Стабильные при хранении ферментные препараты, их получение и применение

Настоящее изобретение относится к ферментному препарату. Описан жидкий ферментный препарат для приготовления моющих составов, содержащий от 0,1% до 30 мас.% компонента (a), представляющего собой соль согласно общей формуле (I)

(R²)₃N⁺-(CH₂)_nC(R³)(R⁴)-(O-X)_m-O-C(O)-R¹ A^- (I), где n выбрано из от 1 до 12, m равно 0,

R¹ выбран из метила, этила, -CH(OH)-CH(OH)-COOH, CH(OH)-CH₃, (E)-CH=CHCOOH, (Z)-CH=CHCOOH, -C₆H₅, пара-HO-C₆H₄-, о,п-дигидроксифенила, и 3,4,5-тригидроксифенила или O-C(O)-R¹ вместе составляют цитрат, R² являются одинаковыми или различными и выбраны из C₁-C₁₀-алкила и фенила, R³ и R⁴ являются одинаковыми или различными и выбраны из водорода и C₁-C₄-алкила, X представляет собой C₂-C₄-алкилен и A^- представляет собой неорганический или органический противоион, от 0,1% до 40 мас.% компонента (b), представляющего собой по меньшей мере один фермент, выбранный из группы липаз (EC 3.1.1) и эндопептидаз (EC 3.4.21), и от 0,1% до 60 мас.% компонента (c), представляющего собой по меньшей мере одно соединение, выбранное из стабилизаторов ферментов, отличных от компонента (a), консервантов и поверхностно-активных веществ. Технический результат - обеспечение ферментного препарата, который позволяет гибко составлять композиции с высоким или низким содержанием воды, в обоих случаях с превосходным сроком службы в отношении содержащегося в нем фермента (ферментов). 6 н. и 16 з.п. ф-лы, 5 табл.

 

Настоящее изобретение относится к ферментному препарату, содержащему

компонент (a): по меньшей мере одна соль согласно общей формуле (I)

(R²)₃N⁺-(CH₂)_nC(R³)(R⁴)-(O-X)_m-O-C(O)-R¹ A^- (I),

где

n выбрано из от 1 до 12,

m выбрано из от 0 до 50,

R¹ выбран из C₁-C₁₀-алкила, линейного или разветвленного, и C₆-C₁₀-арила, где R¹ может нести одну или несколько гидроксильных или C=O или COOH групп или является частично или полностью нейтрализованным, если применимо,

R² являются одинаковыми или различными и выбраны из C₁-C₁₀-алкила, фенила,

R³ и R⁴ являются одинаковыми или различными и выбраны из водорода и C₁-C₄-алкила,

X представляет собой C₂-C₄-алкилен, и

A^- представляет собой неорганический или органический противоион,

компонент (b): по меньшей мере один фермент, выбранный из гидролаз (EC 3),

и

необязательно компонент (c): по меньшей мере одно соединение, выбранное из стабилизаторов ферментов, отличных от компонента (a), и поверхностно-активных веществ.

Ферменты обычно получают коммерчески в виде жидкого концентрата, часто получаемого из ферментационного бульона. Фермент имеет тенденцию дестабилизироваться, если он остается в водной среде, и поэтому обычной практикой является превращение его в безводную форму: водные концентраты могут быть лиофилизированы или высушены распылением, например, в присутствии материала-носителя для формирования агрегатов. Обычно твердые ферментные продукты должны быть «растворены» перед использованием. Известно, что для стабилизации ферментов в жидких продуктах ингибиторы ферментов, предпочтительно обратимые ингибиторы ферментов, временно ингибируют активность ферментов до тех пор, пока ингибитор ферментов не будет высвобожден.

Известно, что борная кислота и бороновые кислоты обратимо ингибируют протеолитические ферменты. Обсуждение ингибирования одной сериновой протеазы, субтилизина, бороновой кислотой приводится в Molecular & Cellular Biochemistry 51, 1983, pp. 5-32. Для реактивации этот ингибитор необходимо удалить до или во время применения, что можно сделать, например, путем разбавления.

Кроме того, известно, что стабильность липолитических ферментов улучшается добавлением стабилизирующего материала, такого как производные бороновой кислоты, путем обратимого образования комплекса с активным центром липолитического фермента (например, ЕР 0478050).

Из соображений охраны окружающей среды существует потребность в по меньшей мере уменьшении количеств борсодержащих соединений, используемых для стабилизации ферментов. Существует поиск альтернатив для использования в качестве стабилизаторов ферментов в присутствии ферментов.

Задача, решаемая настоящим изобретением, относится к обеспечению альтернативного стабилизатора фермента. Еще одной задачей настоящего изобретения было обеспечение ферментного препарата, который позволяет гибко составлять композиции с высоким или низким содержанием воды, в обоих случаях с превосходным сроком службы в отношении содержащегося в нем фермента (ферментов).

Задача решена посредством применения по меньшей мере одной соли согласно общей формуле (I) в качестве стабилизатора фермента, где общая формула (I) представляет собой следующую:

(R²)₃N⁺-(CH₂)_nC(R³)(R⁴)-(O-X)_m-O-C(O)-R¹ A^- (I),

где

n выбрано из от 1 до 12,

m выбрано из от 0 до 50,

R¹ выбран из C₁-C₁₀-алкила, линейного или разветвленного, и C₆-C₁₀-арила, где R¹ может нести одну или несколько гидроксильных или C=O или COOH групп или является частично или полностью нейтрализованным, если применимо,

R² являются одинаковыми или различными и выбраны из C₁-C₁₀-алкила, фенила,

R³ и R⁴ являются одинаковыми или различными и выбраны из водорода и C₁-C₄-алкила,

X представляет собой C₂-C₄-алкилен, и

A^- представляет собой неорганический или органический противоион.

Стабилизатор фермента согласно настоящему изобретению стабилизирует фермент, выбранный из группы гидролаз (ЕС 3). Названия ферментов известны специалистам в данной области на основании рекомендаций Комитета по номенклатуре Международного союза биохимии и молекулярной биологии (IUBMB). Названия ферментов включают в себя: номер EC (Комиссия по ферментам), рекомендуемое название, альтернативные названия (если есть), каталитическую активность и другие факторы, см. http://www.sbcs.qmul.ac.uk/iubmb/enzyme/EC3/ в последней версии, обновленной 12 марта 2017 г.

Согласно одному варианту осуществления настоящего изобретения по меньшей мере одна гидролаза выбрана из группы ферментов, действующих на сложноэфирную связь (EC 3.1), гликозилаз (EC 3.2) и пептидаз (EC 3.4).

Настоящее изобретение обеспечивает жидкий ферментный препарат, содержащий

компонент (a): по меньшей мере одна соль согласно общей формуле (I)

(R²)₃N⁺-(CH₂)_nC(R³)(R⁴)-(O-X)_m-O-C(O)-R¹ A^- (I),

где

n выбрано из от 1 до 12,

m выбрано из от 0 до 50,

R¹ выбран из C₁-C₁₀-алкила, линейного или разветвленного, и C₆-C₁₀-арила, где R¹ может нести одну или несколько гидроксильных или C=O или COOH групп или является частично или полностью нейтрализованным, если применимо,

R² являются одинаковыми или различными и выбраны из C₁-C₁₀-алкила, фенила,

R³ и R⁴ являются одинаковыми или различными и выбраны из водорода и C₁-C₄-алкила,

X представляет собой C₂-C₄-алкилен, и

A^- представляет собой неорганический или органический противоион,

компонент (b): по меньшей мере один фермент, предпочтительно выбранный из гидролаз (EC 3),

и

необязательно компонент (c): по меньшей мере одно соединение, выбранное из стабилизаторов ферментов, отличных от компонента (a), и поверхностно-активных веществ.

Ферментный препарат согласно настоящему изобретению может быть жидким при 20°C и 101.3 кПа. Согласно одному варианту осуществления настоящего изобретения «жидкий» означает, что ферментный препарат не показывает следов образования осадка или мутности даже через 20 дней хранения.

Компонент (a)

Соль (компонент (a)) представляет собой соль органического сложного эфира холина или производного холина. Анион соли (компонент (a)) - противоион - может быть неорганическим или органическим, предпочтительно органическим. Примерами неорганических противоионов соли (компонент (а)) являются нитрат, гидроксид, сульфат, фосфат, гидрофосфат, дигидрофосфат, карбонат, бикарбонат и галогенид, например, бромид или хлорид. Предпочтительными являются галогениды, особенно хлорид, а также сульфат, карбонат и бикарбонат. Примерами органических противоионов являются лактат, ацетат, тартрат, цитрат и CH₃SO₃^-(метансульфонат). Согласно вариантам осуществления с двухвалентными или трехвалентными противоионами присутствует катион присутствует в соответствующих молярных количествах.

Атом азота в соли (компонент (а)) несет три метильные группы и гидроксиэтильную группу. Термин «производные холина», используемый в контексте настоящего изобретения, относится к соединениям, которые несут по меньшей мере одну алкильную группу, отличную от метильной группы, или гидроксиалкильную группу, отличную от 2-гидроксиэтильной группы, или дополнительные алкоксигруппы.

Более конкретно, компонент (a) представляет собой соединение общей формулы (I)

(R²)₃N⁺-(CH₂)_nC(R³)(R⁴)-(O-X)_m-O-C(O)-R¹ A^- (I)

где,

n выбрано из от 1 до 12, например, от 1 до 9, предпочтительно 1, 2, 3, или 4, и даже более предпочтительно n представляет собой 1;

m выбрано из от 0 до 50, например, от 2 до 50, предпочтительно представляет собой от 10 до 25. Наиболее предпочтительно, однако, m представляет собой ноль;

R¹ выбран из C₁-C₁₀-алкила, линейного или разветвленного, и C₆-C₁₀-арила, где R¹ может нести одну или несколько гидроксильных или C=O или COOH групп или является частично или полностью нейтрализованным, если применимо. Предпочтительными примерами R¹ являются незамещенный C₁-C₆-алкил, такой как метил, этил, н-пропил, изопропил, н-бутил, изобутил, н-гексил, предпочтительный незамещенный C₁-C₁₀-алкил представляет собой метил и этил, кроме того, замещенный C₁-C₁₀-алкил, такой как -CH(OH)-CH(OH)-COOH, CH(OH)-CH₃, (E)-CH=CHCOOH, (Z)-CH=CHCOOH, -C₆H₅, пара-HO-C₆H₄-, о,п-дигидроксифенил, и 3,4,5-тригидроксифенил. Согласно предпочтительному варианту осуществления O-C(O)-R¹ вместе составляют цитрат. Даже более предпочтительно, R¹ представляет собой метил;

R² являются одинаковыми или различными и выбраны из фенила и C₁-C₁₀-алкила, например, метила, этила, н-пропила, изопропила, н-бутила, изобутила, втор.-бутила, трет.-бутила, н-пентила, изопентила, втор.-пентила, неопентила, 1,2-диметилпропила, изоамила н-гексила, изогексила, втор.-гексила, н-гептила, н-октила, 2-этилгексила, н-нонила, н-децила, 2-н-пропилгептила или изодецила, предпочтительным является линейный C₁-C₁₀-алкил, и более предпочтительным является линейный C₁-C₄-алкил, даже более предпочтительно по меньшей мере две R² группы представляют собой CH_3, и третий R² выбран из линейного C₁-C₁₀-алкила, и наиболее предпочтительно все R² являются одинаковыми и представляют собой метил;

R³ и R⁴ являются одинаковыми или различными и выбраны из водорода и C₁-C₄-алкила, предпочтительными являются неразветвленные, например, метил, этил, н-пропил и н-бутил, и даже более предпочтительно оба R³ и R⁴ представляют собой водород. Согласно другому варианту осуществления R³ представляет собой C₁-C₄-алкил, и R⁴ представляет собой водород, предпочтительно R³ представляет собой метил, и R⁴ представляет собой водород;

X представляет собой C₂-C₄-алкилен, например, -CH₂-CH₂-, -CH(CH₃)-CH₂-, -(CH₂)₃-, CH₂-CH(CH₃)-, или -(CH₂)₄-; и

A^- представляет собой противоион, неорганический или органический. Примерами неорганических противоионов соли (компонент (а)) являются сульфат, фосфат, гидрофосфат, дигидрофосфат, карбонат, бикарбонат и галогенид, например, бромид или хлорид. Предпочтительными являются галогениды, особенно хлорид, а также сульфат, карбонат и бикарбонат. Примерами органических противоионов являются лактат, ацетат, тартрат, цитрат и CH₃SO₃^- (метансульфонат).

Компонент (a) не представляет собой поверхностно-активное вещество. Согласно одному варианту осуществления настоящего изобретения раствор 5 г компонента (a) в 1000 г воды имеет динамическое поверхностное натяжение > 45 мН/м при 20 C и 101.3 кПа. Раствор 5 г компонента (a) в 1000 г воды может иметь динамическое поверхностное натяжение ≥ 50 мН/м при 20°C и 101.3 кПа.

Динамическое поверхностное натяжение может быть измерено тензометром давления пузырька, в котором измеряется максимальное внутреннее давление пузырька газа, который образуется в жидкости с помощью капилляра; измеренное значение обычно соответствует поверхностному натяжению при определенном старении поверхности, времени от начала образования пузырька до появления максимума давления. Согласно одному варианту осуществления настоящего изобретения старение поверхности при измерении динамического поверхностного натяжения при 20°С и 101,3 кПа с тензометром давления пузырька составляет 50 мс.

Наиболее предпочтительным примером солей (компонент (а)) являются соли сложных эфиров холина с тартратом или цитратом в качестве противоиона и соли ацетилхолина, цитрата холина и тартрата холина, например, лактаты, ацетаты, тартраты, цитраты.

Согласно вариантам осуществления, в которых противоион A^- является - или может быть - двухвалентным, как например сульфат, тартрат, карбонат, или поливалентным, как например фосфат или цитрат, необходимый положительный заряд может быть получен катионом, полученным из другой соли (компонент (а)), или катионами щелочных металлов, такими как калий или предпочтительно натрий, или аммонием, незамещенным или замещенным C₁-C₄-алкилом и/или 2-гидроксиэтилом.

Согласно вариантам осуществления, в которых R¹ несет одну или более карбоксильных групп, они могут представлять собой свободные COOH группы или могут быть частично или полностью нейтрализованы щелочью, например, калием или особенно натрием, или они могут быть эстерифицированы, например, (R²)₃N⁺-(CH₂)_n-(O-X)_m-OH. Такие варианты осуществления приводят к сложному ди- или триэфиру, если применимо, соответствующей ди- или трикарбоновой кислоты. Также возможны смеси сложных моно- и диэфиров, например, винной кислоты или лимонной кислоты, и смеси сложных ди- и триэфиров лимонной кислоты.

Согласно предпочтительному варианту осуществления настоящего изобретения соль (компонент (a)) представляет собой соединение согласно формуле (II)

(CH₃)₃N⁺-(CH₂)₂-O-C(O)-R⁵ (A¹)^- (II)

где (A¹)^- выбран из метансульфоната, тартрата и цитрата,

и где R⁵ выбран из -CH₂-C(OH)(COOX²)-CH₂-COOX² и -CH(OH)-CH(OH)-COOX¹

где X¹ выбран из водорода, щелочного металла - особенно натрия - и (CH₃)₃N⁺-(CH₂)₂-,

и где X² являются одинаковыми или различными и выбраны из водорода, щелочного металла - особенно натрия - и (CH₃)₃N⁺-(CH₂)₂-. Согласно предпочтительному варианту осуществления сложноэфирная группа O-C(O)-R⁵ и (A¹)^- соответствуют друг другу.

Согласно одному варианту осуществления настоящего изобретения жидкие ферментные препараты содержат компонент (a) в количествах в интервале от 0.1% до 30 мас.%, относительно общей массы ферментного препарата. Ферментный препарат может содержать компонент (a) в количествах в интервале от 0.1% до 15 мас.%, от 0.25% до 10 мас.%, от 0.5% до 10 мас.%, от 0.5% до 6 мас.%, или от 1% до 3 мас.%, все относительно общей массы ферментного препарата.

Согласно одному варианту осуществления настоящего изобретения соль (компонент (a)) содержит в качестве примеси соединение (a’), которое соответствует:

(R²)₃N⁺-(CH₂)_nC(R³)(R⁴)-(O-X)_m-OH R¹-COO-

где переменные R¹, R², X, n и m имеют такие же значения, как в соответствующей соли (компонент (a)). Указанная примесь может составлять до 50 мол.%, предпочтительно от 0.1 до 20 мол.%, даже более предпочтительно от 1 до 10 мол.% от соли (компонент (a)). Хотя соединение примеси (a') может происходить в результате синтеза соли (компонент (a)) и может быть удалено посредством способов очистки, предпочтительно его не удаляют.

Компонент (b)

Согласно одному аспекту настоящего изобретения по меньшей мере один фермент, содержащийся в компоненте (b), является частью жидкого концентрата фермента. «Жидкий концентрат фермента» в настоящем документе означает любой жидкий продукт, содержащий фермент, содержащий по меньшей мере один фермент. «Жидкий» в контексте концентрата фермента относится к физическому проявлению при 20°C и 101.3 кПа.

Жидкий концентрат фермента может быть получен в результате растворения твердого фермента в растворителе. Растворитель может быть выбран из воды и органического растворителя. Жидкий концентрат фермента, образующийся в результате растворения твердого фермента в растворителе, может содержать количество фермента до концентрации насыщения.

Растворение в настоящем документе означает, что твердые соединения разжижаются при контакте с по меньшей мере одним растворителем. Растворение означает полное растворение твердого соединения до тех пор, пока концентрация насыщения не будет достигнута в указанном растворителе, когда не происходит разделение фаз

Согласно одному аспекту настоящего изобретения компонент (b) полученного концентрата фермента может быть свободен от воды, что означает, что значительные количества воды не присутствуют. Незначительные количества воды согласно настоящему изобретению означают, что ферментный препарат содержит менее 25%, менее 20%, менее 15%, менее 10%, менее 7%, менее 5%, менее 4%, менее 3%, менее 2 мас.% воды, все относительно общей массы концентрата фермента, или не содержит воду.

Согласно одному варианту осуществления настоящего изобретения ферментный препарат согласно настоящему изобретению содержит по меньшей мере один органический растворитель, выбранный из этанола, н-пропанола, изопропанола, н-бутанола, изобутанола, втор-бутанола, этиленгликоля, пропиленгликоля, 1,3-пропандиола, бутандиола, глицерина, дигликоля, пропилдигликоля , бутилдигликоля, гексиленгликоля, метилового простого эфира этиленгликоля, этилового простого эфира этиленгликоля, пропилового простого эфира этиленгликоля и феноксиэтанола, предпочтительными являются этанол, изопропанол или пропиленгликоль. Кроме того, ферментный препарат согласно настоящему изобретению может содержать по меньшей мере один органический растворитель, выбранный из соединений, таких как 2-бутоксиэтанол, изопропиловый спирт и d-лимонен.

Жидкие концентраты фермента, содержащие воду, могут быть названы «водные концентраты фермента». Водные концентраты фермента могут представлять собой содержащие фермент растворы, где твердый ферментный продукт был растворен в воде. Согласно одному варианту осуществления «водный концентрат фермента» означает содержащие фермент продукты, полученные в результате продукции посредством ферментации.

Ферментация означает процесс культивирования рекомбинантных клеток, которые экспрессируют желаемый фермент в подходящей питательной среде, позволяя рекомбинантным клеткам-хозяевам расти (этот процесс можно назвать ферментацией) и экспрессировать желаемый белок. В конце ферментации ферментационный бульон обычно собирают и дополнительно обрабатывают, причем ферментационный бульон содержит жидкую фракцию и твердую фракцию. В зависимости от того, был ли фермент секретирован в жидкую фракцию или нет, желаемый белок или фермент может быть выделен из жидкой фракции ферментационного бульона или из клеточных лизатов. При выделении желаемого фермента применяют способы, известные специалистам в данной области. Подходящие способы выделения белков или ферментов из ферментационного бульона включают, но не ограничиваются этим, сбор, центрифугирование, фильтрацию, экстракцию и осаждение.

Жидкие концентраты фермента могут содержать количества фермента в интервале от 0.1% до 40 мас.% или от 0.5% до 30 мас.%, или от 1% до 25 мас.%, или от 3% до 25 мас.%, или от 5% до 25 мас.%, все относительно общей массы концентрата фермента. Согласно одному варианту осуществления настоящего изобретения жидкие концентраты фермента получены в результате ферментации и являются водными.

Водные концентраты фермента, полученные в результате ферментации, могут содержать воду в количествах более около 50 мас.%, более около 60 мас.%, более около 70 мас.%, или более около 80 мас.%, все относительно общей массы концентрата фермента. Водные концентраты фермента, которые получены в результате ферментации, могут содержать остаточные компоненты, такие как соли, происходящие из среды ферментации, клеточный дебрис, происходящий из продуцирующих клеток-хозяев, метаболиты, продуцируемые продуцирующими клетками-хозяевами во время ферментации. Согласно одному варианту осуществления настоящего изобретения остаточные компоненты могут содержаться в жидких концентратах фермента в количествах менее 30 мас.%, менее 20 мас.%, менее 10 мас.% или менее 5 мас.%, все относительно общей массы водного концентрата фермента.

По меньшей мере один фермент, содержащийся в компоненте (b), выбран из гидролаз (EC 3), далее также упоминаемых как фермент (компонент (b)). Предпочтительные ферменты (компонент (b)) выбраны из группы ферментов, действующих на сложноэфирную связь (E.C. 3.1), гликозилаз (E.C. 3.2) и пептидаз (E.C. 3.4). Ферменты, действующие на сложноэфирную связь (E.C. 3.1), далее также упоминаются как липазы (компонент (b)), соответственно. Гликозилазы (E.C. 3.2) далее также упоминаются как амилазы (компонент (b)) и целлюлазы (компонент (b)). Пептидазы далее также упоминаются как протеазы (компонент (b)).

Гидролазы (компонент (b)) в контексте настоящего изобретения идентифицируются полипептидными последовательностями (также называемыми в настоящем документе аминокислотными последовательностями). Полипептидная последовательность определяет трехмерную структуру, включающую «активный сайт» фермента, который, в свою очередь, определяет его каталитическую активность. Полипептидные последовательности могут быть идентифицированы с помощью SEQ ID NO. Согласно стандарту ST.25 (1998) Всемирной организации интеллектуальной собственности (ВОИС) аминокислоты в настоящем документе представлены с использованием трехбуквенного кода с первой буквой в качестве заглавной или соответствующей одной буквы.

Фермент (компонент (b)) согласно настоящему изобретению относится к родительским ферментам и/или вариантам фермента, причем оба обладают ферментативной активностью. Ферменты, обладающие ферментативной активностью, являются ферментативно активными или вызывают ферментативное превращение, что означает, что ферменты действуют на субстраты и превращают их в продукты. Термин «фермент» в настоящем документе исключает неактивные варианты фермента.

«Родительская» последовательность (родительского белка или фермента, также называемого «родительским ферментом») является исходной последовательностью для введения изменений (например, путем введения одной или более аминокислотных замен, вставок, делеций или их комбинации) в последовательность, что приводит к «вариантам» родительских последовательностей. Термин «родительский фермент» (или родительская последовательность) включает ферменты (последовательности) дикого типа и синтетически полученные последовательности (ферменты), которые используются в качестве исходных последовательностей для введения (дальнейших) изменений.

Термин «вариант фермента» или «вариант последовательности» или «вариантный фермент» относится к ферменту, который в определенной степени отличается от своего родительского фермента по своей аминокислотной последовательности. Если не указано иное, вариантный фермент «имеющий ферментативную активность» означает, что этот вариантный фермент обладает таким же типом ферментативной активности, что и соответствующий родительский фермент.

При описании вариантов настоящего изобретения применяется следующая номенклатура:

Аминокислотные замены описаны, показывая исходную аминокислоту родительского фермента, за которой следует номер позиции в аминокислотной последовательности, за которой следует замещенная аминокислота.

Делеции аминокислот описаны, показывая исходную аминокислоту родительского фермента, за которой следует номер позиции в аминокислотной последовательности, за которой следует *.

Вставки аминокислот описаны, показывая исходную аминокислоту родительского фермента, за которой следует номер позиции в аминокислотной последовательности, за которой следует исходная аминокислота и дополнительная аминокислота. Например, вставка в положении 180 лизина после глицина обозначена как «Gly180GlyLys» или «G180GK».

В тех случаях, когда замена и вставка происходят в одном и том же положении, это может указываться как S99SD + S99A или коротко S99AD. В тех случаях, когда вставлен остаток аминокислоты, идентичный существующему остатку аминокислоты, ясно, что возникает вырождение в номенклатуре. Если, например, глицин вставлен после глицина в вышеприведенном примере, это будет указано как G180GG.

В тех случаях, когда в положение могут вноситься различные изменения, различные изменения разделяются запятой, например, «Arg170Tyr, Glu» представляет собой замену аргинина в положении 170 тирозином или глутаминовой кислотой. В качестве альтернативы в скобках могут быть указаны различные изменения или необязательные замены, например, Arg170 [Tyr, Gly] или Arg170 {Tyr, Gly}; или коротко R170 [Y, G] или R170 {Y, G}; или в длинном варианте R170Y, R170G.

Варианты ферментов могут определяться своей «идентичностью последовательности» по сравнению с родительской последовательностью. Идентичность последовательности обычно указывается как «% идентичности последовательности» или «% идентичности». Для вычисления идентичности последовательностей на первом этапе необходимо выполнить выравнивание последовательностей. В соответствии с настоящим изобретением должно производиться парное глобальное выравнивание, что означает, что две последовательности должны быть выровнены по всей их длине, что обычно производится с использованием математического подхода, называемого алгоритмом выравнивания.

Согласно настоящему изобретению выравнивание генерируется с использованием алгоритма Нидлмана — Вунша (J. Mol. Biol. (1979) 48, p. 443-453). Предпочтительно, для целей настоящего изобретения используется программа «NEEDLE» (The European Molecular Biology Open Software Suite (EMBOSS)) с использованием параметра программы по умолчанию (полинуклеотиды: открытие гэпа = 10,0, расширение гэпа = 0,5 и матрица = EDNAFULL; полипептиды: открытие гэпа = 10,0, расширение гэпа = 0,5 и матрица =EBLOSUM62).

Согласно настоящему изобретению, % идентичности рассчитывается следующим образом: % идентичности = (идентичные остатки / длина области выравнивания, которая показывает соответствующую последовательность настоящего изобретения по всей ее длине) * 100.

Согласно настоящему изобретению варианты фермента могут быть описаны как аминокислотная последовательность, которая на по меньшей мере n% идентична аминокислотной последовательности соответствующего родительского фермента, причем «n» представляет собой целое число от 10 до 100. Согласно одному варианту осуществления настоящего изобретения варианты фермента на по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 81%, по меньшей мере 82%, по меньшей мере 83%, по меньшей мере 84%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 86%, по меньшей мере 87%, по меньшей мере 88%, по меньшей мере 89%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 91%, по меньшей мере 92%, по меньшей мере 93%, по меньшей мере 94%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98%, или по меньшей мере 99% идентичны по сравнению с аминокислотной последовательностью полной длины родительского фермента, где вариант фермента имеет ферментативную активность.

Варианты фермента могут определяться по их «подобию последовательности» по сравнению с родительским ферментом. Подобие последовательностей обычно предоставляется как «% подобия последовательностей» или «% подобия». % подобия последовательностей учитывает, что определенные наборы аминокислот имеют сходные свойства, например, по размеру, по их гидрофобности, по их заряду или по другим характеристикам. Здесь замена одной аминокислоты на подобную аминокислоту может представлять собой «консервативную мутацию».

Для определения %-подобия согласно настоящему изобретению применяют следующее: аминокислота A подобна аминокислоте S; аминокислота D подобна аминокислотам E и N; аминокислота E подобна аминокислотам D и K и Q; аминокислота F подобна аминокислотам W и Y; аминокислота H подобна аминокислотам N и Y; аминокислота I подобна аминокислотам L и M и V; аминокислота K подобна аминокислотам E и Q и R; аминокислота L подобна аминокислотам I и M и V; аминокислота M подобна аминокислотам I и L и V; аминокислота N подобна аминокислотам D и H и S; аминокислота Q подобна аминокислотам E и K и R; аминокислота R подобна аминокислотам K и Q; аминокислота S подобна аминокислотам A и N и T; аминокислота T подобна аминокислоте S; аминокислота V подобна аминокислоте I и L и M; аминокислота W подобна аминокислоте F и Y; аминокислота Y подобна аминокислотам F и H и W.

Консервативные аминокислотные замены могут происходить по всей длине последовательности полипептидной последовательности функционального белка, такого как фермент. Согласно одному варианту осуществления настоящего изобретения такие мутации не относятся к функциональным доменам фермента. Согласно одному варианту осуществления настоящего изобретения консервативные мутации не относятся к каталитическим центрам фермента.

Чтобы принять во внимание консервативные мутации, значение для подобия последовательностей двух аминокислотных последовательностей может быть вычислено на основе одного и того же выравнивания, которое используется для вычисления % идентичности.

Согласно настоящему изобретению, % подобия рассчитывается следующим образом: % подобия = [(идентичные остатки+подобные остатки) / длина области выравнивания, которая показывает соответствующую последовательность (последовательности) настоящего изобретения по всей ее длине)] * 100.

Согласно настоящему изобретению варианты фермента могут быть описаны как аминокислотная последовательность, которая на по меньшей мере m % подобна соответствующей родительской аминокислотной последовательности, причем «m» представляет собой целое число от 10 до 100. Согласно одному варианту осуществления настоящего изобретения варианты фермента на по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 91%, по меньшей мере 92%, по меньшей мере 93%, по меньшей мере 94%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98%, или по меньшей мере 99% подобны по сравнению с полипептидной последовательностью полной длины родительского фермента, где вариантный фермент имеет ферментативную активность.

«Ферментативная активность» означает каталитический эффект, оказываемый ферментом, который обычно выражается в единицах на миллиграмм фермента (удельная активность), который относится к молекулам субстрата, трансформированным в минуту на молекулу фермента (молекулярная активность).

Варианты фермента могут иметь ферментативную активность согласно настоящему изобретению, когда указанные варианты фермента проявляют по меньшей мере 20%, по меньшей мере 25%, по меньшей мере 30%, по меньшей мере 35%, по меньшей мере 40%, по меньшей мере 45%, по меньшей мере 50%, по меньшей мере 55%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 65%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, или 100% от ферментативной активности соответствующего родительского фермента.

По меньшей мере один фермент, содержащийся в компоненте (b), выбран из группы гидролаз (EC 3).

Липаза

Согласно одному варианту осуществления настоящего изобретения ферментные препараты согласно настоящему изобретению содержат по меньшей мере одну липазу (EC 3.1.1; компонент (b)). «Липазы», «липолитический фермент», «липидная эстераза», все относятся к ферменту EC класса 3.1.1 («карбоксильная сложноэфирная гидролаза»). Липаза означает активный белок, имеющий липазную активность (или липолитическую активность; триацилглицероллипазу, EC 3.1.1.3), кутиназную активность (EC 3.1.1.74; ферменты, имеющие кутиназную активность могут быть названы кутиназой в настоящем документе), стеролэстеразную активность (EC 3.1.1.13) и/или воск-сложноэфирную гидролазную активность (EC 3.1.1.50).

Способы определения липолитической активности хорошо известны из литературы (см., например, Gupta et al. (2003), Biotechnol. Appl. Biochem. 37, p. 63-71). Например, липазная активность может быть измерена посредством гидролиза сложноэфирной связи в субстрате пара-нитрофенилпальмитате (pNP-пальмитат, C:16) и высвобождения pNP, который имеет желтый цвет и может быть обнаружен при 405 нм.

«Липолитическая активность» означает каталитический эффект, оказываемый липазой, который может быть обеспечен в липолитических единицах (LU). Например, 1LU может соответствовать количеству липазы, которое продуцирует 1 мкмоль титруемой жирной кислоты в минуту в устройстве pH-стат, при следующих условиях: температура 30°С; рН = 9,0; субстрат может представлять собой эмульсию из 3,3 мас.% оливкового масла и 3,3% гуммиарабика, в присутствии 13 ммоль/л Ca²⁺ и 20 ммоль/л NaCl в 5 ммоль/л Трис-буфера.

Липазы (компонент (b)) включают липазы бактериального или грибкового происхождения. Согласно одному аспекту настоящего изобретения подходящая липаза (компонент (b)) выбрана из следующих: липазы из Humicola (синоним Thermomyces), например, из H. lanuginosa (T. lanuginosus), как описано в EP 258068, EP 305216, WO 92/05249 и WO 2009/109500 или из H. insolens, как описано в WO 96/13580; липазы, происходящие из Rhizomucor miehei, как описано в WO 92/05249; липаза из штаммов Pseudomonas (некоторые из них в настоящее время переименованы в Burkholderia), например, из P. alcaligenes или P. pseudoalcaligenes (EP 218272, WO 94/25578, WO 95/30744, WO 95/35381, WO 96/00292), P. cepacia (EP 331376), P. stutzeri (GB 1372034), P. fluorescens, Pseudomonas sp. штамм SD705 (WO 95/06720 и WO 96/27002), P. wisconsinensis (WO 96/12012), Pseudomonas mendocina (WO 95/14783), P. glumae (WO 95/35381, WO 96/00292); липаза из Streptomyces griseus (WO 2011/150157) и S. pristinaespiralis (WO 2012/137147), липазы из Streptomyces типа GDSL (WO 2010/065455); липаза из Thermobifida fusca, как раскрыто в WO 2011/084412; липаза из Geobacillus stearothermophilus, как раскрыто в WO 2011/084417; Bacillus lipases, например, как раскрыто в WO 00/60063, липазы из B. subtilis, как раскрыто в Dartois et al. (1992), Biochemica et Biophysica Acta, 1131, 253-360 или WO 2011/084599, B. stearothermophilus (JP S64-074992) или B. pumilus (WO 91/16422); липаза из Candida antarctica, как раскрыто в WO 94/01541; кутиназа из Pseudomonas mendocina (US 5389536, WO 88/09367); кутиназа из Magnaporthe grisea (WO 2010/107560); кутиназа из Fusarum solani pisi, как раскрыто в WO 90/09446, WO 00/34450 и WO 01/92502; и кутиназа из Humicola lanuginosa, как раскрыто в WO 00/34450 и WO 01/92502.

Подходящие липазы (компонент (b)) также включают липазы, упоминаемые как ацилтрансферазы или пергидролазы, например, ацилтрансферазы, гомологичные липазе A из Candida antarctica (WO 2010/111143), ацилтрансферазы из Mycobacterium smegmatis (WO 2005/056782), пергидролазы семейства CE7 (WO 2009/67279), и варианты пергидролаз из M. smegmatis, в частности вариант S54V (WO 2010/100028).

Подходящие липазы (компонент (b)) также включают липазы, которые представляют собой варианты вышеописанных липаз, которые имеют липолитическую активность. Такие подходящие варианты липаз (компонент (b)) представляют собой, например, липазы, которые получены способами, как раскрыто в WO 95/22615, WO 97/04079, WO 97/07202, WO 00/60063, WO 2007/087508, EP 407225 и EP 260105.

Подходящие липазы (компонент (b)) включают варианты липаз, имеющие липолитическую активность, которые на по меньшей мере 40%, по меньшей мере 45%, по меньшей мере 50%, по меньшей мере 55%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 65%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 91%, по меньшей мере 92%, по меньшей мере 93%, по меньшей мере 94%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентичны по сравнению с полипептидной последовательностью полной длины родительского фермента, как описано выше.

Подходящие липазы (компонент (b)) включают варианты липаз, имеющие липолитическую активность, которые на по меньшей мере 40%, по меньшей мере 45%, по меньшей мере 50%, по меньшей мере 55%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 65%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 91%, по меньшей мере 92%, по меньшей мере 93%, по меньшей мере 94%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% подобны по сравнению с полипептидной последовательностью полной длины родительского фермента.

Согласно одному варианту осуществления настоящего изобретения липаза (компонент (b)) выбрана из грибковой триацилглицероллипазы (EC класс 3.1.1.3). Грибковая триацилглицероллипаза (компонент (b)) может быть выбрана из липазы из Thermomyces lanuginosa. Согласно одному варианту осуществления настоящего изобретения липаза из Thermomyces lanuginosa (компонент (b)) выбрана из триацилглицероллипазы согласно аминокислотам 1-269 последовательности SEQ ID NO:2 из US 5869438 и ее вариантов, имеющих липолитическую активность. Триацилглицероллипаза согласно аминокислотам 1-269 последовательности SEQ ID NO:2 из US 5869438 может быть названа липолазой в настоящем документе.

Липаза из Thermomyces lanuginosa (компонент (b)) может быть выбрана из вариантов, имеющих липолитическую активность, которые на по меньшей мере 90%, по меньшей мере 91%, по меньшей мере 92%, по меньшей мере 93%, по меньшей мере 94%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентичны по сравнению с полипептидной последовательностью полной длины аминокислот 1-269 последовательности SEQ ID NO:2 из US 5869438.

Липаза из Thermomyces lanuginosa (компонент (b)) может быть выбрана из вариантов, имеющих липолитическую, содержащих только консервативные мутации, которые, однако, не относятся к функциональному домену аминокислот 1-269 последовательности SEQ ID NO:2 из US 5869438. Варианты липазы согласно этому варианту осуществления, имеющие липолитическую активность, могут быть на по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% подобны по сравнению с полипептидной последовательностью полной длины аминокислот 1-269 последовательности SEQ ID NO:2 из US 5869438.

Липаза из Thermomyces lanuginosa (компонент (b)) может быть на по меньшей мере 80% идентична последовательности SEQ ID NO:2 из US 5869438, отличающейся присутствием аминокислоты T231R и N233R. Указанная липаза из Thermomyces lanuginosa может дополнительно содержать одну или более из следующих аминокислотных замен: Q4V, V60S, A150G, L227G, P256K.

Согласно одному варианту осуществления настоящего изобретения по меньшей мере одна липаза выбрана из коммерчески доступных липаз, которые включают, но без ограничения к этому, продукты, продаваемые под торговыми наименованиями Lipolase™, Lipex™, Lipolex™ и Lipoclean™ (Novozymes A/S), Lumafast (изначально от Genencor) и Lipomax (Gist-Brocades/ в настоящее время DSM).

Согласно настоящему изобретению компонент (b) может содержать комбинацию по меньшей мере двух липаз, предпочтительно выбранных из группы триацилглицероллипаз (EC 3.1.1.3).

Согласно одному варианту осуществления настоящего изобретения компонент (b) содержит по меньшей мере одну липазу, выбранную из триацилглицероллипаза согласно аминокислотам 1-269 последовательности SEQ ID NO:2 из US 5869438 и ее вариантов, имеющих липолитическую активность, как описано выше.

Согласно одному варианту осуществления настоящего изобретения компонент (b) содержит комбинацию по меньшей мере одной липазы, предпочтительно выбранной из группы триацилглицероллипаз (EC 3.1.1.3), и по меньшей мере одной протеазы, предпочтительно выбранной из серинэндопептидаз (EC 3.4.21), более предпочтительно выбранной из группы протеаз типа субтилизина (EC 3.4.21.62).

Протеаза

Согласно одному варианту осуществления настоящего изобретения ферментные препараты согласно настоящему изобретению содержат по меньшей мере одну протеазу (компонент (b)). Протеазы являются членом класса EC 3.4. Протеазы (компонент (b)) включают аминопептидазы (EC 3.4.11), дипептидазы (EC 3.4.13), дипептидил-пептидазы и трипептидил-пептидазы (EC 3.4.14), пептидил-дипептидазы (EC 3.4.15), карбоксипептидазы серинового типа (EC 3.4.16), металлокарбоксипептидазы (EC 3.4.17), карбоксипептидазы цистеинового типа (EC 3.4.18), омега пептидазы (EC 3.4.19), сериновые эндопептидазы (EC 3.4.21), цистеиновые эндопептидазы (EC 3.4.22), аспарагиновые эндопептидазы (EC 3.4.23), металлоэндопептидазы (EC 3.4.24), треониновые эндопептидазы (EC 3.4.25), или эндопептидазы неизвестного каталитического механизма (EC 3.4.99).

Согласно одному варианту осуществления настоящего изобретения по меньшей мере одна протеаза (компонент (b)) выбрана из сериновых протеаз (EC 3.4.21). Сериновые протеазы или сериновые пептидазы отличаются присутствием серина в каталитически активном сайте, который образует ковалентный аддукт с субстратом в ходе каталитической реакции. Сериновая протеаза (компонент (b)) в контексте настоящего изобретения выбрана из группы, состоящей из химотрипсина (например, EC 3.4.21.1), эластазы (например, EC 3.4.21.36), эластазы (например, EC 3.4.21.37 или EC 3.4.21.71), гранзима (например, EC 3.4.21.78 или EC 3.4.21.79), калликреина (например, EC 3.4.21.34, EC 3.4.21.35, EC 3.4.21.118, или EC 3.4.21.119,) плазмина (например, EC 3.4.21.7), трипсина (например, EC 3.4.21.4), тромбина (например, EC 3.4.21.5), и субтилизина. Субтилизин также известен как субтилопептидаза, например, EC 3.4.21.62, причем последняя далее также упоминается как “субтилизин”.

Подгруппа сериновых протеаз, предварительно обозначенная как субтилазы, предложена Siezen et al. (1991), Protein Eng. 4:719-737 и Siezen et al. (1997), Protein Science 6:501-523. Субтилазы включают субтилизиновое семейство, термитазное семейство, семейство протеиназ К, семейство лантибиотических пептидаз, семейство кексинов и семейство пиролизинов.

Подгруппой субтилаз являются субтилизины, которые представляют собой сериновые протеаза из семейства S8, как определено в базе данных MEROPS (http://merops.sanger.ac.uk). Семейство пептидаз S8 содержит сериновую эндопептидазу субтилизин и его гомологи. В подсемействе S8A остатки активного сайта часто встречаются в мотивах Asp-Thr/Ser-Gly (что подобно мотиву последовательности в семействах аспарагиновой эндопептидазы в клане AA), His-Gly-Thr-His и Gly-Thr-Ser-Met-Ala-Xaa-Pro.

Относящийся к субтилизину класс сериновых протеаз (компонент (b)) имеет общую аминокислотную последовательность, определяющую каталитическую триаду, которая отличает их от относящегося к химотрипсину класса сериновых протеаз. Субтилизины и химотрипсин-связанные сериновые протеазы имеют каталитическую триаду, включающую аспартат, гистидин и серин.

Примеры включают субтилизины, как описано в WO 89/06276 и EP 0283075, WO 89/06279, WO 89/09830, WO 89/09819, WO 91/06637 и WO 91/02792.

Протеазы представляют собой активные белки, проявляющие “протеазную активность” или “протеолитическую активность”. Протеолитическая активность относится к скорости разрушения белка протеазой или протеолитическим ферментом в течение определенного периода времени.

Способы анализа протеолитической активности хорошо известны из литературы (см., например, Gupta et al. (2002), Appl. Microbiol. Biotechnol. 60: 381-395). Протеолитическая активность может быть определена посредством применения сукцинил-Ala-Ala-Pro-Phe-п-нитроанилида (Suc-AAPF-pNA, кратко AAPF; см., например, DelMar et al. (1979), Analytical Biochem 99, 316-320) в качестве субстрата. pNA отщепляется от молекулы субстрата протеолитическим расщеплением, что приводит к появлению желтого цвета свободного pNA, которую можно количественно определить путем измерения OD₄₀₅.

Протеолитическая активность может быть обеспечена в единицах на грамм фермента. Например, 1 Е протеазы может соответствовать количеству протеазы, которое высвобождает 1 мкмоль фолин-позитивных аминокислот и пептидов (как тирозин) в минуту при рН 8,0 и 37 °С (казеин в качестве субстрата).

Протеазы (компонент (b)) субтилизинового типа (EC 3.4.21.62) могут представлять собой бактериальные протеазы, происходящие из микроорганизма, выбранного из Bacillus, Clostridium, Enterococcus, Geobacillus, Lactobacillus, Lactococcus, Oceanobacillus, Staphylococcus, Streptococcus, или протеазу из Streptomyces протеаза, или полипептид из грамотрицательных бактерий, таких как Campylobacter, E. coli, Flavobacterium, Fusobacterium, Helicobacter, llyobacter, Neisseria, Pseudomonas, Salmonella и Ureaplasma.

Согласно одному аспекту настоящего изобретения по меньшей мере одна протеаза (компонент (b)) выбрана из протеаз из Bacillus alcalophilus, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus brevis, Bacillus circulans, Bacillus clausii, Bacillus coagulans, Bacillus firmus, Bacillus gibsonii, Bacillus lautus, Bacillus lentus, Bacillus licheniformis, Bacillus megaterium, Bacillus pumilus, Bacillus sphaericus, Bacillus stearothermophilus, Bacillus subtilis, или Bacillus thuringiensis.

Согласно одному варианту осуществления настоящего изобретения по меньшей мере одна протеаза (компонент (b)) выбрана из следующих: субтилизин из Bacillus amyloliquefaciens BPN' (описано Vasantha et al. (1984) J. Bacteriol. Volume 159, p. 811-819 и JA Wells et al. (1983) in Nucleic Acids Research, Volume 11, p. 7911-7925); субтилизин из Bacillus licheniformis (субтилизин Carlsberg; раскрытый в EL Smith et al. (1968) in J. Biol Chem, Volume 243, pp. 2184-2191, и Jacobs et al. (1985) in Nucl. Acids Res, Vol 13, p. 8913-8926); субтилизин PB92 (исходная последовательность щелочной протеазы PB92 описана в EP 283075 A2); субтилизин 147 и/или 309 (Esperase®, Savinase®, соответственно), как раскрыто в WO 89/06279; субтилизин из Bacillus lentus, как раскрыто в WO 91/02792, как например из Bacillus lentus DSM 5483 или вариантов Bacillus lentus DSM 5483, как описано в WO 95/23221; субтилизин из Bacillus alcalophilus (DSM 11233), раскрытого в DE 10064983; субтилизин из Bacillus gibsonii (DSM 14391), как раскрыто в WO 2003/054184; субтилизин из Bacillus sp. (DSM 14390), как раскрыто в WO 2003/056017; субтилизин из Bacillus sp. (DSM 14392), как раскрыто в WO 2003/055974; субтилизин из Bacillus gibsonii (DSM 14393), как раскрыто в WO 2003/054184; субтилизин, имеющий последовательность SEQ ID NO: 4, как описано в WO 2005/063974; субтилизин, имеющий последовательность SEQ ID NO: 4, как описано в WO 2005/103244; субтилизин, имеющий последовательность SEQ ID NO: 7, как описано в WO 2005/103244; и субтилизин, имеющий последовательность SEQ ID NO: 2, как описано в заявке DE 102005028295.4.

Согласно одному варианту осуществления настоящего изобретения компонент (b) содержит по меньшей мере субтилизин 309 (который может быть назван Savinase в настоящем документе), как раскрыто в виде последовательности a) в Таблице I в WO 89/06279, или вариант, который на по меньшей мере 80% идентичен ему и имеет протеолитическую активность.

Примеры подходящих протеаз (компонент (b)) согласно настоящему изобретению содержат варианты, описанные в: WO 92/19729, WO 95/23221, WO 96/34946, WO 98/20115, WO 98/20116, WO 99/11768, WO 01/44452, WO 02/088340, WO 03/006602, WO 2004/03186, WO 2004/041979, WO 2007/006305, WO 2011/036263, WO 2011/036264, и WO 2011/072099. Подходящие примеры включают в частности варианты протеазы субтилизин, происходящие из последовательности SEQ ID NO:22, как описано в EP 1921147 (которая представляет собой последовательность зрелой щелочной протеазы из Bacillus lentus DSM 5483) с аминокислотными заменами в одном или более из следующих положений: 3, 4, 9, 15, 24, 27, 33, 36, 57, 68, 76, 77, 87, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101 , 102, 103, 104, 106, 118, 120, 123, 128, 129, 130, 131, 154, 160, 167, 170, 194, 195, 199, 205, 206, 217, 218, 222, 224, 232, 235, 236, 245, 248, 252 и 274 (согласно BPN' нумерации), которые имеют протеолитическую активность. Согласно одному варианту осуществления настоящего изобретения такая протеаза не имеет мутацию в положениях Asp32, His64 и Ser221 (согласно BPN’ нумерации).

Подходящие протеазы (компонент (b)) включают варианты протеаз, имеющие протеолитическую активность, которые на по меньшей мере 40%, по меньшей мере 45%, по меньшей мере 50%, по меньшей мере 55%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 65%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 91%, по меньшей мере 92%, по меньшей мере 93%, по меньшей мере 94%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентичны по сравнению с полипептидной последовательностью полной длины родительского фермента, как описано выше.

Подходящие протеазы (компонент (b)) включают варианты протеазы, имеющие протеолитическую активность, которые на по меньшей мере 40%, по меньшей мере 45%, по меньшей мере 50%, по меньшей мере 55%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 65%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 91%, по меньшей мере 92%, по меньшей мере 93%, по меньшей мере 94%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% подобны по сравнению с полипептидной последовательностью полной длины родительского фермента.

Согласно одному варианту осуществления настоящего изобретения по меньшей мере одна протеаза (компонент (b)) имеет последовательность SEQ ID NO:22, как описано в EP 1921147, или протеаза на по меньшей мере 80% идентична ей и имеет протеолитическую активность. Согласно одному варианту осуществления настоящего изобретения указанная протеаза отличается присутствием аминокислоты глутаминовая кислота (E), или аспарагиновая кислота (D), или аспарагин (N), или глутамин (Q), или аланин (A), или глицин (G), или серин (S) в положении 101 (согласно BPN’ нумерации) и имеет протеолитическую активность. Согласно одному варианту осуществления настоящего изобретения указанная протеаза содержит одну или более следующих замен: (a) треонин в положении 3 (3T), (b) изолейцин в положении 4 (4I), (c) аланин, треонин или аргинин в положении 63 (63A, 63T, или 63R), (d) аспарагиновая кислота или глутаминовая кислота в положении 156 (156D или 156E), (e) пролин в положении 194 (194P), (f) метионин в положении 199 (199M), (g) изолейцин в положении 205 (205I), (h) аспарагиновая кислота, глутаминовая кислота или глицин в положении 217 (217D, 217E или 217G), (i) комбинации двух или более аминокислот согласно (a) - (h). По меньшей мере одна протеаза (компонент (b)) может быть на по меньшей мере 80% идентична последовательности SEQ ID NO:22, как описано в EP 1921147, и отличается содержанием одной аминокислоты (согласно (a)-(h)) или комбинаций согласно (i) вместе с аминокислотой 101E, 101D, 101N, 101Q, 101A, 101G, или 101S (согласно BPN’ нумерации) и наличием протеолитической активности. Согласно одному варианту осуществления настоящего изобретения указанная протеаза отличается содержанием мутации (согласно BPN’ нумерации) R101E, или S3T + V4I + V205I, или R101E и S3T, V4I, и V205I, или S3T + V4I + V199M + V205I + L217D, и имеет протеолитическую активность.

Согласно одному варианту осуществления настоящего изобретения протеаза согласно последовательности SEQ ID NO:22, как описано в EP 1921147, отличается содержанием мутации (согласно BPN’ нумерации) S3T + V4I + S9R + A15T + V68A + D99S + R101S + A103S + I104V + N218D, и присутствием протеолитической активности.

Согласно одному варианту осуществления настоящего изобретения по меньшей мере одна протеаза выбран из коммерчески доступных протеазных ферментов, которые включают, но без ограничения к этому, продукты, продаваемые под торговыми наименованиями Alcalase®, Blaze®, Duralase™, Durazym™, Relase®, Relase® Ultra, Savinase®, Savinase® Ultra, Primase®, Polarzyme®, Kannase®, Liquanase®, Liquanase® Ultra, Ovozyme®, Coronase®, Coronase® Ultra, Neutrase®, Everlase® and Esperase® (Novozymes A/S), продаваемые под торговыми наименованиями Maxatase®, Maxacal®, Maxapem®, Purafect®, Purafect® Prime, Purafect MA®, Purafect Ox®, Purafect OxP®, Puramax®, Properase®, FN2®, FN3®, FN4®, Excellase®, Eraser®, Ultimase®, Opticlean®, Effectenz®, Preferenz® и Optimase® (Danisco/DuPont), Axapem™ (Gist-Brocases N.V.), щелочная протеаза из Bacillus lentus (BLAP; последовательность показана на Фиг. 29 в US 5,352,604) и ее варианты и KAP (субтилизин из Bacillus alkalophilus) от Kao Corp.

Согласно настоящему изобретению компонент (b) может содержать комбинацию по меньшей мере двух протеаз, предпочтительно выбранных из группы сериновых эндопептидаз (EC 3.4.21), более предпочтительно выбранных из группы протеаз субтилизинового типа (EC 3.4.21.62) – все, как описано выше.

Согласно одному варианту осуществления настоящего изобретения компонент (b) содержит комбинацию по меньшей мере одной липазы м по меньшей мере одной протеазы. Согласно одному варианту осуществления настоящего изобретения компонент (b) содержит по меньшей мере одну липазу, выбранную из триацилглицероллипазы (EC 3.1.1.3), и по меньшей мере одну протеазу, выбранную из группы сериновых эндопептидаз (EC 3.4.21), более предпочтительно выбранных из группы протеаз субтилизинового типа (EC 3.4.21.62).

Согласно одному варианту осуществления настоящего изобретения компонент (b) содержит по меньшей мере одну липазу, выбранную из триацилглицероллипазы (EC 3.1.1.3), и по меньшей мере одну протеазу, выбранную из протеаз согласно последовательности SEQ ID NO:22, как описано в EP 1921147, или ее вариантов, имеющих протеолитическую активность – все, как описано выше.

Согласно одному варианту осуществления настоящего изобретения компонент (b) содержит по меньшей мере одну липазу, выбранную из триацилглицероллипазы согласно аминокислотам 1-269 последовательности SEQ ID NO:2 из US 5869438 и ее вариантов, имеющих липолитическую активность, и по меньшей мере одну протеазу, выбранную из протеаз согласно последовательности SEQ ID NO:22, как описано в EP 1921147, или ее вариантов, имеющих протеолитическую активность – все, как описано выше.

Согласно одному варианту осуществления настоящего изобретения компонент (b) содержит по меньшей мере одну липазу, выбранную из триацилглицероллипазы согласно аминокислотам 1-269 последовательности SEQ ID NO:2 из US 5869438 и ее вариантов, имеющих липолитическую активность, и по меньшей мере одну протеазу, выбранную из субтилизина 309, как раскрыто в Таблице I a) из WO 89/06279, или его вариантов, имеющих протеолитическую активность – все, как описано выше.

Амилаза

Согласно одному варианту осуществления настоящего изобретения ферментные препараты согласно настоящему изобретению содержат по меньшей мере одну амилазу (компонент (b)). “Амилазы” (компонент (b)) согласно настоящему изобретению (альфа и/или бета) включают амилазы бактериального или грибкового происхождения (EC 3.2.1.1 и 3.2.1.2, соответственно). Химически модифицированные или полученные с помощью белковой инженерии мутанты включены.

Амилазы (компонент (b)) согласно настоящему изобретению обладают «амилолитической активностью» или «амилазной активностью», включающей (эндо)гидролиз глюкозидных связей в полисахаридах. Активность α-амилазы может быть определена с помощью анализов для измерения активности α-амилазы, которые известны специалистам в данной области техники. Примерами анализов, измеряющих активность α-амилазы, являются:

активность α-амилазы может быть определена способом, использующим таблетки Phadebas в качестве субстрата (Phadebas Amylase Test, поставляемый Magle Life Science). Крахмал гидролизуется α-амилазой, давая растворимые синие фрагменты. Поглощение полученного синего раствора, измеренное спектрофотометрически при 620 нм, является функцией активности α-амилазы. Измеренное поглощение прямо пропорционально удельной активности (активность/мг чистого белка α-амилазы) рассматриваемой α-амилазы при данном наборе условий.

Активность α-амилазы также может быть определена методом, использующим этилиден-4-нитрофенил-α-D-мальтогептаозид (EPS). D-мальтогептаозид представляет собой блокированный олигосахарид, который может расщепляться эндоамилазой. После расщепления α-глюкозидаза, включенная в набор для расщепления субстрата, высвобождает свободную молекулу PNP, которая имеет желтый цвет и, таким образом, может быть измерена с помощью видимой спектрофотомерии при 405 нм. Наборы, содержащие субстрат EPS и α-глюкозидазу, производятся Roche Costum Biotech (кат. № 10880078103). Наклон кривой зависимости адсорбции от времени прямо пропорционален удельной активности (активность на мг фермента) рассматриваемой α-амилазы в данном наборе условий.

Амилолитическая активность может быть обеспечена в единицах на грамм фермента. Например, 1 единица α-амилазы может высвобождать 1.0 мг мальтозы из крахмала за 3 мин при pH 6.9 при 20°C.

По меньшей мере одна амилаза (компонент (b)) может быть выбрана из следующих: амилазы из Bacillus licheniformis, имеющие последовательность SEQ ID NO:2, как описано в WO 95/10603; амилазы из B. stearothermophilus, имеющие последовательность SEQ ID NO:6, как раскрыто в WO 02/10355; амилазы из Bacillus sp.707, имеющие последовательность SEQ ID NO:6, как раскрыто в WO 99/19467; амилазы из Bacillus halmapalus, имеющие последовательность SEQ ID NO:2 или SEQ ID NO:7, как описано в WO 96/23872, также описанные как SP-722; амилазы из Bacillus sp. DSM 12649, имеющие последовательность SEQ ID NO:4, как раскрыто в WO 00/22103; амилазы из штамма Bacillus TS-23, имеющие последовательность SEQ ID NO:2, как раскрыто в WO 2009/061380; амилазы из Cytophaga sp., имеющие последовательность SEQ ID NO:1, как раскрыто в WO 2013/184577; амилазы из Bacillus megaterium DSM 90, имеющие последовательность SEQ ID NO:1, как раскрыто в WO 2010/104675; амилазы из Bacillus sp., содержащие аминокислоты 1 - 485 последовательности SEQ ID NO:2, как описано в WO 00/60060.

Подходящие амилазы (компонент (b)) включают варианты амилазы, имеющие амилазную активность, которые на по меньшей мере 40%, по меньшей мере 45%, по меньшей мере 50%, по меньшей мере 55%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 65%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 91%, по меньшей мере 92%, по меньшей мере 93%, по меньшей мере 94%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентичны по сравнению с полипептидной последовательностью полной длины родительского фермента, как описано выше.

Подходящие амилазы (компонент (b)) включают варианты амилазы, имеющие амилазную активность, которые на по меньшей мере 40%, по меньшей мере 45%, по меньшей мере 50%, по меньшей мере 55%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 65%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 91%, по меньшей мере 92%, по меньшей мере 93%, по меньшей мере 94%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% подобны по сравнению с полипептидной последовательностью полной длины родительского фермента.

По меньшей мере одна амилаза (компонент (b)) может иметь последовательность SEQ ID NO: 12, как описано в WO 2006/002643, ил на по меньшей мере 80% идентичную ей, и имеет амилолитическую активность. По меньшей мере одна амилаза может быть на по меньшей мере 80% идентична последовательности SEQ ID NO:12 и содержит замены в положениях Y295F и M202LITV.

По меньшей мере одна амилаза (компонент (b)) может иметь последовательность SEQ ID NO:6, как описано в WO 2011/098531, ил на по меньшей мере 80% идентичную ей, и имеет амилолитическую активность. По меньшей мере одна амилаза может быть на по меньшей мере 80% идентична последовательности SEQ ID NO:6 и содержит замену в родном или более положениях, выбранных из группы, состоящей из 193 [G,A,S,T или M], 195 [F,W,Y,L,I или V], 197 [F,W,Y,L,I или V], 198 [Q или N], 200 [F,W,Y,L,I или V], 203 [F,W,Y,L,I или V], 206 [F,W,Y,N,L,I,V,H,Q,D или E], 210 [F,W,Y,L,I или V], 212 [F,W,Y,L,I или V], 213 [G,A,S,T или M] и 243 [F,W,Y,L,I или V].

По меньшей мере одна амилаза (компонент (b)) может иметь последовательность SEQ ID NO:1, как описано в WO 2013/001078, или на по меньшей мере 85% идентичную ей, и имеет амилолитическую активность. По меньшей мере одна амилаза может быть на по меньшей мере 85% идентична последовательности SEQ ID NO:1 и содержит изменение в двух или более (нескольких) положениях, соответствующее положениям G304, W140, W189, D134, E260, F262, W284, W347, W439, W469, G476 и G477.

По меньшей мере одна амилаза (компонент (b)) может иметь последовательность SEQ ID NO:2, как описано в WO 2013/001087, или на по меньшей мере 85% идентичную ей, и имеет амилолитическую активность. По меньшей мере одна амилаза может быть на по меньшей мере 85% идентична последовательности SEQ ID NO:2 и содержит делецию в положениях 181+182, или 182+183, или 183+184, и имеет амилолитическую активность. Согласно одному варианту осуществления настоящего изобретения указанная амилаза может содержать одну или две или более других модификаций в любом из положений, соответствующих W140, W159, W167, Q169, W189, E194, N260, F262, W284, F289, G304, G305, R320, W347, W439, W469, G476 и G477.

Согласно одному варианту осуществления настоящего изобретения по меньшей мере одна амилаза выбрана из коммерчески доступных амилаз, которые включают, но без ограничения к этому, продукты, продаваемые под торговыми наименованиями Duramyl™, Termamyl™, Fungamyl™, Stainzyme™, Stainzyme Plus™, Natalase™, Liquozyme X и BAN™ (от Novozymes A/S), и Rapidase™, Purastar™, Powerase^TM, Effectenz™ (M100 от DuPont), Preferenz™ (S1000, S110 и F1000; от DuPont), PrimaGreen™ (ALL; DuPont), Optisize™ (DuPont).

Согласно настоящему изобретению комбинация по меньшей мере двух амилаз (компонент (b)) может применяться.

Согласно одному варианту осуществления настоящего изобретения компонент (b) содержит комбинацию по меньшей мере одной липазы и по меньшей мере одной амилазы.

Согласно одному варианту осуществления настоящего изобретения компонент (b) содержит комбинацию по меньшей мере одной протеаза и/или по меньшей мере одной амилазы.

Согласно одному варианту осуществления настоящего изобретения компонент (b) содержит комбинацию по меньшей мере одной липазы и по меньшей мере одной протеазы и по меньшей мере одной амилазы.

Целлюлаза

Ферментный препарат согласно настоящему изобретению может содержать по меньшей мере одну целлюлазу (компонент (b)). Три основных типа целлюлаз известны, а именно целлобиогидролаза (1,4-P-D-глюканцеллобиогидролаза, EC 3.2.1.91), эндо-ss-1,4-глюканаза (эндо-1,4-P-D-глюкан-4-глюкангидролаза, EC 3.2.1.4) и ss-глюкозидаза (EC 3.2.1.21).

"Целлюлазы", “целлюлазные ферменты” или “целлюлолитические ферменты” (компонент (b)) представляют собой ферменты, участвующие в гидролизе целлюлозы. Анализы для измерения «целлюлазной активности» или «целлюлолитической активности» известны специалистам в данной области техники. Например, целлюлолитическая активность может быть определена в силу того факта, что целлюлаза гидролизует карбоксиметилцеллюлозу с восстановлением углеводов, восстановительная способность которых определяется колориметрически с помощью реакции феррицианида, согласно Hoffman, W. S., J. Biol. Chem. 120, 51 (1937).

Целлюлолитическая активность может быть обеспечена в единицах на грамм фермента. Например, 1 единица может высвободить 1,0 мкмоль глюкозы из целлюлозы за один час при рН 5,0 при 37 °С (время инкубации 2 часа).

Целлюлазы согласно настоящему изобретению включают целлюлазы бактериального или грибкового происхождения.

Согласно одному варианту осуществления настоящего изобретения по меньшей мере одна целлюлаза (компонент (b)) выбрана из коммерчески доступных целлюлаз, которые включают, но без ограничения к этому, Celluzyme^TM, Endolase^TM, Carezyme^TM, Cellusoft^TM, Renozyme^TM, Celluclean^TM (от Novozymes A/S), Ecostone^TM, Biotouch^TM, Econase^TM, Ecopulp^TM (от AB Enzymes Finland), Clazinase^TM, и Puradax HA^TM, Genencor detergent cellulase L, IndiAge^TM Neutra (от Genencor International Inc./DuPont), Revitalenz^TM (2000 от DuPont), Primafast^TM (DuPont) и KAC-500^TM (от Kao Corporation).

Компонент (c)

Согласно одному варианту осуществления настоящего изобретения жидкий ферментный препарат согласно настоящему изобретению содержит компонент (c), который содержит по меньшей мере одно соединение, выбранное из стабилизаторов ферментов, отличных от компонента (a), консервантов и поверхностно-активных веществ.

Стабилизаторы ферментов, отличные от компонента (a):

Жидкий ферментный препарат согласно настоящему изобретению может содержать по меньшей мере один стабилизатор фермента, отличный от компонента (a). Указанный стабилизатор фермента (компонент (c)) может быть выбран из борсодержащих соединений, полиолов, пептидных альдегидов, других стабилизаторов и их смесей.

Борсодержащие соединения:

Борсодержащие соединения (компонент (c)) могут быть выбраны из борной кислоты или ее производных и из бороновой кислоты или ее производных, таких как арилбороновые кислоты или их производные, из их солей и из их смесей. Борная кислота в настоящем изобретении может обозначаться как ортоборная кислота.

Согласно одному варианту осуществления настоящего изобретения борсодержащее соединение (компонент (c)) из группы, состоящей из арилбороновых кислот и их производных. В одном варианте выполнения настоящего изобретения, борсодержащее соединение выбрано из группы, состоящей из бензолбороновой кислоты (BBA), которая может быть названа в настоящем изобретении фенилбороновой кислотой (PBA), их производных и их смесей. В одном варианте выполнения настоящего изобретения, производные фенилбороновой кислоты выбирают из группы, состоящей из производных формулы (IIIa) и формулы (IIIb):

где

R1 выбирают из группы, состоящей из водорода, гидрокси, незамещенного или замещенного C₁-C₆ алкила, и незамещенного или замещенного C₁-C₆ алкенила; в предпочтительном варианте выполнения настоящего изобретения, R1 выбирают из группы, состоящей из гидрокси и незамещенного C₁ алкила;

R2 выбирают из группы, состоящей из водорода, гидрокси, незамещенного или замещенного C₁-C₆ алкила и незамещенного или замещенного C₁-C₆ алкенила; в предпочтительном варианте выполнения настоящего изобретения, R2 выбирают из группы, состоящей из H, гидрокси и замещенного C₁ алкила.

Согласно одному варианту осуществления производные фенилбороновой кислоты (компонент (c)) выбирают из группы, состоящей из 4-формилфенилбороновой кислоты (4-FPBA), 4-карбоксифенилбороновой кислоты (4-CPBA), 4-(гидроксиметил)фенилбороновой кислоты (4-HMPBA), и п-толилбороновой кислоты (п-TBA).

Другие подходящие производные (компонент (c)) включают 2-тиенилбороновую кислоту, 3-тиенилбороновую кислоту, (2-ацетамидофенил) бороновую кислоту, 2-бензофуранилбороновую кислоту, 1-нафтилбороновую кислоту, 2-нафтилбороновую кислоту, 2-FPBA, 3-FBPA, 1-тиантренилбороновую кислоту, 4-дибензофуранбороновую кислоту, 5-метил-2-тиенил бороновую кислоту, 1-бензотиофен-2 бороновую кислоту, 2-фуранилбороновую кислоту, 3-фуранилбороновую кислоту, 4,4-бифенил-дибороновую кислоту, 6-гидрокси-2-нафталинбороновую кислоту, 4-(метилтио)фенилбороновую кислоту, 4-(триметилсилил)фенилбороновую кислоту, 3-бромтиофенбороновую кислоту, 4-метилтиофенбороновую кислоту, 2-нафитлбороновую кислоту, 5-бромтиофенбороновую кислоту, 5-хлортиофенбороновую кислоту, диметилтиофенбороновую кислоту, 2-бромфенил бороновую кислоту, 3-хлорфенил бороновую кислоту, 3-метокси-2-тиофенбороновую кислоту, п-метил-фенилэтилбороновую кислоту, 2-тиантренилбороновую кислоту, ди-бензотиофенбороновую кислоту, 9-антраценбороновую кислоту, 3,5-дихлорфенилбороновую кислоту, дифенилбороновой кислоты ангидрид, o-хлорфенилбороновую кислоту, п-хлорфенил бороновую кислоту, м-бромфенилбороновую кислоту, п-бромофенилбороновую кислоту, п-фторфенилбороновую кислоту, октилбороновую кислоту, 1,3,5-триметилфенилбороновую кислоту, 3-хлор-4-фторфенилбороновую кислоту, 3-аминофенилбороновую кислоту, 3,5-бис-(трифтормеитл)фенилбороновую кислоту, 2,4-дихлорфенил бороновую кислоту, 4-метоксифенилбороновую кислоту и их смеси.

Полиолы:

Полиолы (компонент (c)) могут быть выбраны из полиолов, содержащих от 2 до 6 гидроксильных групп. Подходящие примеры включают гликоль, пропиленгликоль, 1,2-пропандиол, 1,2-бутандиол, этиленгликоль, гексиленгликоль, глицерин, сорбит, маннит, эритрит, глюкозу, фруктозу, лактозу и эритритан.

Пептидные альдегиды:

Пептидные альдегиды (компонент (c)) могут быть выбраны из альдегидов ди-, три- или тетрапептидов и альдегидных аналогов (любой из форм B1-BO-R, где R представляет собой H, H, CH₃, CX₃, CHX₂, или CH₂X (X= галоген), BO представляет собой один аминокислотный остаток (в одном варианте выполнения настоящего изобретения с необязательно замещенной алифатической или ароматической боковой цепью), и B1 состоит из одного или более аминокислотных остатков (в одном варианте выполнения настоящего изобретения один, два или три), необязательно содержащих N-концевую защитную группу, или, как раскрывается в WO 09/118375 и WO 98/13459, или протезного ингибитора типа белка, такого как RASI, BASI, WASI (бифункциональные альфа-амилазные/субтилизиновые ингибиторы из риса, ячменя и пшеницы) или CI₂ или SSI.

Другие стабилизаторы:

Другие стабилизаторы (компонент (c)) могут быть выбраны из солей, таких как NaCl или KCl, и щелочных солей молочной кислоты и муравьиной кислоты.

Другие стабилизаторы (компонент (c)) могут быть выбраны из водорастворимых источников ионов цинка (II), кальция (II) и/или магния (II) в готовых композициях, которые обеспечивают такие ионы ферментам, а также ионов других металлов (например, бария (II), скандия (II), железа (II), марганца (II), алюминия (III), олова (II), кобальта (II), меди (II), никеля (II) и оксованадия (IV)).

Соединения, стабилизирующие жидкий ферментный препарат как таковой

Соединения, стабилизирующие жидкий ферментный препарат как таковой, означают любое соединение, за исключением стабилизаторов фермента, необходимое для установления стабильности при хранении жидкого препарата, в количествах, эффективных для обеспечения стабильности при хранении.

Стабильность при хранении в контексте жидких препаратов для специалистов в данной области техники обычно включает аспекты внешнего вида продукта и однородности дозировки.

На внешний вид продукта влияет значение рН продукта и присутствие таких соединений, как консерванты, антиоксиданты, модификаторы вязкости, эмульгаторы и т.д.

Равномерность дозировки обычно связана с однородностью продукта.

Консерванты:

Жидкий ферментный препарат согласно настоящему изобретению может содержать по меньшей мере один консервант. Консерванты добавляют в количествах, эффективных для предотвращения микробного загрязнения жидкого ферментного препарата, предпочтительно водного ферментного препарата.

Неограничивающие примеры подходящих (четвертичных) аммониевых соединений включают хлориды бензалкония, полигексаметилен бигуанид (PHMB), дидецилдиметиламмония хлорид (DDAC) и N-(3-аминопропил) -N-додецилпропан-1,3-диамин (диамин). Неограничивающие примеры подходящих изотиазолинонов включают 1,2-бензизотиазолин-3-он (BIT), 2-метил-2H-изотиазол-3-он (MIT), 5-хлор-2-метил-2H-изотиазол-3- один (CIT), 2-октил-2H-изотиазол-3-он (OIT) и 2-бутил-бензо[d]изотиазол-3-он (BBIT). Неограничивающие примеры подходящих органических кислот включают бензойную кислоту, сорбиновую кислоту, L - (+) - молочную кислоту, муравьиную кислоту и салициловую кислоту. Неограничивающие примеры подходящего формальдегид-высвобождающего агента включают N,N'-метиленбисморфолин (MBM), 2,2 ',2''(гексагидро-1,3,5-триазин-1,3,5-триил)триэтанол (HHT), (этилендиокси)диметанол, .альфа.,.альфа.′,.альфа.′′-триметил-1,3,5-триазин-1,3,5(2H,4H,6H) -триэтанол (HPT), 3,3'-метиленебис[5-метилоксазолидин] (MBO) и цис-1-(3-хлораллил)-3,5,7-триаза-1-азониаадамантан хлорид (CTAC).

Другие полезные консерванты включают иодпропинил бутилкарбамат (IPBC), галоген-высвобождающие соединения, такие как дихлор-диметил-гидантоин (DCDMH), бром-хлор-диметил-гидантоин (BCDMH) и дибром-диметил-гидантоин (DBDMH); бром-нитросоединения, такие как бронопол (2-бром-2-нитропропан-1,3-диол), 2,2-дибром-2-цианоацетамид (DBNPA); альдегиды, такие как глутаральдегид; феноксиэтанол; бифенил-2-ол; и цинка или натрия пиритион.

Поверхностно-активные вещества

Жидкий ферментный препарат согласно настоящему изобретению может содержать по меньшей мере одно поверхностно-активное вещество (компонент (c)). Примеры поверхностно-активных веществ включают неионные поверхностно-активные вещества, амфотерные поверхностно-активные вещества, анионные поверхностно-активные вещества, и катионные поверхностно-активные вещества, далее также упоминаемые как неионные поверхностно-активные вещества (компонент (c)), амфотерные поверхностно-активные вещества (компонент (c)), анионные поверхностно-активные вещества (компонент (c)), и катионные поверхностно-активные вещества (компонент (c)). Согласно одному варианту осуществления настоящего изобретения жидкий ферментный препарат согласно настоящему изобретению содержит по меньшей мере одно поверхностно-активное вещество, выбранное из неионные поверхностно-активных веществ, из амфотерных поверхностно-активных веществ и анионных поверхностно-активных веществ.

Жидкий ферментный препарат может содержать от 0.1 до 60 мас.% относительно общей массы ферментного препарата поверхностно-активного вещества (компонент (c)). Компонент (c) может содержать по меньшей мере одно соединение, выбранное из анионных поверхностно-активных веществ, неионных поверхностно-активных веществ, амфотерных поверхностно-активных веществ и аминоксидных поверхностно-активных веществ, а также комбинаций из по меньшей мере дух из вышеуказанного. Согласно одному варианту осуществления настоящего изобретения ферментный препарат согласно настоящему изобретению содержит от 5 до 30 мас.% анионного поверхностно-активного вещества и по меньшей мере одно неионное поверхностно-активное вещество, например, в интервале от 3 до 20 мас.%, все относительно общей массы ферментного препарата.

По меньшей мере одно неионное поверхностно-активное вещество (компонент (c)) может быть выбрано из алкоксилированных спиртов, ди- и мультиблочных сополимеров этиленоксида и пропиленоксида, и продуктов реакции сорбитана с этиленоксидом или пропиленоксидом, алкилполигликозидов (APG), гидроксиалкиловых смешанных простых эфиров и аминооксидов.

Предпочтительными примерами алкоксилированных спиртов и алкоксилированных жирных спиртов являются, например, соединения общей формулы (IV)

где

R³ является идентичным или отличным и выбирается из водорода и линейного C₁-C₁₀-алкила, предпочтительно в каждом случае является идентичным и представляет собой этил и особенно предпочтительно водород или метил,

R⁴ выбирается из C₈-C₂₂-алкила, разветвленного или линейного, например, н-C₈H₁₇, н-C₁₀H₂₁, н-C₁₂H₂₅, н-C₁₄H₂₉, н-C₁₆H₃₃ или н-C₁₈H₃₇,

R⁵ выбирается из C₁-C₁₀-алкила, метила, этила, н-пропила, изопропил, н-бутила, изобутил, втор.-бутила, трет.-бутила, н-пентила, изопентила, втор.-пентила, неопентила, 1,2-диметилпропила, изоамила, н-гексила, изогексила, втор.-гексила, н-гептила, н-октила, 2-этилгексила, н-нонила, н-децила или изодецила.

переменные m и n находятся в интервале от нуля до 300, где сумма n и m составляет по меньшей мере один, предпочтительно в интервале от 3 до 50. Предпочтительно, m находится в интервале от 1 до 100, и n находится в интервале от 0 до 30.

В одном варианте выполнения настоящего изобретения, соединения общей формулы (III) могут представлять собой блок-сополимеры или статистические сополимеры, предпочтительными являются блок-сополимеры.

Другими предпочтительными примерами алкоксилированных спиртов являются, например, соединения общей формулы (V):

где

R⁶ является идентичным или отличным и выбирается из водорода и линейного C₁-C₁₀-алкила, предпочтительно в каждом случае является идентичным и представляет собой этил, и особенно предпочтительно водород или метил,

R⁷ выбирается из C₆-C₂₀-алкила, разветвленного или линейного, в частности н-C₈H₁₇, н-C₁₀H₂₁, н-C₁₂H₂₅, н-C₁₃H₂₇, н-C₁₅H₃₁, н-C₁₄H₂₉, н-C₁₆H₃₃, н-C₁₈H₃₇,

a представляет собой число в интервале от нуля до 10, предпочтительно от 1 до 6,

b представляет собой число в интервале от 1 до 80, предпочтительно от 4 до 20,

c представляет собой число в интервале от нуля до 50, предпочтительно от 4 до 25.

Сумма a + b + c предпочтительно находится в интервале от 5 до 100, даже более предпочтительно в интервале от 9 до 50.

Предпочтительными примерами гидроксиалкиловых смешанных простых эфиров являются соединения общей формулы (VI)

в которой переменные определяются следующим образом:

R⁸ является идентичным или отличным и выбирается из водорода и линейного C₁-C₁₀-алкила, предпочтительно в каждом случая является идентичным и представляет собой этил и особенно предпочтительно водород или метил,

R⁹ выбран из C₈-C₂₂-алкила, разветвленного или линейного, например, изо-C₁₁H₂₃, изо-C₁₃H₂₇, н-C₈H₁₇, н-C₁₀H₂₁, н-C₁₂H₂₅, н-C₁₄H₂₉, н-C₁₆H₃₃ или н-C₁₈H₃₇,

R¹⁰ выбран из C₁-C₁₈-алкил, метил, этил, н-пропил, изопропил, н-бутил, изобутил, втор-бутил, трет-бутил, н-пентил, изопентил, втор-пентил, неопентил, 1,2-диметилпропил, изоамил, н-гексила, изогексила, втор-гексила, н-гептила, н-октила, 2-этилгексила, н-нонила, н-децила, изодецила, н-додецила, н-тетрадецила, н-гексадецила и н-октадецила.

Переменные m и x находятся в интервале от нуля до 300, где сумма n и m составляет по меньшей мере один, предпочтительно в интервале от 5 до 50. Предпочтительно, m находится в интервале от 1 до 100, и n находится в интервале от 0 до 30.

Соединения общей формулы (V) и (VI) могут представлять собой блок-сополимеры или статистические сополимеры, причем предпочтительными являются блок-сополимеры.

Другие подходящие неионные поверхностно-активные вещества выбираются из ди- и мультиблочных сополимеров, состоящих из этиленоксида и пропиленоксида. Другие подходящие неионные поверхностно-активные вещества выбираются из этоксилированных или пропоксилированных сложных эфиров сорбитана. Аминооксиды или алкилполигликозиды, особенно линейные C₄-C₁₈-алкилполигликозиды и разветвленные C₈-C₁₈-алкилполигликозиды, такие как соединения общей формулы (VII), подобным образом являются подходящими.

где

R¹¹ представляет собой C₁-C₄-алкил, в частности этил, н-пропил или изопропил,

R¹² представляет собой -(CH₂)₂-R¹¹,

G¹ выбирается из моносахаридов с 4 - 6 атомами углерода, особенно из глюкозы и ксилозы,

y находится в интервале от 1,1 до 4, причем y представляет собой среднее число,

Другими примерами неионных поверхностно-активных веществ являются соединения общей формулы (VIIIa) и (VIIIb)

где

AO выбирается из этиленоксида, пропиленоксида и бутиленоксида,

EO представляет собой этиленоксид, CH₂CH₂-O,

R¹³ представляет собой C₁-C₄-алкил, в частности этил, н-пропил или изопропил,

R¹⁴ выбран из C₈-C₁₈-алкила, разветвленного или линейного,

A³O выбран из пропиленоксида и бутиленоксида,

w представляет собой число в интервале от 15 до 70, предпочтительно от 30 до 50,

w1 и w3 представляют собой числа в интервале от 1 до 5, и

w2 представляет собой число в интервале от 13 до 35.

Обзор других подходящих неионных поверхностно-активных веществ можно найти в EP-A 0 851 023 и в DE-A 198 19 187.

Согласно одному варианту осуществления настоящего изобретения ферментный препарат содержит смеси двух или более различных неионных поверхностно-активных веществ (компонент (c)).

По меньшей мере одно амфотерное поверхностно-активное вещество (компонент (c)) может быть выбрано из поверхностно-активных веществ, которые несут положительный и отрицательный заряд в одной молекуле в условиях применения. Предпочтительными примерами амфотерных поверхностно-активных веществ являются, так называемые, бетаиновые поверхностно-активные вещества. Многие примеры бетаиновых поверхностно-активных веществ несут один кватернизированный атом азота и одну группу карбоновой кислоты на молекулу. Особенно предпочтительным примером амфотерных поверхностно-активных веществ является кокамидопропилбетаин (лаурамидопропилбетаин).

Примерами аминооксидных поверхностно-активных веществ являются соединения общей формулы (IX)

R¹³R¹⁴R¹⁵N→O (IX)

где R¹³, R¹⁴ и R¹⁵ независимо друг от друга выбираются из алифатических, циклоалифатических или C₂-C₄-алкилен-C₁₀-C₂₀-алкиламидо составляющих. Предпочтительно, R¹² выбирается из C₈-C₂₀-алкила или C₂-C₄-алкилен-C₁₀-C₂₀-алкиламидо, и R¹³ и R¹⁴ оба представляют собой метил.

Особенно предпочтительным примером является лаурилдиметиламиноксид, иногда также называемый лаураминоксидом. Другим особенно предпочтительным примером является кокамидилпропилдиметиламиноксид, иногда также называемый кокамидопропиламиноксид.

По меньшей мере одно анионное поверхностно-активное вещество (компонент (c)) может быть выбрано из солей щелочных металлов и аммониевых солей C₈-C₁₈-алкилсульфатов, сульфатов простых полиэфиров C₈-C₁₈-жирных спиртов, сложных полуэфиров серной кислоты и этоксилированных C₄-C₁₂-алкилфенолов (этоксилирование: от 1 до 50 моль этиленоксида/моль), алкиловых сложных эфиров C₁₂-C₁₈ жирных сульфокислот, например метиловых сложных эфиров C₁₂-C₁₈ жирных сульфокислот, кроме того, C₁₂-C₁₈-алкилсульфоновых кислот и C₁₀-C₁₈-алкиларилсульфоновых кислот. Предпочтительными являются соли щелочных металлов вышеуказанных соединений, особенно предпочтительно натриевые соли.

Конкретные примеры анионных поверхностно-активных веществ (компонент (c)) представляют собой соединения согласно общей формуле (X)

C_sH_2s+1-O(CH₂CH₂O)_t-SO₃M (X)

где

s представляет собой число в интервале от 10 до 18, предпочтительно от 12 до 14, и даже более предпочтительно s = 12,

t представляет собой число в интервале от 1 до 5, предпочтительно от 2 до 4 и даже более предпочтительно 3.

M выбран из щелочных металлов, предпочтительно калия и даже более предпочтительно натрия.

Переменные s и t могут представлять собой средние значения и поэтому они не обязательно должны представлять собой целые числа, тогда как в отдельных молекулах согласно формуле (X), как s, так и t представляют собой целые числа.

Другими примерами подходящих анионных поверхностно-активных веществ (компонент (с)) являются мыла, например, натриевые или калиевые соли стеариновой кислоты, олеиновой кислоты, пальмитиновой кислоты, простоэфирные карбоксилаты и алкилпростоэфирные фосфаты.

Согласно одному варианту осуществления настоящего изобретения ферментный препарат согласно настоящему изобретению является водным, содержащим воду в количествах в интервале от 5% до 95 мас.%, в интервале от 5% до 30 мас.%, в интервале от 5% до 25 мас.%, или в интервале от 20% до 70 мас.%, все относительно общей массы ферментного препарата. Указанный ферментный препарат может содержать органические растворители в количествах в интервале от 0% до 20 мас.% относительно общей массы ферментного препарата. Согласно одному варианту осуществления настоящего изобретения ферментный препарат содержит воду в количествах в интервале от 5% до 15 мас.% и незначительные количества органического растворителя, например, 1 мас.% или менее, все относительно общей массы ферментного препарата.

Ферментные препараты согласно настоящему изобретению могут быть щелочными или проявлять нейтральное или слегка кислотное значение pH, например, от 6 до 14, от 6.5 до 13, от 8 до 10.5 или от 8.5 до 9.0.

Получение ферментного состава:

Настоящее изобретение относится к способу получения ферментного препарата, причем указанный способ включает стадию смешивания по меньшей мере компонента (a), как описано выше, и компонента (b), как описано выше.

Компонент (b) может быть твердым. Твердый компонент (b) может быть добавлен к твердому компоненту (a) перед контактом обоих с по меньшей мере одним растворителем. По меньшей мере один растворитель является таким, как описано выше. Контакт с по меньшей мере одним растворителем может привести к солюбилизации по меньшей мере одной молекулы компонента (a) и по меньшей мере одной молекулы компонента (b), приводя к стабилизации по меньшей мере одной молекулы компонента (b). Согласно одному варианту осуществления настоящего изобретения твердые компоненты (a) и (b) полностью растворяются в по меньшей мере одном растворителе без разделения фаз.

Твердый компонент (а) может быть растворен в по меньшей мере одном растворителе перед смешиванием с твердым или жидким компонентом (b). Согласно одному варианту осуществления настоящего изобретения компонент (а) полностью растворяется в по меньшей мере одном растворителе перед смешиванием с компонентом (b). По меньшей мере один растворитель является таким, как описано выше.

Компонент (b) может быть жидким, где по меньшей мере один фермент может содержаться в жидком концентрате фермента, как описано выше. Жидкий компонент (b) может быть дополнен твердым компонентом (a), причем твердый компонент (a) растворяется в жидком компоненте (b). Согласно одному варианту осуществления настоящего изобретения жидкий компонент (b) является водным, предпочтительно в результате ферментации.

Согласно одному варианту осуществления настоящего изобретения компонент (c), как описано выше, смешивают с компонентами (a) и (b), где смешивание отличается тем, что проводится в одну или более стадий.

Стабилизация фермента

Настоящее изобретение относится к способу стабилизации компонента (b) посредством стадии добавления компонента (a), где компоненты (a) и (b) являются такими, как раскрыто выше. Согласно одному варианту осуществления настоящего изобретения компонент (b) является жидким. Согласно одному варианту осуществления настоящего изобретения настоящее изобретение относится к способу стабилизации компонента (b) в присутствии по меньшей мере одного поверхностно-активного вещества посредством стадии добавления компонента (a), где компоненты (a) и (b) и по меньшей мере одно поверхностно-активное вещество являются такими, как описано выше. Согласно одному варианту осуществления настоящего изобретения настоящее изобретение относится к способу стабилизации компонента (b) посредством стадии добавления компонента (a), где компонент (b) содержит по меньшей мере одну липазу и по меньшей мере одну протеазу.

Кроме того, настоящее изобретение относится к способу стабилизации по меньшей мере одного фермента в жидких составах, включающему смешивание в неопределенном порядке в одну или более стадий компонентов (a) и (b), как описано выше, с одним или более компонентами состава. Согласно одному варианту осуществления настоящего изобретения жидкие составы представляют собой моющие составы.

Настоящее изобретение относится к применению компонента (a) в качестве добавки для компонента (b). Согласно одному варианту осуществления настоящего изобретения компоненты (a) и (b) являются твердыми, и компонент (b) стабилизируется при контакте смеси твердых компонентов (a) и (b) с по меньшей мере одним растворителем. По меньшей мере один растворитель является таким, как описано выше. Контакт с по меньшей мере одним растворителем может привести к солюбилизации по меньшей мере одной молекулы компонента (a) и по меньшей мере одной молекулы компонента (b), приводя к стабилизации по меньшей мере одной молекулы компонента (b). Согласно одному варианту осуществления настоящего изобретения твердые компоненты (a) и (b) полностью растворяются в по меньшей мере одном растворителе без разделения фаз.

Стабилизация фермента может относиться к стабильности с течением времени (например, стабильности при хранении), термической стабильности, стабильности pH и химической стабильности. Термин «стабильность фермента» в настоящем документе предпочтительно относится к сохранению ферментативной активности как функции от времени, например, в ходе хранения или эксплуатации. Термин «хранение» в настоящем документе означает, что он указывает на факт хранения продуктов или композиций с момента их изготовления до момента их использования в конечном применении. Сохранение ферментативной активности как функция от времени в ходе хранения называется «стабильностью при хранении».

Чтобы определить изменения ферментативной активности с течением времени, «начальная ферментативная активность» фермента может быть измерена при определенных условиях в нулевой момент времени (т.е. до хранения), а «ферментативная активность после хранения» может быть измерена в определенный момент времени позже (т.е. после хранения).

Ферментативная активность после хранения, поделенная на начальную ферментативную активность, умноженная на 100, дает «ферментативную активность, доступную при применении» (a%).

Фермент является стабильным согласно настоящему изобретению, когда его ферментативная активность “доступная при применении” равна 100% по сравнению с начальной ферментативной активностью до хранения. Фермент может быть назван стабильным в контексте настоящего изобретения, если его ферментативная активность, доступная при применении, составляет по меньшей мере 60%, по меньшей мере 65%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 91%, по меньшей мере 92%, по меньшей мере 93%, по меньшей мере 94%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99%, или по меньшей мере 99.5% по сравнению с начальной ферментативной активностью до хранения.

Согласно одному варианту осуществления настоящего изобретения липолитическая активность, доступная после хранения при 37°C в течение 30 дней, составляет по меньшей мере 60%, по сравнению с начальной липолитической активностью до хранения.

Вычитание a% из 100% дает “потерю ферментативной активности в ходе хранения” по сравнению с начальной ферментативной активностью до хранения. Согласно одному варианту осуществления настоящего изобретения фермент является стабильным согласно настоящему изобретению, когда по существу не происходит потеря ферментативной активности в ходе хранения, т.е. потеря ферментативной активности равна 0% по сравнению с начальной ферментативной активностью до хранения. Отсутствие по существу потери ферментативной активности в контексте настоящего изобретения может означать, что потеря ферментативной активности составляет менее 30%, менее 25%, менее 20%, менее 15%, менее 10%, менее 9%, менее 8%, менее 7%, менее 6%, менее 5%, менее 4%, менее 3%, менее 2%, или менее 1% по сравнению с начальной ферментативной активностью до хранения.

Согласно одному варианту осуществления настоящего изобретения потеря липолитической активности после хранения при 37°C в течение 30 дней составляет менее 40% по сравнению с начальной липолитической активностью до хранения.

Согласно одному аспекту настоящего изобретения компонент (a) применяют для уменьшения потери ферментативной активности в ходе хранения по меньшей мере одного фермента, содержащегося в жидком концентрате фермента. Уменьшенная потеря ферментативной активности в контекст настоящего изобретения может означать, что потеря ферментативной активности уменьшается на по меньшей мере 5%, на по меньшей мере 10%, на по меньшей мере 15%, на по меньшей мере 20%, на по меньшей мере 25%, на по меньшей мере 30%, на по меньшей мере 40%, на по меньшей мере 50%, на по меньшей мере 60%, по меньшей мере 65%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 91%, по меньшей мере 92%, по меньшей мере 93%, по меньшей мере 94%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99%, или по меньшей мере 99.5% по сравнению с начальной ферментативной активностью до хранения.

Согласно одному варианту осуществления настоящего изобретения потеря липолитической активности после хранения при 37°C в течение 30 дней уменьшается компонентом (a) на по меньшей мере 60% по сравнению с начальной липолитической активностью до хранения.

Согласно одному варианту осуществления настоящего изобретения потеря протеолитической активности после хранения при 37°C в течение 30 дней уменьшается компонентом (a) на по меньшей мере 20% по сравнению с начальной протеолитической активностью до хранения.

Ферменты, ингибированные ингибитором фермента, обычно проявляют пониженную ферментативную активность по сравнению с неингибированной ферментативной активностью указанного фермента. Ферментативная активность, измеренная после добавления ингибитора фермента, поделенная на начальную ферментативную активность, умноженная на 100, в настоящем документе может называться «остаточной ферментативной активностью» (b%). Ферменты могут быть названы «стабилизированными» в настоящем документе, когда они проявляют остаточную ферментативную активность (b%), которая составляет менее 50%, менее 45%, менее 40%, менее 35%, менее 30%, менее 25%, менее 20%, менее 15%, менее 10%, менее 5%, или менее 1% по сравнению с начальной ферментативной активностью до хранения. Фермент можно назвать стабилизированным, если его ферментативная активность, доступная для применения после высвобождения ингибитора, составляет по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 91%, по меньшей мере 92%, по меньшей мере 93%, по меньшей мере 94%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99%, по меньшей мере 99.5%, или 100% по сравнению с начальной ферментативной активностью до хранения. Ингибитор может быть назван “стабилизатором фермента” в настоящем документе.

Применение ферментного препарата для приготовления составов

Согласно одному аспекту настоящее изобретение относится к применению жидкого ферментного препарата согласно настоящему изобретению для включения в моющие составы, где компоненты (a) и (b) смешивают в неопределенном порядке за одну или более стадий с одним или более компонентами моющего средства.

Согласно одному аспекту настоящее изобретение относится к моющему составу, содержащему жидкий ферментный препарат согласно настоящему изобретению и один или более компонентов моющего средства.

Компоненты моющего средства различаются по типу и/или количеству в моющем составе в зависимости от желаемого применения, такого как стирка белого текстиля, цветного текстиля и шерсти. Выбранный компонент (компоненты) дополнительно зависит от физической формы моющего состава (жидкий, твердый, гелеобразный, в виде пакетиков или таблеток и т.д.). Компонент (компоненты), выбранный (выбранные), например, для составов для стирки, также зависят от региональных соглашений, которые связаны с такими аспектами, как используемые температуры стирки, механика стиральной машины (машины с вертикальной или горизонтальной осью), расход воды на цикл стирки и т.д. и географические характеристики, такие как средняя жесткость воды.

Отдельные компоненты моющего средства и применение в моющих составах известны специалистам в данной области техники. Подходящие компоненты моющего средства содержат среди прочего поверхностно-активные вещества, моющие компоненты, полимеры, щелочи, отбеливающие системы, флуоресцентные отбеливатели, супрессоры и стабилизаторы пены, гидротропы и ингибиторы коррозии. Другие примеры описаны, например, в “complete Technology Book on Detergents with Formulations (Detergent Cake, Dishwashing Detergents, Liquid & Paste Detergents, Enzyme Detergents, Cleaning Powder & Spray Dried Washing Powder)”, Engineers India Research Institute (EIRI), 6^th edition (2015). Другим ссылочным источником для специалиста в данной области техники может быть “Detergent Formulations Encyclopedia”, Solverchem Publications, 2016.

Понятно, что компоненты моющего средства являются дополнением к компонентам, содержащимся в ферментном препарате согласно настоящему изобретению. Если компонент, содержащийся в состав ферментном препарате согласно настоящему изобретению, также является компонентом моющего средства, может быть необходимо отрегулировать концентрации, чтобы этот компонент был эффективен для достижения желаемой цели в моющем составе.

Компоненты моющего средства могут иметь более одной функции в конечном применении моющего состава, поэтому любой компонент моющего средства, упомянутый в контексте конкретной функции в настоящем документе, может также выполнять другую функцию в конечном применении моющего состава. Функция конкретного компонента моющего средства в конечном применении моющего состава обычно зависит от его количества в моющем составе, то есть эффективного количества компонента моющего средства.

Термин «эффективное количество» включает количества отдельных компонентов для обеспечения эффективного удаления пятен и/или эффективные условия очистки (например, значение pH, количество пенообразования), количества определенных компонентов для эффективного обеспечения оптических преимуществ (например, оптическое осветление, ингибирование переноса красителя), и/или количества определенных компонентов для эффективного содействия обработке (поддержание физических характеристик при обработке, хранении и использовании; например, модификаторы реологических свойств, гидротропы, осушители).

Согласно одному варианту осуществления настоящего изобретения моющий состав представляет собой состав из более чем двух компонентов моющего средства, где по меньшей мере один компонент эффективен для удаления пятен, по меньшей мере один компонент эффективен для обеспечения оптимальных условий очистки, и по меньшей мере один компонент эффективен для поддержания физических характеристик моющего средства.

Моющие составы согласно настоящему изобретению могут содержать компонент (a) и компонент (b), растворенные в растворителе. «Растворенный» может означать растворенный в общем моющем составе. «Растворенный» может означать, что компонент (a) и компонент (b) являются частью жидкого ферментного препарата согласно настоящему изобретению, который может быть инкапсулированным. Инкапсулированный жидкий ферментный препарат может быть частью жидкого моющего состава или частью твердого моющего состава.

Согласно одному варианту осуществления настоящего изобретения моющие составы содержат от 0.5 до 20 мас.%, в частности 1-10 мас.% компонента (b) и от 0.01% до 10% компонента (a), более конкретно от 0.05 до 5 мас.% и наиболее конкретно от 0.1% до 2 мас.% компонента (a), все относительно общей массы жидкого моющего состава.

Моющие составы согласно настоящему изобретению могут содержать по меньшей мере одно соединение, выбранное из моющих компонентов, полимеров, ароматизаторов и красителей.

Согласно одному варианту осуществления настоящего изобретения компонент (a) применяют в качестве моющего компонента в моющих составах в количествах, эффективных для обеспечения желаемой моющей функции. Применение компонента (a) в качестве моющего компонента обеспечивает гибкий моющий состав, либо с высоким, либо с низким содержанием воды. Для жидких моющих составов с низким содержанием воды, могут не применяться другие моющие вещества кроме компонента (a). Низкое содержание воды согласно настоящему изобретению может означать по меньшей мере ≤ 30 мас.%, по меньшей мере ≤ 20 мас.%, по меньшей мере ≤ 10 мас.%, или по меньшей мере ≤ 5 мас.%, все относительно общей массы моющего состава.

Согласно одному варианту осуществления настоящего изобретения моющие составы могут содержать один или более моющих компонентов, отличных от компонента (a).

Моющие составы согласно настоящему изобретению могут содержать от 1 до 40 мас.% моющего компонента, отличного от компонента (а), такого как, но не ограничиваясь этим, цеолит, фосфат, фосфонат, цитрат, полимерные моющие компоненты или аминокарбоксилаты, такие как соли щелочных металлов и иминодисукцинатов, например, IDS-Na₄, кроме того, нитрилотриуксусная кислота («NTA»), метилглициндиуксусная кислота («MGDA»), глутаминовая диуксусная кислота («GLDA»), этилендиаминтетрауксусная кислота («EDTA») или диэтилентриаминпентауксусная кислота («DTPA»). Предпочтительными солями щелочных металлов являются соли калия и особенно соли натрия.

Другими примерами моющих компонентов являются полимеры с комплексообразующими группами, такие как, например, полиэтиленимин, в котором от 20 до 90 мол.% N-атомов несут по меньшей мере одну CH₂COO^- группу, и соответствующие соли щелочных металлов вышеуказанных комплексообразователей, особенно их натриевые соли.

Другими примерами подходящих полимеров являются полиалкиленимины, например, полиэтиленимины и полипропиленимины. Полиалкиленимины могут применяться как таковые или в виде полиалкоксилированных производных, например, этоксилированных или пропоксилированных. Полиалкиленимины содержат по меньшей мере три единицы алкиленимина на молекулу.

Согласно одному варианту осуществления настоящего изобретения указанная единица алкиленимина представляет собой единицу C₂-C₁₀-алкилендиамина, например, 1,2-пропилендиамин, предпочтительно α,ω-C₂-C₁₀-алкилендиамин, например, 1,2-этилендиамин, 1,3-пропилендиамин, 1,4-бутилендиамин, 1,5-пентилендиамин, 1,6-гександиамин (также упоминаемый как 1,6-гексилендиамин), 1,8-диамин или 1,10-декандиамин, даже более предпочтительно представляет собой 1,2-этилендиамин, 1,3-пропилендиамин, 1,4-бутилендиамин и 1,6-гександиамин.

Согласно другому варианту осуществления настоящего изобретения указанный полиалкиленимин выбран из единицы полиалкиленимина, предпочтительно единицы полиэтиленимина или полипропиленимина.

Термин “полиэтиленимин” в контексте настоящего изобретения относится не только к гомополимерам полиэтиленимина, но также к полиалкилениминам, содержащим NH-CH₂-CH₂-NH структурные элементы вместе с другими алкилендиаминовыми структурными элементами, например, NH-CH₂-CH₂-CH₂-NH структурными элементами, NH-CH₂-CH(CH₃)-NH структурными элементами, NH-(CH₂)₄-NH структурными элементами, NH-(CH₂)₆-NH структурными элементами или (NH-(CH₂)₈-NH структурными элементами, но NH-CH₂-CH₂- NH структурные элементы находятся в большинстве относительно молярной доли. Предпочтительные полиэтиленимины содержат NH-CH₂-CH₂-NH структурные элементы, находящиеся в большинстве относительно молярной доли, например, составляющие до 60 мол.% или более, более предпочтительно составляющие до по меньшей мере 70 мол.%, по отношению ко всем алкилениминовым структурным элементам. Согласно конкретному варианту осуществления термин полиэтиленимин относится к тем полиалкилениминам, которые несут только один или ноль алкилениминовых структурных элементов на единицу полиэтиленимина, которые отличны от NH-CH₂-CH₂-NH.

Термин “полипропиленимин” в контексте настоящего изобретения относится не только к гомополимерам полипропиленимина, но также к полиалкилениминам, содержащим NH-CH₂-CH(CH₃)-NH структурные элементы вместе с другими алкилендиаминовыми структурными элементами, например, NH-CH₂-CH₂-CH₂-NH структурными элементами, NH-CH₂-CH₂-NH структурными элементами, NH-(CH₂)₄-NH структурными элементами, NH-(CH₂)₆-NH структурными элементами или (NH-(CH₂)₈-NH структурными элементами, но NH-CH₂-CH(CH₃)-NH структурные элементы находятся в большинстве относительно молярной доли. Предпочтительные полипропиленимины содержат NH-CH₂-CH(CH₃)-NH структурные элементы, находящиеся в большинстве относительно молярной доли, например, составляющие до 60 мол.% или более, более предпочтительно составляющие до по меньшей мере 70 мол.%, по отношению ко всем алкилениминовым структурным элементам. Согласно конкретному варианту осуществления термин полипропиленимин относится к тем полиалкилениминам, которые несут только один или ноль алкилениминовых структурных элементов на единицу полипропиленимина, которые отличны от NH-CH₂-CH(CH₃)-NH.

Разветвлениями могут быть алкиленаминогруппы, такие как, но без ограничения к этому, -CH₂-CH₂-NH₂ группы или (CH₂)₃-NH₂ группы. Более длинными разветвлениями могут быть, например, -(CH₂)₃-N(CH₂CH₂CH₂NH₂)₂ или
-(CH₂)₂-N(CH₂CH₂NH₂)₂ группы. Высоко разветвленными полиэтилениминами являются, например, дендримеры полиэтиленимина или родственные молекулы со степенью разветвления в интервале от 0.25 до 0.95, предпочтительно в интервале от 0.30 до 0.80 и особенно предпочтительно по меньшей мере 0.5. Степень разветвления может быть определена, например, посредством ¹³C-ЯМР или ¹⁵N-ЯМР спектроскопии, предпочтительно в D₂O, и определяется следующим образом:

DB = D+T/D+T+L

где D (дендритный) соответствует доле третичных аминогрупп, L (линейный) соответствует доле вторичных аминогрупп и T (концевой) соответствует доле первичных аминогрупп.

Согласно настоящему изобретению разветвленные полиэтилениминовые единицы представляют собой полиэтилениминовые единицы с DB в интервале от 0.25 до 0.95, в частности предпочтительно в интервале от 0.30 до 0.90% и очень особенно предпочтительно по меньшей мере 0.5. Предпочтительные полиэтилениминовые единицы представляют собой те, которые проявляют небольшое разветвление или не проявляют разветвление, таким образом, преимущественно линейные или линейные полиэтиленимиовые единицы.

В контексте настоящего изобретения CH₃-группы не рассматриваются как разветвленные.

Согласно одному варианту осуществления согласно настоящему изобретению полиалкиленимин может иметь первичное аминное число в интервале от 1 до 1000 мг KOH/г, предпочтительно от 10 до 500 мг KOH/г, наиболее предпочтительно от 50 до 300 мг KOH/г. Первичное аминное число может быть определено согласно ASTM D2074-07.

Согласно одному варианту осуществления согласно настоящему изобретению полиалкиленимин может иметь вторичное аминное число в интервале от 10 до 1000 мг KOH/г, предпочтительно от 50 до 500 мг KOH/г, наиболее предпочтительно от 50 до 500 мг KOH/г. Вторичное аминное число может быть определено согласно ASTM D2074-07.

Согласно одному варианту осуществления согласно настоящему изобретению полиалкиленимин может иметь третичное аминное число в интервале от 1 до 300 мг KOH/г, предпочтительно от 5 до 200 мг KOH/г, наиболее предпочтительно от 10 до 100 мг KOH/г. Третичное аминное число может быть определено согласно ASTM D2074-07.

Согласно одному варианту осуществления настоящего изобретения молярную долю третичных атомов N определяют посредством ¹⁵N-ЯМР спектроскопии. В случаях, когда третичное аминное число и результат согласно ¹³C-ЯМР-спектроскопии противоречат друг другу, предпочтение будет отдаваться результатам, полученным с помощью ¹³C-ЯМР-спектроскопии.

Согласно одному варианту осуществления настоящего изобретения средняя молекулярная масса M_w указанного полиалкиленимина находится в интервале от 250 до 100000 г/моль, предпочтительно до 50000 г/моль и более предпочтительно от 800 до 25000 г/моль. Среднюю молекулярную массу M_w полиалкиленимина можно определить с помощью гель-проникающей хроматографии (ГПХ) промежуточного соединения соответствующего полиалкиленимина, с 1,5 мас.% водной муравьиной кислоты в качестве элюента и сшитым поли-гидроксиэтилметакрилатом в качестве стационарной фазы.

Указанный полиалкиленимин может быть свободным или алкоксилированным, причем указанное алкоксилирование выбрано из этоксилирования, пропоксилирования, бутоксилирования и комбинаций по меньшей мере двух из вышеперечисленных. Предпочтение отдается этиленоксиду, 1,2-пропиленоксиду и смесям этиленоксида и 1,2-пропиленоксида. Если применяются смеси по меньшей мере двух алкиленоксидов, они могут вступать в реакцию поэтапно или одновременно.

Согласно одному варианту осуществления настоящего изобретения алкоксилированный полиалкиленимин несет по меньшей мере 6 атомов азота на единицу.

Согласно одному варианту осуществления настоящего изобретения полиалкиленимин алкоксилирован с от 2 до 50 молями алкиленоксида на NH группу, предпочтительно 5-30 молями алкиленоксида на NH группу, даже более предпочтительно 5-25 молями этиленоксида или 1,2-пропиленоксида или их комбинациями на NH группу. В контексте настоящего изобретения, единица NH₂ считается как две группы NH. Предпочтительно все, или почти все, группы NH являются алкоксилированными, и обнаруживаемых количеств групп NH не остается.

В зависимости от получения такого алкоксилированного полиалкиленимина, распределение молекулярной массы может быть узким или широким. Например, полидисперсность Q = M_w/M_n в интервале от 1 до 3, предпочтительно по меньшей мере 2, или она может быть более 3 и до 20, например, от 3.5 до 15 и даже более предпочтительно в интервале от 4 до 5.5.

Согласно одному варианту осуществления настоящего изобретения полидисперсность Q алкоксилированного полиалкиленимина находится в интервале от 2 до 10.

Согласно одному варианту осуществления настоящего изобретения алкоксилированный полиалкиленимин выбран из полиэтоксилированного полиэтиленимина, этоксилированного полипропиленимина, этоксилированных α,ω-гександиаминов, этоксилированного и пропоксилированного полиэтиленимина, этоксилированного и пропоксилированного полипропиленимина, и пропоксилированных и полипропоксилированных α,ω-гександиаминов.

Согласно одному варианту осуществления настоящего изобретения средняя молекулярная масса M_n (среднечисловая) алкоксилированного полиэтиленимина находится в интервале от 2500 до 1500000 г/моль, как определено посредством GPC, предпочтительно до 500000 г/моль.

Согласно одному варианту осуществления настоящего изобретения алкоксилированные полиалкиленимины выбраны из алкоксилированных α,ω-гександиаминов и этоксилированных и полипропоксилированных α,ω-гександиаминов, каждый со средней молекулярной массой M_n (среднечисловой) в интервале от 800 до 500000 г/моль.

Примерами буферов являются моноэтаноламин и N,N,N-триэтаноламин.

Примерами пеногасителей являются силиконы.

Примерами ароматизаторов являются бензилсалицилат, 2-(4-трет.-бутилфенил) 2-метилпропионал, коммерчески доступный как Lilial®, и гексилциннамальдегид.

Примерами красителей являются Acid Blue 9, Acid Yellow 3, Acid Yellow 23, Acid Yellow 73, Pigment Yellow 101, Acid Green 1, Solvent Green 7 и Acid Green 25.

Жидкие моющие составы могут содержать по меньшей мере одно соединение, выбранное из органических растворителей, консервантов, модификаторов вязкости и гидротропов.

Согласно одному варианту осуществления настоящего изобретения жидкие моющие составы содержат количества органических растворителей от 0.5 до 25 мас.%, относительно общей массы жидкого моющего состава. Особенно, если жидкие моющие составы согласно настоящему изобретению обеспечиваются в пакетиках или тому подобном, может содержаться от 8 до 25 мас.% органического растворителя (растворителей) относительно общей массы жидкого моющего состава. Органические растворители представляют собой описанные выше.

Жидкие моющие составы согласно настоящему изобретению могут содержать один или более консервантов, выбранных из описанных выше, в количествах, эффективных для того, чтобы избежать микробного загрязнения жидкого моющего состава.

Согласно одному варианту осуществления настоящего изобретения жидкие моющие составы содержат один или более модификаторов вязкости. Неограничивающие примеры подходящих модификаторов вязкости включают агар-агар, карраген, трагакант, гуммиарабик, альгинаты, пектины, гидроксиэтилцеллюлозу, гидроксипропилцеллюлозу, крахмал, желатин, камедь рожкового дерева, сшитые поли(мет)акрилаты, например, полиакриловую кислоту, сшитую с бис-(мет)акриламидом, кроме того, кремниевую кислоту, глину, такую как, но не ограничиваясь этим, монтмориллонит, цеолит, декстрин и казеин. Модификаторы вязкости могут содержаться в количествах, эффективных для обеспечения желаемой вязкости.

Согласно одному варианту осуществления настоящего изобретения жидкие моющие составы содержат один или более гидротропов, которые могут представлять собой органические растворители, такие как этанол, изопропанол, этиленгликоль, 1,2-пропиленгликоль и другие органические растворители, которые смешиваются с водой при нормальных условиях без ограничений. Другими примерами подходящих гидротропов являются натриевые соли толуолсульфоновой кислоты, ксилолсульфоновой кислоты и кумолсульфоновой кислоты. Гидротропы могут содержаться в количествах, которые облегчают или обеспечивают растворение соединений, которые проявляют ограниченную растворимость в воде.

«Моющий состав» или «чистящий состав» согласно настоящему изобретению означает составы, предназначенные для чистки загрязненного материала. Чистка включает в себя стирку и чистку твердых поверхностей. Загрязненный материал согласно изобретению включает текстиль и/или твердые поверхности.

Термин «стирка» относится как к стирке в домашних условиях, так и к стирке в промышленных условиях, и означает процесс обработки текстиля раствором, содержащим моющую композицию согласно настоящему изобретению. Процесс стирки может осуществляться с использованием технических устройств, таких как бытовая или промышленная стиральная машина. В качестве альтернативы, процесс стирки может быть выполнен вручную.

Термин «текстиль» означает любой текстильный материал, включая пряжу (нить из натуральных или синтетических волокон, используемых для вязания или ткачества), промежуточные продукты из пряжи, волокна, нетканые материалы, натуральные материалы, синтетические материалы, а также ткани (текстиль, изготовленный из текстильных, трикотажных или войлочных волокон), изготовленные из таких материалов, такие как предметы одежды (любые предметы одежды из текстиля), одежда и другие изделия.

Термин «волокна» включает натуральные волокна, синтетические волокна и их смеси. Примеры природных волокон имеют растительное (например, лен, джут и хлопок) или животное происхождение, включая белки, такие как коллаген, кератин и фиброин (например, шелк, овечья шерсть, ангора, мохер, кашемир). Примерами волокон синтетического происхождения являются полиуретановые волокна, такие как Spandex® или Lycra®, полиэфирные волокна, полиолефины, такие как эластофин, или полиамидные волокна, такие как нейлон. Волокна могут представлять собой отдельные волокна или части текстиля, такие как трикотаж, ткани или нетканые материалы.

Термин «очистка твердых поверхностей» определяется в настоящей заявке как очистка твердых поверхностей, где твердые поверхности могут включать любые твердые поверхности в домашнем хозяйстве, такие как полы, предметы интерьера, стены, санитарная керамика, стекло, металлические поверхности, включая столовые приборы или посуду.

Термин «мытье посуды» относится ко всем формам мытья посуды, например, ручная или автоматическая мойка посуды. Мытье посуды включает, но не ограничивается этим, чистку всех видов посуды, таких как тарелки, чашки, стаканы, миски, всех видов столовых приборов, таких как ложки, ножи, вилки и сервировочная посуда, а также керамику, пластмассу, такую как меламин, металлы, фарфор, стекло и акрилы.

Другое применение

Настоящее изобретение относится к способу удаления пятен, включающему стадии контакта пятна с моющим составом, содержащим компоненты (a) и (b) и один или более моющих компонентов. Согласно одному варианту осуществления настоящего изобретения моющий состав содержит ферментный препарат согласно настоящему изобретению. Согласно одному варианту осуществления настоящего изобретения способ относится к удалению пятен, содержащих жир.

Жиры могут быть подразделены на жир, сало или масло в зависимости от температуры плавления. Масло обычно является жидким при комнатной температуре. Сало имеет более высокую вязкость, чем масло при комнатной температуре, и его можно назвать пастообразным.

Согласно одному варианту осуществления настоящего изобретения удаление пятен, содержащих жир, проводят при температурах ≤ 40°C, в частности при температурах ≤ 30°C.

Примеры

Настоящее изобретение далее проиллюстрировано посредством следующих рабочих примеров.

Общие замечания: проценты приведены в виде мас. процентов, если иное специально не указано.

Ацетилхолин (A.12) приобретали у Sigma Aldrich. Противоионом был хлорид.

Предшественник (A.14) может быть получен непосредственно вместо использования HCl при этоксилировании триметиламина или путем реакции гидроликарбоната холина с метансульфоновой кислотой, см. Constantinescu et al in Chem. Eng. Data, 2007, 52 1280-1285.

I. Синтез солей (компонент (a))

На основании количества отогнанной воды и посредством ИК-спектроскопии можно показать, что реакции эстерификации были завершены.

90%-ная метансульфоновая кислота относится к смеси 10% воды и 90% метансульфоновой кислоты.

I.1 Синтез соли согласно настоящему изобретению (A.1):

Количество 225 г (1.5 моля) винной кислоты растворяли в 280 г 75 мас.%-ного водного раствора хлорида холина (1.5 моля). Воду удаляли в течение 45 минут на роторном испарителе (колба объемом 2 л) - на масляной бане при температуре от 100 до 120°C, от 50 до 80 мбар. Количество 15 г 90 мас.%-ной водной метансульфоновой кислоты добавляли, и температуру поднимали до 145°C при давлении 800 мбар. После одного часа выпаривания на роторном испарителе давление непрерывно понижали до 10 мбар, при этом воду удаляли в течение еще 4.5 ч при 145°C. Вещество светло-желтоватого цвета получали, которое разбавляли с помощью 200 г диэтиленгликоля. Количество 617 г жидкости желтоватого цвета получали. Аликвоту 200 г жидкости, полученной таким образом, нейтрализовали с помощью 7.8 г этаноламина до значения рН от 6 до 6.5 (10% в воде). Соль согласно настоящему изобретению (A.1) получали.

I.2 Синтез соли согласно настоящему изобретению (A.2):

Количество 150 г винной кислоты (1.0 моль) растворяли в 374 г 75 мас.%-ного водного раствора хлорида холина (2.0 моля). Воду удаляли в течение 45 минут на роторном испарителе (колба объемом 2 л) - на масляной бане при температуре от 100 до 120°C, от 50 до 80 мбар. Количество 15 г 90 мас.%-ной метансульфоновой кислоты добавляли, и температуру поднимали до 145°C при давлении 800 мбар. После одного часа выпаривания на роторном испарителе давление непрерывно понижали до 10 мбар, при этом воду удаляли в течение еще 4.5 ч при 145°C. Вещество светло-желтоватого цвета получали, которое разбавляли с помощью 200 г диэтиленгликоля. Количество 607 г жидкости желтоватого цвета получали. Аликвоту 200 г жидкости, полученной таким образом, нейтрализовали с помощью 8.7 г этаноламина до значения рН от 6 до 6.5 (10% в воде). Соль согласно настоящему изобретению (A.2) получали.

I.3 Синтез соли согласно настоящему изобретению (A.3):

Количество 210 г моногидрата лимонной кислоты (1.0 моль) растворяли в 374 г 75 мас.%-ного водного раствора хлорида холина (2.0 моля). Воду удаляли в течение 45 минут на роторном испарителе (колба объемом 2 л) - на масляной бане при температуре от 100 до 120°C, от 50 до 80 мбар. Количество 18 г 90 мас.%-ной метансульфоновой кислоты добавляли, и температуру поднимали до 145°C при давлении 800 мбар. Через один час на роторном испарителе давление непрерывно понижали до 10 мбар, при этом воду удаляли в течение еще 4.5 ч при 145°C. Вещество светло-желтоватого цвета получали, которое разбавляли с помощью 200 г диэтиленгликоля. Количество 607 г жидкости желтоватого цвета получали. Аликвоту 200 г жидкости, полученной таким образом, нейтрализовали с помощью 10.3 г этаноламина до значения рН от 6 до 6.5 (10% в воде). Соль согласно настоящему изобретению (A.3) получали.

I.4 Синтез соли согласно настоящему изобретению (A.4):

Количество 210 г моногидрата лимонной кислоты (1.0 моль) растворяли в 561 г 75 мас.%-ного водного раствора хлорида холина (3.0 моля). Воду удаляли в течение 45 минут на роторном испарителе (колба объемом 2 л) - на масляной бане при температуре от 100 до 120°C, от 50 до 80 мбар. Количество 18 г 90 мас. %-ной метансульфоновой кислоты добавляли, и температуру поднимали до 145°C при давлении 800 мбар. После одного часа выпаривания на роторном испарителе давление непрерывно понижали до 10 мбар, при этом воду удаляли в течение еще 4.5 ч при 145°C. Вещество светло-желтоватого цвета получали, которое разбавляли с помощью 270 г диэтиленгликоля. Количество 868 г жидкости желтоватого цвета получали. Аликвоту 200 г жидкости, полученной таким образом, нейтрализовали с помощью 9.6 г этаноламина до значения рН от 6 до 6.5 (10% в воде). Соль согласно настоящему изобретению (A.4) получали.

I.5 Синтез соли согласно настоящему изобретению (A.5):

Количество 210 г моногидрата лимонной кислоты (1.0 моль) растворяли в 485 г 75 мас.%-ного водного раствора метансульфоната холина (2.0 моль). Воду удаляли в течение 45 минут на роторном испарителе (колба объемом 2 л) - на масляной бане при температуре от 100 до 120°C, от 50 до 80 мбар. Количество 18 г 90 мас. %-ной метансульфоновой кислоты добавляли, и температуру поднимали до 145°C при давлении 800 мбар. После одного часа выпаривания на роторном испарителе давление непрерывно понижали до 10 мбар, при этом воду удаляли в течение еще 4.5 ч при 145°C. Вещество светло-желтоватого цвета получали, которое разбавляли с помощью 200 г диэтиленгликоля. Количество 663 г жидкости желтоватого цвета получали. Аликвоту 200 г жидкости, полученной таким образом, нейтрализовали с помощью 12.5 г этаноламина до значения рН от 6 до 6.5 (10% в воде). Соль согласно настоящему изобретению (A.5) получали.

I.6 Синтез соли согласно настоящему изобретению (A.6):

Количество 98,1 г малеинового ангидрида (1.0 моль) смешивали с 363 г метансульфоната холина (2.0 моля) в виде сухого вещества. Смесь нагревали на роторном испарителе до 135°C. Через один час смешивания количество 12 г метансульфоновой кислоты (чистой) добавляли, и температуру поднимали до 145°C при давлении 800 мбар. После одного часа смешивания давление непрерывно повышали до 10 мбар, при этом воду удаляли в течение еще 4.5 ч при 145°C. Вещество светло-желтоватого цвета получали, которое разбавляли с помощью 200 г диэтиленгликоля. Количество 653 г жидкости желтоватого цвета получали. Аликвоту 200 г жидкости, полученной таким образом, нейтрализовали с помощью 8.9 г этаноламина до значения рН от 6 до 6.5 (10% в воде). Соль согласно настоящему изобретению (A.6) получали.

I.7 Синтез соли согласно настоящему изобретению (A.7):

Количество 210 г моногидрата лимонной кислоты (1.0 моль) растворяли в 437 г 70 мас.%-ного водного раствора бета-метилхолина хлорида (HO-CH(CH₃)-CH₂-N(CH₃)₃ Cl, 2.0 моля). Воду удаляли в течение 45 минут на роторном испарителе (колба объемом 2 л) – на масляной бане при температуре от 100 до 120°C, от 50 до 80 мбар. Количество 18 г 90 мас.%-ной метансульфоновой кислоты добавляли, и температуру поднимали до 145°C при давлении 800 мбар. После одного часа выпаривания на роторном испарителе давление непрерывно понижали до 10 мбар, при этом воду удаляли в течение еще 4.5 ч при 145°C. Вещество светло-желтоватого цвета получали, которое разбавляли с помощью 200г диэтиленгликоля. Количество 676 г жидкости желтоватого цвета получали. Аликвоту 200 г жидкости, полученной таким образом, нейтрализовали с помощью 12.3 г этаноламина до значения рН от 6 до 6.5 (10% в воде). Соль согласно настоящему изобретению (A.7) получали.

I.8 Синтез соли согласно настоящему изобретению (A.8):

Количество 105 г моногидрата лимонной кислоты (0.5 моля) растворяли в 327 г 70 мас.%-ного водного раствора бета-метилхолина хлорида (1.5 моля). Воду удаляли в течение 45 минут на роторном испарителе (колба объемом 2 л) – на масляной бане при температуре от 100 до 120°C, от 50 до 80 мбар. Количество 13 г 90%-ной метансульфоновой кислоты по массе метансульфоновой кислоты добавляли, и температуру поднимали до 145°C при давлении 800 мбар. После одного часа выпаривания на роторном испарителе давление непрерывно понижали до 10 мбар, при этом воду удаляли в течение еще 4.5 ч при 145°C. Вещество светло-желтоватого цвета получали, которое разбавляли с помощью 170 г диэтиленгликоля. Количество 471 г жидкости желтоватого цвета получали. Аликвоту 200 г жидкости, полученной таким образом, нейтрализовали с помощью 21.7 г триэтаноламина до значения рН от 6 до 6.5 (10% в воде). Соль согласно настоящему изобретению (A.8) получали.

I.9 Синтез соли согласно настоящему изобретению (A.9):

Количество 210 г моногидрата лимонной кислоты (1.0 моль) растворяли в 520 г 70 мас.%-ного водного раствора бета-н-пропилхолина хлорида (2.0 моля). Воду удаляли в течение 45 минут на роторном испарителе (колба объемом 2 л) - на масляной бане при температуре от 100 до 120°C, от 50 до 80 мбар. Количество 18 г 90%-ной метансульфоновой кислоты добавляли, и температуру поднимали до 145°C при давлении 800 мбар. После одного часа выпаривания на роторном испарителе давление непрерывно понижали до 10 мбар, при этом воду удаляли в течение еще 4.5 ч при 145°C. Вещество светло-желтоватого цвета получали, которое разбавляли с помощью 250 г пропиленгликоля. Количество 774 г жидкости желтоватого цвета получали. Аликвоту 200 г жидкости, полученной таким образом, нейтрализовали с помощью 11.9 г этаноламина до значения рН от 6 до 6.5 (10% в воде). Соль согласно настоящему изобретению (A.9) получали.

I.10 Синтез соли согласно настоящему изобретению (A.10):

Количество 210 г моногидрата лимонной кислоты (1.0 моль) растворяли в 520 г 70%-ного водного раствора диметилмонобутилхолин хлорида (2.0 моля). Воду удаляли в течение 45 минут на роторном испарителе (колба объемом 2 л) – на масляной бане при температуре от 100 до 120°C, от 50 до 80 мбар. Количество 18 г 90%-ной метансульфоновой кислоты добавляли, и температуру поднимали до 145°C при давлении 800 мбар. После одного часа выпаривания на роторном испарителе давление непрерывно понижали до 10 мбар, при этом воду удаляли в течение еще 4.5 ч при 145°C. Вещество светло-желтоватого цвета получали, которое разбавляли с помощью 200 г пропиленгликоля. Количество 788 г жидкости желтоватого цвета получали. Аликвоту 200 г жидкости, полученной таким образом, нейтрализовали с помощью 11.4 г этаноламина до значения рН от 6 до 6.5 (10% в воде). Соль согласно настоящему изобретению (A.10) получали.

I.11 Синтез соли согласно настоящему изобретению (A.11):

Количество 105 г моногидрата лимонной кислоты (0.5 моля) растворяли в 397 г 60 мас.%-ного водного раствора диметил-н-октилхолина хлорида (1.0 моль). Воду удаляли в течение 90 минут на роторном испарителе (колба объемом 2 л) – на масляной бане при температуре от 100 до 120°C, от 50 до 80 мбар. Количество 9.5 г 90%-ной метансульфоновой кислоты добавляли, и температуру поднимали до 145°C при давлении 800 мбар. После одного часа выпаривания на роторном испарителе давление непрерывно понижали до 10 мбар, при этом воду удаляли в течение еще 4.5 ч при 145°C. Вещество светло-желтоватого цвета получали, которое разбавляли с помощью 200 г пропиленгликоля. Количество 470 г жидкости желтоватого цвета получали. Аликвоту 200 г жидкости, полученной таким образом, нейтрализовали с помощью 8.9 г этаноламина до значения рН от 6 до 6.5 (10% в воде). Соль согласно настоящему изобретению (A.11) получали.

I.13 Синтез соли согласно настоящему изобретению (A.13):

Количество 85 г галлиевой кислоты (3,4,5-тригидроксиюензойная кислота, 0.5 моль) диспергировали в 121 г 75 мас.%-ного водного раствора метансульфоната холина (0.5 моль). Воду удаляли в течение 90 минут на роторном испарителе (колба объемом 2 л) - на масляной бане при температуре от 100 до 120°C, от 50 до 80 мбар. Количество 8 г 90%-ной метансульфоновой кислоты добавляли, и температуру поднимали до 145°C при давлении 800 мбар. После одного часа выпаривания на роторном испарителе давление непрерывно понижали до 10 мбар, при этом воду удаляли в течение еще 4.5 ч при 145°C. Вещество светло-желтоватого цвета получали, которое разбавляли с помощью 100 г диэтиленгликоля. Количество 271 г жидкости желтоватого цвета получали. Аликвоту 100 г жидкости, полученной таким образом, нейтрализовали с помощью 4.6 г этаноламина до значения рН от 6 до 6.5 (10% в воде). Соль согласно настоящему изобретению (A.13) получали.

Сравнительные соли:

C-(A.15): хлорид холина, 75 мас.%-ный водный раствор, коммерчески доступный от BASF SE

C-(A.16):

Количество 75 г (0.5 моль) винной кислоты растворяли порционно (единицы по 15 г) в 206 г 80 мас.%-ного водного раствора бикарбоната холина (1.0 моль). Раствор перемешивали до прекращения выделения CO₂. Воду удаляли в течение 90 минут на роторном испарителе (колба объемом 2 л) - на масляной бане при температуре 120°C, 10 мбар. Прозрачное вещество получали, которое разбавляли с помощью 150 г диэтиленгликоля. 390 г прозрачного раствора получали, C-(A.16). Образование сложного эфира не было обнаружено.

C-(A.17): Количество 105 g (0.5 моль) моногидрат лимонной кислоты растворяли порционно (единиц по 20 г) в 206 г 80 мас.%-ного водного раствора бикарбоната холина (1.0 моль). Раствор перемешивали до прекращения выделения CO₂. Воду удаляли в течение 90 минут на роторном испарителе (колба объемом 2 л) - на масляной бане при температуре 120°C, 10 мбар. Прозрачное вещество получали, которое разбавляли с помощью 150 г диэтиленгликоля. 412 г прозрачного раствора получали, C-(A.17). Образование сложного эфира не было обнаружено.

C-(A.18): Количество 105 г (0.5 моль) моногидрата лимонной кислоты растворяли порционно (единицы по 20 г) в 309 г 80 мас.%-ного водного раствора бикарбоната холина (1.5 моля). Раствор перемешивали до прекращения выделения CO₂. Воду удаляли в течение 90 минут на роторном испарителе (колба объемом 2 л) - на масляной бане при температуре 120°C, 10 мбар. Прозрачное вещество получали, которое разбавляли с помощью 150г диэтиленгликоля. 497 г прозрачного вязкого раствора получали, C-(A.18). Образование сложного эфира не было обнаружено.

C-(A.19): моногидрат лимонной кислоты

C-(A.20): мононатриевая соль лимонной кислоты

C-(A.21): динатриевая соль лимонной кислоты

C-(A.22): тринатриевая соль лимонной кислоты

C-(A.19), C-(A.20), C-(A.21) и C-(A.22) являются известными моющими соединениями, применяемыми в моющих составах.

II. Испытания на применение

II.1 Жидкие составы

В жидких моющих составах с низким содержанием воды вода замещена на гликоли, такие как диэтиленгликоль или DPG, и следовательно растворимость неизбежна. Соли (A.1) - (A.11) и C-(A.16) - C-(A.18) каждая растворима в диэтиленгликоле и/или дипропиленгликоле и, следовательно, могут быть включены в состав без воды.

50 г C-(A.19), C-(A.20), C-(A.21) и C-(A.22) каждый объединили в колбе вместе со 100 г диэтиленгликоля и нагревали при 100°C в течение 30 минут при перемешивании. Источник нагрева удаляли, и полученные суспензии белого цвета охлаждали до температуры окружающей среды в течение 10 часов. Полученные суспензии фильтровали (бумажный фильтр), и осадок на фильтре дважды промывали 50 г изопропанола. Выделенные соединения C-(A.19), C-(A.20), C-(A.21) и C-(A.22) определяли гравиметрически, показывая, что в отсутствие воды C-(A. 19), C-(A.20), C-(A.21) и C-(A.22) не могут быть использованы из-за недостаточной растворимости. Следующие количества были получены в виде осадка на фильтре: C-(A.19): 44.0 г; C-(A.20): 45.8 г; C-(A.21): 47.2 г; C-(A.22): 48.2 г.

II.2 Стабильность фермента

Стабильность при хранении липазы и протеазы в воде оценили при 37°C.

Базовые тестовые составы были получены путем получения базовых составов I-VI путем смешивания компонентов в соответствии с таблицей 1.

Соответствующую соль (компонент (а)) или сравнительное соединение добавляли, если применимо, к соответствующему базовому составу в количествах, как указано в таблице 1.

Фермент (компонент (b)) добавляли в соответствующий базовый состав в количествах, как указано в таблице 1. Количество фермента, указанное в таблице 1, относится к активному белку. В зависимости от того, какую ферментативную активность измеряли, добавляли либо липазу, либо протеазу.

Lipolase® 100L (CAS-No. 9001-62-1, EC-No. 232-619-9) была получена у Sigma-Aldrich.

Savinase® 16.0L (CAS-No. 9014-01-1, EC-No. 232-752-2) была получена у Sigma-Aldrich.

Воду добавляли в соответствии с балансом до 100.

Таблица 1: жидкие составы
Ингредиенты	мас.% в составе
ссылка	I.	II.	III.	IV.	V.	VI.
Базовый состав:
(B.1)	6	15	8	-	35	30	25
(B.2)	-	--	6	8	-	-	-
(B.3)	7.5	6	4	-	8	-	22
(B.4)	2	2	-	-	10	12	6
(B.5)	8		4	8	4	14	-
(B.6)	-	-	2.5	-	-	5	-
Сорбит	-	3	-	-	3	-	-
PEI-EO20	-	3	5	3	5	5	-
Пропиленгликоль	8		4	-	8	6	4
Глицерин (G) или Этанол (E)	(E) 2.5	-	-	(G) 6	-	(G) 6	(G) 8
Ca-формиат	-	1	-	1	2	2	-
Добавки:
Savinase 16.0L	0.5	0.5	0.5	0.5	0.5	0.5	0.5
Lipolase	0.4	0.4	0.4	0.4	0.4	0.4	0.4
компонент (a)**	-	2.5	2.5	2.5	4.0	4.0	4.0
Баланс	вода до 100

(B.1): н-C₁₈-алкил-(OCH₂CH₂)₂₅-OH

(B.2): C₁₀-C₁₈-алкилполигликозидная смесь

(B.3): Натрия C₁₀-C₁₂-алкилбензолсульфонат

(B.4): Куменсульфонат натрия

(B.5): Лауретсульфат натрия – н-C₁₂H₂₅-O-(CH₂CH₂O)₃-SO₃Na

(B.6): н-C₁₂H₂₅(CH₃)₂N→O

** для сравнительных испытаний без соединений согласно настоящему изобретению они были замещены таким же количеством диэтиленгликоля.

Активность липазы:

Активность липазы Lipolase в определенные моменты времени, как указано в таблице 2, определяли, используя п-нитрофенолвалерат (2,4 мМ pNP-C5 в 100 мМ Tris pH 8,0, 0,01% Triton X100) в качестве субстрата. Поглощение измеряли при 20°С каждые 30 секунд в течение 5 минут при 405 нм. Наклон (увеличение поглощения при 405 нм в минуту) кривой зависимости поглощения от времени прямо пропорционален активности липазы.

В таблице 2 показана активность липазы в жидких составах, измеренная после хранения; 1-30 дней при 37°С. Значения липолитической активности, представленные в таблице 2, были рассчитаны по отношению к 100%-ному значению, определенному для контрольного состава в момент времени 0.

Номенклатура составов является следующей: римское число перед точкой характеризует базовый состав, арабское число - тип соли (A.№ соль согласно настоящему изобретению (компонент (a)); C-(A.№) сравнительный соединение). Ноль («0»): без соли, но с диэтиленгликолем.

Таблица 2: Активность липазы в ходе хранения при 37°C
Идентификатор состава	T0	1 д	3 д	6 д	10 д	15 д	20 д	25 д	30 д
Базовый состав	соединение
I.	0	95	89	77	68	53	38	30	22	16
I.	(A.1)	96	96	93	94	89	85	82	64	72
I.	(A.3)	101	100	98	95	91	88	85	68	78
I.	(A.4)	103	100	99	96	95	93	90	86	85
I.	(A.6)	97	96	94	92	89	85	80	78	75
I.	(A.7)	95	95	91	85	81	76	69	65	59
I.	C-(A.15)	97	95	80	67	55	41	32	22	20
I.	C-(A.16)	95	90	81	68	51	40	34	25	24
I.	C-(A.17)	97	90	80	70	53	42	38	33	29
I.	C-(A.18)	98	91	84	72	55	45	39	32	29
II.	0	94	92	81	73	57	41	32	25	20
II.	(A.2)	95	94	92	90	88	84	80	75	68
II.	(A.5)	102	100	97	95	93	89	86	72	79
II.	(A.6)	103	100	99	96	94	92	90	86	88
II.	(A.8)	96	94	90	85	80	80	76	72	68
II.	(A.9)	97	93	90	87	83	81	77	75	76
II.	(A.10)	96	96	92	89	83	84	79	76	73
II.	(A.12)	100	98	96	95	88	86	80	77	76
II.	C-(A.15)	96	95	82	65	56	40	33	26	22
II.	C-(A.22)	95	87	79	67	55	40	33	24	18
III.	0	96	93	83	74	63	51	42	30	24
III.	(A.4)	100	98	96	93	90	85	84	82	77
III.	(A.6)	104	100	101	97	94	90	89	86	82
III.	(A.9)	97	95	93	88	84	80	77	73	71
III.	(A.10)	96	96	91	86	82	79	76	73	69
III.	(A.11)	97	96	93	84	83	76	71	70	63
III.	(A.12)	102	98	97	95	91	86	80	78	74
III.	C-(A.20)	100	92	79	70	51	39	30	22	16
III.	C-(A.21)	101	93	78	68	50	39	31	25	20
III.	C-(A.22)	98	92	76	66	48	37	28	23	19
IV.	0	88	85	81	70	60	55	46	39	33
IV.	(A.1)	98	96	93	92	87	84	82	79	71
IV.	(A.3)	99	100	98	95	90	88	85	80	74
IV.	(A.4)	101	100	97	93	90	89	86	81	73
IV.	(A.6)	96	96	91	89	86	85	81	78	75
IV.	(A.7)	97	95	90	85	81	78	73	70	64
IV.	C-(A.15)	94	95	82	72	59	44	36	30	23
IV.	C-(A.16)	95	90	81	67	55	41	34	28	25
IV.	C-(A.17)	96	93	86	74	63	51	46	38	33
IV.	C-(A.18)	95	91	84	72	58	49	46	39	35
V.	0	83	80	75	68	59	50	41	36	30
V.	(A.2)	97	94	90	87	84	81	78	74	69
V.	(A.4)	101	98	94	90	87	84	80	76	71
V.	(A.5)	101	100	98	96	94	88	84	77	74
V.	(A.7)	96	95	92	88	84	80	75	70	66
V.	(A.11)	97	96	91	89	85	77	73	68	60
V.	(A.13)	95	96	91	87	80	70	61	52	45
V.	C-(A.15)	98	95	86	74	63	54	41	39	30
V.	C-(A.16)	96	92	85	70	65	58	49	37	28
VI.	0	82	79	72	63	54	47	38	30	25
VI.	(A.4)	102	99	96	91	86	82	80	75	65
VI.	(A.5)	99	97	95	91	83	78	73	70	63
VI.	(A.6)	96	90	87	84	81	74	70	67	61
VI.	(A.11)	97	92	88	84	83	78	75	72	65
VI.	C-(A.18)	96	90	83	75	58	50	48	37	32

Активность протеазы:

Активность Savinase в определенные моменты времени, как указано в Таблице 3, определяли посредством применения сукцинил-Ala-Ala-Pro-Phe-п-нитроанилида (Suc-AAPF-pNA, кратко AAPF) в качестве субстрата. pNA отщепляется от молекулы субстрата посредством протеолитического расщепления, приводя к высвобождению свободного pNA желтого цвета, который определяют посредством измерения OD₄₀₅4. Измерение проводят при 20°C.

В таблице 3 показана активность протеазы в жидких составах, измеренная после хранения; 1-30 дней при 37°С. Значения протеолитической активности, представленные в таблице 3, были рассчитаны по отношению к 100%-ному значению, определенному для контрольного состава в момент времени 0.

Номенклатура составов является следующей: римское число перед точкой характеризует базовый состав, арабское число - тип соли (A.№ соль согласно настоящему изобретению (компонент (a)); C-(A.№) сравнительный соединение). Ноль («0»): без соли, но с диэтиленгликолем.

Таблица 3: активность протеазы в ходе хранения при 37°C
Идентификатор состава	T0	1 д	3 д	6 д	10 д	15 д	20 д	25 д	30 д
Базовый состав	соединение
I.	0	98	98	86	67	49	38	30	23	8
I.	(A.1)	96	94	91	75	59	48	42	36	29
I.	(A.4)	100	97	95	76	60	50	45	36	32
I.	(A.5)	99	96	94	73	58	49	44	38	33
I.	(A.6)	96	93	87	75	59	50	45	40	29
I.	C-(A.15)	98	92	85	64	47	39	31	22	8
I.	C-(A.16)	98	91	84	66	49	38	30	23	10
I.	C-(A.17)	98	90	81	70	49	38	30	23	12
III.	0	96	95	86	71	51	40	33	21	12
III.	(A.6)	92	96	92	82	69	59	50	41	34
III.	(A.8)	94	95	93	78	68	60	52	42	33
III.	(A.12)	96	96	92	80	70	61	50	39	31
III.	C-(A.17)	92	94	83	71	53	42	34	27	14
III.	C-(A.18)	94	94	85	72	54	43	35	28	14
V.	0	83	98	86	70	49	38	30	23	13
V.	(A.1)	84	93	88	80	62	54	46	38	30
V.	(A.2)	87	90	90	83	66	58	50	44	36
V.	(A.6)	88	91	89	84	70	60	52	43	35
V.	C-(A.18)	83	90	83	64	50	40	33	25	16
VI.	0	87	93	86	70	49	38	30	23	11
VI.	(A.4)	84	90	88	76	68	61	53	44	30
VI.	(A.7)	85	90	84	74	66	59	50	40	31
VI.	(A.9)	83	87	85	75	67	60	51	40	30
VI.	(A.11)	86	91	87	77	69	58	49	42	32
VI.	C-(A.15)	85	90	84	66	47	36	29	20	10

II.3 Испытания по очистке текстиля

Моющая эффективность составов при очистке двух типов испытуемых тканей была протестирована. Образцы ткани для испытаний имели сложное загрязнение, содержащее белковые и жировые компоненты в результате процесса CFT, а также образцы ткани для испытаний содержали жировой/в виде частиц тип загрязнения.

Испытание проводили следующим образом: монитор с множеством пятен, содержащий 8 стандартизованных образцов загрязненной ткани, каждый размером 2,5 x 2,5 см и сшитые с двух сторон на сложнополиэфирным носителем, промывали вместе в устройстве для определения прочности тканей к стирке с 2,5 г хлопковой ткани и 5 г/л жидкого тестируемого моющего средства для стирки, Таблица 4.

Условия были следующими: устройство: прибор для определения прочности тканей к стирке от SDL Atlas, Rock Hill, USA. Моющий раствор: 250 мл, время стирки: 60 минут, температура стирки: 30°C. Твердость воды: 2.5 ммоль/л; Ca:Mg:HC0₃ 4:1:8

Соотношение ткань: моющий раствор 1:12. После проведения цикла стирки монитор с множеством пятен промывали в воде, с последующей сушкой при комнатной температуре в течение 14 часов.

Применяли следующие предварительно загрязненные тестируемые ткани:

CFT C-S-10: масло на хлопке

CFT C-S-62: сало, окрашенное на хлопке

CFT C-S-68: шоколадное мороженное на хлопке

EMPA 112: какао на хлопке

EMPA 141/1: губная помада на хлопке

EMPA 125: монитор для тензида

wfk20D: пигмент и жир типа сала на смешанной ткани полиэстер/хлопок

CFT C-S-70: шоколадный мусс

wfk = wfk тестовые ткани GmbH, Krefeld

EMPA = Swiss Federal Institute of Materials Testing

CFT = Center for Test Material B.V.

Общий уровень очистки оценивали с помощью измерений цвета. Значения отражения пятен на мониторах измеряли с использованием сферического отражательного спектрометра (тип SF 500 от Datacolor, США, диапазон длин волн 360-700 нм, оптическая геометрия d/8°) с фильтром с ограниченной полосой пропускания УФ при 460 нм. В этом случае с помощью классификации цветового пространства CIE-Lab были измерены яркость L *, значение a * на оси цвета красный-зеленый и значение b * на оси цвета желтый-синий, до и после стирки, и усреднены для 8 пятен монитора. Изменение значения цвета (ΔE) определяется и рассчитывается автоматически инструментами оценки цвета по следующему уравнению:

ΔE = Δ дельта a * 2 + Δ дельта b * 2 + + Δ дельта L * 2,

ΔE является мерой достигнутого эффекта очистки. Все измерения были повторены шесть раз, чтобы получить среднее число. Необходимо отметить, что более высокие значения Δ E показывают лучшую очистку. Разница в 1 единицу может быть обнаружена квалифицированным специалистом. Не специалист в данной области техники может легко обнаружить 2 единицы. Результаты показаны в таблице 5.

R_w =отражения загрязнения после стирки

R_o =отражение без загрязнения

Увеличение моющей способности за счет моющего компонента было рассчитано следующим образом: в ходе этого исследования было проведено 6 повторений для каждой ткани; статистический уровень достоверности 90-95% был рассчитан.

Тестируемые составы получали путем получения составов VII-XIII посредством смешивания компонентов согласно Таблице 14.

Соответствующую соль (компонент (a)) или сравнительное соединение добавляли при необходимости в соответствующий базовый состав в количествах, приведенных в Таблице 4.

Lipolase® 100L добавляли при необходимости в соответствующий базовый состав в количествах, приведенных в Таблице 4.

Savinase® 16.0L добавляли при необходимости в соответствующий базовый состав в количествах, приведенных в Таблице 4.

Воду добавляли в соответствии с балансом до 100.

Таблица 4: жидкие составы для стирки
Ингредиенты		мас.% в составе
VII.	VIII.	IX.	X.	XI.	XII.	XIII.
Базовый состав:
(B.1)	8	8	8	35	35	35	35
(B.2)	6	6	6	-	-	-	-
(B.3)	4	4	4	8	8	8	8
(B.4)	-	-	-	10	10	10	10
(B.5)	4	4	4	4	4	4	4
(B.6)	2.5	2.5	2.5	-	-	-	-
Сорбит	-	-	-	2	2	2	2
PEI-EO20	5	5	5	5	5	5	5
Пропиленгликоль	4	4	4	8	8	8	8
Глицерин	-	-	-	-	-	-	-
Ca-формиат	-	-	-	2	2	2	2
Добавки:
Savinase 16.0L	-	-	-	-	-	0.5	0,5
Lipolase	-	-	0.4	-	0.4	0.4	0.4
компонент (a)**	-	2.5	2.5	-	2.5	2.5	4
Баланс	вода до 100

(B.1): н-C₁₈-алкил-(OCH₂CH₂)₂₅-OH

(B.2): C₁₀-C₁₈-алкилполигликозидная смесь

(B.3): Натрия C₁₀-C₁₂-алкилбензолсульфонат

(B.4): Куменсульфонат натрия

(B.5): Лауретсульфат натрия – н-C₁₂H₂₅-O-(CH₂CH₂O)₃-SO₃Na

(B.6): н-C₁₂H₂₅(CH₃)₂N→O

** для сравнительных испытаний без соединений согласно настоящему изобретению они были замещены таким же количеством диэтиленгликоля.

Увеличение моющей способности благодаря соли (компонент (а)) вычисляли следующим образом: в ходе этого исследования было протестировано 6 примеров каждой ткани; статистический уровень достоверности> 90% был рассчитан. Таблица 5 показывает сумму ΔE вышеупомянутого монитора множества пятен. Испытания на устройстве для определения прочности тканей к стирке проводились со свежеприготовленным составом (до) и составом после хранения при 37°С в течение 2 месяцев при температуре хранения. В качестве приближения одна неделя при 37°C эквивалентна 3½ неделям при 20°C.

Таблица 5: Результаты испытаний на устройстве для определения прочности тканей к стирке
Идентификатор состава	ΔE T0	ΔE 1 неделя	ΔE 2 недели	ΔE 4 недели	ΔE 6 недель	ΔE 8 недель
Базовый состав	соединение
VII.	0	158	157	159	158	158	156
VIII.	C-(A.21)	161	160	159	158	160	159
VIII.	(A.12)	157	160	157	158	158	157
VIII.	(A.4)	162	163	161	163	161	161
VIII.	(A.2)	160	159	161	158	160	158
IX.	0	183	180	174	170	166	161
IX.	(A.2)	184	183	180	178	177	173
IX.	(A.3)	183	184	181	179	179	175
IX.	(A.4)	185	185	183	181	182	181
IX.	(A.7)	181	179	180	178	179	177
X.	0	164	164	163	162	163	163
XI.	0	188	186	180	174	169	164
XI.	(A.5)	191	189	188	188	184	185
XI.	(A.10)	185	187	187	185	182	180
XI.	(A.12)	185	186	186	187	185	185
XII.	0	190	186	181	178	172	164
XII.	(A.12)	190	189	188	188	188	184
XII.	(A.2)	191	189	186	186	184	182
XII.	(A.5)	191	194	193	191	189	188
XIII.	0	194	190	184	177	171	165
XIII.	C-(A.15)	190	189	185	175	168	163
XIII.	(A.8)	191	191	189	189	186	186
XIII.	(A.10)	192	188	189	188	185	183
XIII.	(A.12)	190	191	190	188	187	188

1. Жидкий ферментный препарат для приготовления моющих составов, содержащий от 0,1% до 30 мас.% компонента (a), представляющего собой соль согласно общей формуле (I)

(R²)₃N⁺-(CH₂)_nC(R³)(R⁴)-(O-X)_m-O-C(O)-R¹ A^- (I),

где n выбрано из от 1 до 12,

m равено 0,

R¹ выбран из метила, этила, -CH(OH)-CH(OH)-COOH, CH(OH)-CH₃, (E)-CH=CHCOOH, (Z)-CH=CHCOOH, -C₆H₅, пара-HO-C₆H₄-, о,п-дигидроксифенила и 3,4,5-тригидроксифенила или O-C(O)-R¹ вместе составляют цитрат,

R² являются одинаковыми или различными и выбраны из C₁-C₁₀-алкила и фенила,

R³ и R⁴ являются одинаковыми или различными и выбраны из водорода и C₁-C₄-алкила,

X представляет собой C₂-C₄-алкилен и

A^- представляет собой неорганический или органический противоион,

от 0,1% до 40 мас.% компонента (b), представляющего собой по меньшей мере один фермент, выбранный из группы липаз (EC 3.1.1) и эндопептидаз (EC 3.4.21),

и от 0,1% до 60 мас.% компонента (c), представляющего собой по меньшей мере одно соединение, выбранное из стабилизаторов ферментов, отличных от компонента (a), консервантов и поверхностно-активных веществ.

2. Ферментный препарат по п. 1, в котором компонент (b) выбран из группы триацилглицероллипазы (EC 3.1.1.3) и протеаз типа субтилизина (EC3.4.21.62).

3. Ферментный препарат по п. 1, в котором поверхностно-активные вещества выбраны из неионных, амфотерных и анионных поверхностно-активных веществ.

4. Ферментный препарат по п. 1, в котором компонент (a) имеет противоион, выбранный из галогенида, сульфата, карбоната, тартрата, цитрата, лактата и метансульфоната.

5. Ферментный препарат по п. 1, в котором R² в соединении согласно общей формуле (I) все представляют собой метил.

6. Ферментный препарат по п. 1, в котором указанный ферментный препарат содержит компонент (a) в количествах в интервале от 0,1 до 15 мас.% относительно общей массы ферментного препарата.

7. Ферментный препарат по п. 1, в котором компонент (a) содержит в качестве примеси соединение (a’):

(R²)₃N⁺-(CH₂)_nC(R³)(R⁴)-(O-X)_m-OH R¹-COO- (a’),

где переменные R¹, R², X, n и m имеют такие же значения, как в

соответствующем компоненте (a).

8. Ферментный препарат по п. 1, причем компонент (c) содержит по меньшей мере один стабилизатор фермента, выбранный из борсодержащих соединений и пептидных альдегидов.

9. Ферментный препарат по любому из пп. 1-8, причем борсодержащие соединения выбраны из фенилбороновой кислоты (PBA) или ее производных, предпочтительно представляют собой 4-формилфенилбороновую кислоту (4-FPBA).

10. Способ получения ферментного препарата, причем указанный способ включает стадии смешивания по меньшей мере компонента (a), представляющего собой соль, которая представляет собой соединение общей формулы (I),

(R²)₃N⁺-(CH₂)_nC(R³)(R⁴)-(O-X)_m-O-C(O)-R¹ A^- (I),

где n выбрано из от 1 до 12,

m равно 0,

R¹ выбран из метила, этила, -CH(OH)-CH(OH)-COOH, CH(OH)-CH₃, (E)-CH=CHCOOH, (Z)-CH=CHCOOH, -C₆H₅, пара-HO-C₆H₄-, о,п-дигидроксифенила и 3,4,5-тригидроксифенила, или OC(O)-R¹ вместе составляют цитрат,

R² являются одинаковыми или различными и выбраны из C₁-C₁₀-алкила, фенила,

R³ и R⁴ являются одинаковыми или различными и выбраны из водорода и C₁-C₄-алкила,

X представляет собой C₂-C₄-алкилен и

A^- представляет собой неорганический или органический противоион,

компонента (b), представляющего собой по меньшей мере один фермент, выбранный из группы липаз (EC 3.1.1) и эндопептидаз (EC 3.4.21),

и компонента (c), представляющего собой по меньшей мере одно соединение, выбранное из стабилизаторов ферментов, отличных от компонента (a), консервантов и поверхностно-активных веществ.

11. Способ по п. 10, в котором компонент (b) выбран из группы триацилглицероллипазы (EC 3.1.1.3) и протеаз типа субтилизина (EC3.4.21.62).

12. Способ по п. 10 или 11, в котором поверхностно-активные вещества выбраны из неионных, амфотерных и анионных поверхностно-активных веществ.

13. Способ стабилизации по меньшей мере одного фермента, выбранного из группы липаз (EC 3.1.1) и эндопептидаз (EC 3.4.21), в жидком ферментном препарате посредством стадии добавления соли общей формулы (I),

(R²)₃N⁺-(CH₂)_nC(R³)(R⁴)-(O-X)_m-O-C(O)-R¹ A^- (I),

где n выбрано из от 1 до 12,

m равно 0,

R¹ выбран из метила, этила, -CH(OH)-CH(OH)-COOH, CH(OH)-CH₃, (E)-CH=CHCOOH, (Z)-CH=CHCOOH, -C₆H₅, пара-HO-C₆H₄-, о,п-дигидроксифенила, и 3,4,5-тригидроксифенила или OC(O)-R¹ вместе составляют цитрат,

R² являются одинаковыми или различными и выбраны из C₁-C₁₀-алкила,

фенила,

R³ и R⁴ являются одинаковыми или различными и выбраны из водорода и C₁-C₄-алкила,

X представляет собой C₂-C₄-алкилен и представляет собой неорганический или органический противоион.

14. Способ по п. 13, в котором по меньшей мере один фермент выбран из группы триацилглицероллипазы (EC 3.1.1.3) и протеаз типа субтилизина (EC 3.4.21.62).

15. Способ по п. 13 или 14, в котором фермент стабилизируют в присутствии по меньшей мере одного поверхностно-активного вещества, предпочтительно выбранного из неионного поверхностно-активного вещества, амфотерного поверхностно-активного вещества и анионного поверхностно-активного вещества.

16. Применение соли общей формулы (I)

(R²)₃N⁺-(CH₂)_nC(R³)(R⁴)-(O-X)_m-O-C(O)-R¹ A^- (I),

где n выбрано из от 1 до 12,

m равно 0,

R¹ выбран из метила, этила, -CH(OH)-CH(OH)-COOH, CH(OH)-CH₃, (E)-CH=CHCOOH, (Z)-CH=CHCOOH, -C₆H₅, пара-HO-C₆H₄-, о,п-дигидроксифенила, и 3,4,5-тригидроксифенила, или OC(O)-R¹ вместе составляют цитрат,

R² являются одинаковыми или различными и выбраны из C₁-C₁₀-алкила, фенила,

R³ и R⁴ являются одинаковыми или различными и выбраны из водорода и C₁-C₄-алкила,

X представляет собой C₂-C₄-алкилен и

А^- представляет собой неорганический или органический противоион,

в качестве добавки для по меньшей мере одного фермента, выбранного из группы липаз (EC 3.1.1) и эндопептидаз (EC 3.4.21), где указанная соль и указанный фермент являются твердыми и где стабилизация указанного фермента происходит, когда указанная соль и указанный фермент контактируют с по меньшей мере одним растворителем, выбранным из воды и органического растворителя, выбранного из этанола, н-пропанола, изопропанола, н-бутанола, изобутанола, втор-бутанола, этиленгликоля, пропиленгликоля, 1,3-пропандиола, бутандиола, глицерина, дигликоля, пропилдигликоля, бутилдигликоля, гексиленгликоля, метилового простого эфира этиленгликоля, этилового простого эфира этиленгликоля, пропилового простого эфира этиленгликоля, феноксиэтанола, 2-бутоксиэтанола и d-лимонена.

17. Применение по п. 16, в котором по меньшей мере один фермент выбран из группы триацилглицероллипазы (EC 3.1.1.3) и протеаз типа субтилизина (EC 3.4.21.62).

18. Применение жидкого ферментного препарата по любому из пп. 1-9 для приготовления моющих составов, где ферментный препарат по любому из пп. 1-9 смешивают в одну или более стадий с одним или более компонентами моющего средства.

19. Жидкий моющий состав, содержащий жидкий ферментный препарат по любому из пп. 1-9

и по меньшей мере один компонент моющего средства в эффективном количестве.

20. Способ удаления пятен, содержащих жир, включающий стадию контакта пятна с моющим составом по п. 19, где по меньшей мере один фермент моющего состава содержит по меньшей мере одну липазу (EC 3.1.1).

21. Способ по п. 20, в котором по меньшей мере одна липаза (EC 3.1.1) выбрана из группы триацилглицероллипазы (EC 3.1.1.3).

22. Способ по п. 20 или 21, где пятно подлежит удалению с текстиля при температуре ≤ 40°C.