Способ отбора коров-доноров ооцитов

Авторы патента:

Касьянов Роман Олегович (RU)

Смоловская Оксана Владимировна (RU)

Гармашов Сергей Юрьевич (RU)

Зубова Татьяна Владимировна (RU)

Плешков Владимир Александрович (RU)

Семечкова Анна Вячеславовна (RU)

Хитрий Филипп Николаевич (RU)

G01N33/50 - химический анализ биологических материалов, например крови, мочи; испытания, основанные на способах связывания биоспецифических лигандов; иммунологические испытания (способы измерения или испытания с использованием ферментов или микроорганизмов иные, чем иммунологические, составы или индикаторная бумага для них, способы образования подобных составов, управление режимами микробиологических и ферментативных процессов C12Q)

A01K67/02 - разведение позвоночных (животных) (станы для случки A01K 15/00; устройства для предотвращения произвольного спаривания или для оказания помощи при нем A01K 21/00)

Владельцы патента RU 2782637:

Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Кузбасская государственная сельскохозяйственная академия" (RU)

Изобретение относится к сельскому хозяйству, в частности к способу отбора коров-доноров ооцитов в технологии трансплантации эмбрионов in vitro. Для осуществления указанного способа для отбора животных дополнительно осуществляют этап оценки по биохимическим параметрам крови: по прогестерону, холестерину и каротину за 10 дней до планируемой процедуры вымывания ооцитов на 10 день полового цикла. Коров отбирают в том случае, когда содержание в крови прогестерона 3,39±0,24 нг/мл, холестерина 2,23±0,22 ммоль и каротина 1,28±0,21 мг%. Настоящее изобретение позволяет повысить количество ооцитов на одну аспирацию, полученных от коров-доноров в результате проведения процедуры вымывания ооцитов в технологии трансплантации эмбрионов in vitro, и гарантирует получение более 3 ооцитов за одну процедуру вымывания. 3 табл., 2 пр.

Изобретение относится к сельскому хозяйству, в частности репродуктивной биотехнологии для разведения крупного рогатого скота методом трансплантации эмбрионов in vitro.

Основу технологии трансплантации эмбрионов in vitro составляет ряд последовательных технологических операций, к которым относится отбор доноров, и реципиентов; получение, оценка и культивирование ооцитов; подбор спермы от быков производителей, оценка качества спермы, капацитация сперматозоидов; оплодотворение ооцитов; замораживание эмбрионов или пересадка их реципиентам.

Первым этапом в реализации технологии трансплантации эмбрионов in vitro является отбор коров-доноров ооцитов, где используют ограниченное количество особей, которые могут стать улучшателями породы по одному или нескольким значимым признакам. На роль доноров выбирают породистых телок или коров, обладающих высокоценными качествами.

При работе с донорами одним из важнейших этапов в технологии трансплантации эмбрионов является суперовуляция, под которой понимается выделение множества яйцеклеток из яичников коровы в течение одного полового цикла. Для этих целей существуют определенные методы, которые позволяют максимально полно использовать биологический репродуктивный потенциал яичников коров. В основе этого метода лежит синхронный рост множества фолликулов, их созревание с последующей овуляцией. Для этого используют специальные программы гормональной обработки коров доноров.

Зачастую введение гормональных препаратов не оправдывает себя, и планируемое количество ооцитов не всегда получается. В результате происходит существенная трата времени специалистов при работе с донорами, расход дорогостоящих гормональных препаратов. Применение гормональных препаратов зачастую негативно отражается на физиологическом здоровье коров доноров, животное страдает и выпадает из технологической цепи производства.

В технологии трансплантации эмбрионов in vitro большинство специалистов при получении ооцитов от коров доноров не используют схемы гормональных обработок. При вымывании ооцитов не всегда гарантировано стабильное получение ооцитов, и их количество при вымывании колеблется от 0-10 ооцитов. Нестабильное количество при получении ооцитов обуславливает увеличение трудоемкости процесса и увеличение экономических затрат.

В этом отношении становится актуальным вопросом разработка предварительной оценки коров доноров для стабильного гарантированного получения ооцитов.

Поскольку биохимические показатели крови животных, характеризующие интенсивность и качество обменных процессов, протекающих в организме животного, отражают физиологические показатели здоровья, в том числе и воспроизводительные способности, то ряд показателей может служить индикатором для отбора коров доноров с целью получения большего количества ооцитов.

В литературных источниках в большей степени представлен материал по отбору и работе с коровами донорами эмбрионов в технологии in vivo, в то время как по подбору коров доноров ооцитов в технологии in vitro информация практически отсутствует.

Согласно общеизвестному способу, по ГОСТ 28424-2014 «Средства воспроизводства. Эмбрионы крупного рогатого скота. Технические условия» коров доноров эмбрионов отбирают по ряду показателей, в числе которых проводится отбор в состав коров - доноров эмбрионов по ветеринарным и зоотехническим характеристикам. Доноров яйцеклеток (в последующем - эмбрионов) отбирают из поголовья, на которое не наложены ветеринарные ограничения по причине наличия болезни или возбудителя болезни. Доноры яйцеклеток (в последующем - эмбрионов) должны подбираться с учетом комплекса селекционно-генетических признаков, иметь продуктивность (молочную, мясную, мясомолочную), превышающую стандарт породы. Однако использование данного метода не гарантирует получения ооцитов при проведении процедуры аспирации от коров доноров.

Одним из способов, наиболее часто применяемых в производственной практике на технологическом этапе отбора коров - доноров, является способ прогнозирования ответа на введенные гонадотропины, согласно которому учитывают индивидуальные особенности суперовуляции за счет проведения разовой гормональной обработки животного, отобранного в качестве донора эмбрионов по селекционным признакам и клиническому состоянию здоровья (Попов Д.В., Бригида А.В., Косовский Г.Ю. Руководство по получению и трансплантации эмбрионов крупного рогатого скота. - М.: КлабПринт, 2017 г., страницы 7-9. Сайт Интернет: http://ceerb.ru/Rukovodstvo.pdf, 2018 г.). Недостатком вышеизложенного метода является то, что отбирают коров - доноров на основе прогнозируемого показателя - количества желтых тел на яичниках (число овуляций), определяемого после факта проведения разовой гормональной обработки.

Известен патент RU 2032338, опубл. 10.04.1995 «Способ определения потенциальных доноров эмбрионов и ранней половозрелости у овец», который предусматривает яркам в возрасте 11-12 месяцев и овцематкам в период сезонного анэструса инъекцию тестостерона пропионата, преимущественно в дозе 0,225-0,230 мг/кг живой массы, а затем выявление в течение 5 суток животных в половой охоте. Однако заявленный способ предусматривает определение потенциальных доноров эмбрионов только в овцеводстве.

Существует способ отбора коров-доноров эмбрионов в процессе проведения технологии трансплантации эмбрионов (патент RU 2699519, опубл. 05.09.2019) включающий проведение прогнозирования ответной реакции яичников коровы-донора эмбрионов на стимуляцию полиовуляции экзогенными гонадотропинами, причем прогнозируют ответную реакцию яичников путем проведения у коровы-донора эндоректального исследования яичника и желтого тела с использованием метода ультразвуковой эхографии и проведения морфометрических измерений параметров яичника и желтого тела.

В качестве ближайшего аналога выбран способ получения эмбрионов от телок- доноров голштинской породы (патент RU 2750208, опубл. 24.06.2021), включающий отбор телок- доноров голштинской породы в возрасте 13-15 месяцев клинически здоровых, имеющих хороший экстерьер, отличную родословную, продуктивность матери за наивысшую лактацию не менее 9000 кг с содержанием жира в молоке не менее 3,9%, белка - 3,3%, индукцию суперовуляции по схеме путем многократного введения в виде инъекций гормональных препаратов, содержащих фолликулостимулирующий и лютеинизирующий гормоны, и гормональных препаратов для синхронизации половой охоты и регулирования воспроизводительной функции.

Недостатками предлагаемых способов является достаточно трудоемкий процесс, сложность проведения измерения и расчетов. Также все представленные способы описывают способы получения эмбрионов с использованием гормональных препаратов.

Техническим результатом изобретения является повышение количества ооцитов на одну аспирацию, полученных от коров-доноров в результате проведения процедуры вымывания ооцитов в технологии трансплантации эмбрионов in vitro.

Благодаря разработанному способу отбора коров-доноров при вымывании ооцитов увеличивается количество ооцитов на одну процедуру вымывания, что дает возможность максимально использовать биологический репродуктивный потенциал яичников коров, обуславливает снижение трудоемкости процесса при получении ооцитов на одно вымывание и что обуславливает снижение экономических затрат.

Технический результат достигается тем, что в технологию отбора коров-донора дополнительно вводится этап оценки с использованием оценки биохимических параметров крови по прогестерону, холестерину и каротину, что позволяет исключить животных, из которых вымывается малое количество ооцитов.

Пример выполнения

Научно-хозяйственный опыт проводили на коровах черно-пестрой породы. Оценку эффективности предлагаемого способа отбора коров доноров проводили по количеству полученных ооцитов.

Предложенный способ отбора ооцитов у коров-доноров состоит из двух этапов:

1 этап.

Отбор коров доноров ооцитов по ветеринарным и зоотехническим параметрам согласно ГОСТ 28424-2014 «Средства воспроизводства. Эмбрионы крупного рогатого скота».

Для разработки способа было отобрано 67 аналогичные коровы-донора с однотипным кормлением и условиями содержания. Характеристика отобранных коров доноров представлена в таблице 1.

Таблица 1 - Характеристика коров доноров

Количество коров доноров	Порода	Масса, кг	Количество лактаций	Физиологический статус
67	Черно-пестрая	500-550	2-4	Здоровые животные. 2-3 месяц после отела.

2 этап.

Способ оценки с использованием оценки биохимических параметров крови.

Оценку биохимических показателей крови коров доноров проводили по схеме, представленной в таблице 2.

На 10 день полового цикла за 10 дней до планируемой процедуры аспирации ооцитов проводили забор крови из яремной вены по общепринятой методике у коров доноров.

Всего было проведено 67 аспираций из 134 яичников коров доноров.

Аспирацию ооцитов проводили с помощью OPU технологии.

Полученные ооциты доставляли в лабораторию в течении 2 часов, где проводили их подсчет. В среднем за все время исследования было получено 3,18±0,22 ооцитов.

Таблица 2 - Влияние биохимических показателей крови на количество полученных ооцитов

Исследуемый показатель	Значение показателя	Вымыто ооцитов	Проведено аспираций	Количество ооцитов на 1 аспирацию
Прогестерон, нг/мл	1,85±0,10	0-2	21	1,05±0,17
Холестерин, ммоль	1,74±0,11	0-2	21	1,05±0,17
Каротин, мг%	0,51±0,07
Прогестерон, нг/мл	2,43±0,11^0-2***	3-4	32	3,41±0,09^0-2***
Холестерин, ммоль	1,98±0,12	3-4	32	3,41±0,09^0-2***
Каротин, мг%	0,87±0,09^0-2**
Прогестерон, нг/мл	3,39±0,24^0-2*3-4*	5 и более	14	5,86±0,24^0-2*3-4*
Холестерин, ммоль	2,23±0,22	5 и более	14	5,86±0,24^0-2*3-4*
Каротин, мг%	1,28±0,21^0-2**

Примечание: разница достоверна при **p<0,01; ***p<0,001

Оценка полученных результатов позволила установить достоверную взаимосвязь по изучаемым показателям. Установлено достоверно большее значение по количеству полученных ооцитов при более высоком содержании в крови коров доноров прогестерона, холестерина и каротина.

В таблице 3 приведена корреляционная связь между биохимическими показателями крови коров-доноров и количества вымытых ооцитов.

Таблица 3 - Корреляционная связь между изучаемыми показателями

Показатели	Описание
Прогестерон - количество вымытых ооцитов	Коэффициент корреляции Спирмена (ρ) равен 0.801. Связь между исследуемыми признаками - прямая, теснота (сила) связи по шкале Чеддока - высокая. Число степеней свободы (f) составляет 65. t-критерий Стьюдента равен 10.788. Критическое значение t-критерия Стьюдента при данном числе степеней свободы составляет 1.998. tнaбл > tкрит, зависимость признаков статистически значима.
Холестерин - количество вымытых ооцитов	Коэффициент корреляции Спирмена (ρ) равен 0.492. Связь между исследуемыми признаками - прямая, теснота (сила) связи по шкале Чеддока - умеренная. Число степеней свободы (f) составляет 65. t-критерий Стьюдента равен 4.552. Критическое значение t-критерия Стьюдента при данном числе степеней свободы составляет 1.998. tнaбл > tкрит, зависимость признаков статистически значима.
Каротин - количество вымытых ооцитов	Коэффициент корреляции Спирмена (ρ) равен 0.643. Связь между исследуемыми признаками - прямая, теснота (сила) связи по шкале Чеддока - заметная. Число степеней свободы (f) составляет 65. t-критерий Стьюдента равен 6.772. Критическое значение t-критерия Стьюдента при данном числе степеней свободы составляет 1.998. tнaбл > tкрит, зависимость признаков статистически значима.

Таким образом, применение предложенного способа позволяет гарантировано получать более 3 ооцитов за одну процедуру вымывания.

Возможностью осуществления данного изобретения является применение способа оценки биохимических показателей крови (прогестерона, холестерина и каротина) коров-доноров за 10 дней до процедуры вымывания ооцит кумулюсных комплексов на 10 день полового цикла.

Способ отбора коров-доноров ооцитов в технологии трансплантации эмбрионов in vitro, отличающийся тем, что для отбора животных дополнительно осуществляется этап оценки с использованием оценки по биохимическим параметрам крови по прогестерону, холестерину и каротину за 10 дней до планируемой процедуры вымывания ооцитов на 10 день полового цикла, при этом коров отбирают в том случае, когда содержание в крови прогестерона 3,39±0,24 нг/мл, холестерина 2,23±0,22 ммоль и каротина 1,28±0,21 мг%.

Изобретение относится к медицине, а именно к медицинской диагностике, и может быть использовано для прогнозирования риска развития H. pylori–позитивной язвенной болезни двенадцатиперстной кишки у неродственных русских индивидуумов, уроженцев Центрально-Черноземного региона РФ.

Способы прогнозирования применимости белков или белковых фрагментов для иммунотерапии // 2782336

Изобретение относится к области фармацевтики и медицины, а именно к способу прогнозирования применимости ассоциированных с опухолью неоантигенов или неоэпитопов, содержащих одну или несколько специфических по отношению к раку аминокислотных модификаций, в противораковой иммунотерапии, согласно которому 1) выявляют ассоциированные с опухолью неоантигены или неоэпитопы, содержащие одну или несколько специфических по отношению к раку аминокислотных модификаций; 2) идентифицируют среди выявленных неоантигенов или неоэпитопов те, для которых процессирование и презентация неоантигена по пути MHC I приводит к распознаванию комплексов, образованных MHC I и неоэпитопами неоантигена, CD8+ T-клетками; 3) устанавливают распределение или локализацию выявленных неоантигенов или неоэпитопов и используют вычислительную базу данных для определения тех, которые являются локализованными или распространенными в цитозоле и/или в экзосомах in vivo; 4) прогнозируют, что выявленные неоантигены или неоэпитопы являются применимыми для противораковой иммунотерапии.

Способы прогнозирования применимости белков или белковых фрагментов для иммунотерапии // 2782336

Способ прогнозирования риска развития язвенной болезни двенадцатиперстной кишки на основе молекулярно-генетического тестирования // 2782304

Изобретение относится к медицине, а именно к медицинской диагностике, и может быть использовано для прогнозирования риска развития язвенной болезни двенадцатиперстной кишки у неродственных русских индивидуумов, уроженцев Центрально-Черноземного региона РФ. Осуществляют забор венозной крови, выделение ДНК из периферической венозной крови и анализ полиморфных локусов rs17576-rs3787268-rs2250889 гена ММР-9.

Способ прогнозирования обострения хронического увеита у мужчин с анкилозирующим спондилитом // 2782116

Изобретение относится к медицине, а именно к офтальмологии и ревматологии, и может быть использовано для прогнозирования обострения хронического увеита у мужчин с анкилозирующим спондилитом. У мужчин, страдающих анкилозирующим спондилитом и увеитом, с дебютом анкилозирующего спондилита в возрасте от 12 лет и старше и длительностью заболевания от 16 лет и более, проводят забор крови.

Способ дифференциальной диагностики образования слизистой оболочки щеки по содержанию биомаркеров в ротовой жидкости пациента // 2782093

Изобретение относится к области медицины, а именно к дифференциальной диагностике образования слизистой оболочки щеки, и может быть использовано в дифференциальной диагностике воспалительных заболеваний и злокачественных новообразований органов полости рта в условиях стоматологических, онкологических и хирургических лечебных заведений.

Способ дифференциальной диагностики образования слизистой оболочки губы по содержанию биомаркеров в ротовой жидкости пациента // 2782092

Изобретение относится к области медицины, а именно к способу дифференциальной диагностики образования слизистой оболочки губы, и может быть использовано в дифференциальной диагностике воспалительных заболеваний и злокачественных новообразований органов полости рта в условиях стоматологических, онкологических и хирургических лечебных заведений.

Способ прогнозирования степени тяжести двигательных нарушений у детей с врожденными поражениями головного мозга // 2781741

Изобретение относится к медицине, а именно к неврологии, и может быть использовано для прогнозирования степени тяжести двигательных нарушений у детей с врожденными поражениями головного мозга. Исследуют генотип плода или ребенка.

Способ оценки резвостных качеств жеребцов чистокровной верховой породы по элементному составу волос // 2781015

Изобретение относится к области животноводства. Способ оценки резвостных качеств жеребцов чистокровной верховой породы по элементному составу волос характеризуется тем, что включает отбор волос с участка гривы в области проекции первого шейного позвонка, оценку концентраций кобальта и ртути в них, определение коэффициента резвости, который рассчитывают по формуле: K=Co/Hg, где: K - коэффициент резвости, ед; Co - концентрация кобальта в волосе, мг/кг; Hg - концентрация ртути в волосе, мг/кг, при этом если значения коэффициента резвости находятся в интервале 7,5-32,5 ед., то жеребцов следует считать спринтерами, а при значениях коэффициента в интервале 0,04-7,4 ед.

Способ прогнозирования длительности безрецидивного периода у больных резектабельным трижды негативным раком молочной железы // 2780922

Изобретение относится к медицине, точнее к онкологии, и касается способа прогнозирования длительности безрецидивного периода у больных резектабельным трижды негативным раком молочной железы. У больной с резектабельным трижды негативным раком молочной железы определяют уровень спонтанной продукции IL-4 (X2), IL-6 (X1), IL-8 (X3); индуцированной продукции TNF-α (X4) и концентрацию гамма/дельта Т-лимфоцитов (X5), затем по полученным значениям рассчитывают дискриминантные функции: F1, F2, F3, F4, где F1 соответствует продолжительности безрецидивного периода от 0 до 4 месяцев, F2 - от 4 до 10 месяцев, F3 - от 10 до 14 месяцев, F4 - более 14 месяцев.

Экспрессирующие cas мышиные эмбриональные стволовые клетки и мыши и их применения // 2782358

Изобретение относится к области биотехнологии, в частности к мыши, содержащей экспрессионную кассету Cas9, геномно интегрированную в локус Rosa26, причем экспрессионная кассета Cas9 содержит кодирующую последовательность для белка Cas9, к клетке указанной мыши, а также к способу ее получения. Изобретение эффективно для испытания способности CRISPR/Cas9-нуклеазы, содержащей белок Cas9 и гидовую РНК, модифицировать целевой геномный локус in vivo, а также для оптимизации способности CRISPR/Cas9-нуклеазы модифицировать целевой геномный локус in vivo.