Способ получения биомассы с повышенным содержанием полиненасыщенных жирных кислот

Авторы патента:

C12P7/64 - жиры; жирные масла; воски эфирного типа; высшие жирные кислоты, т.е. содержащие не менее семи атомов углерода в непрерывной цепи, связанной с карбоксильной группой; окисленные масла или жиры

C12N1/00 - Микроорганизмы, например простейшие; их композиции (лекарственные препараты, содержащие материал из микроорганизмов A61K 35/66; приготовление лекарственных составов, содержащих бактериальные антигены или антитела, например бактериальных вакцин A61K 39/00); способы размножения, содержания или консервирования микроорганизмов или их композиций; способы приготовления или выделения композиций, содержащих микроорганизмы; питательные среды

Владельцы патента RU 2779882:

ЭВОНИК ОПЕРЕЙШЕНС ГМБХ (DE)

Группа изобретений относится к биотехнологии. Предложены способ получения биомассы, содержащей PUFA путем культивирования PUFA-продуцирующих клеток семейства Thraustochytriaceae в среде для ферментации в условиях регулирования содержания сульфата так, чтобы сульфат всегда присутствовал в среде в течение всего периода фазы продуцирования масла в концентрации от 0,01 до 2 г на кг биомассы, не содержащей липидов, по меньшей мере в течение второй половины фазы продуцирования масла; и биомасса, содержащая PUFA, полученная заявленным способом. Изобретения обеспечивают увеличение выхода целевого продукта, характеризующегося повышенной массовой долей полиненасыщенных жирных кислот (PUFA). 2 н. и 11 з.п. ф-лы, 1 табл., 4 пр.

Настоящее изобретение относится к способу получения биомассы, характеризующейся повышенным содержанием полиненасыщенных жирных кислот, и к биомассе, получаемой с помощью указанного способа.

Способы получения биомассы, содержащей полиненасыщенные жирные кислоты (PUFA), уже были описаны в предшествующем уровне техники. В данном документе часто используются виды класса Labyrinthulomycetes, которые естественным образом накапливают полиненасыщенные жирные кислоты в качестве запасных липидов в относительно большом количестве в клетке.

Такие микроводоросли в природе растут в морской воде, это значит, что культивирование микроводорослей первоначально проводили в средах с высоким содержанием хлорида. Однако высокие содержания хлорида не пригодны для культивирования в стальных биореакторах, поскольку они вызывают коррозию металлов.

Следовательно, среды для ферментации, характеризующиеся низким содержанием хлорида и, напротив, высоким содержанием сульфата, были описаны в предшествующем уровне техники как альтернативные среды для ферментации.

Однако в данном случае полученная биомасса обычно характеризуется лимитированным содержанием PUFA, предположительно, не в последнюю очередь потому, что высокое количество сульфатов значит, что доля клеточной стенки, образующейся в конечном продукте, относительно высока за счет количества присутствующих PUFA.

Эксперименты с очень низким содержанием сульфата на последней фазе ферментации показали, что относительная доля PUFA, образованных в конечном продукте, может быть заметно повышена в результате регулирования добавления сульфата на последней фазе ферментации, хотя в то же время клетки являются в относительно большой степени дестабилизированными, что значит, что может встречаться частичное высвобождение присутствующего масла в среду для ферментации в течение ферментации.

Исходя из этих знаний, целью настоящего изобретения является предоставить способ, в котором полученная биомасса характеризуется повышенной массовой долей PUFA в конечном продукте. В то же время предполагается, что предпочтительно в способе применяется не вызывающая коррозии среда для ферментации и что достигаются высокие выход продукта и объемная производительность, и что преждевременное высвобождение масла в среду для ферментации предотвращается настолько, насколько это возможно.

Возможно достичь цели настоящего изобретения с помощью способа, в котором содержание сульфата в среде регулируют так, чтобы сульфат всегда присутствовал в среде на последней фазе ферментации, но концентрация сульфата всегда была ниже концентрации насыщения клеток, что означает, что присутствующий сульфат непосредственно полностью ассимилируется клетками.

Следовательно, настоящее изобретение, во-первых, предусматривает способ получения биомассы, содержащей PUFA, характеризующийся тем, что биомассу получают путем культивирования PUFA-продуцирующих клеток в среде для ферментации, в которой содержание сульфата регулируют так, чтобы сульфат всегда присутствовал в среде на последней фазе ферментации, но концентрация сульфата в среде всегда была ниже границы насыщения клеток.

В соответствии с настоящим изобретением граница насыщения сульфатом или концентрация насыщения сульфатом клеток определены как количество сульфата, который может быть непосредственно полностью ассимилирован клетками биомассы в указанных условиях. В одном варианте осуществления настоящего изобретения, который является предпочтительным в соответствии с настоящим изобретением, применяют клетки видов семейства Thraustochytriaceae, которые характеризуются границей насыщения сульфатом, составляющей приблизительно 5 г на кг биомассы, не содержащей липидов.

Следовательно, настоящее изобретение предпочтительно дополнительно предусматривает способ получения биомассы, содержащей PUFA, отличающийся тем, что биомассу получают путем культивирования клеток видов семейства Thraustochytriaceae в среде для ферментации, где содержание сульфата регулируют так, чтобы на последней фазе ферментации концентрация сульфата в среде всегда составляла от 0,005 до 5 г сульфата на кг биомассы, не содержащей липидов, предпочтительно от 0,01 до 4 и наиболее предпочтительно от 0,01 до 3, 2 или 1 г сульфата на кг биомассы, не содержащей липидов, и предпочтительнее всего от 0,01 до 0,05 г сульфата на кг биомассы, не содержащей липидов.

Способы в соответствии с настоящим изобретением предпочтительно включают фазу роста и последующую фазу продуцирования масла с целью оптимизации продуцирования масла. В начальной фазе роста происходит, во-первых, культивирование и увеличение биомассы PUFA-продуцирующих клеток, присутствующих в среде для ферментации, с максимальным угнетением продуцирования масла, что ведет к тому, что в среде устанавливается наиболее высокая возможная плотность биомассы, при этом на последующей фазе продуцирования масла, которую обычно начинают с помощью конкретных действий, преимущественно происходит продуцирование масла клетками биомассы, с остановкой роста клеток по меньшей мере насколько это возможно. Это означает, что на фазе продуцирования масла увеличение биомассы по меньшей мере в первую очередь связано не с увеличением количества клеток, а с накоплением липидов внутри присутствующих клеток. Рост клеток на фазе роста становится возможным с помощью обеспечения оптимальных условий роста, при этом переход к фазе продуцирования масла можно начинать путем лимитирования отдельных или множественных лимитирующих факторов, особенно питательных компонентов, таких как, например, источники азота.

В соответствии с настоящим изобретением следует понимать, что «последняя фаза ферментации» предпочтительно обозначает фазу продуцирования масла.

Таким образом, способы в соответствии с настоящим изобретением предпочтительно отличаются тем, что сульфат присутствует в среде по меньшей мере в течение 50% периода времени фазы продуцирования масла, предпочтительно по меньшей мере в течение 75% или 85% периода времени фазы продуцирования масла, наиболее предпочтительно по меньшей мере в течение 90% или 95% периода времени фазы продуцирования масла и предпочтительнее всего в течение всей фазы продуцирования масла, но концентрация сульфата всегда находится ниже границы насыщения клеток, присутствующих в среде.

Предпочтительные способы в данном контексте отличаются тем, что сульфат присутствует в среде по меньшей мере в течение 50% оставшегося периода времени фазы продуцирования масла, предпочтительно по меньшей мере в течение 75% или 85% оставшегося периода времени фазы продуцирования масла, наиболее предпочтительно по меньшей мере в течение 90% или 95% оставшегося периода времени фазы продуцирования масла и предпочтительнее всего в течение всей фазы продуцирования масла, но концентрация сульфата всегда находится ниже границы насыщение клеток, присутствующих в среде; это значит, что в течение соответственно комплементарного исходного периода времени фазы продуцирования масла, концентрация сульфата необязательно все еще может быть выше границы насыщения клеток.

Настоящее изобретение соответственно также предусматривает способ получения биомассы, содержащей PUFA, отличающийся тем, что биомассу получают путем культивирования клеток видов семейства Thraustochytriaceae в среде для ферментации, где содержание сульфата регулируют так, чтобы по меньшей мере в течение 50% периода времени фазы продуцирования масла, предпочтительно по меньшей мере в течение 75% или 85% периода времени фазы продуцирования масла, наиболее предпочтительно по меньшей мере в течение 90% или 95% периода времени фазы продуцирования масла и предпочтительнее всего в течение всей фазы продуцирования масла, концентрация сульфата в среде всегда находится в пределах от 0,005 до 5 г сульфата на кг биомассы, не содержащей липидов, предпочтительно от 0,01 до 4 и наиболее предпочтительно от 0,01 до 3, 2 или 1 г сульфата на кг биомассы, не содержащей липидов, и предпочтительнее всего от 0,01 до 0,05 г сульфата на кг биомассы, не содержащей липидов.

Настоящее изобретение соответственно также дополнительно предусматривает способ получения биомассы, содержащей PUFA, отличающийся тем, что биомассу получают путем культивирования клеток видов семейства Thraustochytriaceae в среде для ферментации, где содержание сульфата регулируют так, чтобы по меньшей мере в течение 50% оставшегося периода времени фазы продуцирования масла, предпочтительно по меньшей мере в течение 75% или 85% оставшегося периода времени фазы продуцирования масла, наиболее предпочтительно по меньшей мере в течение 90% или 95% оставшегося периода времени фазы продуцирования масла и предпочтительнее всего в течение всей фазы продуцирования масла, концентрация сульфата в среде всегда находится в пределах от 0,005 до 5 г сульфата на кг биомассы, не содержащей липидов, предпочтительно от 0,01 до 4 и наиболее предпочтительно от 0,01 до 3, 2 или 1 г сульфата на кг биомассы, не содержащей липидов, и предпочтительнее всего от 0,01 до 0,05 г сульфата на кг биомассы, не содержащей липидов.

Настоящее изобретение дополнительно предусматривает биомассы, предпочтительно те, которые содержат клетки видов семейства Thraustochytriaceae, которые получают с помощью способов в соответствии с настоящим изобретением.

В предпочтительных вариантах осуществления в соответствии с настоящим изобретением получают биомассы, характеризующиеся содержанием сульфата, составляющим от 12 до 20 г сульфата на кг биомассы, предпочтительно от 12 до 16 г сульфата на кг биомассы.

Следовательно, в частности в настоящем изобретении также дополнительно предусмотрена биомасса, содержащая PUFA, которая характеризуется содержанием сульфата, составляющим от 12 до 20 г сульфата на кг биомассы, предпочтительно от 12 до 18 г сульфата на кг биомассы и в частности от 12 до 16 г сульфата на кг биомассы, биомасса предпочтительно содержит клетки видов семейства Thraustochytriaceae.

В соответствии с настоящим изобретением следует понимать, что «содержание сульфата» обозначает общее содержание сульфата, т.е. содержание свободного и связанного, в частности органически связанного, сульфата по отношению к биомассе. Можно предположить, что большая часть сульфата, присутствующего в биомассе, присутствует в составе экзополисахаридов, которые участвуют в образовании клеточной стенки микроорганизмов.

В соответствии с настоящим изобретением содержание сульфата предпочтительно определяют путем определения содержания серы в полученной биомассе, поскольку большая часть серы, присутствующей в биомассе, может быть отнесена к присутствию сульфата. Серу, которую можно отнести к другим источникам, можно не принимать во внимание из-за количества присутствующего сульфата. Таким образом, количество присутствующего сульфата может быть легко оценено из количества выявленной серы.

В связи с этим, содержание серы в биомассе предпочтительно определяют путем анализа элементов в соответствии с DIN EN ISO 11885. Для анализа содержания серы в биомассе подходящие аликвоты образца разрушают перед анализом предпочтительно с применением азотной кислоты и пероксида водорода при температуре 240°C под давлением так, чтобы обеспечить легкую доступность присутствующей серы.

В соответствии с настоящим изобретением следует понимать, что «биомасса», «сухая биомасса», «биомасса PUFA-продуцирующих клеток» или «сухая биомасса PUFA-продуцирующих клеток» в общем обозначает определяемую сухую биомассу.

В данном контексте количество сухой биомассы, присутствующей в образце, предпочтительно определяют следующим образом. Гомогенный образец собирают и центрифугируют для отделения жидких составляющих. После этого биомассу, полученную с помощью центрифугирования, промывают с помощью воды с целью растворения солей и любых дополнительных растворимых составляющих, а затем снова центрифугируют. Сухую биомассу, полученную таким образом, наконец высушивают в течение ночи в сушильном шкафу. В данном контексте долю в процентах сухой биомассы, присутствующей в образце, получают из отношения между массой определенной сухой биомассы после высушивания и начальной массой исследуемого образца. Сухая биомасса, установленная таким образом, также дополнительно содержит масло, образованное биомассой.

Соответственно в соответствии с настоящим изобретением следует понимать, что «биомасса, не содержащая липидов», «сухая биомасса, не содержащая липидов», «биомасса PUFA-продуцирующих клеток, не содержащая липидов» или «сухая биомасса PUFA-продуцирующих клеток, не содержащая липидов» обозначает сухую биомасса, установленную до отнимания доли жира, присутствующего в сухой биомассе.

Долю жира, присутствующего в сухой биомассе, предпочтительно определяют путем поглощения сухой биомассы раствором метанол/хлороформ и последующей обработки образца, полученного таким образом, ультразвуком. Образец, полученный таким образом, последовательно подвергают омылению с гидроксидом калия и подкисляют с применением хлористоводородной кислоты. После этого свободные жирные кислоты подвергают метилированию с применением BF3 (30% трифторид бора в метаноле) и разделяют методом распределительной хроматографии с использованием градиента температур. Затем проводят обнаружение с помощью метода обнаружения с использованием пламенной ионизации (FID). В соответствии с настоящим изобретением содержание биомассы затем определяют путем вычитания таким образом определенного содержания жира от ранее определенного содержания сухой биомассы.

В соответствии с настоящим изобретением применяют термин сухая биомасса, не содержащая липидов, поскольку граница насыщения сульфатом клеток не зависит от содержания липидов в клетках, но содержание липидов в клетках значительно повышается на фазе продуцирования масла, что значит, что количество сульфата, подлежащего добавлению, должно быть установлено, принимая во внимание общее содержание сухой биомассы, не содержащей липидов, вместо общего содержания сухой биомассы. Поскольку содержание сухой биомассы, не содержащей липидов, практически остается устойчивым после осуществления фазы продуцирования масла из-за максимального угнетения размножения клеток, в общем, не обязательно определять содержание сухой биомассы, не содержащей липидов, снова после осуществления фазы продуцирования масла.

В соответствии с настоящим изобретением требуемую концентрацию сульфата в среде можно регулировать разными способами.

В соответствии с настоящим изобретением важно то, что дозированное добавление сульфата всегда следует проводить на последней фазе ферментации, предпочтительно в конце фазы продуцирования масла (так называемый периодический способ с подпиткой). Начало дозированного добавления сульфата определяют, оценивая то, присутствует ли сульфат в исходной среде в начале ферментации и сколько его присутствует. Количество сульфата в исходной среде в принципе можно выбирать по требованию, что значит, что потребность в отношении дозированного добавления сульфата может возникать в разные моменты времени в течение ферментации.

Из требования, что сульфат должен присутствовать в среде для ферментации на последней фазе ферментации, но концентрация сульфата в ней должна быть ниже границы насыщения клеток, становится понятно, что концентрация сульфата в исходной среде представляет собой верхнюю границу, которую должны наблюдать соответственно, и которую легко рассчитать. В предпочтительном варианте осуществления количество сульфата в исходной среда выбирают так, чтобы концентрация сульфата была выше концентрации насыщение клеток по меньшей мере в течение первых 30% периода времени фазы роста клеток, предпочтительно по меньшей мере в течение первых 40%, 50% или 60% и в частности в течение первых 70%, 80% или 90% периода времени фазы роста клеток. В данном контексте концентрация сульфата составляет предпочтительно по меньшей мере 5 г сульфата на кг биомассы, не содержащей липидов, в течение указанной фазы.

Дозированное добавление сульфата нужно начинать не позже, чем перед тем, как концентрация сульфата опустится до нуля. Это обеспечивают путем непрерывного определения концентрации сульфата в среде. Предпочтительно дозированное добавление сульфата осуществляют только тогда, когда концентрация сульфата в среде падает до менее 2 г сульфата на кг биомассы, в частности до менее 1 г сульфата на кг биомассы и наиболее предпочтительно только тогда, когда концентрация сульфата в среде падает до менее 0,5 г сульфата на кг биомассы, не содержащей липидов, и в соответствии с настоящим изобретением это осуществляют только перед переходом к фазе продуцирования масла для оптимизации продуцирования масла. В одном наиболее предпочтительном варианте осуществления в соответствии с настоящим изобретением концентрация сульфата в среде, следовательно, падает только прямо перед началом фазы продуцирования масла, предпочтительно за 3 часа, в частности за 2 часа и предпочтительнее всего за один час до начала фазы продуцирования масла, менее 2 г, в частности менее 1 г и наиболее предпочтительно менее 0,5 г сульфата на кг биомассы, не содержащей липидов.

Вместо изначальной загрузки относительно большого количества сульфата в исходную среду в качестве альтернативы также возможно осуществлять дозированное добавление сульфата уже во время фазы роста клеток. В данном контексте дозированное добавление сульфата на фазе роста соответственно осуществляют так, чтобы количество сульфата всегда находилось выше концентрации насыщения клеток, и составляло предпочтительно при по меньшей мере 5 г сульфата на кг биомассы, по меньшей мере во время первой фазы роста. На последующей фазе продуцирования масла дозированное добавление сульфата соответственно снижают, что приводит к тому, что концентрация сульфата на фазе продуцирования масла или прямо перед началом фазы продуцирования масла опускается ниже концентрации насыщения клеток, предпочтительно ниже 5 г сульфата на кг биомассы, не содержащей липидов, наиболее предпочтительно ниже 3, 2 или 1 г сульфата на кг биомассы, не содержащей липидов, и предпочтительнее всего ниже 0,5 г сульфата на кг биомассы, не содержащей липидов.

В дополнительном варианте осуществления в соответствии с настоящим изобретением сульфат указан в количестве, которое приводит к тому, что концентрация сульфата в течение всего процесса ферментации или по меньшей мере в течение большей части времени всего процесса ферментации всегда находится ниже концентрации насыщения клеток, предпочтительно ниже 5 г сульфата на кг биомассы, не содержащей липидов, и в частности ниже 4, 3, 2 или 1 г сульфата на кг биомассы, не содержащей липидов.

Поскольку в способе важно, чтобы концентрация сульфата не опускалась до нуля, возможно, особенно когда в ходе ферментации обнаруживается, что количество полученной биомассы превышает первоначально рассчитанное значение, обеспечить предупреждение понижения концентрации сульфата до нуля с помощью подходящего регулирования дозировано добавляемого количества сульфата.

В одном предпочтительном варианте осуществления в соответствии с настоящим изобретением осуществляют непрерывное дозированное сульфата в среду для ферментации в течение большей части времени фазы продуцирования масла, предпочтительно по меньшей мере в течение 50%, 60% или 70% периода времени фазы продуцирования масла и наиболее предпочтительно по меньшей мере в течение последних 50%, 60% или 70% периода времени фазы продуцирования масла, в малом количестве, предпочтительно в количестве, составляющем от 5 до 100 мг, предпочтительно от 10 до 50 мг на кг среды для ферментации.

В соответствии с настоящим изобретением применяемая сульфатная соль предпочтительно представляет собой сульфат натрия, сульфат аммония или сульфат магния, а также их смеси. В соответствии с настоящим изобретением подачу сульфата, в качестве альтернативы или дополнительно можно также осуществлять путем применения промышленных исходных материалов, которые загрязнены или дополнены сульфатом.

В соответствии с настоящим изобретением дополнительно выяснили, что, неожиданно, низкую концентрацию сульфата можно также объединять с низкими концентрациями хлорида, что значит, что биомассу можно получать с применением не вызывающей коррозии среды для ферментации.

Следовательно, способ в соответствии с настоящим изобретением предпочтительно дополнительно отличается средой для ферментации, применяемой в соответствии с настоящим изобретением, характеризующейся концентрацией хлорида, составляющей менее 1 г/л, в частности менее 500 мг/л и предпочтительно менее 250 мг/л, в течение всей ферментации.

Биомассы в соответствии с настоящим изобретением предпочтительно характеризуются содержанием хлорида, составляющим не более 2 г на кг биомассы, в частности от 0,5 до 1,8 г и наиболее предпочтительно 0,5 до 1,5 г на кг биомассы.

В соответствии с настоящим изобретением следует понимать, что «содержание хлорида» обозначает количество выявляемого хлора. Количество присутствующего хлора можно, например, определять путем элементного анализа в соответствии с DIN EN ISO 11885. Хлор присутствует в биомассе в форме солей, которые называются «хлоридами». Если в настоящей заявке упоминаются «хлориды» или «хлоридные ионы», они всегда обозначают только количество хлорида или выявляемого хлора и не обозначают количество хлоридных солей, которые также всегда содержат катионные противоионы помимо хлоридных ионов.

PUFA-продуцирующие клетки предпочтительно представляют собой клетки, которые уже естественным образом продуцируют PUFA; однако, они также могут представлять собой клетки, сконструированные способными к продуцированию PUFA путем подходящих способов генной инженерии. Продуцирование в данном контексте может быть автотрофным, миксотрофным или гетеротрофным.

Биомасса в соответствии с настоящим изобретением соответственно содержит такие клетки и предпочтительно по сути состоит из таких клеток.

Предпочтительно клетки представляют собой клетки, которые продуцируют PUFA гетеротрофно. В соответствии с настоящим изобретением клетки предпочтительно представляют собой клетки водорослей, грибов, в частности дрожжей или протистов. Наиболее предпочтительно клетки представляют собой микроорганизмы, в частности одноклеточные водоросли или грибы.

Подходящие клетки продуцирующих масло дрожжей представляют собой, в частности, клетки штаммов Yarrowia, Candida, Rhodotorula, Rhodosporidium, Cryptococcus, Trichosporon и Lipomyces.

Клетки предпочтительно представляют собой клетки представителей из таксона Labyrinthulomycetes (Labyrinthulea), в частности виды семейства Thraustochytriaceae. Семейство Thraustochytriaceae включает роды Althornia, Aplanochytrium, Elina, Japonochytrium, Schizochytrium, Thraustochytrium, Aurantiochytrium, Oblongichytrium и Ulkenia. Особое предпочтение отдают клеткам рода Thraustochytrium, Schizochytrium, Aurantiochytrium или Oblongichytrium, особенно клеткам рода Aurantiochytrium. Наиболее предпочтительный штамм представляет собой штамм Aurantiochytrium limacinum SR21 (IFO 32693).

Биомасса в соответствии с настоящим изобретением предпочтительно представляет собой продукт, полученный способом ферментативного культивирования. Соответственно, биомасса может содержать не только клетки, подлежащие разрушению, но также составляющие среды для ферментации. Такие составляющие могут представлять собой, в частности, соли, противовспенивающие средства и непрореагировавший источник углерода и/или источник азота. Содержание клеток в данной биомассе составляет предпочтительно по меньшей мере 70% по весу, предпочтительно по меньшей мере 75% по весу. Необязательно содержание клеток в биомассе может быть повышено путем подходящих стадий промывки, например, до по меньшей мере 80 или по меньшей мере 90% по весу перед проведением процесса разрушения клеток. Однако, полученную биомассу можно также применять непосредственно в способе разрушения клеток.

Клетки в биомассе предпочтительно характеризуются тем, что они содержат по меньшей мере 20% по весу, предпочтительно по меньшей мере 30% по весу, в частности по меньшей мере 40% по весу PUFA, в каждом случае в пересчете на сухой вес клеток.

В предпочтительном варианте осуществления большая часть липидов присутствует в форме триглицеридов, при этом предпочтительно по меньшей мере 50% по весу, в частности по меньшей мере 75% по весу, и в особенно предпочтительном варианте осуществления по меньшей мере 90% по весу липидов присутствуют в клетке в форме триглицеридов.

Предпочтительно по меньшей мере 10% по весу, в частности по меньшей мере 20% по весу, особенно предпочтительно от 20 до 60% по весу, в частности от 20 до 40% по весу жирных кислот, присутствующих в клетке, представляют собой PUFA.

В соответствии с настоящим изобретением следует понимать, что полиненасыщенные жирные кислоты (PUFA) обозначают жирные кислоты, имеющие по меньшей мере две двойные связи C-C. В соответствии с настоящим изобретением высоконенасыщенные жирные кислоты (HUFA) являются предпочтительными среди PUFA. В соответствии с настоящим изобретением подразумевается, что HUFA означают жирные кислоты, имеющие по меньшей мере четыре двойные C-C-связи.

PUFA могут присутствовать в клетке в свободной форме или в связанной форме. Примеры наличия в связанной форме представляют собой фосфолипиды и сложные эфиры PUFA, в частности моноацил-, диацил- и триацилглицериды. В предпочтительном варианте осуществления большинство PUFA присутствует в форме триглицеридов, при этом предпочтительно по меньшей мере 50% по весу, в частности по меньшей мере 75% по весу, и в особенно предпочтительном варианте осуществления по меньшей мере 90% по весу присутствующих PUFA присутствуют в клетке в форме триглицеридов.

Предпочтительными PUFA являются омега-3 жирные кислоты и омега-6 жирные кислоты, при этом омега-3 жирные кислоты являются особенно предпочтительными. Предпочтительные омега-3 жирные кислоты в данном контексте представляют собой эйкозaпентаноевую кислоту (EPA, 20:5ω-3), в частности (5Z,8Z,11Z,14Z,17Z)-эйкоза-5,8,11,14,17-пентаноевую кислоту и докозагексаноевую кислоту (DHA, 22:6ω-3), в частности (4Z,7Z,10Z,13Z,16Z,19Z)-докоза-4,7,10,13,16,19-гексаноевую кислоту, при этом докозагексаноевая кислота является особенно предпочтительной.

Способы получения PUFA-содержащих клеток, особенно из порядка Thraustochytriales, были подробно описаны в предшествующем уровне техники (см., например, WO91/07498, WO94/08467, WO97/37032, WO97/36996, WO01/54510). Продуцирование в общем осуществляется клетками, которые культивируют в ферментере в присутствии источника углерода и источника азота. В данном контексте могут быть достигнуты значения плотности биомассы, составляющие более 100 грамм на литр, и значения скорости продуцирования, составляющие более 0,5 грамм липида на литр в час. Способ предпочтительно осуществляют как так называемый периодический способ с подпиткой, т.е. источник углерода и возможно также источники азота и фосфата подают постепенно в течение ферментации. Когда необходимое количество биомассы достигнуто, продуцирование липидов может быть индуцировано различными действиями, например путем лимитирования источника азота, источника фосфата или содержания кислорода или их комбинаций.

Подходящие источники углерода представляют собой как спиртовые, так и неспиртовые источники углерода. Примеры спиртовых источников углерода представляют собой метанол, этанол и изопропанол. Примеры неспиртовых источников углерода представляют собой фруктозу, глюкозу, сахарозу, мелассу, крахмал и кукурузную патоку, а также органические кислоты, такие как уксусная кислота, пропионовая кислота и жирные кислоты со средними и длинными цепями и их соли. Предпочтительные способы в соответствии с настоящим изобретением отличаются тем, что по меньшей мере один источник углерода непрерывно дозируют в среду в течение всего процесса ферментации.

Подходящие источники азота представляют собой как неорганические, так и органические источники азота. Примеры неорганических источников азота представляют собой нитраты и соли аммония, в частности сульфат аммония и гидроксид аммония. Примеры органических источников азота представляют собой аминокислоты, в частности глутамат и мочевину.

В соответствии с настоящим изобретением осуществление фазы продуцирования масла предпочтительно проводят как описано в WO 01/54510, лимитируя по меньшей мере один лимитирующий питательный компонент, предпочтительно лимитируя по меньшей мере один источник азота.

Содержание хлорида в среде для ферментации всегда составляет предпочтительно менее 2 г/л, в частности менее 1 г/л, предпочтительно менее 500 мг/л и наиболее предпочтительно менее 250 мг/л, предпочтительно в течение всей ферментации, но по меньшей мере в течение фазы продуцирования масла.

В дополнение к применяемым сульфатам и любым хлоридам, также возможно в течение ферментации необязательно использовать дополнительные соли, особенно соли, выбранные из карбоната натрия, гидрокарбоната натрия, кальцинированной соды или соединений неорганического фосфора. Если применяют дополнительные соли, каждую из них предпочтительно применяют в количестве, составляющем менее 12 г/л, в частности менее 8 г/л и наиболее предпочтительно менее 5 г/л. Общее содержание соли в среде для ферментации составляет предпочтительно от 5 до 30 г/л, в частности от 10 до 20 г/л в начале основного этапа ферментации.

Кроме того, для обеспечения положительного эффекта в отношении ферментации, также можно добавлять органические соединения фосфора и/или известные стимулирующие рост вещества, такие как, например, дрожжевой экстракт или жидкий кукурузный экстракт.

Клетки ферментируют предпочтительно при pH от 3 до 11, в частности от 4 до 10 и предпочтительно при температуре, составляющей по меньшей мере 20°C, в частности от 20°C до 40°C и наиболее предпочтительно по меньшей мере 30°C. Обычный способ ферментации занимает до приблизительно 100 часов.

В соответствии с настоящим изобретением клетки предпочтительно ферментируют до момента, когда плотность биомассы составляет по меньшей мере 50, 60 или 70 г/л, в частности от 50 до 250 г/л или от 60 до 220 г/л, предпочтительно по меньшей мере от 80 или 90 г/л, в частности от 80 до 200 г/л, наиболее предпочтительно по меньшей мере 100 г/л и в частности от 100 до 180 г/л. В данном контексте данные основаны на содержании сухой биомассы по отношению к общему объему ферментационного бульона после завершения ферментации. Содержание сухой биомассы определяют путем фильтрации биомассы из ферментационного бульона, последующего промывания с помощью воды, а затем полного высушивания, например, в микроволновой печи, и, наконец, определения сухого веса.

В одном предпочтительном варианте осуществления в соответствии с настоящим изобретением концентрация сульфата опускается ниже концентрации, составляющей 5 г сульфата на кг биомассы, не содержащей липидов, предпочтительно ниже 4, 3, 2 или 1 г сульфата на кг биомассы, не содержащей липидов, и в частности ниже 0,5, 0,1 или 0,05 г сульфата на кг биомассы, не содержащей липидов, прямо перед началом фазы продуцирования масла, предпочтительно после того, как плотность биомассы достигает по меньшей мере 50 г, наиболее предпочтительно по меньшей мере 80, 100, 120 или 140 г на литр среды для ферментации и предпочтительно также остается ниже данной концентрации в течение оставшегося времени ферментации.

После сбора клеток или необязательно даже незадолго перед сбором клеток клетки предпочтительно пастеризуют с целью уничтожения клеток и инактивации ферментов, которые могут способствовать разрушению липидов.

После завершения ферментации полученный ферментационный бульон можно подвергать способу выделения масла непосредственно или необязательно после предшествующего концентрирования с целью выделения присутствующего масла. Такие способы выделения масла, например, описаны в WO 01/53512 и WO 2011/153246.

В качестве альтернативы после завершения ферментации также можно собирать биомассу, содержащую PUFA. С этой целью ферментационный бульон предпочтительно также сначала концентрируют.

В соответствии с настоящим изобретением ферментационный бульон предпочтительно концентрируют посредством центрифугирования, фильтрации, декантирования и/или выпаривания растворителя с целью сначала отделить большую часть среды для ферментации от биомассы. Выпаривание растворителя предпочтительно достигается с применением сушильного барабана, сушильного устройства туннельного типа, с помощью метода распылительного высушивания или вакуумного выпаривания. В частности, выпаривание растворителя также может достигаться с применением роторного испарителя, тонкопленочного испарителя или выпарного аппарата с падающей пленкой. Подходящей альтернативой выпариванию растворителя является, например, обратный осмос для концентрирования ферментационного бульона.

Для получения биомассы концентрированный ферментационный бульон, полученный таким образом, предпочтительно дополнительно высушивают, предпочтительно путем грануляции в псевдоожиженном слое. Предпочтительно содержание влаги в биомассе снижают до менее 15% по весу, в частности до менее 10% по весу и наиболее предпочтительно до менее 5% по весу с помощью последующего процесса высушивания.

В частности в одном предпочтительном варианте осуществления в соответствии с настоящим изобретением биомассу высушивают в соответствии с настоящим изобретением путем грануляции в псевдоожиженном слое или путем высушивания с форсуночным распылением, как описано, например, в WO 2015/052048.

Во время высушивания к биомассе необязательно добавляют диоксид кремния в качестве средства против слеживания, поэтому биомассу можно преобразовывать в более легкое для регуляции состояние. Для этой цели ферментационный бульон, содержащий биомассу и также диоксид кремния, предпочтительно распыляют в определенную зону сушки. В качестве альтернативы биомассу предпочтительно смешивают с диоксидом кремния только после процесса высушивания. В связи с этим также приведена ссылка, в частности, на патентную заявку WO 2015/052048.

В предпочтительном варианте осуществления биомасса, подлежащая применению в соответствии с настоящим изобретением, характеризуется концентрацией диоксида кремния, в частности гидрофильного или гидрофобного диоксида кремния, составляющей от 0,2 до 10% по весу, в частности от 0,5 до 5% по весу, особенно от 0,5 до 2% по весу после процесса высушивания.

Сыпучий, мелкозернистый или крупнозернистый продукт, предпочтительно гранулят, предпочтительно получают способом высушивания. Продукт, характеризующийся желаемым размером частиц необязательно можно получать из гранулята, полученного путем просеивания или отделения пыли.

В результате получали сыпучий мелкозернистый порошок, который необязательно можно преобразовать в крупнозернистый, легко сыпучий и в значительной степени не содержащий пыли продукт, который можно готовить к хранению с помощью подходящих способов прессования или гранулирования.

Традиционные органические или неорганические вспомогательные средства или носители, такие как крахмал, желатин, производные целлюлозы или подобные вещества, которые, как правило, применяются в пищевой переработке или кормовой переработке в качестве связующих средств, гелеобразующих средств или загустителей, необязательно можно применять в данном последовательном процессе грануляции или уплотнения.

В соответствии с настоящим изобретением следует понимать, что «сыпучий» обозначает порошок, который может беспрепятственно высыпаться из ряда стеклянных проточных сосудов, имеющих выпускные отверстия разного размера, по меньшей мере, из сосуда, имеющего отверстие 5 миллиметров (Klein: Seifen, Öle, Fette, Wachse 94, 12 (1968)).

В соответствии с настоящим изобретением следует понимать, что «мелкозернистый» обозначает порошок, имеющий преобладающую фракцию (>50%) с размером частиц, диаметр которых составляет от 20 до 100 микрометров.

В соответствии с настоящим изобретением следует понимать, что «крупнозернистый» обозначает порошок, имеющий преобладающую фракцию (>50%) с размером частиц, диаметр которых составляет от 100 до 2500 микрометров.

В соответствии с настоящим изобретением следует понимать, что «не содержащий пыли» обозначает порошок, содержащий только малое количество фракций (<10%, предпочтительно <5%) с размером частиц, составляющим менее 100 микрометров.

Размер частиц предпочтительно определяют в соответствии с настоящим изобретением путем спектрометрических способов с использованием лазерной дифракции. Применимые способы описаны в учебнике “Teilchengrößenmessung in der Laborpraxis” [Particle size measurement in laboratory practice] by R. H. Müller and R. Schuhmann, Wissenschaftliche Verlagsgesellschaft Stuttgart (1996) и в учебнике “Introduction to Particle Technology” by M. Rhodes, Wiley & Sons (1998). Поскольку могут использоваться различные способы, предпочтительно применяют первый упомянутый применимый способ из учебника R.H. Müller и R. Schuhmann для измерения размера частиц.

Продукты, полученные с помощью способа высушивания в соответствии с настоящим изобретением, предпочтительно имеют фракцию, составляющую по меньшей мере 80% по весу, в частности по меньшей мере 90% по весу, наиболее предпочтительно по меньшей мере 95% по весу, частиц, характеризующихся размером частиц, составляющим от 100 до 3500 микрометров, предпочтительно от 100 до 3000 микрометров, предпочтительнее всего от 100 до 2500 микрометров.

Продукты, полученные с помощью способа грануляции в псевдоожиженном слое в соответствии с настоящим изобретением, предпочтительно в данном случае имеют фракцию, составляющую по меньшей мере 80% по весу, в частности по меньшей мере 90% по весу, наиболее предпочтительно по меньшей мере 95% по весу, частиц, характеризующихся размером частиц, составляющим от 200 до 3500 микрометров, предпочтительно от 300 до 3000 микрометров, предпочтительнее всего от 500 до 2500 микрометров.

Продукты, полученные с помощью способа распылительного высушивания в соответствии с настоящим изобретением, напротив, предпочтительно имеют фракцию, составляющую по меньшей мере 80% по весу, в частности по меньшей мере 90% по весу, наиболее предпочтительно по меньшей мере 95% по весу, частиц, характеризующихся размером частиц, составляющим от 100 до 500 микрометров, предпочтительно от 100 до 400 микрометров, предпочтительнее всего от 100 до 300 микрометров.

Продукты, полученные с помощью способа распылительного высушивания и последующего способа грануляции в соответствии с настоящим изобретением, предпочтительно имеют фракцию, составляющую по меньшей мере 80% по весу, в частности по меньшей мере 90% по весу, наиболее предпочтительно по меньшей мере 95% по весу, частиц, характеризующихся размером частиц, составляющим от 100 до 1000 микрометров.

Фракция пыли, т.е. частиц, характеризующихся размером частиц, составляющим менее 100 микрометров, присутствует предпочтительно в количестве, составляющем не более 10% по весу, в частности не более 8% по весу, наиболее предпочтительно не более 5% по весу, предпочтительнее всего не более 3% по весу.

Объемная плотность продуктов в соответствии с настоящим изобретением предпочтительно составляет от 400 до 800 кг/м³, наиболее предпочтительно от 450 до 700 кг/м³.

Следовательно, настоящее изобретение также дополнительно предусматривает кормовой продукт, содержащий биомассу в соответствии с настоящим изобретением, а также дополнительный кормовые ингредиенты.

В связи с этим дополнительные кормовые ингредиенты предпочтительно выбраны из компонентов, содержащих белок, содержащих углевод, содержащий нуклеиновую кислоту, и компонентов, растворимых в липидах, и, при необходимости, дополнительных компонентов, содержащих жир, и, кроме того, из ряда других добавок, таких как минералы, витамины, пигменты и аминокислоты. Кроме того, помимо питательных веществ также могут присутствовать структурообразующие компоненты, например, для того, чтобы улучшить текстуру или внешний вид кормового продукта. Кроме того, также возможно применять, например, связующие средства для того, чтобы изменять консистенцию кормового продукта. Компонент, который предпочтительно используют и который является как питательным компонентом, так и структурообразующим компонентом, представляет собой крахмал.

В соответствии с настоящим изобретением кормовой продукт в соответствии с настоящим изобретением или композиция, используемая для получения кормового продукта в соответствии с настоящим изобретением, предпочтительно отличается тем, что он содержит биомассу в соответствии с настоящим изобретением в количестве, составляющем от 1 до 25% по весу, предпочтительно от 2 до 20% по весу, в частности от 3 до 15% по весу, предпочтительнее всего от 4 до 12% по весу.

Указанный кормовой продукт или композиция, используемая для получения кормового продукта, предпочтительно дополнительно характеризуются по меньшей мере одним, предпочтительно всеми из следующих свойств:

a) общее содержание белка составляет от 33 до 67% по весу, предпочтительно от 39 до 61% по весу, в частности от 44 до 55% по весу;

b) общее содержание жира составляет от 5 до 25% по весу, предпочтительно от 8 до 22% по весу, в частности от 10 до 20% по весу, предпочтительнее всего от 12 до 18% по весу;

c) общее содержание крахмала составляет не более 25% по весу, в частности не более 20% по весу, предпочтительно от 6 до 17% по весу, особенно предпочтительно от 8 до 14% по весу;

d) содержание полиненасыщенных жирных кислот (PUFA) составляет от 2 до 13% по весу, предпочтительно от 3 до 11% по весу, в частности от 4 до 10% по весу, предпочтительнее всего от 5,5 до 9% по весу;

e) содержание омега-3 жирных кислот составляет от 1 до 7% по весу, предпочтительно от 1,5 до 5,5% по весу, в частности от 2 до 5% по весу, предпочтительнее всего от 2,5 до 4,5% по весу;

f) содержание DHA составляет от 0,5 до 3% по весу, предпочтительно от 0,8 до 2,8% по весу, в частности от 1 до 2,8% по весу, предпочтительнее всего от 1,3 до 2,4% по весу, в частности от 1,3 до 2,2% по весу.

Следовательно, настоящее изобретение предпочтительно также предусматривает кормовой продукт или композицию, подходящую для получения кормового продукта, характеризующиеся по меньшей мере одним, предпочтительно всеми из следующих свойств:

d) содержание биомассы в соответствии с настоящим изобретением, в частности биомассы Labyrinthulea в соответствии с настоящим изобретением, предпочтительно биомассы Thraustochytriaceae в соответствии с настоящим изобретением, составляет от 2 до 24% по весу, предпочтительно от 4 до 22% по весу, в частности от 9 до 20% по весу, предпочтительнее всего от 11 до 18% по весу;

e) содержание полиненасыщенных жирных кислот (PUFA) составляет от 2 до 13% по весу, предпочтительно от 3 до 11% по весу, в частности от 4 до 10% по весу, предпочтительнее всего от 5,5 до 9% по весу;

f) содержание омега-3 жирных кислот составляет от 1 до 7% по весу, предпочтительно от 1,5 до 5,5% по весу, в частности от 2 до 5% по весу, предпочтительнее всего от 2,5 до 4,5% по весу;

g) содержание DHA составляет от 0,5 до 3% по весу, предпочтительно от 0,8 до 2,8% по весу, в частности от 1 до 2,8% по весу, предпочтительнее всего от 1,3 до 2,4% по весу, в частности от 1,3 до 2,2% по весу.

a) общее содержание белка составляет от 33 до 67% по весу, предпочтительно от 39 до 61% по весу, в частности от 40 до 50% по весу;

d) содержание биомассы Aurantiochytrium или Schizochytrium в соответствии с настоящим изобретением, предпочтительно биомассы Aurantiochytrium limacinum в соответствии с настоящим изобретением, предпочтительнее всего биомассы Aurantiochytrium limacinum SR21 в соответствии с настоящим изобретением, составляет от 1 до 25% по весу, предпочтительно от 2 до 20% по весу, в частности от 3 до 15% по весу, предпочтительнее всего от 4 до 12% по весу;

Путем экструзии вышеуказанных композиции можно получать экструдат. Настоящее изобретение предпочтительно предусматривает указанные экструдаты. В связи с этим экструзию кормового продукта предпочтительно осуществляют с потребляемой мощностью, составляющей 12–28 ватт-час/кг, в частности 14–26 ватт-час/кг, особенно предпочтительно 16–24 ватт-час/кг, предпочтительнее всего 18–22 ватт-час/кг.

В связи с этим предпочтительно используют одношнековый или двухшнековый экструдер в способе экструзии. Экструзию предпочтительно проводят при температуре, составляющей 80–220°C, в частности 80–130°C, предпочтительнее всего 95–110°C, при давлении, составляющем 10–40 бар, и при скорости вращения валов, составляющей 100–1000 об/мин, в частности 300–700 об/мин. Время выдерживания вводимой смеси составляет предпочтительно 5-30 секунд, в частности 10-20 секунд.

Способ экструзии может необязательно включать стадию прессования и/или стадию уплотнения.

Предпочтительно непосредственно смешивать компоненты друг с другом перед проведением способа экструзии. Его предпочтительно проводят в барабане, оснащенном лопастями. В предпочтительном варианте осуществления данная стадия смешивания включает нагнетание пара, в частности для того, чтобы вызвать набухание крахмала, который предпочтительно присутствует. В связи с этим нагнетание пара предпочтительно проводят при давлении, составляющем от 1 до 5 бар, наиболее предпочтительно при давлении, составляющем от 2 до 4 бар.

Перед смешиванием с биомассой водорослей дополнительные кормовые ингредиенты предпочтительно измельчают, если требуется, для того, чтобы обеспечить получение гомогенной смеси на стадии смешивания. Измельчение дополнительных кормовых ингредиентов можно проводить, например, с применением молотковой мельницы.

Полученный экструдат предпочтительно характеризуется диаметром, составляющим от 1 до 14 мм, предпочтительно от 2 до 12 мм, в частности от 2 до 6 мм, и предпочтительно также характеризуется длиной, составляющей от 1 до 14 мм, предпочтительно от 2 до 12 мм, в частности от 2 до 6 мм. Длину экструдата устанавливают во время экструзии путем применения режущего инструмента. Длина экструдата предпочтительно выбрана так, чтобы она приблизительно соответствовала диаметру экструдата. Диаметр экструдата определяется выбором диаметра сита.

В одном предпочтительном варианте осуществления в соответствии с настоящим изобретением после экструзии полученный экструдат загружают маслом. С этой целью экструдат предпочтительно сперва высушивают до содержания влаги, составляющего не более 5% по весу. В соответствии с настоящим изобретением продукт экструзии можно загружать маслом путем, например, помещения экструдата в масло или обрызгивания экструдата маслом; однако в соответствии с настоящим изобретением предпочтение отдают вакуумному нанесению покрытия.

Таким образом получают кормовые продукты, которые содержат биомассы в соответствии с настоящим изобретением предпочтительно в количестве, составляющем от 1 до 25% по весу, в частности от 2 до 20% по весу, особенно предпочтительно от 3 до 15% по весу, предпочтительнее всего от 4 до 12% по весу.

Соответственно, указанные кормовые продукты предпочтительно дополнительно характеризуются по меньшей мере одним, предпочтительно всеми из следующих свойств:

a) общее содержание белка составляет от 30 до 60% по весу, предпочтительно от 35 до 55% по весу, в частности от 40 до 50% по весу;

b) общее содержание жира составляет от 15 до 35% по весу, предпочтительно от 18 до 32% по весу, в частности от 20 до 30% по весу, предпочтительнее всего от 22 до 28% по весу;

c) общее содержание крахмала составляет не более 25% по весу, в частности не более 20% по весу, предпочтительно от 5 до 15% по весу, особенно предпочтительно от 7 до 13% по весу;

d) содержание полиненасыщенных жирных кислот (PUFA) составляет от 2 до 12% по весу, предпочтительно от 3 до 10% по весу, в частности от 4 до 9% по весу, предпочтительнее всего от 5 до 8% по весу;

e) содержание омега-3 жирных кислот составляет от 1 до 6% по весу, предпочтительно от 1,5 до 5% по весу, в частности от 2 до 4,5% по весу, предпочтительнее всего от 2,5 до 4% по весу;

f) содержание DHA составляет от 0,5 до 3% по весу, предпочтительно от 0,8 до 2,5% по весу, в частности от 1 до 2,5% по весу, предпочтительнее всего от 1,2 до 2,2% по весу, в частности от 1,2 до 2,0% по весу.

Следовательно, настоящее изобретение предпочтительно также предусматривает кормовой продукт, в частности экструдат, характеризующийся по меньшей мере одним, предпочтительно всеми из следующих свойств:

d) содержание биомассы в соответствии с настоящим изобретением, в частности биомассы Labyrinthulea в соответствии с настоящим изобретением, предпочтительно биомассы Thraustochytriaceae в соответствии с настоящим изобретением, составляет от 1 до 25% по весу, предпочтительно от 2 до 20% по весу, в частности от 3 до 15% по весу, предпочтительнее всего от 4 до 12% по весу;

e) содержание полиненасыщенных жирных кислот (PUFA) составляет от 2 до 12% по весу, предпочтительно от 3 до 10% по весу, в частности от 4 до 9% по весу, предпочтительнее всего от 5 до 8% по весу;

f) содержание омега-3 жирных кислот составляет от 1 до 6% по весу, предпочтительно от 1,5 до 5% по весу, в частности от 2 до 4,5% по весу, предпочтительнее всего от 2,5 до 4% по весу;

g) содержание DHA составляет от 0,5 до 3% по весу, предпочтительно от 0,8 до 2,5% по весу, в частности от 1 до 2,5% по весу, предпочтительнее всего от 1,2 до 2,2% по весу, в частности от 1,2 до 2,0% по весу.

В соответствии с настоящим изобретением применяемый компонент, содержащий жир, помимо биомассы, подлежащей применению в соответствии с настоящим изобретением, может представлять собой жиры, в частности масла, как животного, так и растительного происхождения. В соответствии с настоящим изобретением подходящие компоненты, содержащие жир, представляют собой в частности растительные масла, например соевое масло, рапсовое масло, подсолнечное масло, льняное масло или пальмовое масло и их смеси. Кроме того, в малых количествах можно также необязательно применять рыбий жир в качестве компонента, содержащего жир.

В соответствии с настоящим изобретением применяемый компонент, содержащий белок, может представлять собой, например, соевый белок, гороховый белок, пшеничный глютен или кукурузный глютен и их смеси.

Следующие примеры можно использовать в качестве компонентов, содержащих белок, которые дополнительно содержат жиры: рыбную муку, муку из криля, муку из моллюсков, муку из кальмаров или раковины креветок. Ниже они обобщены в данном документе под термином «мука из морепродуктов». В предпочтительном варианте осуществления кормовой продукт в соответствии с настоящим изобретением содержит муку из морепродуктов, предпочтительно рыбную муку, в количестве, составляющем от 3 до 18% по весу, в частности от 5 до 15% по весу, предпочтительнее всего от 7 до 13% по весу.

Применяемый компонент, содержащий углевод, может представлять собой, например, пшеничную муку, подсолнечную муку или соевую муку и их смеси.

При применении кормовых продуктов в соответствии с настоящим изобретением, в частности экструдата, покрытого маслом в соответствии с настоящим изобретением, в животноводстве становится заметно, что они значительно способствуют росту животных и способствуют улучшению в отношении уровня стресса у животных.

Настоящее изобретение также дополнительно предусматривает способ разведения животных, характеризующийся тем, что им вводят в рацион кормовой продукт в соответствии с настоящим изобретением.

В связи с этим настоящее изобретение, в частности, предусматривает способ улучшения роста животных, характеризующийся тем, что им вводят в рацион кормовой продукт в соответствии с настоящим изобретением.

Настоящее изобретение дополнительно предусматривает, в частности, аналогичный способ улучшения в отношении фракции омега-3 жирных кислот, в частности DHA, в мышечной ткани животных, характеризующийся тем, что им вводят в рацион кормовой продукт в соответствии с настоящим изобретением.

Предпочтительно в способе в соответствии с настоящим изобретением кормовой продукт вводят в рацион по меньшей мере раз в два дня, предпочтительно по меньшей мере раз в день.

Настоящее изобретение дополнительно предусматривает аналогичное применение кормового продукта в соответствии с настоящим изобретением, предназначенное для улучшения роста животных.

Настоящее изобретение дополнительно предусматривает аналогичное применение кормового продукта в соответствии с настоящим изобретением, предназначенное для улучшения в отношении фракции омега-3 жирных кислот в мышечной ткани животных.

Настоящее изобретение дополнительно предусматривает аналогичное применение кормового продукта в соответствии с настоящим изобретением, предназначенное для улучшения физического состояния животных, в частности для осуществления улучшения в отношении уровня стресса у животных.

Настоящее изобретение дополнительно предусматривает аналогичное применение кормового продукта в соответствии с настоящим изобретением, предназначенное для обеспечения разведения животных со сниженным уровнем стресса.

Животные, которых разводят, которых вскармливают кормовым продуктом в соответствии с настоящим изобретением, предпочтительно представляют собой домашнюю птицу, свиней или крупный рогатый скот.

Однако животные, которых разводят, особенно предпочтительно представляют собой морских животных, особенно предпочтительно костных рыб или ракообразных. Указанные выше включают, в частности, карпа, тилапию, сома, тунца, лосося, форель, белого морского окуня, леща, окуня, треску, пресноводных креветок, омаров, крабов, глубоководных креветок и раков. Животные, которых разводят, особенно предпочтительно представляют собой лосося. Предпочтительными типами лосося в данном контексте являются атлантический лосось, нерка, лосось мазу, чавыча, кетовый лосось, кижуч, дунайский лосось, тихоокеанский лосось и горбуша.

Животные, которых разводят, могут в частности также представлять собой рыбу, которую впоследствии перерабатывают в рыбную муку или рыбий жир. В связи с этим рыба предпочтительно представляет собой сельдь, минтай, менхэден, анчоусы, мойву или треску. Рыбную муку или рыбное масло, полученные таким образом, в свою очередь можно применять в рыбном хозяйстве для разведения съедобной рыбы или ракообразных.

Однако животные, которых разводят, могут также представлять собой небольшие организмы, которые применяют в качестве кормового продукта в рыбном хозяйстве. Такие небольшие организмы могут представлять собой, например, нематод, ракообразных или коловраток.

Разведение морских животных можно осуществлять в прудах, резервуарах, бассейнах или на отдельных участках в море или в озерах, в частности в этом случае в садках или загонах с сеткой. Разведение можно применять для разведения готовой съедобной рыбы, но также можно применять для выращивания мальков, которые впоследствии выпускаются для пополнения запасов диких рыб.

При выращивании лосося рыбу предпочтительно сначала выращивают в смолтов в пресноводных резервуарах или искусственных водотоках, а затем выращивают в садках или загонах с сеткой, которые плавают в море и которые предпочтительно ставят на якорь в заливах или фьордах.

Соответственно, кормовой продукт в соответствии с настоящим изобретением представляет собой предпочтительно кормовой продукт, предназначенный для применения в разведении вышеуказанных животных.

Иллюстративные варианты осуществления

Пример 1. Получение биомассы путем ферментации Aurantiochytrium limacinum SR21 в среде, характеризующейся высоким содержанием сульфата, и последующее высушивание биомассы

Композиция исходной среды состояла из следующего:

среда 1: 20 г/кг глюкозы; 4 г/кг дрожжевого экстракта; 2 г/кг сульфата аммония; 12 или 16 г/кг сульфата натрия; 2,46 г/кг сульфата магния (гептагидрат); 0,45 г/кг хлорида калия; 4,5 г/кг дигидрофосфата калия; 0,1 г/кг тиамина (HCl); 5 г/кг раствора микроэлементов.

Композиция раствора микроэлементов состояла из следующего: 35 г/кг хлористоводородной кислоты (37%); 1,86 г/кг хлорида марганца (тетрагидрат); 1,82 г/кг сульфата цинка (гептагидрат); 0,818 г/кг EDTA натрия; 0,29 г/кг борной кислоты; 0,24 г/кг молибдата натрия (дигидрат); 4,58 г/кг хлорида кальция (дигидрат); 17,33 г/кг сульфата железа (гептагидрат); 0,15 г/кг хлорида меди (дигидрат).

Культивирование проводили в следующих условиях: температура культивирования 28°C; скорость аэрации 0,5 об/об/мин, скорость перемешивателя 600-1950 об/мин, регулировка pH на фазе роста на уровне 4,5 с применением аммиачной воды (25% об/об). Ферментацию проводили до тех пор, пока плотность биомассы не составляла 80 г/л до начала фазы продуцирования масла путем лимитирования фосфата и азота. Из-за высокого содержания сульфата в исходной среде до завершения ферментации, т. е. включая период до завершения фазы продуцирования масла, концентрация сульфата всегда была выше границы насыщения клеток, которая составляла приблизительно 5 г на кг сухой биомассы. Получаемые биомассы далее в данном документе называются «биомасса 1» (12 г/кг сульфата натрия в исходной среде) и «биомасса 2» (16 г/кг сульфата натрия в исходной среде).

Пример 2. Получение биомассы путем ферментации Aurantiochytrium limacinum SR21 в среде, характеризующейся низким содержанием сульфата, и последующее высушивание биомассы

Клетки культивировали в течение приблизительно 70 ч. способом с подпиткой с применением стального ферментера с объемом ферментера, составляющим 2 литра, и с общей исходной массой, составляющей 712 г, и полученной общей конечной массой, составляющей приблизительно 1,5 кг. В течение способа осуществляли дозированное добавление раствора глюкозы (570 г/кг глюкозы) в («периодическом процессе с подпиткой»).

Композиция исходной среды состояла из следующего:

среда 1: 20 г/кг глюкозы; 4 г/кг дрожжевого экстракта; 0 г/кг сульфата аммония; 2,46 г/кг сульфата магния (гептагидрат); 0,45 г/кг хлорида калия; 4,5 г/кг дигидрофосфата калия; 0,1 г/кг тиамина (HCl); 5 г/кг раствора микроэлементов.

Культивирование проводили в следующих условиях: температура культивирования 28°C; скорость аэрации 0,5 об/об/мин, скорость перемешивателя 600-1950 об/мин, регулировка pH на фазе роста на уровне 4,5 с применением аммиачной воды (25% об/об). Ферментацию проводили до тех пор, пока плотность биомассы не составляла 80 г/л до начала фазы продуцирования масла путем лимитирования фосфата и азота. Концентрация сульфата уже опустилась ниже границы обнаружения, составляющей 0,05 г на кг среды для ферментации, до начала фазы продуцирования масла, и концентрация сульфата также была соответственно ниже границы обнаружения в течение всей фазы продуцирования масла. И поскольку не осуществляли дозированное добавление сульфата, концентрация сульфата опускалась до нуля в течение фазы продуцирования масла. Полученная биомасса далее в данном документе называется «биомасса 3».

Пример 3. Получение биомассы путем ферментации Aurantiochytrium limacinum SR21 в среде, характеризующейся низким содержанием сульфата, с одновременным добавлением сульфата в течение ферментации, и последующее высушивание биомассы

Клетки культивировали в течение приблизительно 70 ч способом с подпиткой с применением стального ферментера с объемом ферментера, составляющим 2 литра, и с общей исходной массой, составляющей 712 г, и полученной общей конечной массой, составляющей приблизительно 1,5 кг. В течение способа дозированное добавление раствора глюкозы (570 г/кг глюкозы) осуществляли в («периодическом процессе с подпиткой»), также растворы сульфата натрия при разных концентрациях (7,4; 14,8 или 22,2 г/кг сульфата натрия) или растворы сульфата аммония при разных концентрациях (6,8; 13,6 или 20,4 г/кг сульфата аммония) добавляли шестью разными порциями при постоянной скорости подпитки, составляющей 3 г/ч. Скорости подпитки для растворов сульфата выбирали так, чтобы содержание сульфата на фазе хранения оставалось ниже границы обнаружения (0,05 г/л) сульфата.

Кроме того, применяли одну порцию воды с такой же скоростью подпитки (3 г/ч) в качестве отрицательного контроля с целью исключения «эффекта разбавления».

Композиция исходной среды состояла из следующего:

среда 1: 20 г/кг глюкозы; 4 г/кг дрожжевого экстракта; 2 г/кг сульфата аммония; 2,46 г/кг сульфата магния (гептагидрат); 0,45 г/кг хлорида калия; 4,5 г/кг дигидрофосфата калия; 0,1 г/кг тиамина (HCl); 5 г/кг раствора микроэлементов.

Культивирование проводили в следующих условиях: температура культивирования 28°C; скорость аэрации 0,5 об/об/мин, скорость перемешивателя 600-1950 об/мин, регулировка pH на фазе роста на уровне 4,5 с применением аммиачной воды (25% об/об). Ферментацию проводили до тех пор, пока плотность биомассы не составляла 50 г/л до начала фазы продуцирования масла путем лимитирования фосфата и азота. Концентрация сульфата уже опустилась ниже границы обнаружения, составляющей 0,05 г на кг среды для ферментации, до начала фазы продуцирования масла, и концентрация сульфата также была соответственно ниже границы обнаружения в течение всей фазы продуцирования масла. Из-за непрерывного дозированного добавления сульфата, концентрация сульфата в среде, однако, не может упасть до нуля. Далее в данном документе биомассы с подпиткой с использованием сульфата натрия называются «биомассы 3, 4 и 5», а биомассы подпиткой с использованием сульфата аммония называются «биомассы 6, 7 и 8».

Пример 4. Обработка и сравнение полученных биомасс и способов

После способа культивирования ферментационные бульоны нагревали до температуры 60°C в течение 20 минут для предотвращения дополнительной активности клеток.

За этим следовало двухэтапное высушивание биомассы. Сначала ферментационный бульон концентрировали путем выпаривания до сухой массы, составляющей приблизительно 20% по весу. После этого концентрированный ферментационный бульон подвергали высушиванию распылением с применением Production MinorTM Spray Dryer (GEA NIRO) с температурой воздуха высушивания на входе, составляющей 340°C. С помощью высушивания распылением, таким образом, получали порошок, содержащий более 95% по весу сухой массы.

Таблица 1. Сравнение полученных биомасс

Биомасса	Содержание сульфата [г/кг] (сульфат на кг биомассы)	Выход [%] (г DHA на г декстрозы)	Продукт, общий вес [г] (г DHA)	Чистота [%] (г DHA на г сухой биомассы)
1	29,7	7,8	44,2	15,7
2	32,5	7,3	45,4	15,4
3	8,4	7,1	35,5	20,1
4	12,4	8,3	52,5	21,2
5	13,6	8,7	53,9	22,5
6	15,0	8,5	52,1	21,5
7	12,2	8,3	51,8	21,3
8	13,9	8,6	55,8	21,7
9	15,4	8,4	51,9	21,3

Биомассы 1 и 2 представляют собой биомассы, полученные путем ферментации с высоким содержанием сульфата, как в примере 1, биомасса 3 представляет собой биомассу, полученную путем ферментации с низким содержанием сульфата, как в примере 2, при этом биомассы от 4 до 9 получали путем ферментации с низким содержанием сульфата и с непрерывной подпиткой с использованием сульфата при низком дозированном расходе, как в примере 3.

Можно заметить, что способы ферментации, с помощью которых получали биомассы от 4 до 9, позволяли получить заметно более высокий выход DHA, а также большее количество продукта и более чистый продукт, чем в способе, который проводят с низким содержанием сульфата без непрерывной подпитки с помощью сульфата (биомасса 3), или в тех способах, которые проводят с высоким содержанием сульфата (биомассы 1 и 2). Предпочтительные биомассы в соответствии с настоящим изобретением представляют собой те, которые получали способами, как в примере 3, предусматривающими сульфат в количестве, составляющем от 12 до 16 г на кг биомассы.

1. Способ получения биомассы, содержащей PUFA, путем культивирования PUFA-продуцирующих клеток семейства Thraustochytriaceae в среде для ферментации, при этом способ включает фазу роста и фазу продуцирования масла, отличающийся тем, что содержание сульфата регулируют так, чтобы сульфат всегда присутствовал в среде в течение всего периода фазы продуцирования масла, но концентрация сульфата в среде всегда находилась в пределах от 0,01 до 2 г на кг биомассы, не содержащей липидов, по меньшей мере в течение второй половины фазы продуцирования масла.

2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что концентрация сульфата в среде всегда находится в пределах от 0,01 до 2 г на кг биомассы, не содержащей липидов, по меньшей мере в течение последних 70%, 80% или 90% периода фазы продуцирования масла и наиболее предпочтительно в течение всей фазы продуцирования масла.

3. Способ по п. 1 или 2, отличающийся тем, что концентрация сульфата в среде находится в пределах от 0,01 до 1 г сульфата на кг биомассы, не содержащей липидов, и предпочтительнее всего от 0,01 и 0,05 г сульфата на кг биомассы, не содержащей липидов, по меньшей мере в течение второй половины фазы продуцирования масла, предпочтительно по меньшей мере в течение последних 70%, 80% или 90% периода фазы продуцирования масла и наиболее предпочтительно в течение всей фазы продуцирования масла.

4. Способ по любому из предыдущих пунктов, отличающийся тем, что клетки культивируют, предпочтительно в фазе роста, до тех пор, пока плотность биомассы не достигнет по меньшей мере 50 г на литр среды для ферментации, в частности от 50 до 250 г на литр среды для ферментации, предпочтительно по меньшей мере 80, 100, 120 или 140 г на литр среды для ферментации и в частности от 80, 100, 120 или 140 г до 200 или 220 г на литр среды для ферментации.

5. Способ по любому из предыдущих пунктов, отличающийся тем, что фазу продуцирования масла начинают путем лимитирования по меньшей мере одного лимитирующего питательного компонента, особенно путем лимитирования источника азота.

6. Способ по любому из пп. 1-5, отличающийся тем, что осуществляют непрерывное дозирование сульфата в малом количестве в среду для ферментации в течение большей части периода фазы продуцирования масла, предпочтительно в количестве, составляющем от 5 до 100 мг, предпочтительно от 10 до 50 мг на кг среды для ферментации.

7. Способ по любому из предыдущих пунктов, отличающийся тем, что сульфат изначально загружают посредством исходной среды и начинают дозированное добавление сульфата, как только концентрация сульфата опустится ниже 2 г на кг среды для ферментации, в частности ниже 1 г на кг среды для ферментации и предпочтительнее всего ниже 0,5 г на кг среды для ферментации.

8. Способ по любому из предыдущих пунктов, отличающийся тем, что концентрация сульфата опускается ниже концентрации, составляющей 5 г сульфата на кг биомассы, не содержащей липидов, предпочтительно ниже 4, 3, 2 или 1 г сульфата на кг биомассы, не содержащей липидов, и в частности ниже 0,5, 0,1 или 0,05 г сульфата на кг биомассы, не содержащей липидов, прямо перед началом фазы продуцирования масла, предпочтительно после того, как плотность биомассы достигает по меньшей мере 50 г, предпочтительно по меньшей мере 80, 100, 120 г на литр среды для ферментации и предпочтительно остается ниже данной концентрации в течение оставшегося времени ферментации.

9. Способ по любому из предыдущих пунктов, отличающийся тем, что концентрация сульфата всегда находится ниже 0,5 г на кг среды для ферментации до тех пор, пока не начинают дозированное добавление сульфата.

10. Способ по любому из предыдущих пунктов, отличающийся тем, что применяемая среда для ферментации характеризуется концентрацией хлорида, составляющей менее 1 г/л, в частности менее 500 мг/л и предпочтительно менее 250 мг/л, в течение всей ферментации.

11. Способ по любому из предыдущих пунктов, отличающийся тем, что микроорганизмы представляют собой микроорганизмы родов Althornia, Aplanochytrium, Elina, Japonochytrium, Schizochytrium, Thraustochytrium, Aurantiochytrium, Oblongichytrium или Ulkenia, предпочтительнее всего вида Aurantiochytrium limacinum.

12. Способ по любому из предыдущих пунктов, отличающийся тем, что PUFA представляют собой омега-3 жирные кислоты, предпочтительно DHA и/или EPA.

13. Биомасса, содержащая PUFA, получаемая с помощью способа по любому из пп. 1-12, отличающаяся тем, что содержание сульфата в ней составляет от 12 до 16 г на кг биомассы, и клетки биомассы предпочтительно представляют собой микроорганизмы семейства Thraustochytriaceae, наиболее предпочтительно родов Althornia, Aplanochytrium, Elina, Japonochytrium, Schizochytrium, Thraustochytrium, Aurantiochytrium, Oblongichytrium или Ulkenia и предпочтительнее всего микроорганизмы вида Aurantiochytrium limacinum.

Изобретение относится к области биотехнологии. Описан способ получения одного или более продуктов с помощью микробиологической ферментации потока газа.

Способ получения биомассы, которая может легко расщепляться и которая характеризуется повышенным содержанием полиненасыщенных жирных кислот // 2776914

Группа изобретений относится к биотехнологии. Предложены способ получения биомассы, содержащей PUFA, путем культивирования PUFA-продуцирующих клеток семейства Thraustochytriaceae в среде для ферментации в условиях регулирования содержания сульфата - снижением его до нуля во второй половине фазы роста; и биомасса, содержащая PUFA, полученная заявленным способом.

Способ двойного центрифугирования для очистки питательного масла // 2769461

Группа изобретений относится к биотехнологии. Предложен способ повышения выхода продукта – масла с полиненасыщенными жирными кислотами (варианты).

Новые штаммы микроводорослей рода thraustochytrium и способ получения полиненасыщенных жирных кислот с их использованием // 2754686

Группа изобретений относится к биотехнологии. Предложены микроводоросли CJM01 рода Thraustochytrium КСТС 13538ВР, обладающие повышенным продуцированием докозагексаеновой кислоты (DHA) и уменьшенным продуцированием аминокислот; способ получения биомассы, включающий культивирование заявленных микроводорослей, и способ получения биомасла, включающий культивирование заявленных микроводорослей и извлечение из них липида, содержащего докозагексаеновую кислоту (DHA).

Биотехнологическое получение ω-функционализированных карбоновых кислот и их сложных эфиров // 2751363

Группа изобретений относится к биотехнологическому способу получения сложных эфиров ω-функционализированных карбоновых кислот. Предложены клетка микроорганизма и способ для получения по меньшей мере одного сложного эфира ω-функционализированной карбоновой кислоты из ундекана и/или додекана.

Бактерия, конститутивно продуцирующая монофосфориллипид а, и способ получения монофосфориллипида а с использованием бактерии // 2751357

Группа изобретений относится к рекомбинантной бактерии, конститутивно продуцирующей монофосфориллипид A (MLA), не конъюгированный с 2-кето-3-деокси-D-манно-октулозонатной (Kdo) группировкой, а также способу получения MLA, не конъюгированного с Kdo группировкой, с использованием указанной бактерии. Предложена рекомбинантная бактерия, конститутивно продуцирующая MLA, не конъюгированный с Kdo группировкой, где указанная рекомбинантная бактерия имеет повышенную экспрессию гена, кодирующего полипептид липид A 1-фосфатазу (LpxE), по сравнению с родительской бактериальной клеткой.

Способ выделения липидов из липидсодержащей биомассы // 2744913

Изобретение относится к масложировой промышленности. Способ выделения липида, содержащего полиненасыщенные жирные кислоты (PUFA), из биомассы, предусматривающий следующие стадии: a) обеспечение суспензии биомассы, содержащей клетки, которые содержат липид, содержащий PUFA; b) необязательно лизирование клеток биомассы; c) концентрирование суспензии до общего содержания сухого вещества (TDM), составляющего от 20 до 60 вес.%, если суспензия имеет более низкое содержание TDM; d) регулирование температуры в суспензии от 20 до 100°C; e) поддержание температуры в диапазоне, указанном в (d), в течение периода от 1 до 36 часов при добавлении всего от 7,5 до 25 моль эквивалента основания к 10 кг всего сухого вещества, содержащегося в суспензии; f) необязательно нейтрализацию деэмульгированной композиции, полученной согласно стадии (e), если она характеризуется значением pH, выходящим за пределы диапазона от 5,5 до 8.5; g) отделение липидов в форме маслосодержащей легкой фазы.

Ацидофильные штаммы fusarium oxysporum, способы их получения и способы их применения // 2742437

Изобретения относятся к выделенному штамму грибов ацидофильного Fusarium oxysporum, продуцирования высокоэнергетического метаболита, представляющего собой липид, этанол и/или водород, способам применения указанного штамма и композиции, содержащей указанный штамм. Предложен выделенный штамм Fusarium МК7, депонированный как ATCC под номером PTA-10698 и продуцирующий высокоэнергетический метаболит, представляющий собой липид, этанол и/или водород.

Штамм микроводоросли lobosphaera (parietochloris) sp. - продуцент арахидоновой кислоты // 2737139

Изобретение относится к биотехнологии. Штамм микроводоросли Lobosphaera (Parietochloris) sp.

Способ очистки замазученной древесно-кустарниковой растительности // 2778687

Изобретение относится к области экологической безопасности, а именно к средствам очистки ДКР, замазученной в результате аварийных разливов нефти. В зависимости от степени загрязнения ДКР способ очистки замазученной ДКР содержит по меньшей мере один технический этап, включающий обработку почвы около ДКР сорбентом или сорбирующим материалом, смыв нефти и/или нефтепродуктов с коры ДКР 0,5% раствором кокосульфата натрия и ополаскивание ДКР водой, и/или по меньшей мере один биологический этап, включающий обработку ДКР раствором, содержащим биоэмульсию, включающую ассоциацию штаммов, вазелиновое масло, эмульгатор и минеральную добавку при следующем соотношении компонентов, мас.%: ассоциация штаммов на основе жидких культур Rhodococcus erythropolis ВКПМ АС-1660 и Rhodococcus sp.