica плюс инактивированная вакцина на основе Bacterium burgeri обладает хорошим защитным действием.

Следует отметить, что Pamica, как описано в настоящем раскрытии, представляет собой комплекс, имеющий совершенно новую структуру по сравнению с простой композицией.

В некоторых вариантах осуществления катионный стабилизатор характеризуется молекулярным весом, который может быть дополнительно выбран из 4 кДа, 4,5 кДа, 3 кДа, 3,5 кДа, 2,5 кДа, 2 кДа, 1,5 кДа, 1 кДа, 500 Да, 400 Да, 300 Да, 200 Да и 100 Да.

В некоторых вариантах осуществления водорастворимое аминосоединение, отличное от антибиотика, представляет собой одно или более соединений, выбранных из группы, состоящей из олигосахаридов хитозана, хитоолигосахаридов, глюкозаминов, катионных липосом, DEAE-декстрана, полиакриламида, полиаминов, тетрааминофульвена и полиэтиленимина;

В некоторых вариантах осуществления катионный стабилизатор выбран из группы, состоящей из привитого сополимера (COS-g-MPEG) олигосахарида хитозана и метоксиполиэтиленгликоля, привитого сополимера (PEG-g-CS) гидрохлорида хитозана и полиэтиленгликоля, привитого сополимера (FA-g-CS) фолиевой кислоты и гидрохлорида хитозана, привитого сополимера (GAL-g-PEG -g-PEI) галактозы, полиэтиленгликоля и полиэтиленимина, привитого сополимера (COS-g-MPEG-g-PEI) хитозана, метоксиполиэтиленгликоля и полиэтиленимина, привитого сополимера (CS-g-PEG-g-PEI) хитозана, метоксиполиэтиленгликоля и полиэтиленимина, привитого сополимера (PEI-g-PEG) полиэтиленгликоля и полиэтиленимина, привитого сополимера (PEI-g-COS) олигосахарида хитозана и полиэтиленимина, привитого сополимера (PEI-g-CS) гидрохлорида хитозана и полиэтиленимина, привитого сополимера (COS-g-PEG) олигосахарида хитозана и полиэтиленгликоля и привитого сополимера (COS-g-PEG-g-PEI) олигосахарида хитозана, полиэтиленгликоля и полиэтиленимина.

В некоторых вариантах осуществления катионный стабилизатор выбран из группы, состоящей из олигосахарида хитозана (COS), привитого сополимера (COS-g-MPEG) олигосахарида хитозана и метоксиполиэтиленгликоля, привитого сополимера (COS-g-MPEG-g-PEI) олигосахарида хитозана, метоксиполиэтиленгликоля и полиэтиленимина.

В некоторых вариантах осуществления привитой сополимер характеризуется молекулярным весом, составляющим 50 кДа или меньше.

В некоторых вариантах осуществления молекулярный вес катионного стабилизатора может быть дополнительно выбран из 45 кДа, 40 кДа, 35 кДа, 30 кДа, 25 кДа, 20 кДа, 15 кДа, 10 кДа, 9 кДа, 8 кДа, 7 кДа, 8 кДа, 5 кДа, 4 кДа, 3 кДа, 2 кДа, 1 кДа, 500 Да, 400 Да, 300 Да, 200 Да и 100 Да.

В некоторых вариантах осуществления олигосахарид хитозана характеризуется степенью деацетилирования, составляющей 70% или больше; можно также выбрать 80%, 85%, 90% или 95%, предпочтительно 90-100%.

В некоторых вариантах осуществления мономер олигосахарида хитозана характеризуется молекулярным весом, составляющим 161, степенью полимеризации, составляющей 2-20, и выбранным молекулярным весом в диапазоне 322-3220.

В некоторых вариантах осуществления молекулярный вес олигосахарида хитозана, хитоолигосахарида и глюкозамина составляет 3200 или меньше.

В некоторых вариантах осуществления метоксиполиэтиленгликоль, полиэтиленгликоль и полиэтиленимин характеризуются молекулярным весом, составляющим 40000 или меньше, и дополнительно можно выбрать 30000, 20000, 15000, 10000, 8000, 6000, 4000, 2000, 1500, 1000 или 500.

В некоторых вариантах осуществления растворимая соль кальция выбрана из CaCl₂ и/или CaNO₃.

В некоторых вариантах осуществления полиинозиновая-полирибоцитидиловая кислота характеризуется молекулярным весом, составляющим 100-3000 п. о.

В некоторых вариантах осуществления полирибоинозиновая-полирибоцитидиловая кислота характеризуется молекулярным весом, составляющим 100-1500 п. о.

В некоторых вариантах осуществления комбинированный продукт дополнительно содержит одно или более из регулятора pH, триполифосфата натрия, альгината натрия, фенилбороновой кислоты, катехола, буферной соли/реагента и воды.

В некоторых вариантах осуществления соответствующие компоненты в комбинированном продукте упакованы отдельно;

В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере два компонента в комбинированном продукте смешаны и упакованы совместно, например, положительно заряженные ионы и вода и/или буферная соль упакованы совместно;

В некоторых вариантах осуществления полиинозиновая-полицитидиловая кислота упакована в форме ее исходных материалов, например, полиинозиновой кислоты (PI) и полицитидиловой кислоты (PC).

В соответствии с аспектом настоящего изобретения настоящее изобретение также относится к комплексу для потенцирования иммунного ответа, который получен из реагентов в комбинированном продукте, как описано выше.

В некоторых вариантах осуществления получение осуществляют в системе, представляющей собой раствор, и в реагенте полиинозиновая-полицитидиловая кислота характеризуется концентрацией, составляющей 0,1-10 мг/мл;

концентрация полиинозиновой-полицитидиловой кислоты теоретически может достигать более высокой концентрации за счет прививания для повышения растворимости;

В некоторых вариантах осуществления получение осуществляют в системе, представляющей собой раствор, и в реагенте концентрация полиинозина составляет 0,5-5 мг/мл, и можно дополнительно выбрать 1 мг/мл, 2 мг/мл, 3 мг/мл, 4 мг/мл, 5 мг/мл, 6 мг/мл, 6,4 мг/мл, 7 мг/мл, 8 мг/мл или 9 мг/мл.

В некоторых вариантах осуществления получение осуществляют в системе, представляющей собой раствор, и в реагенте концентрация катионного стабилизатора составляет 0,5-51,2 мг/мл;

В некоторых вариантах осуществления катионный стабилизатор характеризуется концентрацией, составляющей 0,8-25,6 мг/мл, и можно дополнительно выбрать 1 мг/мл, 2 мг/мл, 3 мг/мл, 4 мг/мл, 5 мг/мл, 10 мг/мл, 15 мг/мл или 20мг/мл.

В некоторых вариантах осуществления получение осуществляют в системе, представляющей собой раствор, и в реагенте массовое соотношение полиинозиновой-полицитидиловой кислоты и катионного стабилизатора составляет 1:0,8-25,6; можно дополнительно выбрать 1: 6,4 или 1: 12,8.

В некоторых вариантах осуществления получение осуществляют в системе, представляющей собой раствор, и в реагенте концентрация ионов кальция в растворимой соли кальция составляет 0,1-1 мМ, и дополнительно можно выбрать 0,2 мМ, 0,3 мМ, 0,4 мМ, 0,5 мМ, 0,6 мМ, 0,7 мМ, 0,8 мМ или 0,9 мМ.

В некоторых вариантах осуществления комплекс хранится в растворе.

Раствор предпочтительно представляет собой буферный раствор.

В некоторых вариантах осуществления раствор характеризуется значением pH, находящимся в диапазоне 5,0-7,2.

В некоторых вариантах осуществления значение pH раствора равняется 5,9-6,9, и можно также выбрать 6,0, 6,2, 6,4, 6,8, 7,0, 7,2, 7,4, 7,6 или 7,8.

В соответствии с аспектом настоящего изобретения настоящее изобретение также относится к нетерапевтическому применению комплекса, описанного выше, в качестве иммунного адъюванта.

В соответствии с аспектом настоящего изобретения настоящее изобретение также относится к применению комплекса, описанного выше, для получения антитела, вакцинного состава или вакцинной композиции, или к применению для получения вспомогательного вещества для вакцины или адъюванта для вакцины.

В соответствии с аспектом настоящего изобретения настоящее изобретение также относится к вакцинной композиции, содержащей комплекс, описанный выше, и по меньшей мере один антиген.

В некоторых вариантах осуществления антиген представляет собой вирус, бактерию, белок, полипептид, полисахарид, нуклеиновую кислоту или конъюгат на основе низкомолекулярного белка.

В некоторых вариантах осуществления вакцинная композиция представляет собой, например, аттенуированную вакцину (например, аттенуированную вакцину на основе вируса или бактерий), инактивированную вакцину (например, инактивированную вакцину на основе вируса или бактерий), вакцину на основе белка, вакцину на основе полисахарида, вакцину на основе субъединицы белка, химерную векторную вакцину, вакцину на основе ДНК, вакцину на основе РНК, вакцину на основе полипептида или вакцину на основе конъюгата на основе низкомолекулярного белка.

В соответствии с аспектом настоящего изобретения настоящее изобретение также относится к применению комплекса, описанного выше, для регуляции активности иммунных клеток, который применяют in vivo или in vitro.

В некоторых вариантах осуществления регуляция активности иммунных клеток специфически потенцирует активность иммунных клеток.

В некоторых вариантах осуществления иммунная клетка выбрана из макрофагов, лимфоцитов и дендритных клеток.

В некоторых вариантах осуществления регуляция или потенцирование активности иммунных клеток способствуют высвобождению иммунными клетками провоспалительного фактора.

В некоторых вариантах осуществления провоспалительный фактор включает IL-2, IL-6, IL-12p40, IL-18, IL-22, IFN-α, IFN-γ и TNF-α.

В некоторых вариантах осуществления провоспалительный фактор включает IFN-γ и TNF-α.

В соответствии с аспектом настоящего изобретения настоящее изобретение также относится к применению комплексов, описанных выше, для получения лекарственных средств для лечения и/или предупреждения опухолей, противовирусных, антибактериальных, противогрибковых, противопаразитарных средств, средств, снижающих интенсивность побочных эффектов химиотерапии, противодействующих усталости или улучшающих иммунитет, облегчающих боль в организме и стимулирующих иммунный ответ на антиген в организме.

В некоторых вариантах осуществления лекарственное средство представляет собой лекарственную форму для введения путем инъекции, лекарственную форму для респираторного введения, назальные капли, лекарственную форму для введения через кожу, лекарственную форму для введения через слизистую оболочку или лекарственную форму для полостного введения.

В некоторых вариантах осуществления лекарственная форма для введения путем инъекции выбрана, например, из инъекций (включая множество путей введения посредством инъекции, таких как внутривенная инъекция, внутримышечная инъекция, подкожная инъекция и внутрикожная инъекция).

В некоторых вариантах осуществления лекарственная форма для респираторного введения выбрана, например, из спреев, аэрозолей, порошковых аэрозолей и т. п.

В некоторых вариантах осуществления лекарственная форма для введения через кожу выбрана из группы, состоящей, например, из растворов, лосьонов, линиментов, мазей, пластырей, паст, повязок и т. п., которые применяются наружно и действуют местно или оказывают системное действие посредством чрескожной абсорбции после введения.

В некоторых вариантах осуществления лекарственная форма для введения через слизистую оболочку выбрана из группы, состоящей, например, из глазных капель, капель для носа, офтальмологических мазей, средств для полоскания рта или горла и подъязычных таблеток и т. п., введение через слизистую оболочку может действовать местно или посредством абсорбции слизистой оболочкой для проявления системного действия. ⑤ Лекарственная форма для полостного введения включает, например, суппозитории, аэрозоли и т. п., используемые для прямой кишки, влагалища, мочеиспускательного канала, носовой полости, слухового прохода и т. п. Полостное введение может действовать локально или оказывать системное действие после абсорбции.

В некоторых вариантах осуществления антиген включает опухолевый, вирусный, бактериальный, грибковый или паразитарный антиген.

В некоторых вариантах осуществления организм является млекопитающим.

В некоторых вариантах осуществления организм является приматом.

В некоторых вариантах осуществления организм является человеком.

В некоторых вариантах осуществления, если антиген представляет собой вирусный, бактериальный, грибковый или паразитарный антиген, лекарственное средство характеризуется количеством, составляющим 1-8 мг на дозу;

В некоторых вариантах осуществления, если антиген представляет собой опухолевый антиген, лекарственное средство характеризуется количеством, составляющим 1-10 мг на дозу.

В соответствии с аспектом настоящего изобретения настоящее изобретение также относится к фармацевтической композиции, содержащей комплексы, описанные выше. Фармацевтическая композиция дополнительно содержит одно или более из лекарственного средства для терапии иммунными клетками, лекарственного средства для терапии антителами, химического лекарственного средства, вещества, которое способствует поглощению иммунологически активных средств слизистой оболочкой или адгезии на слизистой оболочке, иммуномодулятора, антигена патогена, лиганда паттерн-распознающего рецептора и фармацевтически приемлемого вспомогательного вещества.

В некоторых вариантах осуществления фармацевтическая композиция содержит комплекс, описанный выше, и фармацевтическая композиция дополнительно содержит одно или более из лекарственного средства для терапии иммунными клетками, лекарственного средства для терапии антителами, химического лекарственного средства, вещества, которое способствует поглощению иммунологически активных средств слизистой оболочкой или адгезии на слизистой оболочке, иммуномодулятора, антигена патогена, лиганда паттерн-распознающего рецептора и фармацевтически приемлемой соли или вспомогательного вещества.

В некоторых вариантах осуществления лекарственное средство для терапии иммунными клетками представляет собой одно или более из клеток, выбранных из группы, состоящей из лимфоцитов, инфильтрирующих опухоль (TIL), дендритных клеток (DC), цитокин-индуцированных клеток-киллеров (CIK), дендритных клеток и цитокин-индуцированных клеток-киллеров (DC-CIK), естественных клеток-киллеров (NK), γδT-клеток, CD3AK, CAR-T и TCR-T.

В некоторых вариантах осуществления терапевтическое лекарственное средство на основе антитела выбрано из группы, состоящей из антитела к PD1, антитела к PDL1, антитела к CTLA4 и антитела к CD-антигену.

В некоторых вариантах осуществления химическое лекарственное средство представляет собой одно или более из средств, выбранных из группы, состоящей из алкилирующего средства, антиметаболического средства, противоопухолевого антибиотика, противоопухолевого лекарственного средства растительного происхождения, гормонального лекарственного средства и другого лекарственного средства;

Другое лекарственное средство выбрано из группы, состоящей из L-аспарагиназы, цисплатина, карбоплатина, оксалиплатина, дакарбазина, лекарственных средств на основе гексаметилмеламина и производных вышеупомянутых лекарственных средств.

В некоторых вариантах осуществления алкилирующее средство выбрано из группы, состоящей из циклофосфамида, бусульфана, дакарбазина, цисплатина, мехлорэтамина, мелфалана, нитрозомочевин и производных вышеуказанных лекарственных средств;

В некоторых вариантах осуществления антиметаболическое средство выбрано из группы, состоящей из 5-фторурацила, метотрексата, цитарабина, циклоцитидина, гидроксимочевины и производных вышеуказанных лекарственных средств;

В некоторых вариантах осуществления противоопухолевый антибиотик выбран из группы, состоящей из актиномицина, митомицина, идарубицина, доксорубицина, дауномицина, дактиномицина, блеомицина и производных вышеуказанных лекарственных средств;

В некоторых вариантах осуществления гормональное лекарственное средство выбрано из группы, состоящей из полового гормона, кортикостероидного гормона и производных вышеуказанных лекарственных средств.

В некоторых вариантах осуществления вещество, которое способствует поглощению иммунологически активных средств слизистой оболочкой или адгезии на слизистой оболочке, представляет собой одно или более из веществ, выбранных из группы, состоящей из анионных поверхностно-активных веществ (таких как карбоксилаты, сульфонаты, сульфаты, фосфаты и т. п.), катионных поверхностно-активных веществ (таких как соли аминов, четвертичные аммониевые соли, гетероциклы, ониевые соли и т. п.), цвиттер-ионных поверхностно-активных веществ (например, карбоксилатного типа, сульфонатного типа, фосфатного типа, бетаинового типа, имидазолинового типа, аминокислотного типа и т. п), неионных поверхностно-активных веществ (например, алкилполигликозидного типа, полиоксиэтиленового типа, полиолового типа, алканоламидного типа, типа блок-полимера простого полиэфира), специальных поверхностно-активных веществ (таких как фторсодержащего типа, кремнийсодержащего типа, борсодержащего типа, полимерного типа и т. п.), хелатирующих средств (таких как полифосфат, аминокарбоновая кислота, 1,3-дикетон, гидроксикарбоновая кислота, полиамин и т. п.), адгезивных средств [водорастворимые адгезивные средства (такие как крахмал, декстрин, поливиниловый спирт, карбоксиметилцеллюлоза и т. п.), термоплавких адгезивных средств (таких как полиуретан, полистирол, полиакрилат, сополимер этилена и винилацетата и т. п.), адгезивных средств на основе растворителей (таких как шеллак, бутилкаучук и т. п.), эмульсионных адгезивных веществ (таких как винилацетатная смола, акриловая смола, хлорированный каучук и т. п.), жидких адгезивных средств без растворителей (таких как эпоксидная смола и т. п.)], сополимера полимолочной кислоты и гидроксиуксусной кислоты, декстрана и полисахарида.

В некоторых вариантах осуществления иммуномодулятор представляет собой один или более из иммуномодуляторов, выбранных из группы, состоящей из цитокинов, хемокинов, факторов роста стволовых клеток, лимфотоксинов, гемопоэтических факторов, колониестимулирующих факторов (CSF), интерферонов, эритропоэтинов, тромбопоэтинов, факторов некроза опухоли (TNF), интерлейкинов (IL), гранулоцитарных колониестимулирующих факторов (G-CSF), гранулоцитарно-макрофагальных колониестимулирующих факторов (GM-CSF) и факторов роста стволовых клеток.

В некоторых вариантах осуществления антиген патогена выбран из группы, состоящей из опухолевых, вирусных, бактериальных, грибковых или паразитарных антигенов.

В некоторых вариантах осуществления опухоли включают опухоли, возникающие в результате любых поражений кости, соединения костей, мышцы, легкого, трахеи, глотки, носа, сердца, селезенки, артерии, вены, крови, капилляра, лимфатического узла, лимфатического сосуда, лимфатической жидкости, ротовой полости, глотки, пищевода, желудка, двенадцатиперстной кишки, тонкого кишечника, толстой кишки, прямой кишки, анального канала, аппендикса, печени, желчного пузыря, поджелудочной железы, околоушной железы, подъязычной железы, почки, мочеточника, мочевого пузыря, мочеиспускательного канала, яичника, маточной трубы, матки, влагалища, вульвы, мошонки, яичек, семявыносящего протока, полового члена, глаз, ушей, носа, языка, кожи, головного мозга, ствола головного мозга, продолговатого мозга, спинного мозга, спинномозговой жидкости, нервов, щитовидной железы, паращитовидной железы, надпочечника, гипофиза, шишковидной железы, островка поджелудочной железы, тимуса, гонады, подъязычной железы и околоушной железы.

В некоторых вариантах осуществления бактерия включает одно или более из Staphylococcus, Streptococcus, Listeria, Erysipelothrix,Renibacterium, Bacillus, Clostridium, Mycobacterium, Actinomyces, Nocardia, Corynebacterium, Rhodococcus, Bacillus anthracis, erysipelas bacillus, Bacillus tetani, listeria monocytogenes, Bacillus perfringens, Bacillus gangraenae emphysematosae, возбудителя туберкулеза, Escherichia coli, Bacterium proteus, Shigella dysenteriae, Pneumobacillus, Bacterium burgeri, Clostridium perfringens, Haemophilus influenzae, Haemophilus parainfluenzae, Moraxella catarrhalis, Acinetobacter, Yersinia, Legionella pneumophila, Bordetella pertussis, Bordetella parapertussis, Shigella, Pasteurella, Vibrio cholerae и Vibrio parahemolyticus.

В некоторых вариантах осуществления паразит включает одно или более из паразитов пищеварительного тракта (таких как круглые черви, анкилостомы, ленточные черви, endoamoeba histolytica, паразитические жгутиковые и т. п.), внутриполостных паразитов (таких как trichomonas vaginalis), внутрипеченочных паразитов (таких как печеночная двуустка, эхинококк), внутрилегочных паразитов (таких как paragonimus westermani), паразитов ткани головного мозга (таких как Cysticercus cellulosae, toxoplasma gondii), внутрисосудистых паразитов (таких как шистосомоз), паразитов лимфатической системы (таких как филярии), паразитов мышечной ткани (таких как личинки трихинеллы), внутриклеточных паразитов (таких как плазмодий, лейшмания), паразитов костной ткани (таких как эхинококк; кожных паразитов, таких как представители семейства Sarcoptidae, железница) и внутриглазных паразитов (таких как thelazia callipaeda, Cysticerecus cellulosaes).

В некоторых вариантах осуществления вирус включает одно или более из adeniviridae, arenaviridae, astroviridae, bunyaviridae, cliciviridae, flaviviridae, вируса гепатита дельта, hepeviridae, mononegavirales, nidovirales, piconaviridae, orthomyxoviridae, papillomaviridae, parvoviridae, polyomaviridae, poxviridae, reoviridae, retroviridae или togaviridae.

В некоторых вариантах осуществления вирус представляет собой вирус папилломы человека.

В некоторых вариантах осуществления гриб включает одного или более из Coccidioides immitis, Coccidioides posadasii, Histoplasma capsulatum, Histoplasma duboisii, Blastomyces lobo, Paracoccidiodes brasiliensis, Blastomyces dermatitis, Sporothrix schenckii, Penicillium marneffei, Candida albicans, Candida glabrata, Candida tropicalis, Candida lusitaniae, Pneumocystis carinii, Aspergillus, Exophiala jeanselmei, Fonsecaea Pedrosoi, Fonsecaea compacta, Chromomyces verruciformis, Pigmentation dermatitis, Geotrichum candidum, Pseudallescheria boydii, Cryptococcus neoformans, Trichosporon Cutaneum, Rhizopus oryzae, Mucor indicus, Absidia corymbifera, Syncephalastrum racemosum, Basidiobolus ranarum, Conidiobolus coronatus, Conidiobolus incongruus, Enterocytozoon bieneusi, Encephalitozoon intestinalis, Rhinosporidium seeberi, hyalohyphomycet и phaeohyphomycete.

В некоторых вариантах осуществления лиганд паттерн-распознающего рецептора выбран из группы, состоящей из лиганда рецептора TLR, лиганда рецептора RLR, лиганда рецептора CLR и лиганда рецептора NLR.

В некоторых вариантах осуществления связывание лиганда с рецептором TLR включает, например, связывание пептидогликана, дисахарида, маннана, липопептида, гликолипида, атипичного липополисахарида, амилоидного белка сыворотки крови, CPG-ДНК, dsRNA, ssRNA, LPS, PGN, насыщенных жирных кислот, липотейхоевой кислоты, резистина, лактоферрина, поверхностно-активного белка, флагеллина, гиалуроновой кислоты, РНК-связанного антигена, профилин-подобных молекул и т. п.

В некоторых вариантах осуществления связывание лиганда с рецепторами RLR включает связывание, например, РНК, PIC, PICLC, PIC12u и т. п.

В некоторых вариантах осуществления связывание лиганда с рецептором CLR включает связывание, например, маннозы и β-глюкана на поверхности клеточных стенок грибов и т. п.

В некоторых вариантах осуществления связывание лиганда с рецептором NLR включает связывание, например, MDP, Mesϴ DAP и т. п.

В соответствии с аспектом настоящего изобретения настоящее изобретение также относится к способу получения комплекса для потенцирования иммунного ответа, включающему:

приведение в контакт полиинозиновой-полицитидиловой кислоты, по меньшей мере катионного стабилизатора и растворимой соли кальция в жидкой реакционной системе;

при этом катионный стабилизатор представляет собой водорастворимое аминосоединение, отличное от антибиотика, характеризующееся молекулярным весом, составляющим 5 кДа или меньше, или привитой сополимер, образованный из водорастворимого аминосоединения, отличного от антибиотика, и одного или более из метоксиполиэтиленгликоля, полиэтиленгликоля, полиэтиленимина, фолиевой кислоты и галактозы.

В некоторых вариантах осуществления полиинозиновую-полицитидиловую кислоту получают из полицитидиловой кислоты и полиинозиновой кислоты посредством реакции спаривания оснований.

В некоторых вариантах осуществления значения молекулярного веса полицитидиловой кислоты и полиинозиновой кислоты превышают 23000 дальтон.

В некоторых вариантах осуществления молекулярный вес полицитидиловой кислоты находится в диапазоне, составляющем 66000-660000 дальтон.

В некоторых вариантах осуществления молекулярный вес полиинозиновой кислоты находится в диапазоне, составляющем 66000-660000 дальтон.

В некоторых вариантах осуществления реакцию спаривания оснований осуществляют при температуре, составляющей 40-50°C, можно дополнительно выбрать 41°C, 42°C, 43°C, 44°C, 45°C, 46°C, 47°C, 48°C или 49°C.

В некоторых вариантах осуществления реакцию спаривания оснований осуществляют при значении pH, составляющем 6,8-7,6, дополнительно можно выбрать 7,0, 7,2, 7,4.

В некоторых вариантах осуществления перед приведением в контакт полиинозиновую-полицитидиловую кислоту нагревают при 88-92°C в течение 70-120 мин;

В некоторых вариантах осуществления температуру можно дополнительно выбрать из 82°C, 84°C, 86°C, 88°C, 90°C, 92°C, 94°C, 96°C или 98°C.

В некоторых вариантах осуществления время нагревания можно дополнительно выбрать из 80 мин, 90 мин, 100 мин или 110 мин.

В некоторых вариантах осуществления температура жидкой реакционной системы составляет 40-50°C, и можно дополнительно выбрать 41°C, 42°C, 43°C, 44°C, 45°C, 46°C, 47°C, 48°C или 49°C.

В некоторых вариантах осуществления способ получения привитого сополимера включает

сначала активацию одного или нескольких из метоксиполиэтиленгликоля, полиэтиленгликоля, полиэтиленимина, фолиевой кислоты и гaлактозы с применением карбонилдиимидазола, а затем прививание активированного продукта на водорастворимое аминосоединение, отличное от антибиотика, в ионной жидкости [bmim]Cl.

В некоторых вариантах осуществления привитой сополимер представляет собой привитой сополимер олигосахарида хитозана и метоксиполиэтиленгликоля, сначала активирующий метоксиполиэтиленгликоль (MPEG) с помощью карбонилдиимидазола (CDI), а затем прививание активированного MPEG олигосахаридом хитозана (COS) в ионной жидкости [bmim]Cl.

В некоторых вариантах осуществления реакцию прививания осуществляют при 60-80°C в неокислительной атмосфере.

В некоторых вариантах осуществления способ дополнительно включает:

добавление раствора сшивающего средства по каплям к полученному комплексу при перемешивании до проявления эффекта Тиндаля в реакционной системе, а затем перемешивание с получением наночастиц;

сшивающее средство представляет собой по меньшей мере одно сшивающее средство, выбранное из группы, состоящей из триполифосфата натрия, альгината натрия, фенилбороновой кислоты и катехола.

В некоторых вариантах осуществления сшивающее средство содержит антиген (патогена).

В некоторых вариантах осуществления способ дополнительно включает совместную инкубацию комплекса или наночастиц с антигеном.

В некоторых вариантах осуществления антиген представляет собой белковый или полипептидный антиген.

В соответствии с аспектом настоящего изобретения настоящее изобретение также относится к способу стимуляции иммунного ответа на антиген в организме in vivo, регуляции и потенцирования активности иммунных клеток в организме, поддержки организма для снижения утомляемости или облегчения болей в организме, при этом способ включает введение хозяину комплекса, описанного выше, или вакцинной композиции, описанной выше, или фармацевтической композиции, описанной выше.

В некоторых вариантах осуществления хозяин страдает инфекционным заболеванием и ему вводят антигенное соединение для стимуляции иммунного ответа в отношении патогена, вызывающего инфекционное заболевание.

В некоторых вариантах осуществления введение осуществляют путем парентеральной инъекции, внутримышечной инъекции, интраперитонеальной инъекции, внутривенной инъекции, подкожной инъекции, местного введения, трансдермального введения или внутрикожного введения.

В некоторых вариантах осуществления организм является пациентом с опухолью, пациентом с вирусной инфекцией, пациентом с бактериальной инфекцией, пациентом с паразитарной инфекцией или пациентом с ринитом, которому не помогла хирургия, химиотерапия, лучевая терапия или иммунотерапия, или который был оставлен для лечения в медицинских учреждениях.

В некоторых вариантах осуществления способ можно использовать в комбинации с хирургией, лучевой терапией, химиотерапией и различными способами иммунотерапии или также можно использовать в комбинации с традиционными способами терапии пациента с вирусной инфекцией, пациента с бактериальной инфекцией или пациента с паразитарной инфекцией.

В некоторых вариантах осуществления боль вызвана микробной или паразитарной инфекцией, которая вызвана раком или невропатической болью.

В некоторых вариантах осуществления, если антиген представляет собой вирусный, бактериальный, грибковый или паразитарный антиген, лекарственное средство вводят в дозе, составляющей 1-8 мг/кг при каждом введении, или, в качестве альтернативы, предпочтительно вводят один раз в день, один раз в 2 дня, один раз в 3 дня или один раз в 4 дня;

если антиген представляет собой опухолевый антиген, лекарственное средство вводят в дозе, составляющей 1-10 мг/кг при каждом введении, и предпочтительно вводят в течение периода времени, составляющего по меньшей мере 360 дней, по меньшей мере 180 дней, по меньшей мере 60 дней или по меньшей мере 30 дней.

Варианты осуществления настоящего изобретения будут подробно описаны ниже в комбинации с примерами, но специалисты в данной области техники поймут, что следующие примеры предназначены только для иллюстрации настоящего изобретения и не должны рассматриваться как ограничивающие объем настоящего изобретения. Примеры, которые указаны без каких-либо конкретных условий, осуществляются в соответствии с обычными условиями или условиями, рекомендованными изготовителем. Реагенты или инструменты, используемые без указания изготовителя, представляют собой стандартные продукты, являющиеся коммерчески доступными.

Пример 1. Получение Pamica

I. Получение комплекса Pamica

1. Получение раствора PBS (pH 7,2):

1.1 Получение раствора хлорида натрия (0,85%, 1500 мл): 12,75 г хлорида натрия взвешивали, добавляли в мерный цилиндр объемом 2000 мл и доводили объем до 1500 мл посредством введения воды;

1.2 Получение раствора гидрофосфата динатрия (0,006 моль/л, 500 мл): 0,4259 г (0,006×0,5×141,96) гидрофосфата динатрия взвешивали, добавляли в мерную колбу объемом 500 мл и разбавляли до 500 мл 0,85% физиологическим раствором;

1.3 Получение раствора дигидрофосфата натрия (0,006 моль/л, 500 мл): 0,4140 г (0,006×0,5×137,99) дигидрофосфата натрия взвешивали, добавляли в мерную колбу объемом 500 мл и разбавляли до 500 мл 0,85% физиологическим раствором;

1.4 Получение раствора PBS с pH, составляющим 7,2: 273,6 мл «раствора по пункту 1.2» смешивают с 126,4 мл «раствора по п. 1.3».

2. Получение раствора PIC (2,0 мг/мл, 100 мл):

2.1 Взвешивали 114,5 мг (2,0 мг/мл*100мл*【1,04/1,04+1)】/91,5%/(1-2,7%)) PI, добавляли в треугольную колбу объемом 250 мл, растворяли посредством добавления 50 мл раствора PBS и уравновешивали на водяной бане при 40-60°C;

2.2 Взвешивали 113,2 мг (2,0 мг/мл*100 мл*【1/(1,04+1)】/90,4%/(1-4,2%)) PC, добавляли в треугольную колбу объемом 250 мл, растворяли посредством добавления 50 мл раствора PBS и уравновешивали на водяной бане при 40-60°C;

2.3 Получение раствора PIC: 50 мл раствора PI выливали в 50 мл раствора PC и смесь подвергали реакции на водяной бане при 45°C в течение 30 минут.

2.4 Раствор PIC нагревали при 80-99°C в течение 15～300 минут.

3. Получение раствора хлорида кальция (0,16 моль/л, 25 мл):

Взвешивали 0,5881 г CaCl₂.2H₂O (MW: 147,02), добавляли в треугольную колбу объемом 100 мл, растворяли посредством добавления приблизительно 25 мл воды для инъекций и разбавляли до 100 мл.

4. Получение COS-g-MPEG:

Способ получения привитого сополимера COS-g-MPEG заключается в следующем: получали привитой сополимер метоксиполиэтиленгликоля (COS-g-MPEG) с привитым олигосахаридом хитозана и использовали в качестве вспомогательного вещества для получения противоракового лекарственного средства.

Принцип: сочетание карбонилдиимидазола (CDI) используют для получения COS-g-MPEG. Сначала метоксиполиэтиленгликоль (MPEG) активируют карбонилдиимидазолом с получением активированного MPEG, а затем осуществляют реакцию активированного MPEG с олигосахаридом хитозана (COS) в ионной жидкости с синтезом сополимера COS-g-MPEG. Конкретная реакция включает следующие три этапа:

4.1 Получение ионной жидкости, представляющей собой хлоридную соль 1-бутил-3-метилимидазола ([BMIM]Cl)

осуществляют реакцию 1-метилимидазола с хлорбутаном с получением ионной жидкости [BMIM]Cl, и уравнение реакции синтеза выглядит следующим образом:

.

4.2 Активация метоксиполиэтиленгликоля (MPEG, молекулярный вес составляет 1000)

MPEG активируют с помощью CDI, и уравнение реакции синтеза выглядит следующим образом:

4.3 Синтез сополимера COS-g-MPEG;

активированный MPEG прививают и полимеризуют с COS в ионной жидкости, и уравнение реакции синтеза выглядит следующим образом:

4.4 Оборудование и реагенты:

метилимидазол, хлорбутан, толуол, метоксиполиэтиленгликоль, карбонилдиимидазол, безводный простой эфир, молекулярное сито 4A (2-3 мм), диметилсульфоксид, 1,4-диоксан, олигосахарид хитозана, собирающая термостатическая магнитная мешалка с подогревом (типа DF-101S), электронные весы, электротермическая печь для струйного высушивания, вакуумный насос с циркулирующей водой, автоматический дистиллятор для тройной дистилляции чистой воды, печь для вакуумного высушивания, лиофилизатор, сушилка для высушивания стеклянных инструментов воздушным потоком, однофазный конденсаторный пусковой двигатель, роторно-лопастной вакуумный насос, шестиконтурная магнитная мешалка с подогревом, целлюлозный диализный мешок, готовый к использованию диализный мешок с мембраной 45-2000RC, трехгорлая колба (500 мл, 1000 мл), стеклянная пробка, магнитный мешальник, одноразовый бумажный стакан, мерный стакан объемом 500 мл, мерный стакан объемом 2 л, одноразовая пипетка, мерная ложка, сосуд для реагентов, эксикатор и т. п.

4.5 Пути получения:

4.5.1 Получение дистиллированной воды

Дистиллированную воду получали с применением автоматического дистиллятора для тройной дистилляции чистой воды Z-97A три раза.

4.5.2 Мытье стеклянной посуды

трехгорлую колбу, стеклянную пробку, чашку Петри, магнитную мешалку и т. п. сначала промывали водопроводной водой, затем трижды промывали дистиллированной водой и, наконец, высушивали в сушилке для высушивания стеклянных инструментов воздушным потоком.

4.5.3 Высушивание растворителем: в одноразовый мерный стакан устанавливали молекулярное сито с подходящим размером ячеек, затем добавляли подходящее количество диметилсульфоксида, 1,4-диоксана и безводного простого эфира, а также удаляли воду.

4.5.4 Предварительное замораживание безводного простого эфира.

4.6. Операции (указание, на что нужно обратить внимание на каждой стадии):

4.6.1 Получение ионной жидкости

(1) в трехгорлую колбу объемом 500 мл последовательно добавляли 100 г 1-метилимидазола и 148,5 мл хлорбутана. На колбу устанавливали конденсатор и вводили аргон на 30 мин. Раствор перемешивали на магнитной мешалке, затем нагревали до 80°C на масляной бане и подвергали реакции в течение 24 ч;

(2) после завершения реакции колбу вынимали и раствор охлаждали до комнатной температуры, а затем замораживали в холодильнике при -18°C в течение 2 ч. Можно наблюдать расслоение раствора, а затем надосадочную жидкость удаляли (главным образом для удаления хлорбутана);

(3) остаток помещали в печь для струйного высушивания при 80°C и после того, как твердое вещество полностью расплавилось, добавляли подходящее количество толуола, пока он был горячим, и встряхивали для тщательного смешивания толуола с раствором. Смесь затем охлаждали до комнатной температуры, замораживали в холодильнике и затем извлекали, а надосадочную жидкость удаляли (1-метилимидазол и хлорбутан растворяли в толуоле, а толуол, 1-метилимидазол и хлорбутан удаляли);

(4) стадию (3) повторяли два раза для полного удаления непрореагировавшего хлорбутана;

(5) образец помещали в печь для вакуумного высушивания и нагревали до 90°C. После полного расплавления образец высушивали в вакууме при 90°C в течение 8 ч (для удаления толуола), затем извлекали, выдерживали для охлаждения до комнатной температуры и затем помещали в эксикатор для использования.

4.6.2 Активация MPEG

(1) 10 мл диметилсульфоксида и 20 мл 1,4-диоксана добавляли в трехгорлую колбу объемом 500 мл и перемешивали на магнитной мешалке. Добавляли 20 г MPEG и после полного расплавления MPEG добавляли 3,24 г CDI. Смесь нагревали до 37°C на водяной бане и подвергали реакции в течение 18 ч;

(2) после завершения реакции образец добавляли к предварительно охлажденному безводному простому эфиру на ледяной бане при перемешивании на магнитной мешалке и отверстие мерного стакана покрывали консервирующей пленкой, а затем образец помещали в холодильник на 30 мин;

(3) образец извлекали через 30 мин и надосадочную жидкость раствора удаляли. К осадку добавляли предварительно охлажденный безводный простой эфир и перемешивали на магнитной мешалке в течение 30 мин, а затем смесь помещали в холодильник на 30 мин.

(4) Стадию (3) повторяли два раза для полного вымывания непрореагировавшего CDI;

(5) надосадочную жидкость раствора удаляли и остаток помещали в печь для струйного высушивания при 40°C на 6 ч для предварительного удаления простого эфира;

(6) остаток помещали в печь для вакуумного высушивания при 40°C, высушивали в вакууме в течение 2,5 ч для полного удаления простого эфира, затем извлекали, выдерживали для охлаждения до комнатной температуры и затем помещали в эксикатор для использования.

4.6.3 Получение COS-g-MPEG:

(1) ионную жидкость расплавляли в печи для струйного высушивания при 80°C;

(2) 105 г ионной жидкости взвешивали, добавляли в трехгорлую колбу и нагревали до 70°C на масляной бане. Вводили аргон и медленно добавляли 9 г COS. После полного растворения COS добавляли 6 г активированного MPEG и смесь перемешивали на магнитной мешалке. После добавления всех исходных материалов смесь подвергали реакции в течение 6 ч под защитой аргона. После завершения реакции реакционный сосуд охлаждали до комнатной температуры;

(3) сначала диализный мешок зажимали сбоку с помощью зажима и добавляли подходящее количество дистиллированной воды для промывания диализного мешка три раза и проверки диализного мешка на предмет вытекания воды из него. Затем образец из реакционного сосуда помещали в диализный мешок (с отсечкой по молекулярному весу, составляющей 2000) и подвергали диализу в течение 72 часов при количестве дистиллированной воды, достаточном для погружения диализного мешка. Воду обновляли каждые 2-3 часа в первый день, затем каждые 12 часов.

(4) После завершения диализа раствор добавляли в трехгорлую колбу объемом 1000 мл и помещали на водяную баню. Аппарат для вакуумной дистилляции прочно устанавливали и температуру дистилляции постепенно увеличивали от комнатной до 25°C, 30°C, 35°C, 40°C, 45°C, 50°C, 55°C, 60°C. Дистилляцию продолжали до тех пор, пока не оставалось приблизительно 50 мл раствора, затем аппарат для дистилляции убирали. Образец выливали в одноразовый мерный стакан, пока он был горячим. Отверстие мерного стакана покрывали одноразовой перчаткой и образец замораживали в холодильнике в течение не менее 8 часов.

(5) Лиофилизатор предварительно охлаждали в течение 30 минут таким образом, что температура замерзания достигала -52°C. Образец измельчали, распределяли и выравнивали в чашке Петри. Чашку Петри помещали в предварительно охлажденный лиофилизатор и лиофилизировали при -52°C в течение 30 ч. После завершения замораживания лиофилизатор выключали и образец извлекали, взвешивали, помещали в мешок для реагентов и затем хранили в эксикаторе.

(6) Инфракрасный анализ: брали соответствующее количество образца и таблетировали с бромидом калия. Инфракрасный спектр образца измеряли с областью сканирования, составляющей 400-4000 см-1.

5. Получение раствора COS-g-MPEG в PBS:

5.1 5,12%: взвешивали 0,128 г COS-g-MPEG, добавляли в центрифужную пробирку объемом 5 мл, растворяли посредством добавления раствора PBS и разбавляли до 2,5 мл;

5.2 2,56%: 1,2 мл 5,12% раствора + 1,2 мл раствора PBS;

5.3 1,28%: 1,2 мл 2,56% раствора + 1,2 мл раствора PBS;

5.4 0,64%: 1,2 мл 1,28% раствора + 1,2 мл раствора PBS;

5.5 0,32%: 1,2 мл 0,64% раствора + 1,2 мл раствора PBS;

5.6 0,16%: 1,2 мл 0,32% раствора + 1,2 мл раствора PBS;

6. Получение раствора PIC с Pamica, COS-g-MPEG и раствора хлорида кальция:

6.1 1,0 мл раствора PIC помещали на водяную баню при 45°C, по каплям добавляли 1,0 мл раствора 5.1, а затем добавляли 0,005 мл раствора хлорида кальция с достижением его конечной концентрации, составляющей 0,0004 моль/л.

6.2 1,0 мл раствора PIC помещали на водяную баню при 45°C, по каплям добавляли 1,0 мл раствора 5,2, а затем добавляли 0,005 мл раствора хлорида кальция с достижением его конечной концентрации, составляющей 0,0004 моль/л.

6.3 1,0 мл раствора PIC помещали на водяную баню при 45°C, по каплям добавляли 1,0 мл раствора 5,3, а затем добавляли 0,005 мл раствора хлорида кальция с достижением его конечной концентрации, составляющей 0,0004 моль/л.

6.4 1,0 мл раствора PIC помещали на водяную баню при 45°C, по каплям добавляли 1,0 мл раствора 5,4, а затем добавляли 0,005 мл раствора хлорида кальция с достижением его конечной концентрации, составляющей 0,0004 моль/л.

6.5 1,0 мл раствора PIC помещали на водяную баню при 45°C, по каплям добавляли 1,0 мл раствора 5,5, а затем добавляли 0,005 мл раствора хлорида кальция с достижением его конечной концентрации, составляющей 0,0004 моль/л.

6.6 1,0 мл раствора PIC помещали на водяную баню при 45°C, по каплям добавляли 1,0 мл раствора 5,6, а затем добавляли 0,005 мл раствора хлорида кальция с достижением его конечной концентрации, составляющей 0,0004 моль/л.

7. Результаты

MPEG, PEG, PEI и т. п. характеризуются хорошей растворимостью в воде и хорошей совместимостью со многими органическими компонентами. В этом примере с применением, например, MPEG, совместимость значительно повысилась, если привитый сополимер MPEG с катионным стабилизатором (таким как олигосахарид хитозана) получали с PIC. Теоретически совместимость также будет повышаться, если катионный стабилизатор с привитым PEG (и т. п.), такой как хитозан, получают с PIC; после прививания катионного стабилизатора к PEG привитой сополимер как таковой также будет обладать характеристиками PEG.

Результаты теста продемонстрировали, что раствор все еще остается прозрачным при соотношении PIC:COS-g-MPEG, составляющем 1: 25,6 мг, но результаты в отношении гиперхромного эффекта демонстрируют, что большее количество привитых сополимеров не означает получение лучшего результата. Кроме того, образцы в 6.1, 6, 6.3, 6.4, 6.5 и 6.6 оставляли при комнатной температуре после получения 7 мая 2018 года и 14 мая 2018 года было отмечено, что в образце образовался хлопьевидный осадок в 6.6, который невозможно растворить снова. На основании всестороннего рассмотрения соотношение PIC и COS-g-MPEG в составе на основе Pamica ограничено диапазоном, составляющим 1 мг: 6,4 мг.

II. Получение наночастиц на основе Pamica

В соответствии с медицинскими стандартами приобретали триполифосфат натрия (TPP). Комплекс PIC-COS-g-MPEG-CaCl₂ в подходящем соотношении перемешивали с на магнитной мешалке при постоянной температуре с определенной скоростью и по каплям добавляли водные растворы TPP с различными концентрациями. Добавление по каплям немедленно прекращали, если наблюдали явную опалесценцию, и реакцию поддерживали в течение 30 минут. Наночастицы с размером частиц, составляющим менее 1000 нм, получали с помощью самосборки посредством сшивания с применением ионов и получали посредством высокоскоростного центрифугирования. Для определения качества наночастицы верифицировали с помощью различных тестов.

III. Наночастицы на основе полипептидного или белкового антигена

Схема 1: полипептидный или белковый антиген добавляли в ходе образования вышеупомянутых наночастиц: соответствующие компоненты включали в привитой сополимер PEG-COS или матрицу COS и полипептид или белковый антиген входили в содержащую TPP водную фазу и связались. Соответствующие компоненты должны быть связаны при подходящем соотношении и pH при перемешивании с магнитными шариками с образованием комплекса и наночастиц.

Схема 2: полипептидный или белковый антиген инкубировали с вышеупомянутым предварительно образованным комплексом и наночастицами таким образом, что полипептидный или белковый антиген связывался на поверхности комплекса и наночастиц, или полипептидный или белковый антиген смешивали с вышеуказанным комплексом и наночастицами при определенном соотношении. Смесь перемешивали на магнитной мешалке в течение 5 минут, выдерживали при комнатной температуре в течение 1 часа и подвергали ультрацентрифугированию в глицериновом матриксе при 20000 rcf и 4°C в течение 2 часов, после чего получали наночастицы на основе полипептидного или белкового антигена.

Для определения качества комплексы и наночастицы по схеме 1/схеме 2 необходимо верифицировать с помощью различных тестов.

IV. Состав на основе Pamica

Вышеупомянутый комплекс/комплекс, содержащий привитой сополимер/наночастицы на основе комплекса/наночастицы на основе полипептидного или белкового антигена асептически упаковывали в подходящий/отвечающий критериям упаковочный материал с получением различных лекарственных форм, таких как инъекция, спрей или аэрозоль, и получали в виде различных продуктов после верификации с помощью различных тестов продукта для определения качества.

Вышеупомянутый комплекс/комплекс, содержащий привитой сополимер/наночастицы на основе комплекса/наночастицы на основе полипептидного или белкового антигена асептически упаковывали в подходящий/отвечающий критериям упаковочный материал и получали в виде мази.

Пример получения спрея: Pamica получали в соответствии с вышеописанным способом и раствор Pamica помещали в сосуды с пульверизатором. Выявление паттерна спрея медицинского раствора и выявление распределения капель по размерам осуществляли для 20 сосудов с раствором Pamica соответственно.

Паттерны спрея показаны в следующей таблице:

примечание: формы распыления оценивали по соотношению наибольшего диаметра и наименьшего диаметра (чем ближе к 1,0, тем лучше формы спрея).

Распределения капель показаны в следующей таблице:

Пример 2: тест Pamica в комбинации с PEI для повышения растворимости

Получение осуществляли в соответствии со способом получения «Pamica в комбинации с PEG» (т. е. пример 1). После увеличения количества COS в Pamica образовывался осадок, который оказывал влияние на равномерность его введения. После добавления PEI можно избежать образования осадка, и дозу COS увеличивали для дальнейшего усиления его иммунного эффекта.

Эксперимент ясно демонстрирует, что после объединения Pamica с PEI растворимость COS в PIC повышалась с 1,6 мг/мл до 6,4 мг/мл, повышаясь в по меньшей мере 4 раза.

В публикации патента № CN105396130A раскрыты «адъювант на основе PIC-аминосоединения-Cacl₂ и вакцина, содержащая адъювант на основе PIC-аминосоединения-Cacl₂», и раскрыто, что аминосоединение, отличное от антибиотика, необязательно может представлять собой хитозан.

В этом сравнительном примере водорастворимый хитозан (гидрохлорид хитозана, сокращенно CS) использовали для замены олигосахарида хитозана в примере 1 для сравнения эффектов водорастворимого хитозана и олигосахарида хитозана в отношении равномерности введения. Результаты показаны в следующей таблице.

Исследования продемонстрировали, что добавление водорастворимого хитозана приводит к образованию осадка, который невозможно диспергировать посредством встряхивания в ходе получения, что оказывает эффекты на равномерность его введения, в то время как олигосахарид хитозана можно использовать для решения вышеуказанной проблемы. Кроме того, как хитозан, привитый к PEG, так и водорастворимый хитозан необходимо деградировать до олигосахарида хитозана с низким молекулярным весом для легкого усвоения организмом человека, но олигосахарид хитозана может усваиваться напрямую.

Пример 3: нагревание PIC и определение молекулярного веса

Раствор PIC получали в соответствии со способом получения из примера 1, при этом 260 мл раствора PIC разделяли на 13 пробирок в общей сложности с 20 мл/пробирка. 12 пробирок с образцами помещали на водяную баню с постоянной температурой, когда ее температура повышалась до 80-99°C (предпочтительно 90°C). После того, как пробирки помещали на водяную баню, начинали отсчет времени, и одну пробирку извлекали через 10 минут (группа 3), 20 минут (группа 4), 30 минут (группа 5), 40 минут (группа 6), 50 минут ( группа 7), 60 минут (группа 9), 70 минут (группа 10), 80 минут (группа 11), 90 минут (группа 12), 100 минут (группа 13), 110 минут (группа 14) и 120 минут (группа 15) соответственно. Образец в группе 2 не нагревают.

Комплекс, полученный с помощью PIC (Pamica), и вакцина на его основе, нагретые в течение 70-120 минут (предпочтительно, нагретые в течение 120 минут), могут пройти выявление аномальной токсичности на мышах и морских свинках в соответствии с «Испытанием на аномальную токсичность 1141» из 4-го тома ФАРМАКОПЕИ КИТАЙСКОЙ НАРОДНОЙ РЕСПУБЛИКИ 2015 года. PIC, применяемый для получения Pamica, необходимо нагревать до 90°C в течение по меньшей мере 70 минут, предпочтительно до 90°C в течение 120 минут до его применения для получения продукта. Выбранные комплексы, полученные с помощью PIC без нагревания (группа 2), и полученные посредством нагревания в течение 60 минут (группа 9), а также вакцины на их основе не могут пройти выявление аномальной токсичности на морских свинках. Результаты показаны на фиг. 2. Сравнительная группа 1 снизу вверх: 100 п. о., 300 п. о., 500 п. о., 750 п. о., 1000 п. о., 1500 п. о., 2000 п. о., 3000 п. о., 5000 п. о. Сравнительная группа 8 снизу вверх: 100 п. о., 200 п. о., 300 п. о., 400 п. о., 500 п. о., 600 п. о., 700 п. о., 800 п. о., 900 п. о., 1000 п. о.

Пример 4: тест комплекса Pamica с ферментативной деградацией

Способ: комплекс Pamica получали в соответствии со способом получения из примера 1 по настоящему изобретению. После завершения получения соответствующие образцы комплекса Pamica и полиинозиновой-полицитидиловой кислоты для инъекций (полиинозиновая-полицитидиловая кислота-канамицин-хлорид кальция) разбавляли до 0,04 мг/мл соответственно. В каждую из 13 пробирок (по 10 мл) добавляли 5 мл разбавителя для образцов, затем добавляли 25 мкг РНКазы (№ по кат. R4642) от Sigma в каждую пробирку. Пробирки помещали на водяную баню при 37°C. 1 пробирку извлекали каждые 5 минут для измерения значения OD при 248 нм и строили кривую.

Результат показан на фиг. 3.

Пример 5: комплекс Pamica по настоящему изобретению представляет собой комплекс с новой структурой

(1) Определение пика кривой плавления

Способ: соответствующие образцы комплекса Pamica и полиинозиновой-полицитидиловой кислоты для инъекций по настоящему изобретению разбавляли до 0,04 мг/мл, затем переносили в сосуды для реагентов объемом 250 мл. Сосуды для реактивов помещали на водяную баню и водяную баню постоянно нагревали. Через каждые 5°C отбирали 3 мл соответствующих образцов и помещали в кварцевую кювету. Измеряли значение OD при 248 нм и строили кривую.

Результат показан на фиг. 4.

Результат теста показывает, что комплекс Pamica (PIC-катионный стабилизатор-хлорид кальция) по настоящему изобретению имеет пик кривой плавления при 85°C, и полиинозиновая-полицитидиловая кислота (PIC-канамицин-хлорид кальция) для инъекций имеет пик кривой плавления при 80°C, что указывает на то, что комплекс Pamica по настоящему изобретению представляет собой новый комплекс.

(2) Сканирование пика поглощения

Раствор PI, раствор PC, раствор PIC, раствор PIC-COS, растворы PIC-COS-CaCl₂ получали в соответствии со способом получения из примера 1 соответственно. Вышеуказанные образцы разбавляли до 0,04 мг/мл буфером PBS и измеряли спектр поглощения при сканировании отдельно с помощью ультрафиолета. На фиг. 5 показано, что пики, появляющиеся при 240-260 нм, от высокого к низкому, представляют собой PI, PC, PIC, PIC-COS, PIC-COS-CaCl₂, из этих пиков пики PIC-COS и PIC-COS-CaCl₂ перекрывались, что демонстрирует, что комплекс Pamica (PIC-COS-CaCl₂) по настоящему изобретению представляет собой комплекс с новой структурой.

Пример 6: отдельные наночастицы, образованные с помощью PIC, COS и хлорида кальция.

Pamica получали в соответствии со способом из примера 1, где COS выбирали в качестве катионного стабилизатора, а хлорид кальция выбирали в качестве катиона металла. На микрофотографиях, полученных с помощью трансмиссионного электронного микроскопа, можно видеть (фиг. 6 и фиг. 7), что наночастицы образовались в растворе Pamica. Большинство наночастиц имеют сферическую форму и относительно однородны, с размером частиц, составляющим приблизительно 50 нм, и некоторые наночастицы имеют квадратную форму со значениями длины сторон, превышающими 100 нм.

Пример 7: отдельные наночастицы, образованные с помощью PIC, COS-g-MPEG и хлорида кальция

Pamica получали в соответствии со способом из примера 1, где COS-g-MPEG выбирали в качестве катионного стабилизатора, а хлорид кальция выбирали в качестве катиона металла. На микрофотографиях, полученных с помощью трансмиссионного электронного микроскопа, можно видеть (фиг. 8 и фиг. 9), что в растворе Pamica образовались наночастицы, большинство из которых имеют квадратную форму со значениями длин сторон, превышающими 100 нм, и некоторые имеют сферическую форму.

Пример 8: отдельные наночастицы, образованные с помощью PIC, COS, TPP и хлорида кальция

COS растворяли в фосфатном буферном растворе и раствор PIC в TPP получали в соответствии со способом из примера 1. Раствор PIC в TPP медленно по каплям добавляли в раствор COS при перемешивании, а затем по каплям добавляли раствор хлорида кальция. На микрофотографиях, полученных с помощью трансмиссионного электронного микроскопа, можно видеть (фиг. 10, фиг. 11), что образованные наночастицы являются веретеновидными.

В примерах 5-8 можно обнаружить, что раствор комплекса Pamica одновременно содержит два состояния веществ, одно из которых представляет собой наночастицы (результаты электронной микроскопии), а другое представляет собой раствор без наночастиц (результат электрофореза из примера 3).

Преимущество наночастиц состоит в том, что они способны напрямую проникать через клеточную мембрану без эндоцитоза, проникать в клетку и действовать быстро; раствор без наночастиц может попасть в клетку только посредством эндоцитоза и действовать медленнее, чем наночастицы. Pamica может оказывать свое действие двумя способами: эндоцитозом и прямым проникновением в клетки. Кроме того, что более важно, наночастицы характеризуются структурой, которая может защищать Pamica от деградации PIC рибонуклеазой в сыворотке крови приматов и более продвинутых животных, чем приматы, включая человека, для достижения прорыва в противовирусных и противоопухолевых средствах, и обладают более сильными эффектами. Эти эффекты позволяют Pamica оказывать выдающееся противораковое действие у людей и мышей.

Экспериментальный пример: оценка иммунного эффекта комплекса Pamica

В следующих экспериментальных примерах Pamica относится к раствору Pamica в PIC, COS и раствору хлорида кальция, полученным в соответствии с примером 1, если не указано иное.

Экспериментальный пример 1: оценка иммунного эффекта комплекса Pamica на рекомбинантную вакцину против гепатита B [rHBsAg (CHO)]

Материалы: rHBsAg (CHO): 20 мкг/мл; адъювант на основе Pamica: 1 мг/мл; адъювант на основе ADV20: 400 мкг/мл; адъювант на основе гидроксида алюминия: 10 мг/мл; физиологический раствор.

Алюминиевый адъювант/rHBsAg (CHO): 0,07 мл алюминиевого адъюванта + 0,5 мл rHBsAg (CHO) + 0,43 мл физиологического раствора

ADV20 (цитокиновый адъювант)/rHBsAg (CHO): 0,25 мл ADV20 + 0,5 мл rHBsAg (CHO) + 0,25 мл физиологического раствора

адъювант на основе Pamica/rHBsAg (CHO): 0,5 мл адъюванта на основе Pamica + 0,5 мл rHBsAg (CHO)

способ: мышей иммунизировали внутримышечно с помощью 0,1 мл алюминиевого адъюванта/rHBsAg (CHO), ADV20 (цитокиновый адъювант)/rHBsAg (CHO), Pamica/rHBsAg (CHO) в день 0 и в день 14 соответственно, и выявляли у них клеточный иммунитет и гуморальный иммунитет в день 21.

Результаты: комплекс Pamica по настоящему изобретению обладает выдающимся иммунным эффектом; в частности, иммунитет, опосредованный антителами, согласно ELISA, и клеточный иммунитет значительно улучшаются, что значительно лучше данных показателей для алюминиевого адъюванта и ADV20 (цитокиновый адъювант). Pamica является перспективным иммунным адъювантом, см. фиг. 12 и фиг. 13 для получения подробной информации.

Экспериментальный пример 2: оценка иммунных эффектов комплекса Pamica и инактивированного антигена на основе Bacterium burgeri

Способ: мышей иммунизировали с помощью PBS, полиинозиновой-полицитидиловой кислоты для инъекций + инактивированный антиген Bacterium burgeri, комплекса Pamica по настоящему изобретению + инактивированный антиген Bacterium burgeri соответственно, иммунизировали один раз в день 0 и мышей подвергали воздействию вирулентного штамма Brucella после иммунизации в течение 45 дней. После заражения в течение 15 дней мышей умерщвляли для выделения селезенок мышей и культивировали Bacterium burgeri в селезенке в течение 3 дней, подсчитывали и затем оценивали эффективность защиты комплекса Pamica по настоящему изобретению + инактивированный антиген Bacterium burgeri.

Результаты: комплекс Pamica по настоящему изобретению обладает выдающимся иммунными эффектами и перспективен для разработки инактивированных антигенов Bacterium burgeri. Количество выделенных бактерий с применением комплекса Pamica по настоящему изобретению + инактивированный антиген Bacterium burgeri отличается на 3,03 log от количества, определенного с применением группы интактного контроля, и отличается на 1,35 от количества, определенного с применением полиинозиновой-полицитидиловой кислоты для инъекций + инактивированный антиген Bacterium burgeri. Комплекс Pamica и инактивированная Bacterium burgeri обладают выдающимся защитным действием.

Экспериментальный пример 3: применение комплекса Pamica и антигена MYO (человеческий миоглобин) для получения антител

Материалы: Антиген MYO (человеческий миоглобин) с концентрацией, составляющей 1 мг/мл

Комплекс Pamica по настоящему изобретению с концентрацией, составляющей 1 мг/мл

Полный адъювант Фрейнда (CFA, Sigma)

Способ: у кроликов массой 2,3-2,5 кг собирали кровь для отрицательного контроля и отделяли сыворотку крови в качестве контроля перед иммунизацией. После подкожной инъекции различных образцов в несколько мест брюшка и спины сыворотку крови отделяли для выявления антител. Антиген + адъювант получали в количестве, составляющем 0,5 мл + 0,5 мл, и дозировка при каждой иммунизации составляла 1 мл.

Результаты:

(1) кроликов иммунизировали с помощью комплекса Pamica по настоящему изобретению + антиген MYO, полного адъюванта Фрейнда + антиген MYO один раз в 7 дней. Полный адъювант Фрейнда добавляли для иммунизации 2 раза (10 дней) при титре антител, определенном с помощью ELTSA, составляющем 13000; полный адъювант Фрейнда добавляли для иммунизации 3 раза (18 дней) при титре антител, определенном с помощью ELTSA, составляющем 39000, полный адъювант Фрейнда добавляли для иммунизации 6 раз (3 месяца) при титре антител, определенном с помощью ELTSA, составляющем 25000; комплекс Pamica по настоящему изобретению добавляли для иммунизации 2 раза(10 дней) при титре антител, определенном с помощью ELTSA, составляющем 45000, для иммунизации 3 раза (18 дней) при титре антител, определенном с помощью ELTSA, составляющем 51000, и для иммунизации 3 раза (3 месяца) при титре антител, определенном с помощью ELTSA, составляющем 36000. Адъювант Pamica характеризуется относительно высоким значением титра антител с антигеном MYO на ранней стадии и лучшей продолжительностью иммунизации, что указывает на то, что комплекс Pamica по настоящему изобретению значительно лучше, чем полный адъювант Фрейнда в качестве общепринятого стандарта иммунного адъюванта с антигеном MYO, см. фиг. 14 для получения подробной информации.

(2) кроликов иммунизировали в отношении антигена MYO с помощью комплекса Pamica по настоящему изобретению в комбинации с полным адъювантом Фрейнда два раза (один раз иммунизировали в день 0, один раз иммунизировали в день 14), титр антител, определенный с помощью ELISA (через 35 дней после иммунизации), составляет 10000 при использовании полного адъюванта Фрейнда, 60000 при использовании комплекса Pamica по настоящему изобретению и 160000 при использовании комплекса Pamica по настоящему изобретению + полный адъювант Фрейнда (фиг. 15).

Наборы получали с антителами, полученными посредством иммунизации кроликов с помощью полного адъюванта Фрейнда + антиген, адъюванта Pamica + полный адъювант Фрейнда + антиген и адъюванта Pamica + антиген соответственно. После клинической верификации антитела, продуцируемые группой с полным адъювантом Фрейнда или группой с полным адъювантом Фрейнда + антиген с адъювантом на основе Pamica, не соответствуют клиническим образцам и не могут пройти клиническое испытание. Только антитела, продуцируемые с адъювантом Pamica + антиген, могут пройти клиническое испытание, что полностью разрушит монополию голландской компании Dako на поставку исходных материалов на основе антител, используемых в наборе для латекс-теста для определения мутности человеческого миоглобина, и решит серьезную проблему с обычно низкими иммунными титрами, недостаточным разнообразием эпитопов и неэффективным выявлением клинических образцов при использовании полного адъюванта Фрейнда для продуктов отечественного производства.

Наборы, полученные с применением антител, полученных с использованием адъюванта Pamica + группа антигенов, и клинически используемые наборы, полученные с применением антител, предоставленных голландской компанией Dako, сравниваются в следующей таблице.

Экспериментальный пример 4: оценка в NIH эффективности комплекса Pamica в отношении антигена антирабической вакцины

Название: Оценка эффективности в NIH комплекса Pamica по настоящему изобретению в отношении антигена антирабической вакцины

Способ: мышей иммунизировали с помощью комплекса Pamica по настоящему изобретению (1 мг/мл) + антиген, полиинозиновой-полицитидиловой кислоты для инъекций (1 мг/мл) + антиген, PBS + антиген и антигена в день 0 при заражении в день 14, и активность определяли через 28 дней.

Результаты: см. таблицу ниже.

Результаты демонстрируют, что:

a. защитное действие комплекса Pamica по настоящему изобретению + антиген антирабической вакцины из штамма CTN в 3,6 раза выше, чем в случае антигена антирабической вакцины только из штамма CTN, и антиген сохраняется на 1/5;

b. защитное действие комплекса Pamica по настоящему изобретению + антиген антирабической вакцины из штамма CTN в 1,8 раза выше, чем в случае полиинозиновой-полицитидиловой кислоты для инъекций + антиген антирабической вакцины из штамма CTN, и является выдающимся.

Экспериментальный пример 5: комплекс Pamica индуцирует продуцирование нескольких цитокинов у мышей.

Способ: мышей иммунизировали с помощью комплекса Pamica по настоящему изобретению и полиинозиновой-полицитидиловой кислоты для инъекций. Глазные яблоки мышей удаляли через 1 час, 2 часа и 5 часов после иммунизации и кровь собирали в стерильную центрифужную пробирку объемом 2 мл. Центрифужную пробирку выдерживали при комнатной температуре в течение 30 минут, центрифугировали при 3500 об/мин в течение 5 минут. Надосадочную жидкость переносили в новую центрифужную пробирку и замораживали сыворотку крови при -20°C.

Результаты: выходы цитокина TNF-α и IFN-γ, индуцированных комплексом Pamica по настоящему изобретению, очевидно, превосходят таковые для полиинозиновой-полицитидиловой кислоты для инъекций. Все полученные данные представляют собой геометрические средние значения, а конкретные результаты показаны в следующей таблице.

Краткое описание: TNF-α способен уничтожать и подавлять опухолевые клетки, способствовать фагоцитозу нейтрофилов, обеспечивать устойчивость к инфекции, и представляет собой тип цитокина, который способен непосредственно вызывать гибель опухолевых клеток; IFN-γ способен индуцировать устойчивость клеток к вирусной инфекции и, препятствуя транскрипции вирусных генов или трансляции вирусных белковых компонентов, IFN-γ способен предотвращать или ограничивать вирусные инфекции и в настоящее время является наиболее важным цитокином против вирусной инфекции и противоопухолевым цитокином.

Уровни продуцируемых цитокинов TNF-α и IFN-γ, индуцированные с помощью Pamica у мышей, выше, чем уровни, индуцированные полиинозиновой-полицитидиловой кислотой для инъекций, что указывает на то, что продуцируемые TNF-α и IFN-γ, индуцированные комплексом Pamica по настоящему изобретению, характеризуются более мощной способностью к синергетическому уничтожению опухолевых клеток и противодействию инфекциям.

Экспериментальный пример 6: испытание на аномальную токсичность

1. Тест комплекса Pamica по настоящему изобретению на мышах:

1.1 Тест:

Инъекция образца: Здоровым мышам SPF из Куньмин весом 18～22 г путем интраперитонеальной инъекции вводили при 0,5 мл/мышь и 5 мышей/образец, и в то же время 5 здоровых мышей в качестве интактных контролей взвешивали, значения веса составляли 18～22 г.

1.2 Критерии:

Каждой мыши интраперитонеально вводят 0,5 мл тестируемого вещества и наблюдают в течение 7 дней. В ходе наблюдения все мыши должны выжить без аномальных реакций. По истечении времени каждая мышь должна набрать вес, и тогда тестируемое вещество считается соответствующим требованиям. Если вышеуказанные требования не выполняются, для одного повторного теста можно использовать 10 мышей, при этом критерии идентичны тем, что указаны выше (ip. является сокращением от интраперитонеальной инъекции).

1.3. Результаты

2 Тест комплекса Pamica по настоящему изобретению на морских свинках:

2.1 Тест:

Инъекция образца: Здоровым морским свинкам Hartely SPF-класса весом 250～350 г интраперитонеально вводили при 5 мл/морская свинка и 2 морские свинки/образец, и в то же время 2 здоровых морских свинок в качестве интактного контроля взвешивали, значения веса составляли 250-350 г.

2.2 Критерии:

Каждой морской свинке интраперитонеально вводят 5 мл тестируемого вещества и наблюдают в течение 7 дней. В ходе наблюдения все морские свинки должны выжить без аномальных реакций. По истечении времени каждая морская свинка должна набрать вес, и тогда тестируемое вещество считается соответствующим требованиям. Если вышеуказанные требования не выполняются, для одного повторного теста можно использовать 4 морских свинок, при этом критерии идентичны тем, что указаны выше.

2.3. Результаты теста:

Примечание: при повторном тесте все еще не соответствовал требованиям.

3 Тест комплекса Pamica по настоящему изобретению + очищенный антиген антирабической вакцины на морских свинках:

3.1 Тест:

Инъекция образца: Здоровым морским свинкам Hartely SPF-класса весом 250～350 г интраперитонеально вводили при 5 мл/морская свинка и 2 морские свинки/образец, и в то же время 2 здоровых морских свинок в качестве интактного контроля взвешивали, значения веса составляли 250～350 г.

3.2 Критерии:

Каждой морской свинке интраперитонеально вводят 5 мл тестируемого вещества и наблюдают в течение 7 дней. В ходе наблюдения все морские свинки должны выжить без аномальных реакций. По истечении времени каждая морская свинка должна набрать вес, и тогда тестируемое вещество считается соответствующим требованиям. Если вышеуказанные требования не выполняются, для одного повторного теста можно использовать 4 морских свинок, при этом критерии идентичны тем, что указаны выше.

3.3. Результаты теста:

Примечание: 1) при повторном тесте все еще не соответствовал требованиям;

2) очищенный антиген антирабической вакцины: клетка: клетка Vero; штамм вируса: штамм CTN (без ограничения только клетками Vero и штаммом вируса CTN).

4 Тест комплекса Pamica по настоящему изобретению + антиген вакцины против гепатита B на морских свинках:

4.1 Тест:

Инъекция образца: Здоровым морским свинкам Hartely SPF-класса весом 250～350 г интраперитонеально вводили при 5 мл/морская свинка и 2 морские свинки/образец, и в то же время 2 здоровых морских свинок в качестве интактного контроля взвешивали, значения веса составляли 250～350 г.

4.2 Критерии:

Каждой морской свинке интраперитонеально вводят 5 мл тестируемого вещества и наблюдают в течение 7 дней. В ходе наблюдения все морские свинки должны выжить без аномальных реакций. По истечении времени каждая морская свинка должна набрать вес, и тогда тестируемое вещество считается соответствующим требованиям. Если вышеуказанные требования не выполняются, для одного повторного теста можно использовать 4 морских свинок, при этом критерии идентичны тем, что указаны выше.

4.3. Результаты теста:

Примечание: 1) при повторном тесте все еще не соответствовал требованиям;

2) антиген вакцины против гепатита B: экспрессировали в клетках дрожжей (не предназначено для ограничения при экспрессии в клетках дрожжей, и рекомбинантные сконструированные клетки CHO можно также использовать для экспрессии антигена вируса гепатита B).

Краткое описание и анализ:

PIC (двухцепочечная нуклеиновая кислота) раскручивается после нагревания при определенной температуре, и две одиночные цепи спариваются посредством водородных связей, при этом температура медленно снижается для восстановления двойной цепи. Нагревание может снизить молекулярный вес PIC и снизить ее токсичность. Если PIC не подвергают нагреванию или получают без нагревания в течение достаточного времени, комплекс, полученный с помощью этого способа, сам по себе является очень токсичным, и вакцина, полученная с использованием этого комплекса, также очень токсична, что затрудняет применение.

Экспериментальный пример 7: применение комплекса Pamica у некоторых пациентов с раком на поздней стадии и для лечения инфекции.

Из многих случаев рака на поздней стадии можно видеть, что продукт по настоящему изобретению можно вводить с помощью назального спрея в дополнение к введению путем инъекции, и он обладает значительным эффектом в отношении метастатического рака.

(1) Хороший уровень безопасности, отсутствие явных побочных эффектов; иммунный состав на основе Pamica не является цитотоксическим лекарственным средством;

(2) меньшие побочные эффекты лучевой терапии и химиотерапии: увеличиваются количество белых клеток крови и содержание белка в сыворотке крови;

(3) значительные клинические эффекты: облегчение боли, повышение аппетита, увеличение физической силы, изменение психического состояния от пессимизма к оптимизму, уверенность, повышение общей выживаемости на несколько месяцев, а в некоторых случаях на 13 месяцев;

(4) в значительной степени уменьшен размер метастатического рака, в некоторых случаях на 1/3-1/2.

Тестовый пример 8: Тесты стабильности

После завершения получения комплексов Pamica по настоящему изобретению их хранили в помещении в темноте, а образцы тестировали каждые 6 месяцев

Результаты: образцы хранили при комнатной температуре (комнатная температура с августа по сентябрь в Пекине составляла более 30 градусов) в течение 6 месяцев и тестируемые показатели продуктов существенно не изменились, что указывает на то, что продукты были относительно стабильными; Pamica, полученная при 1 мг/мл, может стабилизироваться в течение по меньшей мере 12 месяцев; Pamica, полученная при 3 мг/мл, может стабилизироваться в течение по меньшей мере 9 месяцев. Значение pH продуктов относительно стабильно и существенно не меняется в течение 3 лет. Уровень бактериального эндотоксина в Pamica по настоящему изобретению составляет менее 10 ЕЭ/мл, в то время как уровень бактериального эндотоксина в полиинозиновой-полицитидиловой кислоте для инъекций превышает 100 ЕЭ/мл. Так как это общепринятая технология в данной области техники, бактериальный эндотоксин является компонентом клеточной стенки грамотрицательных бактерий, бактерии будут выделять эндотоксины после гибели или автолиза. Таким образом, бактериальный эндотоксин широко распространен в природе. Например, эндотоксин, содержащийся в водопроводной воде, характеризуется количеством, составляющим 1-100 ЕЭ/мл. Если бактериальный эндотоксин попадает в организм человека через пищеварительный тракт, он безвреден, но если эндотоксин попадает в кровь путем инъекции или другими путями, он способен вызывать различные заболевания. После попадания небольшого количества эндотоксина в кровь он инактивируется купферовскими клетками печени и является безвредным для организма человека. Попадание большого количества эндотоксина в кровь вызывает реакцию лихорадки, т. е. «пирогенную реакцию». Следовательно, такие составы, как биологические продукты, лекарственные препараты для введения путем инъекции, химические вещества, радиофармацевтические средства, антибиотики, вакцины, диализат и т. п., а также медицинское оборудование (например, одноразовые шприцы, имплантируемые биологические материалы) должны пройти верификацию посредством теста в отношении бактериального эндотоксина для определения качества перед использованием.

Экспериментальный пример 9: определение способности Pamica к стимуляции фагоцитарной функции макрофагов

Расположение: Институт фармакологии, Китайская Академия медицинских наук

Способ: сбор макрофагов: 6 мышей Куньмин SPF-класса весом 20-25 г произвольным образом разделили на 2 группы, по 3 мыши в каждой группе. Мышей иммунизировали с помощью Pamica и PBS в день 0, каждой мыши закапывали в нос 200 мкл. Через 2 часа каждой мыши путем инъекции вводили 5,0% красных клеток крови цыпленка в 0,85% суспензии физиологического раствора. Через 4 часа по 3 мыши в каждой группе умерщвляли посредством дислокации шейных позвонков. После дезинфекции осуществляли надрез на коже и вводили буфер Хенкса путем перитонеальной инъекции в дозе, составляющей 2,5 мл/мышь, и брюшко мыши осторожно растирали для полного смывания буфером Хенкса макрофагов в брюшной полости. Затем в середине брюшины вырезали небольшое отверстие и приблизительно 2 мл жидкости из брюшной полости удаляли с помощью пипетки объемом 5 мл и помещали в тестовую пробирку.

Предметное стекло с каплями: жидкость для промывания брюшины в асептических условиях удаляли из тестовой пробирки и помещали капли на предметное стекло. Предметное стекло с каплями помещали горизонтально на влажную марлю. Предметное стекло инкубировали в инкубаторе с постоянной температурой при 37°C в течение получаса и в это время; большое количество макрофагов прилипло к предметному стеклу. Красные клетки крови цыпленка и клетки других тканей на предметном стекле, которые не подверглись фагоцитозу, смывали 0,85% физиологическим раствором, затем предметное стекло высушивали на холодном воздухе.

Фиксация и окрашивание образцов: образцы фиксировали метанолом в течение 5 минут и окрашивали окрашивающим раствором по Гимзе-Райту. Окрашивание осуществляли в соответствии со способом окрашивания по Гимзе и pH используемого буфера PBS доводили до 6,5. Образцы наблюдали и рассчитывали с помощью линзы для масляной иммерсии после высушивания на холодном воздухе.

Процент фагоцитоза: общее количество макрофагов, фагоцитирующих красные клетки крови ÷ общее количество макрофагов × 100%.

Индекс фагоцитоза: общее количество красных клеток крови, фагоцитируемых макрофагами ÷ общее количество макрофагов, фагоцитирующих красные клетки крови × 100% (100 макрофагов наблюдали с помощью линзы для масляной иммерсии и значение, которое получают посредством подсчета количеств красных клеток крови, фагоцитируемых каждым макрофагом, суммируют числа и делят полученную сумму на 100, и получают значение индекса фагоцитоза).

Результаты: в контрольной группе с PBS процент фагоцитоза составляет 12%, и индекс фагоцитоза составлял 0,11; и в группе с Pamica процент фагоцитоза составляет 66%, и индекс фагоцитоза составляет 1,2, что указывает на то, что Pamica оказывает сильное стимулирующее действие на фагоцитарную функцию макрофагов. На фиг. 16 показано, что красные клетки крови фагоцитируются макрофагами, и на фиг. 17 показано, что красные клетки крови не фагоцитируются макрофагами синего цвета (показано стрелками).

Экспериментальный пример 10: тест в отношении защитных свойств иммунного состава Pamica для слизистой оболочки в виде назальных капель отдельно против гриппа на мышах

Вирус гриппа: адаптивный к легким мышей штамм FM1 вируса гриппа подтипа A, приобретенный в Институте предупреждения и контроля вирусных заболеваний Китайской Академии профилактической медицины.

Рибавирин: лекарственное средство для положительного контроля, приобретен на фармацевтической фабрике Shenyang Yanfeng.

Мыши: Мыши Куньмин, мышей весом 8～10 г использовали для пассирования вируса FM1, а мышей весом 14～20 г использовали для последующих формализованных экспериментов.

Фатальную пневмонию можно вызвать посредством назального закапывания суспензии адаптивного к легким мышей штамма FM1 вируса гриппа при 5 LD₅₀/мышь. В тесте мышей сначала инфицировали, а затем осуществляли введение. Тест осуществляли в группах в соответствии со следующей таблицей.

Результаты эксперимента демонстрируют, что в тесте защитных свойств на мышах назальные капли по настоящему изобретению посредством иммунного пути введения через слизистую оболочку обладают лучшим неспецифическим противогриппозным действием, чем рибавирин, который является признанным противовирусным лекарственным средством и обладает значительным противогриппозным эффектом, продемонстрированным с помощью статистического анализа.

Экспериментальный пример 11: эффекты иммунного состава для слизистой оболочки Pamica (назальные капли) в комбинации с вакциной против гриппа посредством иммунизации через слизистую оболочку носа и подкожной инъекции для иммунизации в отношении гуморального антитела IgA и титр вируса гриппа при репродукции по сравнению с полным адъювантом Фрейнда

Схема эксперимента заключается в следующем:

Вирус гриппа: адаптивный к легким мышей штамм FM1 вируса гриппа, приобретенный в Институте предупреждения и контроля вирусных заболеваний Китайской Академии профилактической медицины.

Вакцина против гриппа: сплит-вакцина против вируса гриппа, приобретенная в Hualan Biological Products Co., Ltd.

Полный адъювант Фрейнда: Shanghai Via-geneprobio Technologies Co. Ltd.

Иммунный адъювант для слизистой оболочки по настоящему изобретению: от Xinfu (Пекин) Medical Technology Co., Ltd.

Мышь: Мыши Куньмин, мышей весом 8～10 г использовали для пассирования вируса FM1, а мышей весом 14～20 г использовали для последующих формализованных экспериментов.

Вакцина против гриппа с полным адъювантом Фрейнда: в центрифужную пробирку добавляли вакцину и полный адъювант Фрейнда в одном и том же объеме, гомогенно перемешивали на встряхивателе с образованием эмульсии типа вода в масле.

Назальные капли в комбинации с вакциной против гриппа по настоящему изобретению: вакцину против гриппа и иммунный адъювант для слизистой оболочки по настоящему изобретению смешивали в равных количествах с образованием водного растворителя.

Вакцина против гриппа: Вакцину против гриппа смешивали с PBS в равных количествах с образованием водного растворителя.

Способ иммунизации:

Иммунизация путем подкожной инъекции: мышам путем подкожной инъекции вводили в день 0 и день 28 в дозе, составляющей 0,1 мл/мышь, на 42-й день у некоторых мышей отбирали кровь и отделяли сыворотку крови для определения титра антител. Других мышей инфицировали суспензией с адаптивным к легким мышей штаммом FM1 вируса гриппа при 5 LD₅₀/назальная капельница. На 5-й день после заражения определяли титр вируса в легочной ткани.

Назальная иммунизация: мышей иммунизировали в дозе, составляющей 0,1 мл/мышь, с помощью назальной капельницы в день 0 и день 28. На 42-й день у некоторых мышей отбирали кровь и отделяли сыворотку крови для определения титра антител. Других мышей инфицировали суспензией с адаптивным к легким мышей штаммом FM1 вируса гриппа при 5 LD₅₀/назальная капельница. На 5-й день после заражения определяли титр вируса в легочной ткани.

Результаты эксперимента для каждой группы показаны в следующей таблице:

Тест противогриппозной активности иммунного состава для слизистой оболочки в комбинации с вакциной против гриппа с помощью назальной капельницы

Полный адъювант Фрейнда является общепринятым стандартом для тестирования стимуляции клеточного иммунитета организма. Результаты теста демонстрируют, что иммунизация путем подкожного введения иммунного состава для слизистой оболочки по настоящему изобретению в комбинации с вакциной против гриппа позволяет продуцировать антитела в количестве, которое в 10 раз меньше, чем в случае вакцины против гриппа с полным адъювантом Фрейнда, но снижает титр вируса гриппа в 31,6 раза по сравнению с вакциной против вируса гриппа с полным адъювантом Фрейнда; в частности, назальная иммунизация через слизистую оболочку у мышей демонстрирует, что назальные капли иммунного состава для слизистой оболочки по настоящему изобретению в комбинации с антигеном обеспечивают продуцирование антител в 31,6 раза выше, чем в случае простой вакцины против гриппа, и снижают титр вируса гриппа более чем в 3100 раз, что имеет чрезвычайно важные последствия.

Экспериментальный пример 12: Pamica характеризуется явным эффектом в предварительном тесте в эксперименте с действием клеток CIK на клетки-мишени.

В тесте, проведенном компанией Beijing Jingmeng Hi-Tech Stem Cell Technology Co., Ltd., настоящее изобретение обладает явным эффектом в предварительном тесте для определения действия клеток CIK на клетки-мишени.

Номер образца: JSCIK2016042614; дата проведения теста: 26 апреля 2016 года; дата представления отчета: 28 апреля 2016 года.

Способ осуществления операции: культивирование и анализ проводили в соответствии с традиционным экспериментом для определения действия клеток CIK на клетки-мишени, экспериментальный способ показан, например, в (The Immunotherapeutic Antitumor Effect of Dendritic Cells Co-cultured with Cytokine Induced Killer Cells, Jie Zhuang et al., Chinese Journal of Cell Biology, 2007, 29; 237-240.

Клетка-мишень: A549, эффекторная клетка: культивируемая клетка JSCIK2016042614

Заключение: способность к уничтожению клеток JSCIK2016042614 всесторонне анализировали в комбинации с применением флуоресцентного микроскопа и выявлением с помощью устройства для считывания микропланшетов, а также расчетом ошибки в самом эксперименте и является умеренной при 1:10 (когда соотношение клеток-мишеней и эффекторных клеток составляло 1:10, степень уничтожения клеток-мишеней A549 составляла 51,4%).

Экспериментальный пример 13: противораковое действие иммунного препарата для слизистой оболочки Pamica на модели рака легкого LL2 у мыши с опухолью

Противоопухолевое действие Pamica тестировали на модели опухоли LL2, трансплантированной мыши с помощью назального спрея. Опухолевые клетки в этой модели быстро росли, объем опухоли составлял 2201,9 ± 68,01 мм³ на 14-й день после инокуляции и эксперимент завершали. Цисплатин в качестве положительного контроля обладал лучшим эффектом в отношении уменьшения опухоли, за ним следовала группа, которой вводили Pamica путем внутримышечной инъекции. Однако для назального спрея Pamica, за исключением группы, которой вводили при 0,1 мг/мышь, каждая группа, которой вводили назальный спрей в дозе, составляющей 0,2 мг/мышь, характеризовалась P <0,0001 по сравнению с группой со средой-носителем в качестве отрицательного контроля, демонстрируя значительную разницу. В частности, в той же мышиной модели из ранее полученных данных тип мыши PD1 показан как практически неприменимый. В качестве объяснения, группа, которой вводят цисплатин, с большей вероятностью демонстрирует эффективность в этой модели с очень быстрым делением клеток. В целом, Pamica оказывает заметный эффект в такой модели на мышах с опухолью посредством нового противоракового механизма. Кроме того, в этой мышиной модели не было обнаружено побочных эффектов.

Экспериментальные группы показаны в следующей таблице:

Конкретные результаты эксперимента показаны на фиг. 18-21.

В этом эксперименте клетки характеризовались высокой скоростью образования опухоли, и опухоль в контрольной группе со средой-носителем росла быстро, с объемом опухоли, составляющим 2201,09 ± 68,01 мм³ в конце эксперимента. В группе положительного контроля цисплатин демонстрировал явный эффект подавления опухоли, что свидетельствует об успешности данного эксперимента и достоверности результатов.

Результаты теста демонстрируют, что в этом исследовании на мышиной модели трансплантированной опухоли LL2 при раке легкого мыши с клетками C57BL/6, группы, за исключением группы, которой вводили Pamica в дозе, составляющей 150 мкг/мышь, демонстрируют значительный эффект подавления роста опухоли независимо от пути введения: назальной капельницы или внутримышечного введения, и статистическое определение демонстрирует, что имеет место чрезвычайно существенная разница в P <0,0001; в то же время у мышей с опухолью не наблюдается явных токсических и побочных эффектов.

Предыдущие данные Huiyuan Biotech демонстрировали, что мышиное антитело к PD-1 относительно менее эффективно в модели LL2 (степень подавления опухоли составляет менее 10%). Pamica, который также действует на иммунную систему, демонстрирует лучший эффект, чем антитело к PD-1. Как правило, считается, что противоопухолевая эффективность антитела к PD-1 зависит от уровня экспрессии PD-L1 в опухолевых клетках или связана с мутационной нагрузкой, высокой нестабильностью микросателлитов (MSI-H) или дефектами репарации ошибочно спаренных нуклеотидов (dMMR), что в свою очередь влияет на его лекарственный эффект. В качестве иммунного адъюванта Pamica оказывает подавляющий эффект в более широком диапазоне, чем эффект контрольных точек иммунного ответа, что демонстрирует большие перспективы для развития.

Экспериментальный пример 14: исследование противоопухолевого эффекта Pamica in vivo на мышиной модели рака молочной железы 4T1-luc in-situ

Этот фармакодинамический эксперимент осуществляли для 9 групп: группа со средой-носителем, группа PD1, 6 групп с обработкой с помощью Pamica и группа с введением Pamica в комбинации с PD1. Группе со средой-носителем вводили раствор PBS с помощью назальной капельницы в дозе, составляющей 66,7 мкл/мышь, в 16-й день после инокуляции один раз в два дня; группе с PD1 вводили раствор PD1 путем интраперитонеальной инъекции в дозе, составляющей 100 мкг/мышь, в 16-й день после инокуляции один раз в неделю; 6 группам с обработкой с помощью Pamica вводили соответственно следующим образом: одной группе вводили Pamica с помощью назальной капельницы с дозой, составляющей 200 мкг/мышь, за 7 дней до инокуляции один раз в два дня; одной группе вводили Pamica с помощью назальной капельницы в дозе, составляющей 200 мкг/мышь, в день инокуляции один раз в два дня; одной группе вводили Pamica с помощью назальной капельницы в дозе, составляющей 200 мкг/мышь, на 16-й день после инокуляции один раз в два дня; одной группе вводили Pamica с помощью назальной капельницы в дозе, составляющей 300 мкг/мышь, на 16-й день после инокуляции один раз в два дня; одной группе вводили Pamica путем внутримышечной инъекции в дозе, составляющей 200 мкг/мышь, на 16-й день после инокуляции один раз в два дня; и одной группе вводили Pamica путем внутримышечной инъекции в дозе, составляющей 300 мкг/мышь, на 16-й день после инокуляции один раз в два дня; группе с введением Pamica в комбинации с PD1 вводили Pamica с помощью назальной капельницы в дозе, составляющей 200 мкг/мышь, на 16-й день после инокуляции один раз в два дня + вводили Pamica путем интраперитонеальной инъекции в дозе, составляющей 100 мкг/мышь, на 16-й день после инокуляции один раз в неделю. В эксперименте использовали самок мышей Balb/c, измеряли объем опухоли один раз в три дня и взвешивали для определения веса тела каждые два дня. Эксперимент завершали, когда средний объем опухоли в контрольной группе со средой-носителем превышал 2000 мм³, и биолюминесценцию опухоли измеряли с помощью устройства для визуализации мелких животных in vivo. Наконец, органы мышей каждой группы отбирали для окрашивания с помощью HE.

Результаты фармакодинамического теста продемонстрировали, что группа 7-го дня с раком на поздней стадии и группа 0-го дня характеризовались относительно слабыми способностями к подавлению роста и метастазирования опухоли, а две группы, которым вводили Pamica путем внутримышечной инъекции, характеризовались более сильным подавляющим эффектом в отношении роста и метастазирования опухоли, чем две группы, которым вводили Pamica с помощью назальной капельницы. За исключением группы, которой вводили Pamica с помощью назальной капельницы в дозе, составляющей 200 мкг/мышь, группы, которой вводили Pamica путем внутримышечной инъекции в дозе, составляющей 300 мкг/мышь, группы, которой вводили Pamica путем внутримышечной инъекции в дозе, составляющей 200 мкг/мышь, и группы, которой вводили Pamica путем внутримышечной инъекции в дозе, составляющей 300 мкг/мышь, все группы характеризуются способностью к значительному подавлению роста и метастазирования опухоли. В конце эксперимента значения степени подавления опухоли в группе, которой вводили Pamica с помощью назальной капельницы в дозе, составляющей 200 мкг/мышь, и в группе, которой вводили Pamica с помощью назальной капельницы в дозе, составляющей 300 мкг/мышь, составляли 25% и 35% соответственно. Значения степени подавления опухоли в группе, которой вводили Pamica путем внутримышечной инъекции в дозе, составляющей 200 мкг/мышь, и в группе, которой вводили Pamica путем внутримышечной инъекции в дозе, составляющей 300 мкг/мышь, составляли 56% и 61% соответственно.

Приведенные выше результаты указывают на то, что Pamica характеризуется хорошим эффектом в отношении подавления роста и метастазирования опухоли при раке молочной железы 4T1.

Ниже подробно описаны способ проведения эксперимента и результаты эксперимента.

1. Способ проведения эксперимента

1.1 Конструирование мышиной модели рака молочной железы 4T1-luc in-situ

Использовали самок мышей Balb/c, отбирали клетки рака молочной железы 4T1-luc в логарифмической фазе роста и инокулировали под четвертую молочную железу мышей Balb/c в количестве, составляющем 1×10⁵ клеток/0,2 мл/мышь, для конструирования мышиной модели с опухолью in situ. Объем опухолевой массы динамически измеряли с помощью штангенциркуля с нониусом. Объем опухоли рассчитывают в соответствии со следующей формулой: V=0,5×L×D2 (где V представляет собой объем опухоли, L представляет собой размер опухоли по длинной оси, а D представляет собой размер опухоли по короткой оси).

1.2 Установка времени введения

Для группы, которой вводили Pamica с помощью назальной капельницы за 7 дней до инокуляции (обозначенной как группа с 7-го дня с раком на поздней стадии), отбирали 10 мышей случайным образом за 7 дней до инокуляции опухоли и вводили Pamica в соответствии с таблицей 1;

для группы, которой вводили Pamica с помощью назальной капельницы за 0 дней до инокуляции (обозначенной как группа 0-го дня), отбирали 10 мышей случайным образом в день инокуляции опухоли и вводили Pamica в соответствии с таблицей 1;

Для группы, которой вводили среду-носитель, когда объем опухоли увеличивался до приблизительно 80 мм³, то есть в 16-й день после инокуляции опухоли, введение начинали в соответствии с таблицей 1.

Для группы, которой вводили PD1, когда объем опухоли увеличивался до приблизительно 80 мм³, то есть в 16-й день после инокуляции опухоли, введение начинали в соответствии с таблицей 1.

Для группы, которой вводили Pamica с помощью назальной капельницы в дозе, составляющей 200 мкг/мышь, когда объем опухоли увеличивался до приблизительно 80 мм³, то есть в 16-й день после инокуляции опухоли, введение начинали в соответствии с таблицей 1.

Для группы, которой вводили Pamica с помощью назальной капельницы в дозе, составляющей 300 мкг/мышь, когда объем опухоли увеличивался до приблизительно 80 мм³, то есть в 16-й день после инокуляции опухоли, введение начинали в соответствии с таблицей 1.

Для группы, которой вводили Pamica путем внутримышечной инъекции в дозе, составляющей 200 мкг/мышь, когда объем опухоли увеличивался до приблизительно 80 мм³, то есть в 16-й день после инокуляции опухоли, введение начинали в соответствии с таблицей 1.

Для группы, которой вводили Pamica путем внутримышечной инъекции в дозе, составляющей 300 мкг/мышь, когда объем опухоли увеличивался до приблизительно 80 мм³, то есть в 16-й день после инокуляции опухоли, введение начинали в соответствии с таблицей 1.

Таблица 1: дозировки и группы в эксперименте

1.3 Завершение эксперимента

Полностью эксперимент завершали в день 30 после введения, поскольку объем опухоли превышал 2000 мм³.

1.4 Наблюдаемые показатели

Объем опухоли измеряли для определения объема один раз в три дня и мышей взвешивали один раз в два дня. В конце эксперимента отделяли сердце, печень, селезенку, легкое, почку и опухоль. Сердце, печень, селезенку и почку фиксировали 4% нейтральным формальдегидом, затем получали залитые в парафин срезы и анализировали посредством окрашивания с помощью HE; опухоль фотографировали и взвешивали; легкое фиксировали в фиксирующей смеси Буэна в течение 16 часов, погружали в 50% спирт на 2 часа, фотографировали, фиксировали 4% нейтральным формальдегидом, получали залитые в парафин срезы и анализировали посредством окрашивания с помощью HE.

1.5 Устройство для визуализации мелких животных

При завершении введения мышам путем интраперитонеальной инъекции вводили 100 мкл люциферина в концентрации, составляющей 30 мг/мл, в качестве субстрата флуоресцеина и анестезировали с помощью изофлурана. Через 17 минут мышей фиксировали в устройстве для визуализации мелких животных in vivo для наблюдения биолюминесценции. Параметры захвата изображения являются следующими: время захвата: 0,2 секунды; значение Bin: 4; и значение F: 2. Программное обеспечение для обработки изображений: Программное обеспечение Living Image® (версия 4.3.1; Caliper Life Sciences Inc.).

2. Статистический анализ

Все данные эксперимента выражены как «среднее значение ± стандартное отклонение» и для анализа данных использовали программное обеспечение SPSS Statistics 19 (версия 4.0.100.1124; SPSS Inc., IBM Company, США). Однофакторный дисперсионный анализ ANOVA использовали для сравнения данных, а t-тест использовали для определения значимых различий между группами: * p <0,05; ** p <0,01; *** p <0,001.

3. Результаты эксперимента и обсуждение

3.1 Объем опухоли

Кривые изменений объема опухоли показаны на фиг. 22.

Таблица 2: результаты t-теста в отношении объема опухоли

Примечание: Планка погрешностей указывает на SD; —— указывает на отсутствие данных *: указывает на то, что p <0,05 по сравнению с группой среды-носителя; **: указывает на то, что p <0,01 по сравнению с группой среды-носителя; ***: указывает на то, что p <0,001 по сравнению с группой среды-носителя.

На фиг. 22 и в таблице 2 можно видеть, что эффекты подавления опухоли у группы 7-го дня с раком на поздней стадии и у группы 0-го дня являются относительно слабыми, и две группы, которым вводили путем внутримышечной инъекции, характеризуются лучшими эффектами подавления опухоли, чем две группы, которым вводили с помощью назальной капельницы. Конкретные результаты заключаются в следующем.

Группа 7-го дня, которой вводили Pamica, и группа 0-го дня характеризуются определенными эффектами подавления опухоли на поздней стадии и в основном отсутствием эффекта подавления опухоли на ранней стадии, что указывает на то, что введение на поздней стадии или немедленное введение не обладает явным эффектом уничтожения опухоли, и практически доказывает, что Pamica представляет собой вакцину для лечения опухолей, а не профилактическую вакцину. При завершении эксперимента значения степени подавления опухоли в группе 7-го дня с раком на поздней стадии и в группе 0-го дня составляли 36% и 26% соответственно.

Значения объема опухоли в группе с PD1 на 12-й день значительно отличались от значений объема опухоли в группе со средой-носителем (**p<0,01), что указывает на то, что PD1 оказывает определенный подавляющий эффект на рак молочной железы 4T1 у мышей.

В каждой обрабатываемой группе из групп с введением PD1 в комбинации с Pamica большинство мышей погибли на 20-й день после введения, по этой причине не было получено данных относительно более позднего измерения для двух групп. Среди них объемы опухолей в группах с комбинированным введением в день 6, 12 и 18 значительно отличались от таковых в группе со средой-носителем (*p<0,05, **p<0,01, ***p<0,001 соответственно).

Группа, которой вводили Pamica с помощью назальной капельницы в дозе, составляющей 200 мкг/мышь, характеризовалась значительным подавляющим эффектом при введении на ранней стадии и постепенно ослабевающим эффектом подавления опухоли на поздней стадии введения. Значения объема опухоли в день 6 и 12 в значительной степени отличались от таковых в группе со средой-носителем (**p<0,01). За исключением дня 18 значения объема опухоли в группе, которой вводили Pamica с помощью назальной капельницы в дозе, составляющей 300 мкг/мышь, в значительной степени отличались от таковых в группе со средой-носителем в ряде случаев. Это демонстрирует, что введение с помощью назальной капельницы является эффективным, а эффект подавления опухоли зависит от дозировки. При завершении эксперимента значения степени подавления опухоли в группе, которой вводили Pamica с помощью назальной капельницы в дозе, составляющей 200 мкг/мышь, и в группе, которой вводили Pamica с помощью назальной капельницы в дозе, составляющей 300 мкг/мышь, составляли 25% и 35% соответственно.

Эффекты подавления опухоли в двух группах, которым вводили дозу Pamica путем внутримышечной инъекции, были сходными в ходе всего процесса введения, и в значительной степени отличались от таковых в группе со средой-носителем, и эффект подавления опухоли в двух группах, которым вводили Pamica путем внутримышечной инъекции, был лучше, чем в двух группах, которым вводили Pamica с помощью назальной капельницы. При завершении эксперимента значения степени подавления опухоли в группе, которой вводили Pamica путем внутримышечной инъекции в дозе, составляющей 200 мкг/мышь, и в группе, которой вводили Pamica путем внутримышечной инъекции в дозе, составляющей 300 мкг/мышь, составляли 56% и 61% соответственно.

3.2 Вес тела

Кривые изменений веса тела мышей показаны на фиг. 23.

Таблица 3: статистические результаты t-теста в отношении веса тела мышей в каждой группе и группе со средой-носителем

Примечание: Планка погрешностей указывает на SD; —— указывает на отсутствие данных *: указывает на то, что p <0,05 по сравнению с группой среды-носителя; **: указывает на то, что p <0,01 по сравнению с группой среды-носителя; ***: указывает на то, что p <0,001 по сравнению с группой среды-носителя.

На фиг. 23 и в таблице 3 можно видеть, что значения веса тела мышей в группах с PD1 и комбинированным введением существенно не отличалась от таковых в группе со средой-носителем в течение эффективного времени измерения, что указывает на то, что побочные эффекты у них меньше. За исключением более поздней стадии введения значения веса тела в группе 7-го дня с раком на поздней стадии, группе 0-го дня, группе, которой вводили Pamica с помощью назальной капельницы в дозе, составляющей 200 мкг/мышь, и в группе, которой вводили Pamica с помощью назальной капельницы в дозе, составляющей 300 мкг/мышь, были значительно ниже, чем таковые в группе со средой носителем в ряде случаев. Не наблюдалось существенной разницы между группой, которой вводили Pamica путем внутримышечной инъекции в дозе, составляющей 200 мкг/мышь, и группой со средой-носителем в ходе всего периода введения. Веса тела в группе, которой вводили Pamica путем внутримышечной инъекции в дозе, составляющей 300 мкг/мышь, был ниже, чем вес тела в группе со средой-носителем на промежуточной стадии введения, и существенно не отличался от веса тела в группе со средой-носителем на ранней стадии и поздней стадии введения.

Приведенные выше результаты указывают на то, что внутримышечная инъекция оказывает небольшое влияние на вес тела мышей и характеризуется меньшим побочным эффектом, а интраназальное введение характеризуется определенным побочным эффектом у мышей.

3.3 Вес опухоли, вес селезенки и фотографии опухоли

На фиг. 24 и фиг. 25 можно видеть, что не наблюдалось значительной разницы в весе опухоли между группой 7-го дня с раком на поздней стадии или группой 0-го дня по сравнению с контрольной группой, и две группы, которым вводили Pamica путем внутримышечной инъекции, характеризовались более сильным подавляющим эффектом в отношении роста опухоли, чем две группы, которым вводили Pamica с помощью назальной капельницы. За исключением группы, которой вводили Pamica с помощью назальной капельницы в дозе, составляющей 200 мкг/мышь, группа, которой вводили Pamica с помощью назальной капельницы в дозе, составляющей 300 мкг/мышь, группа, которой вводили Pamica путем внутримышечной инъекции в дозе, составляющей 200 мкг/мышь, и группа, которой вводили Pamica путем внутримышечной инъекции в дозе, составляющей 300 мкг/мышь, могут определяться как характеризующиеся значительным подавлением роста опухоли со статистической разницей по сравнению с группой со средой-носителем (*p<0,05, **p<0,01, ***p<0,001 соответственно).

Селезенка является крупнейшим иммунным органом организма, составляет 25% от общей лимфатической ткани организма, содержит большое количество лимфоцитов и макрофагов и является центром клеточного иммунитета и гуморального иммунитета организма. На фиг. 26 можно видеть, что значения веса селезенки в группе, которой вводили Pamica путем внутримышечной инъекции в дозе, составляющей 200 мкг/мышь, и группе, которой вводили Pamica путем внутримышечной инъекции в дозе, составляющей 300 мкг/мышь, были значительно выше, чем в группе со средой-носителем, со статистическими различиями (**p<0,01, *p<0,05, соответственно), указывая на то, что иммунный ответ группы, которой вводили Pamica путем внутримышечной инъекции, может быть сильнее.

3.4 Фотографии легких

На фиг. 27 и фиг. 28 можно видеть, что на поверхности легочной ткани имеется множество белых узелков опухоли в группе со средой-носителем, группе 7-го дня с раком на поздней стадии и группе 0-го дня, что указывает на то, что группа 7-го дня с раком на поздней стадии и группа 0-го дня в основном характеризуются отсутствием эффекта в отношении подавления метастазирования 4T1 в легкие. Наблюдается меньше узелков на поверхности легочной ткани в группе, которой вводили Pamica с помощью назальной капельницы в дозе, составляющей 200 мкг/мышь, и группе, которой вводили Pamica с помощью назальной капельницы в дозе, составляющей 300 мкг/мышь, а в группе, которой вводили Pamica путем внутримышечной инъекции в дозе, составляющей 200 мкг/мышь, и группе, которой вводили Pamica путем внутримышечной инъекции в дозе, составляющей 300 мкг/мышь, наблюдается наименьшее количество узелков на поверхности легочной ткани, что указывает на то, что две группы, которым вводили Pamica с помощью назальной капельницы, и две группы, которым вводили Pamica путем внутримышечной инъекции, способны эффективно подавлять метастазирование 4T1 в легкие, и группа, которой вводили Pamica путем внутримышечной инъекции, обладает более сильной способностью к подавлению метастазирования 4T1 в легкие, чем группа, которой вводили Pamica с помощью назальной капельницы.

3.5 Устройство для визуализации мелких животных

На фиг. 29-35 можно видеть, что интенсивности биолюминесценции участков опухоли и метастазов в группе со средой-носителем, группе 7-го дня с раком на поздней стадии и группе 0-го дня выше. Интенсивности биолюминесценции участка опухоли и метастазов в группе, которой вводили Pamica с помощью назальной капельницы в дозе, составляющей 200 мкг/мышь, и с Pamica в дозе, составляющей 300 мкг/мышь, были более слабыми, и интенсивности биолюминесценции участков опухоли и метастазов в группе, которой вводили Pamica путем внутримышечной инъекции в дозе, составляющей 200 мкг/мышь и группе, которой вводили Pamica путем внутримышечной инъекции в дозе, составляющей 300 мкг/мышь, были самыми слабыми, что указывает на то, группа, которой вводили Pamica путем внутримышечной инъекции, обладает более сильной способностью к подавлению роста и метастазирования рака молочной железы 4T1, чем группа, которой вводили Pamica с помощью назальной капельницы, что согласуется с приведенными выше результатами.

4. Вывод

В данном эксперименте авторы настоящего изобретения успешно создали мышиную модель рака молочной железы 4T1-luc in-situ. Опухоль быстро росла, и к концу эксперимента объем опухоли превысил 2000 мм³.

Результаты тестов демонстрируют, что в данном исследовании с помощью мышиной ортотопической модели опухоли при раке молочной железы с клетками 4T1-luc мышей Balb/c, за исключением результатов для групп с PD1 и комбинированным введением, большое количество мышей погибло из-за PD1, таким образом получили только часть экспериментальных данных, с другой стороны, каждая группа характеризовалась определенным эффектом подавления опухоли в определенный период времени. Группа 7-го дня с раком на поздней стадии, группа 0-го дня и группа, которой вводили Pamica с помощью назальной капельницы в дозе, составляющей 200 мкг/мышь, не обладали явным эффектом ингибирования опухоли, группа, которой вводили Pamica с помощью назальной капельницы в дозе, составляющей 200 мкг/мышь, группа, которой вводили Pamica путем внутримышечной инъекции в дозе, составляющей 200 мкг/мышь, и группа, которой вводили Pamica с помощью внутримышечной инъекции в дозе, составляющей 300 мкг/мышь, продемонстрировали явные эффекты подавления опухоли.

Экспериментальный пример 15: применение Pamica для лечения пациентов, инфицированных вирусом папилломы человека (HPV)

Экспериментальный пример 16: применение Pamica для лечения рака молочной железы

1. Лекарственные средства для положительного контроля:

PD1, инъекция паклитаксела

2. Конструирование ортотопической животной модели рака молочной железы на мышах с 4T1

Использовали самок мышей BALB/c; отбирали клетки рака молочной железы 4T1-luc в логарифмической фазе роста и инокулировали в количестве 1×10⁵ клеток/0,2 мл/мышь под четвертую молочную железу мышей BALB/c для конструирования ортотопической мышиной модели с опухолью. Объем опухолевой массы динамически измеряли с помощью штангенциркуля с нониусом. Объем опухоли рассчитывали в соответствии со следующей формулой: V=0,5×L×D2 (где V представляет собой объем опухоли, L представляет собой размер опухоли по длинной оси, а D представляет собой размер опухоли по короткой оси).

3. Влияние на рост и спонтанное метастазирование рака молочной железы 4T1 in situ

3.1 Деление на группы и режим дозирования

① для группы, которой вводили PBS, через несколько дней после инокуляции опухоли вводили PBS с помощью назальной капельницы в дозе, составляющей 100 мкл/мышь, один раз через день;

② для группы, которой вводили PD1, через несколько дней после инокуляции опухоли интраперитонеально вводили PD1 в дозе, составляющей 100 мкг/мышь, один раз в неделю;

③ для группы, которой вводили паклитаксел, через несколько дней после инокуляции опухоли паклитаксел вводили путем инъекции в хвостовую вену в дозе, составляющей 10 мг/кг, один раз в неделю;

④ для группы, которой вводили Pamica с помощью назальной капельницы, через несколько дней после инокуляции опухоли Pamica вводили с помощью назальной капельницы в дозе, составляющей 100 мкл (0,3 мг)/мышь один раз через день, с помощью назальной капельницы вводили 50 мкл утром в день введения и с помощью назальной капельницы вводили 50 мкл днем;

⑤ для группы, которой вводили Pamica путем внутримышечной инъекции, через несколько дней после инокуляции опухоли Pamica вводили путем внутримышечной инъекции в дозе, составляющей 100 мкл (0,3 мг)/мышь, вводили один раз через день;

⑥ для группы с комбинированным введением через несколько дней после инокуляции опухоли вводили PD1 интраперитонеально (100 мкг/мышь, вводили один раз в неделю) + Pamica с помощью назальной капельницы (100 мкл/мышь, вводили один раз через день);

⑦ для группы с комбинированным введением через несколько дней после инокуляции опухоли паклитаксел вводили путем инъекции в хвостовую вену (10 мг/кг, вводили один раз в неделю) + Pamica с помощью назальной капельницы (100 мкл/мышь, вводили один раз через день).

3.2 Количество животных в каждой группе: 15 животных в каждой группе (в каждой группе 5 резервных животных).

3.3 Время для завершения эксперимента: в зависимости от актуальной ситуации (мышь погибла или разница между группой с введением и контрольной группой очевидна) эксперимент можно заканчивать раньше.

3.4 Экспериментальный протокол

Создали модель рака молочной железы 4T1-luc in situ и для раннего выявления и группировки использовали устройство для визуализации мелких животных in vivo. Введение осуществляли в соответствии с разделением на группы и режим дозирования по пункту 6.1. Измеряли объем опухоли (измеряли один раз в 3 дня), изменение веса (измеряли один раз в 3 дня), вес опухоли (определяли в конце), вес селезенки (определяли в конце), осуществляли TUNEL-окрашивание (определяли в конце). Легкое фиксировали фиксирующей смесью Буэна, а затем фотографировали. Каждую ткань и орган фиксировали нейтральным формальдегидом, затем окрашивали с помощью H&E (для выявления в конце) и наблюдали интенсивность биолюминесценции опухоли in situ и метастазов в различные моменты времени и конечные моменты времени с помощью устройства для визуализации мелких животных in vivo. Эффекты подавления роста и метастазирования опухоли in situ в каждой группе всесторонне сравнивали.

Эксперименты позволили доказать, что Pamica обладает явными эффектами уменьшения объема опухоли при раке молочной железы, контроля веса опухоли и веса селезенки, а также стимуляции апоптоза опухолевых клеток и других аспектов.

Наконец, следует отметить, что вышеупомянутые варианты осуществления предназначены только для иллюстрации, но не для ограничения технических решений настоящего изобретения; хотя настоящее изобретение было подробно описано со ссылкой на вышеизложенные примеры, специалисты в данной области техники должны понимать, что все еще возможно вносить изменения в технические решения, изложенные в вышеупомянутых примерах, или производить эквивалентные замены некоторых или всех технических характеристик; и эти модификации или замены не приводят к отклонению сущности соответствующих технических решений от объема технических решений из примеров по настоящему изобретению.

Промышленная применимость

В настоящем изобретении раскрыт комплекс для потенцирования иммунного ответа. По сравнению с предшествующим уровнем техники комплекс обладает средней вязкостью и молекулярным весом и является удобным для применения в фармацевтическом производстве; он характеризуется стабильными химическими свойствами и практически не деградирует при длительном хранении, а также безопасен для применения. Комплекс при применении отдельно способен значительно потенцировать неспецифический иммунный ответ организма и достигать цели предупреждения и лечения заболеваний, а при применении в комбинации с другими лекарственными средствами обладает лучшей противоопухолевой, противовирусной и противо(сверх)бактериальной эффективностью и легко усваивается пациентами.

1. Комбинированный продукт для потенцирования иммунного ответа, содержащий полиинозиновую-полицитидиловую кислоту (PIC), катионный стабилизатор и растворимую соль кальция в жидкой реакционной системе;

при этом катионный стабилизатор представляет собой привитой сополимер олигосахарида хитозана и метоксиполиэтиленгликоля (COS-g-MPEG), где олигосахарид хитозана характеризуется молекулярным весом, составляющим 5 кДа или меньше;

полиинозиновая-полицитидиловая кислота предварительно нагрета при температуре от 88 до 90°С в течение от 70 до 120 минут,

соотношение PIC к COS-g-MPEG в комбинированном продукте составляет от 1:0,8 до 1:6,4.

2. Продукт по п. 1, где олигосахарид хитозана характеризуется степенью деацетилирования, составляющей 70% или больше.

3. Продукт по п. 1, где растворимая соль кальция представляет собой CaCl₂ и/или CaNO₃.

4. Продукт по п. 1, где полиинозиновая-полицитидиловая кислота характеризуется молекулярным весом, составляющим 100-3000 п.о.

5. Продукт по п. 1, где полиинозиновая-полицитидиловая кислота характеризуется молекулярным весом, составляющим 100-1500 п.о.

6. Продукт по п. 1, где комбинированный продукт дополнительно содержит одно или более из регулятора рН, триполифосфата натрия, альгината натрия, фенилбороновой кислоты, катехола, буферной соли и воды.

7. Комплекс для потенцирования иммунного ответа, содержащий комбинированный продукт по пп. 1-6.

8. Комплекс по п. 7, где концентрация полиинозиновой-полицитидиловой кислоты в комбинированном продукте составляет 0,1-10 мг/мл.

9. Комплекс по п. 8, где концентрация полиинозиновой-полицитидиловой кислоты в комбинированном продукте составляет 0,5-5 мг/мл.

10. Комплекс по п. 7, где концентрация катионного стабилизатора в комбинированном продукте составляет 0,5-51,2 мг/мл.

11. Комплекс по п. 10, где концентрация катионного стабилизатора в комбинированном продукте составляет 0,8-25,6 мг/мл.

12. Комплекс по п. 10, где концентрация ионов кальция в растворимой соли кальция в комбинированном продукте составляет 0,1-1 мМ.

13. Нетерапевтическое применение комплекса по любому из пп. 7-12 в качестве иммунного адъюванта.

14. Применение комплекса по любому из пп. 7-12 для получения антитела.

15. Применение комплекса по любому из пп. 7-12 для получения вакцинного состава или вакцинной композиции.

16. Применение комплекса по любому из пп. 7-12 для получения адъюванта для вакцины.

17. Вакцинная композиция, содержащая комплекс по любому из пп. 7-12 и по меньшей мере один антиген.

18. Вакцинная композиция по п. 17, где антиген представляет собой вирус, бактерию, белок, полипептид, полисахарид, нуклеиновую кислоту или конъюгат на основе низкомолекулярного белка.

19. Применение комплекса по любому из пп. 7-12 для регуляции активности иммунных клеток, где применение осуществляется in vivo или in vitro.

20. Применение по п. 19, где регуляция активности иммунных клеток специфически потенцирует активность иммунных клеток.

21. Применение по п. 19, где иммунная клетка выбрана из макрофагов, лимфоцитов и дендритных клеток.

22. Применение по п. 19, где регуляция и потенцирование активности иммунных клеток способствуют высвобождению провоспалительных факторов иммунными клетками.

23. Применение по п. 22, где провоспалительные факторы включают IL-2, IL-6, IL-12p40, IL-18, IL-22, IFN-α, IFN-γ и TNF-α.

24. Применение комплекса по любому из пп. 7-12 для получения лекарственных средств для лечения и/или предупреждения опухолей.

25. Применение комплекса по любому из пп. 7-12 для получения противовирусных лекарственных средств.

26. Применение комплекса по любому из пп. 7-12 для получения антибактериальных лекарственных средств.

27. Применение комплекса по любому из пп. 7-12 для получения противогрибковых лекарственных средств.

28. Применение комплекса по любому из пп. 7-12 для получения противопаразитарных лекарственных средств.

29. Применение комплекса по любому из пп. 7-12 для получения лекарственных средств, стимулирующих иммунный ответ на антиген в организме.

30. Применение по любому из пп. 24-29, где лекарственное средство представляет собой лекарственную форму для введения путем инъекции, лекарственную форму для респираторного введения, назальные капли, лекарственную форму для введения через кожу, лекарственную форму для введения через слизистую оболочку или лекарственную форму для полостного введения.

31. Применение по п. 29, где антиген включает опухолевый, вирусный, бактериальный, грибковый или паразитарный антиген.

32. Применение по п. 29, где организм является млекопитающим.

33. Применение по п. 29, где организм является приматом.

34. Применение по п. 29, где организм является человеком.

35. Фармацевтическая композиция для лечения рака и инфекции, содержащая комплекс по любому из пп. 7-12, где фармацевтическая композиция дополнительно содержит одно или более из лекарственного средства для терапии иммунными клетками, лекарственного средства для терапии антителами, химического лекарственного средства, вещества, которое способствует поглощению иммунологически активных средств слизистой оболочкой или адгезии на слизистой оболочке, иммуномодулятора, антигена патогена, лиганда паттерн-распознающего рецептора и фармацевтически приемлемого вспомогательного вещества,

где химическое лекарственное средство представляет собой одно или более из средств, выбранных из группы, состоящей из алкилирующего средства, антиметаболического средства, противоопухолевого антибиотика, противоопухолевого лекарственного средства растительного происхождения, гормонального лекарственного средства и другого лекарственного средства;

где другое лекарственное средство выбрано из группы, состоящей из L-аспарагиназы, цисплатина, карбоплатина, оксалиплатина, дакарбазина, лекарственных средств на основе гексаметилмеламина и производных вышеупомянутых лекарственных средств.

36. Фармацевтическая композиция по п. 35, где лекарственное средство для терапии иммунными клетками представляет собой одно или более из клеток, выбранных из группы, состоящей из лимфоцитов, инфильтрирующих опухоль (TIL), дендритных клеток (DC), цитокин-индуцированных клеток-киллеров (CIK), дендритных клеток и цитокин-индуцированных клеток-киллеров (DC-CIK), естественных клеток-киллеров (NK), γδT-клеток, CD3AK, CAR-T и TCR-T.

37. Фармацевтическая композиция по п. 35 или 36, где терапевтическое лекарственное средство на основе антитела выбрано из группы, состоящей из антитела к PD1, антитела к PDL1, антитела к CTLA4 и антитела к CD-антигену.

38. Фармацевтическая композиция по любому из пп. 35-37, где вещество, которое способствует поглощению иммунологически активных средств слизистой оболочкой или адгезии на слизистой оболочке, представляет собой одно или более из веществ, выбранных из группы, состоящей из анионных поверхностно-активных веществ, катионных поверхностно-активных веществ, цвиттер-ионных поверхностно-активных веществ, неионогенных поверхностно-активных веществ, специальных поверхностно-активных веществ, хелатирующих средств, адгезивных средств, сополимеров полимолочной кислоты и гликолевой кислоты, декстранов и полисахаридов.

39. Фармацевтическая композиция по любому из пп. 35-38, где иммуномодулятор представляет собой один или более из иммуномодуляторов, выбранных из группы, состоящей из цитокинов, хемокинов, факторов роста стволовых клеток, лимфотоксинов, гемопоэтических факторов, колонне стимулирующих факторов (CSF), интерферонов, эритропоэтинов, тромбопоэтинов, факторов некроза опухоли (TNF), интерлейкинов (IL), гранулоцитарных колониестимулирующих факторов (G-CSF), гранулоцитарно-макрофагальных колониестимулирующих факторов (GM-CSF) и факторов роста стволовых клеток.

40. Фармацевтическая композиция по любому из пп. 35-39, где антиген патогена выбран из группы, состоящей из опухолевого, вирусного, бактериального, грибкового или паразитарного антигена.

41. Фармацевтическая композиция по п. 40, где опухоль включает опухоли, возникающие в результате любых поражений кости, соединения костей, мышцы, легкого, трахеи, глотки, носа, сердца, селезенки, артерии, вены, крови, капилляра, лимфатического узла, лимфатического сосуда, лимфатической жидкости, ротовой полости, глотки, пищевода, желудка, двенадцатиперстной кишки, тонкого кишечника, толстой кишки, прямой кишки, анального канала, аппендикса, печени, желчного пузыря, поджелудочной железы, околоушной железы, подъязычной железы, почки, мочеточника, мочевого пузыря, мочеиспускательного канала, яичника, маточной трубы, матки, влагалища, вульвы, мошонки, яичек, семявыносящего протока, полового члена, глаз, ушей, носа, языка, кожи, головного мозга, ствола головного мозга, продолговатого мозга, спинного мозга, спинномозговой жидкости, нервов, щитовидной железы, паращитовидной железы, надпочечника, гипофиза, шишковидной железы, островка поджелудочной железы, тимуса, гонады, подъязычной железы и околоушной железы.

42. Фармацевтическая композиция по п. 40, где бактерия включает одно или более из Staphylococcus, Streptococcus, Listeria, Erysipelothrix, Renibacterium, Bacillus, Clostridium, Mycobacterium, Actinomyces, Nocardia, Corynebacterium, Rhodococcus, Bacillus anthracis, Erysipelas bacillus, Bacillus tetani, Listeria monocytogenes, Bacillus perfringens, Bacillus gangraenae emphysematosae, возбудителя туберкулеза, Escherichia coli, Bacterium proteus, Shigella dysenteriae, Pneumobacillus, Bacterium burgeri, Clostridium perfringens, Haemophilus influenzae, Haemophilus parainfluenzae, Moraxella catarrhalis, Acinetobacter, Yersinia, Legionella pneumophila, Bordetella pertussis, Bordetella parapertussis, Shigella, Pasteurella, Vibrio cholerae и Vibrio Parahemolyticus.

43. Фармацевтическая композиция по п. 40, где паразит включает одно или более из паразитов пищеварительного тракта, внутриполостных паразитов, внутрипеченочных паразитов, внутрилегочных паразитов, паразитов ткани головного мозга, внутрисосудистых паразитов, паразитов лимфатической системы, паразитов мышечной ткани, внутриклеточных паразитов, паразитов костной ткани и внутриглазных паразитов.

44. Фармацевтическая композиция по п. 40, где вирус включает одно или более из adeniviridae, arenaviridae, astroviridae, bunyaviridae, cliciviridae, flaviviridae, вируса гепатита дельта, hepeviridae, mononegavirales, nidovirales, piconaviridae, orthomyxoviridae, papillomaviridae, parvoviridae, polyomaviridae, poxviridae, reoviridae, retroviridae или togaviridae.

45. Фармацевтическая композиция по п. 40, где гриб включает одно или более из Coccidioides immitis, Coccidioides posadasii, Histoplasma capsulatum, Histoplasma duboisii, Blastomyces lobo, Paracoccidiodes brasiliensis, Blastomyces dermatitis, Sporothrix schenckii, Penicillium marneffei, Candida albicans, Candida glabrata, Candida tropicalis, Candida lusitaniae, Pneumocystis carinii, Aspergillus, Exophiala jeanselmei, Fonsecaea pedrosoi, Fonsecaea compacta, Chromomyces verruciformis, Pigmentation dermatitis, Geotrichum candidum, Pseudallescheria boydii, Cryptococcus neoformans, Trichosporon cutaneum, Rhizopus oryzae, Mucor indicus, Absidia corymbifera, Syncephalastrum racemosum, Basidiobolus ranarum, Conidiobolus coronatus, Conidiobolus incongruus, Enterocytozoon bieneusi, Encephalitozoon intestinalis, Rhinosporidium seeberi, гиалогифомицетов и феогифомицетов.

46. Фармацевтическая композиция по любому из пп. 35-45, где лиганд паттерн-распознающего рецептора выбран из группы, состоящей из лиганда рецептора TLR, лиганда рецептора RLR, лиганда рецептора CLR и лиганда рецептора NLR.

47. Способ стимуляции иммунного ответа на антиген в организме in vivo, включающий введение в организм комплекса по любому из пп. 7-12, или вакцинной композиции по п. 17 или 18, или фармацевтической композиции по любому из пп. 36-46,

если антиген представляет собой вирусный, бактериальный, грибковый или паразитарный антиген, комплекс по любому из пп. 7-12, или вакцинную композицию по п. 17 или 18, или фармацевтическую композицию по любому из пп. 36-46 вводят в дозе, составляющей 1-8 мг/кг, при каждом введении; в качестве альтернативы вводят один раз в день, один раз в 2 дня, один раз в 3 дня или один раз в 4 дня;

если антиген представляет собой опухолевый антиген, комплекс по любому из пп. 7-12, или вакцинную композицию по п. 17 или 18, или фармацевтическую композицию по любому из пп. 36-46 вводят в дозе, составляющей 1-10 мг/кг, при каждом введении и вводят в течение по меньшей мере 360 дней, по меньшей мере 180 дней, по меньшей мере 60 дней или по меньшей мере 30 дней.

48. Способ регуляции и потенцирования активности иммунных клеток в организме, включающий введение в организм комплекса по любому из пп. 7-12, или вакцинной композиции по п. 17 или 18, или фармацевтической композиции по любому из пп. 36-46,

если антиген представляет собой вирусный, бактериальный, грибковый или паразитарный антиген, комплекс по любому из пп. 7-12, или вакцинную композицию по п. 17 или 18, или фармацевтическую композицию по любому из пп. 36-46 вводят в дозе, составляющей 1-8 мг/кг, при каждом введении; в качестве альтернативы вводят один раз в день, один раз в 2 дня, один раз в 3 дня или один раз в 4 дня;

если антиген представляет собой опухолевый антиген, комплекс по любому из пп. 7-12, или вакцинную композицию по п. 17 или 18, или фармацевтическую композицию по любому из пп. 36-46 вводят в дозе, составляющей 1-10 мг/кг, при каждом введении и вводят в течение по меньшей мере 360 дней, по меньшей мере 180 дней, по меньшей мере 60 дней или по меньшей мере 30 дней.