Усовершенствованный способ получения дальтепарина натрия
Изобретение относится к химии полисахаридов. Предложены варианты способа получения дальтепарина натрия. В одном из вариантов способ включает деполимеризацию гепарина натрия в растворе в присутствии 2,5-3,5 мас.% нитрита натрия относительно гепарина натрия в присутствии кислоты, восстановление полученного продукта с использованием ≤2,0 мол. эквивалентов восстановителя с получением сырого дальтепарина натрия. Затем извлекают сырой дальтепарин натрия, перемешивают в смеси растворителей с получением осадка дальтепарина натрия. После чего растворяют осадок в воде и облучают ультрафиолетовым светом с длиной волны 254 нм и мощностью 4-40 Вт в течение периода времени 10 секунд - 8 минут. Проводят лиофилизацию раствора в присутствии спирта с получением дальтепарина натрия в форме свободнотекучего порошка. Изобретение направлено на получение дальтепарина натрия с низким содержанием примесей. 3 н. и 8 з.п. ф-лы, 1 ил., 3 табл., 5 пр.
Перекрестная ссылка на родственную заявку
Для настоящего изобретения испрашивается приоритет по Индийской предварительной заявке № 201841005592, зарегистрированной 14 февраля 2018 г., которая полностью включена в настоящее описание посредством ссылки.
Область техники, к которой относится изобретение
Настоящее изобретение относится к усовершенствованному способу получения дальтепарина натрия.
Предпосылки создания изобретения
Антикоагулянты, обычно называемые «разжижителями крови», служат в качестве основной терапии для предотвращения и лечения острых артериальных и венозных тромботических нарушений. В случае длительной терапии в качестве антикоагулянтов используются исключительно нефракционированный гепарин и низкомолекулярные гепарины (НМГ (LMWH)), так как они являются эффективными, безопасными и более удобными. Каждый коммерчески доступный НМГ получают уникальной химической или ферментативной деполимеризацией гепарина слизистой оболочки.
Дальтепарин натрия является одним из таких НМГ и сильным антикоагулянтом, который действует через непрямое ингибирование тромбина – ключевого прокоагулянта, который превращает фибриноген в фибрин. Дальтепарин натрия продается под торговым названием Фрагмин®.
Дальтепарин натрия получают контролируемой деполимеризацией гепарина натрия из слизистой оболочки тонкого кишечника свиней под действием азотистой кислоты с последующим процессом хроматографической очистки, и он содержит:
• 2-O-сульфо-α-L-идопиранозуроновую кислоту на невосстанавливающем конце и 6-O-сульфо-2,5-ангидро-D-маннит на восстанавливающем конце цепи,
• среднемассовая относительная молекулярная масса находится в диапазоне от 5600 до 6400 дальтон (Дa) с характеристическим значением примерно 6000 Да,
• степень сульфатирования составляет 2,0 – 2,5 на дисахаридное звено,
• антифактор Xa не меньше 110 МЕ/мг и не больше 210 МЕ/мг,
• антифактор IIa не меньше 35 МЕ/мг и не больше 100 МЕ/мг, и
• отношение активности антифактора Xa к активности антифактора IIa составляет от 1,9 до 3,2.
Структура дальтепарина натрия представлена ниже.
Дальтепарин натрия впервые был раскрыт в WO 80/01383 и US 4,303,651 и был получен деполимеризацией гепарина натрия окислением азотистой кислотой или периодатом с последующим восстановлением борогидридом натрия. Использование азотистой кислоты и борогидрида натрия приводит к образованию нитритных (NO2-), N-нитрозо (N-NO) соединений и элементарного бора в качестве примесей в конечном продукте. Требования Европейской фармакопеи (Ph. Eur) по допустимым пределам содержания нитрита и бора являются достаточно жесткими, и, хотя пределы по содержанию N-NO в монографии Ph. Eur не установлены, эту примесь также необходимо контролировать, так как она своей структурой сигнализирует о возможной генотоксической активности. Производство дальтепарина натрия в промышленном масштабе включает работу с большими количествами указанных реагентов, следовательно, требуется контролировать эти примеси для того, чтобы сохранять качество дальтепарина натрия, а также обеспечивать соответствие нормативным требованиям.
| Пределы по содержанию примесей Ph. Eur | ||
| NO2- (ч/млн) | N-NO (ч/млн) | Бор (ч/млн) |
| 5 | Не установлены | 1 |
Известны несколько способов получения дальтепарина натрия с использованием различных процедур деполимеризации, восстановления, выделения и очистки, соответствующие требованиям фармакопеи. Например, деполимеризация гепарина натрия азотистой кислотой в водной среде (US 4,500,519); контролируемая деполимеризация гепарина с последующим осаждением или очисткой спиртом (US 5,019,649, EP 0 014 184 и EP 0 076 279); контролируемая деполимеризация гепарина с последующим нагреванием или микроволновой обработкой (EP 1 773 890 B1); получение НМГ с пониженным содержанием гликосерина путем окисления гепарина с использованием соли перманганата (US 2008/0318328). Также имеются некоторые патенты или заявки на патенты Китая, например такие, как CN 101942038 B; CN 102558393 B; CN 103232558 A; CN 101942038 A; CN 102558393 A; CN 104045743 A; CN 104045744 A; CN 104098716 A; CN 105884934 A; CN 105440160 A; CN 106317258 A; CN 106699929 A; CN 106986954 A; CN 107141373 A; CN 107236057 A, в которых раскрываются способы получения дальтепарина натрия, различающиеся, в частности, технологией очистки.
Методы известного уровня техники включают использование больших количеств нитрита натрия и борогидрида натрия, что служит причиной для использования дополнительных стадий и/или хроматографической очистки с целью удаления примесей, образующихся по причине использования этих реагентов. Кроме того, в описанных в литературе процедурах во время деполимеризации используются высокие температуры и длительное воздействие (такое как 20-30 мин) УФ-излучения или используются нагревание или микроволновая обработка для регулирования групп N-NO, которые могут не реагировать во время производства и могут влиять на выходы и качество конечного продукта.
Кроме того, УФ-облучение высокомощной лампой в течение продолжительного времени или УФ-волнами с длиной волны меньше 254 нанометров (нм) ведет к выделению тепла, газообразного озона и, как следствие, ухудшает цвет продукта.
Заявители обнаружили, что реакция, осуществляемая путем воздействия УФ излучения/погружения УФ-лампы в раствор продукта в течение более, чем 10 мин, в небольших масштабах приводит к снижению содержания N-NO, но этот эффект невоспроизводим в большом масштабе.
Следовательно, существует потребность в усовершенствованном способе получения дальтепарина натрия, который преодолевает один или несколько недостатков способа(ов) известного уровня техники. Кроме того, при осуществлении способа в промышленном масштабе могут потребоваться система и/или аппарат, направленные на решение проблемы цвета продукта и контроля за содержанием N-NO.
Сущность изобретения
Настоящее изобретение относится к усовершенствованному способу получения дальтепарина натрия, включающему стадии:
(а) деполимеризации гепарина натрия нитритом натрия, 2,5-3,5 мас.%, в присутствии кислоты,
(b) восстановления продукта, полученного на стадии (а), с использованием ≤ 2,0 мол. эквивалентов восстановителя с получением сырого дальтепарина натрия,
(с) извлечения сырого дальтепарина натрия, полученного на стадии (b),
(d) перемешивания сырого продукта, полученного на стадии (с), в смеси растворителей с получением осадка дальтепарина натрия,
(е) растворения осадка, полученного на стадии (d), в воде и облучения ультрафиолетовым светом с длиной волны 254 нм и мощностью 4-40 Вт в течение периода времени 10 секунд – 8 минут, и
(f) лиофилизации раствора, полученного на стадии (е), в присутствии спирта, с получением дальтепарина натрия в форме свободнотекучего порошка.
Этот усовершенствованный способ получения дальтепарина натрия эффективен, экономически выгоден и промышленно осуществим. Кроме того, настоящее изобретение относится к улучшенному способу получения дальтепарина натрия, имеющего содержания примесей нитрита (NO2-), N-NO и бора ниже пределов, установленных фармакопейными стандартами.
Краткое описание чертежей
Фиг. 1 является иллюстрацией фотохимического реактора, используемого в способе по настоящему изобретению.
Подробное описание изобретения
Перед подробным описанием способов по настоящему изобретению следует условиться, что эти способы не ограничиваются конкретными описанными вариантами осуществления как таковыми и, конечно же, могут варьировать. Также следует понимать, что терминология, используемая в настоящем описании, имеет целью только лишь описание конкретных вариантов осуществления и не предназначена для ограничения, так как объем способов по изобретению будет ограничен только прилагаемой формулой изобретения.
Когда приводятся диапазоны величин, следует понимать, что каждая охваченная величина, до десятой части нижнего предела, если из контекста четко не следует иное, между верхним и нижним пределами этого диапазона, а также любая другая указанная или охваченная величина в этом установленном диапазоне, охватывается способами по изобретению. Верхние и нижние пределы этих более узких диапазонов могут независимо включаться в более узкие диапазоны и также охватываются способами, с учетом любых конкретно исключенных пределов в установленном диапазоне. Когда установленный диапазон включает один или оба предела, диапазоны, исключающие любой или оба из этих указанных пределов, также включены в заявленные способы.
Некоторые диапазоны представлены в настоящем описании числовыми значениями, которым предшествует слово «примерно». Термин «примерно» используется в настоящем описании для обеспечения буквального основания для точного числа, которое следует после, а также для чисел, которые находятся близко к числу или приближенно равны тому числу, которому этот термин предшествует. При определении того, является ли число близким или приблизительно равным конкретно указанному числу, близкое или приближенное неуказанное число может быть числом, которое в рассматриваемом контексте, в котором оно используется, по существу представляет собой эквивалент конкретно указанного числа.
Термин «включающий» или «включает» используется в связи с композициями, способами и их соответствующими компонентами, которые являются существенными для изобретения, и все же он оставляет возможность для включения неуказанных элементов, вне зависимости от того, являются они существенными или нет.
Термин «реактор» используется в связи с системой, моделью, аппаратом или оборудованием.
В одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к усовершенствованному способу получения дальтепарина натрия, более конкретно дальтепарина натрия, имеющего примеси (NO2-), N-NO и бора на уровне ниже пределов, установленных фармакопейными стандартами.
Настоящее изобретение относится к усовершенствованному способу получения дальтепарина натрия, включающему стадии:
(а) деполимеризации гепарина натрия нитритом натрия, 2,5-3,5 мас.%, в присутствии кислоты,
(b) восстановления продукта, полученного на стадии (а), с использованием ≤ 2,0 мол. эквивалентов восстановителя с получением сырого дальтепарина натрия,
(с) извлечения сырого дальтепарина натрия, полученного на стадии (b),
(d) перемешивания сырого продукта, полученного на стадии (с), в смеси растворителей с получением осадка дальтепарина натрия,
(е) растворения осадка, полученного на стадии (d), в воде и облучения ультрафиолетовым светом с длиной волны 254 нм и мощностью 4-40 Вт в течение периода времени 10 секунд – 8 минут, и
(f) лиофилизации раствора, полученного на стадии (е), в присутствии спирта с получением дальтепарина натрия в форме свободнотекучего порошка.
Было обнаружено, что при осуществлении указанного выше способа в указанном порядке полученный таким образом дальтепарин натрия соответствует требованиям фармакопеи в отношении качества в том, что касается молекулярно-массового распределения, содержания иона NO2-, содержания N-NO и содержания бора.
Гепарин натрия деполимеризуют с использованием азотистой кислоты. Азотистую кислоту можно добавлять непосредственно или, в альтернативном варианте ее можно генерировать in situ с использованием контролируемых количеств кислоты и производного азотистой кислоты. Подходящие кислоты можно выбрать из соляной кислоты, уксусной кислоты, серной кислоты, и предпочтительнее выбирать соляную кислоту. Подходящими производными азотистой кислоты могут быть соль, простой эфир-соль или, более предпочтительно, соль щелочного или щелочноземельного металла. В предпочтительном варианте осуществления используют соль азотистой кислоты, водорастворимую соль азотистой кислоты, более предпочтительно соль щелочного металла, такую как нитрит натрия (NaNO2). Во время деполимеризации нитрит реагирует с N-сульфатной группой гепарина с образованием неустойчивого N-нитрозосоединения как промежуточного соединения, которое затем претерпевает внутримолекулярную циклизацию с образованием 2,5-ангидро-D-маннозы.
Деполимеризацию гепарина натрия в растворе выполняют в присутствии 2,5 мас.% - 3,5 мас.% нитрита натрия относительно гепарина натрия, предпочтительно 2,5 мас.% - 3,1 мас.%, при температуре в диапазоне 5-35°С, предпочтительно при температуре 5°С и 15°С. Стадию деполимеризации осуществляют при рН в диапазоне 2,0-4,0, используя соляную кислоту. Использование нитрита натрия в оптимальных количествах является критичным. Количество нитрита натрия в количестве меньше 2,5% может привести к неполной деполимеризации, а количество нитрита натрия больше 3,5% может привести к избыточной деполимеризации. Продукт, полученный любым из таких способов, может не соответствовать компендиальным требованиям по средней молекулярной массе и распределению.
Деполимеризованный гепарин, имеющий альдегидную группу 2,5-ангидро-D-маннозы на своем восстанавливающем конце, восстанавливают до 2,5-ангидро-D-маннита. Восстановление, согласно настоящему изобретению, осуществляют с использованием восстановителя, такого как борогидрид натрия, калия или лития. В предпочтительном варианте осуществления восстановителем является борогидрид натрия. Количество борогидрида натрия, используемого для восстановления, составляет ≤ 2 мол. эквивалентов к массе гепарина натрия. Восстановление осуществляют при комнатной температуре в течение периода примерно 1,0-3,0 часа и более предпочтительно в течение периода примерно 1 час. Оптимальное количество борогидрида натрия способствует ограничению количества примеси бора на более низких уровнях и способствует минимизации стадий очистки.
Затем, согласно стадии (с) осуществляют извлечение дальтепарина натрия путем растворения продукта, полученного на стадии (b), в воде при температуре в интервале 5-35°С с последующим добавлением хлорида натрия. После этого на стадии (d) сырой дальтепарин натрия перемешивают в смеси растворителей, включающей воду и спирт, и фильтруют, и получают осадок дальтепарина натрия. Используемый спирт выбирают из метанола, этанола, изопропанола и т.п.
В еще одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к эффективному удалению содержащейся N-NO согласно стадии (е), которое включает облучение ультрафиолетовым светом раствора дальтепарина натрия, полученного путем растворения в воде осадка дальтепарина натрия, полученного как описано выше. Время облучения зависит от используемой системы излучения, мощности излучения и количества содержащейся примеси N-NO в растворе продукта для удаления. Предпочтительно система ультрафиолетового излучения снабжена 4-40-Вт лампой, и раствор дальтепарина натрия подвергают УФ-облучению при 254 нм в течение периода времени от 10 секунд до 8 минут. В качестве системы УФ-излучения можно представить аппарат или открытого или закрытого типа, позволяющий воздействовать на раствор дальтепарина натрия источником УФ-излучения.
В некоторых вариантах осуществления УФ-облучение можно осуществлять в любом фотохимическом реакторе, снабженном одной или несколькими УФ-лампами (например, в фотохимическом УФ-реакторе). В некоторых воплощениях фотохимический реактор может представлять собой фотохимический реактор непрерывного действия, снабженный одной или несколькими интегрированными УФ-лампами. В другом варианте осуществления можно использовать любой фотохимический УФ-реактор, известный в уровне технике. В других вариантах осуществления фотохимический реактор имеет в составе УФ-лампу, вокруг которой установлена кварцевая рубашка. Раствор, содержащий дальтепарин натрия, циркулирует вокруг УФ-лампы, защищенной кварцевой рубашкой. Иллюстративный пример фотохимического реактора, используемого в способе по настоящему изобретению, приводится на фиг. 1.
В другом варианте осуществления способ по настоящему изобретению в соответствии со стадией (f) включает стадию лиофилизации. Стадия лиофилизации включает добавление спирта к раствору, полученному на стадии (е), для получения дальтепарина натрия в форме свободнотекучего порошка. Лиофилизацию осуществляют с использованием процедур, известных в уровне технике. Спирт выбирают из группы, включающей метанол, этанол, изопропанол и т.п. В некоторых вариантах осуществления лиофилизацию осуществляют с использованием спирта в концентрации 5-15 об.% относительно воды, используемой на стадии (е). Если использовать одну только воду, как описано в уровне техники, она дает дальтепарин натрия в виде массы с остаточным содержанием влаги. Твердость массы варьируется в зависимости от параметров лиофилизации, и для получения свободнотекучего порошка требуется стадия переработки в порошок, такая как измельчение. В то же время, дальтепарин натрия, полученный согласно настоящему изобретению, имеет хорошую текстуру, улучшенную устойчивость и низкое содержание органических летучих примесей (OVI).
В предпочтительном варианте осуществления настоящее изобретение относится к усовершенствованному способу получения дальтепарина натрия, который включает стадии:
(а) деполимеризации гепарина натрия нитритом натрия, 2,5-3,5 мас.%, в присутствии кислоты,
(b) восстановления продукта, полученного на стадии (а), с использованием ≤ 2 мол. эквивалентов борогидрида натрия, с получением сырого дальтепарина натрия,
(с) извлечения сырого дальтепарина натрия, полученного на стадии (b),
(d) перемешивания сырого продукта, полученного на стадии (с), в смеси растворителей с получением осадка дальтепарина натрия,
(е) растворения осадка, полученного на стадии (d), в воде и облучения ультрафиолетовым светом с длиной волны 254 нм и мощностью 4-40 Вт в течение периода времени 10 секунд – 8 минут, и
(f) лиофилизации раствора, полученного на стадии (е), в присутствии спирта с получением дальтепарина натрия в форме свободнотекучего порошка.
В еще одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к усовершенстванному способу получения дальтепарина натрия, который включает стадии:
(а) деполимеризации водного раствора гепарина натрия водным раствором нитрита натрия, 2,5-3,1 мас.% относительно гепарина натрия, в присутствии соляной кислоты при рН 2-4 и температуре 5-10°С,
(b) восстановления продукта, полученного на стадии (а), с использованием 1,5-2 эквивалентов борогидрида натрия с получением сырого дальтепарина натрия,
(с) извлечения сырого дальтепарина натрия, полученного на стадии (b),
(d) перемешивания сырого продукта, полученного на стадии (с), в смеси растворителей с получением осадка дальтепарина натрия,
(е) растворения осадка дальтепарина натрия, полученного на стадии (d), в воде и облучения ультрафиолетовым светом с длиной волны 254 нм и мощностью 4-40 Вт в течение периода времени 10 секунд – 8 минут, и
(f) лиофилизации раствора, полученного на стадии (е), в присутствии спирта для получения дальтепарина натрия в форме свободнотекучего порошка.
В еще одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к усовершенствованному способу получения дальтепарина натрия, включающему стадии:
(а) деполимеризации водного раствора гепарина натрия водным раствором нитрита натрия, 2,5-3,1 мас.%, в присутствии соляной кислоты при рН 2-4 и температуре 5-10°С,
(b) восстановления продукта, полученного на стадии (а), с использованием 1,5-2,0 эквивалентов борогидрида натрия с получением сырого дальтепарина натрия,
(с) извлечения сырого дальтепарина натрия, полученного на стадии (b),
(d) перемешивания сырого продукта, полученного на стадии (с), в смеси растворителей с получением осадка дальтепарина натрия,
(е) растворения осадка, полученного на стадии (d), в воде и облучения ультрафиолетовым светом с длиной волны 254 нм и мощностью 4-40 Вт в течение периода времени 10 секунд – 8 минут, и
(f) лиофилизации раствора, полученного на стадии (е), в присутствии спирта с получением дальтепарина натрия в форме свободнотекучего порошка,
причем указанный способ не включает какую-либо стадию хроматографической очистки.
В некоторых вариантах осуществления способ представляет собой непрерывный процесс или периодический процесс. В других вариантах осуществления способ можно осуществлять в любом фотохимическом реакторе. В способе можно использовать любой фотохимический реактор, описанный выше.
Преимуществами настоящего изобретения над известными способами являются:
1) меньшие количества нитрита натрия;
2) использование оптимального количества борогидрида натрия, в результате чего избегается необходимость гашения, и образование меньших количеств элементарного бора;
3) использование интегрированного УФ-реактора, генерирующего свет с длиной волны 254 нм, с меньшей длительностью УФ-облучения, без нагрева, для контроля образования цвета дальтепарина натрия;
4) извлечение продукта путем простого осаждения спиртом, а не затратными по времени, дорогостоящими и громоздкими хроматографическими методами;
5) использование спирта во время лиофилизации для получения дальтепарина натрия в форме свободнотекучего порошка, причем в результате удается избежать стадию измельчения.
Примеры
Следующие далее примеры приводятся для пояснения изобретения и исключительно с целью пояснения и не должны рассматриваться как ограничивающие объем изобретения.
Пример для сравнения 1
Гепарин натрия (5,0 г) растворяют в дистиллированной воде, и доводят рН раствора до 2-4 с использованием соляной кислоты при 5°С – 10°С. К реакционной массе добавляют раствор нитрита натрия (2,2%) и перемешивают. Затем доводят рН раствора до 8-10 с использованием гидроксида натрия с последующим добавлением борогидрида натрия (1,5 экв.), и реакционную массу выдерживают в течение 16 час. Избыток борогидрида натрия гасят соляной кислотой. Полученную смесь нейтрализуют гидроксидом натрия с последующим насыщением хлоридом натрия. Продукт перемешивают с метанолом, осаждают, отфильтровывают и сушат, и получают сырой дальтепарин натрия. Сырой продукт растворяют в дистиллированной воде, насыщают хлоридом натрия и перемешивают с метанолом для осаждения продукта. Полученный осадок отфильтровывают и сушат в вакууме, и получают дальтепарин натрия с профилем молекулярно-массового распределения, не соответствующим требованиям фармакопеи по среднемассовой молекулярной массе (таблица 1). Выход 2,84 г.
Пример для сравнения 2
Гепарин натрия (10,0 г) растворяют в дистиллированной воде, и доводят рН раствора до 2-4 с использованием соляной кислоты при 5°С – 10°С. К реакционной массе добавляют раствор нитрита натрия (3,5%) и перемешивают. Затем доводят рН раствора до 8-10 с использованием гидроксида натрия с последующим добавлением борогидрида натрия (1,5 экв.), и реакционную массу выдерживают в течение 16 час. Избыток борогидрида натрия гасят соляной кислотой. Полученную смесь нейтрализуют гидроксидом натрия с последующим насыщением хлоридом натрия. Продукт перемешивают с метанолом, осаждают, отфильтровывают и сушат, и получают сырой дальтепарин натрия. Сырой продукт дополнительно обрабатывают, следуя процедурам, описанным в примере 1, и получают дальтепарин натрия с профилем молекулярно-массового распределения, который не соответствует требованиям фармакопеи по среднемассовой молекулярной массе (таблица 1). Выход 3,4 г.
Пример 3
Гепарин натрия (80 г) растворяют в дистиллированной воде, и доводят рН раствора до 2-4 с использованием соляной кислоты при 5°С – 10°С. К реакционной массе добавляют раствор нитрита натрия (2,8%) и перемешивают. Затем доводят рН раствора до 8-10 с использованием гидроксида натрия с последующим добавлением борогидрида натрия (4,23 экв.), и реакционную массу выдерживают в течение 16 часов и подвергают отбеливанию 30% пероксидом водорода. Избыток борогидрида натрия гасят соляной кислотой. Полученную смесь нейтрализуют гидроксидом натрия с последующим насыщением хлоридом натрия. Полученную массу перемешивают с метанолом, осаждают, отфильтровывают и сушат, и получают осадок дальтепарина натрия. Осажденный продукт (29 г) растворяют в дистиллированной воде, и на раствор воздействуют УФ-светом (4 Вт) при 254 нм в течение 5 минут. Реакционную массу насыщают хлоридом натрия, и продукт выделяют путем осаждения метанолом с последующей промывкой метанолом. Полученное твердое соединение отфильтровывают, сушат в вакууме, растворяют в дистиллированной воде, фильтруют через мембранные фильтры 0,45 мкм и затем 0,22 мкм и лиофилизуют, и получают дальтепарин натрия с профилем молекулярно-массового распределения, который соответствует требованиям фармакопеи по среднемассовой молекулярной массе (таблица 1). Выход 33,4 г.
Пример 4
Гепарин натрия (50 г) растворяют в дистиллированной воде, и доводят рН раствора до 2-4 с использованием соляной кислоты при 5°С – 10°С. К реакционной массе добавляют раствор нитрита натрия (2,8%) и перемешивают до отрицательной реакции по иодкрахмальной бумаге. Затем доводят рН раствора до 8-10 с использованием гидроксида натрия с последующим добавлением борогидрида натрия (1,5 экв.), и реакционную массу выдерживают в течение 16 часов. Полученную смесь нейтрализуют соляной кислотой, и отбеливают 30% пероксидом водорода с последующим насыщением реакционной массы хлоридом натрия. Полученную массу перемешивают с метанолом, осаждают, отфильтровывают и сушат, и получают осадок дальтепарина натрия. Осажденный продукт (20 г) растворяют в дистиллированной воде, и на раствор воздействуют УФ-светом (8 Вт) при 254 нм в течение 5 минут. Затем реакционную массу дополнительно обрабатывают, следуя процедуре, описанной в примере 3, и получают дальтепарин натрия с профилем молекулярно-массового распределения, который соответствует требованиям фармакопеи по среднемассовой молекулярной массе (таблица 1). Выход 21,6 г.
Пример 5
Гепарин натрия (250 г) растворяют в дистиллированной воде, и доводят рН раствора до 2-3 с использованием соляной кислоты при 5°С – 10°С. К реакционной массе добавляют раствор нитрита натрия (3,0%) и перемешивают. Доводят рН реакционной массы до 9-10 гидроксидом натрия с последующим добавлением борогидрида натрия (2,0 экв.), и перемешивают в течение 1 часа. Реакционную массу фильтруют через слой угля и промывают водой. Доводят рН реакционной массы до 7,0 соляной кислотой, и затем к реакционной массе добавляют 100 мл 30% пероксида водорода и перемешивают в течение 30 минут. К реакционной массе добавляют твердый хлорид натрия, и продукт осаждают метанолом. Полученный осадок отфильтровывают, промывают дополнительными количествами метанола и сушат в вакууме, и получают 138 г продукта сырого дальтепарина натрия в виде белого твердого вещества.
Растворяют 135 г сырого дальтепарина натрия в дистиллированной воде при 25°С – 30°С. К реакционной массе добавляют твердый хлорид натрия, и продукт осаждают метанолом. Остаток, который дополнительно перемешивают в смеси воды и спирта, отфильтровывают, промывают дополнительными количествами метанола и сушат в вакууме, и получают 110 г продукта осадка дальтепарина натрия в виде белого твердого вещества.
Растворяют 100 г полученного твердого вещества в дистиллированной воде и охлаждают до температуры ниже комнатной. Раствор циркулирует в интегрированном реакторе непрерывного действия, снабженном УФ-лампой с длиной волны 254 нм и мощностью 8 Вт, в течение 40 с и в течение 60 с через шланговый насос. После воздействия УФ реакционную массу обрабатывают углем и фильтруют через микропористую мембрану. К полученному раствору добавляют спирт и перемешивают в течение 5-10 мин. Раствор загружают в лотки для лиофилизации и сушат вымораживанием, включающим начальное вымораживание (от -5°С до -50°С, 3-11 час); первичную сушку (от -50°С до 25°С, 15-50 час, вакуум (~29,3-12 Па (220-90 мторр)) и вторичную сушку (25-40°С, 2-5 час, вакуум ~29,3-12 Па (220-90 мторр). Выход 90 г.
Таблица 1. Молекулярно-массовое распределение и среднемассовая молекулярная масса для дальтепарина по Европейской фармакопее (Ph. Eur) и дальтепарина натрия, полученного в примерах 1-5
| Продукт | Дальтепарин (Ph. Eur) | Пример | ||||
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | ||
| Средняя Mw (Дa) | 5600 – 6400 | 6808 | 5490 | 5943 | 6110 | 5900 |
| % MW < 3000 Дa | NMT 13 | 8,4 | 13,0 | 11,4 | 10,2 | 11,1 |
| % MW > 8000 Дa | 15 – 25 | 29,0 | 14,5 | 19,8 | 21,4 | 18,5 |
Молекулярно-массовое распределение определяют гель-проникающей хроматографией (ГПХ). Результаты в таблице 1 показывают, что способ деполимеризации по настоящему изобретению с использованием 2,5-3,1% раствора нитрита натрия удовлетворят профилю молекулярно-массового распределения по Ph. Eur.
Таблица 2. Изменение содержания бора в связи с различными количествами борогидрида натрия, используемого при деполимеризации гепарина натрия, до и после обработки смесью растворителей (примеры 3-5)
| Пример | NaBH4 (экв.) | Содержание бора (ч/млн) | |
| До | После | ||
| 3 | 4,23 экв. | 12 -16 | 2 - 3 |
| 5 | 2,0 экв. | 7 - 12 | 0,3 - 0,6 |
| 4 | 1,5 экв. | 3 - 5 | 0,3 - 0,5 |
Как видно из таблицы 2, способ восстановления по настоящему изобретению, т.е. путем использования 1,5-2,0 мол. эквивалентов, позволяет получить дальтепарин натрия, имеющий содержание бора менее 1 ч/млн (Ph. Eur).
Таблица 3. Изменение содержания N-NO в дальтепарине натрия с изменениями мощности УФ-лампы и времени экспозиции
| № обр. | Условия УФ-эксперимента | Содержание N-NO (ч./млн) |
| 1. | Фрагмин® | 10-18,2 |
| 2. | Без воздействия УФ (пример 1) | 21,1 |
| 3. | Воздействие УФ (лампа 4 Вт) 5 мин (пример 3) | 11,9 |
| 4. | Воздействие УФ (лампа 8 Вт) 5 мин (пример 4) | 9,7 |
| 5 | Воздействие УФ (8 Вт) 40 с (пример 5) | <2,0 |
| 6. | Воздействие УФ (8 Вт) 60 с (пример 5) | < 1,0 |
Как указано в таблице 3, получение дальтепарина натрия, согласно настоящему изобретению, приводит к продукту с содержанием N-NO, которое ниже, чем определенное для Фрагмина® и образца без облучения УФ.
1. Способ получения дальтепарина натрия, включающий стадии:
(а) деполимеризации гепарина натрия в растворе в присутствии 2,5-3,5 мас.% нитрита натрия относительно гепарина натрия в присутствии кислоты,
(b) восстановления продукта, полученного на стадии (а), с использованием ≤2,0 мол. эквивалентов восстановителя с получением сырого дальтепарина натрия,
(с) извлечения сырого дальтепарина натрия, полученного на стадии (b),
(d) перемешивания сырого продукта, полученного на стадии (с), в смеси растворителей с получением осадка дальтепарина натрия,
(е) растворения осадка, полученного на стадии (d), в воде и облучения ультрафиолетовым светом с длиной волны 254 нм и мощностью 4-40 Вт в течение периода времени 10 секунд – 8 минут и
(f) лиофилизации раствора, полученного на стадии (е), в присутствии спирта с получением дальтепарина натрия в форме свободнотекучего порошка.
2. Способ по п. 1, в котором деполимеризацию осуществляют при рН в диапазоне 2,0-4,0.
3. Способ по п. 1, в котором кислота представляет собой соляную кислоту, уксусную кислоту или серную кислоту.
4. Способ по п. 1, в котором восстановителем является борогидрид натрия, борогидрид калия или борогидрид лития.
5. Способ по п. 1, в котором восстановление осуществляют при комнатной температуре в течение периода примерно 1,0–3,0 часа.
6. Способ по п. 1, в котором лиофилизацию осуществляют путем добавления спирта к раствору дальтепарина натрия, полученному на стадии (е).
7. Способ по п. 6, в котором спирт находится в концентрации 5-15 об.% относительно воды, используемой на стадии (е).
8. Способ по п. 6 или 7, в котором спирт представляет собой этанол.
9. Способ получения дальтепарина натрия, включающий стадии:
(а) деполимеризации гепарина натрия в растворе в присутствии 2,5-3,1 мас.% нитрита натрия относительно гепарина натрия в присутствии соляной кислоты при рН 2-4 и температуре 5-10°С,
(b) восстановления продукта, полученного на стадии (а), с использованием 1,5-2,0 эквивалентов борогидрида натрия с получением сырого дальтепарина натрия,
(с) извлечения сырого дальтепарина натрия, полученного на стадии (b),
(d) перемешивания сырого продукта, полученного на стадии (с), в смеси растворителей с получением осадка дальтепарина натрия,
(е) растворения осадка, полученного на стадии (d), в воде и облучения ультрафиолетовым светом с длиной волны 254 нм и мощностью 4-40 Вт в течение периода времени 10 секунд – 8 минут и
(f) лиофилизации раствора, полученного на стадии (е), в присутствии спирта с получением дальтепарина натрия в форме чистого порошка с содержанием N-NO менее 10 ч./млн.
10. Способ получения дальтепарина натрия, включающий стадии:
(а) деполимеризации гепарина натрия в растворе в присутствии 2,5-3,5 мас.% нитрита натрия относительно гепарина натрия в присутствии соляной кислоты при рН 2-4 и температуре 5-10°С,
(b) восстановления продукта, полученного на стадии (а), с использованием 1,5-2,0 эквивалентов борогидрида натрия и получения сырого дальтепарина натрия,
(с) извлечения сырого дальтепарина натрия, полученного на стадии (b),
(d) перемешивания сырого продукта, полученного на стадии (с), в смеси растворителей с получением осадка дальтепарина натрия,
(е) растворения осадка дальтепарина натрия, полученного на стадии (d), в воде и облучения ультрафиолетовым светом с длиной волны 254 нм и мощностью 4-40 Вт в течение периода времени 10 секунд – 8 минут и
(f) лиофилизации раствора, полученного на стадии (е), в присутствии спирта с получением дальтепарина натрия в форме свободнотекучего порошка,
где указанный способ не включает каких-либо стадий хроматографической очистки.
11. Способ по любому из пп. 1-10, в котором УФ-облучение осуществляют в фотохимическом реакторе непрерывного действия, в который интегрированы одна или несколько УФ-ламп.
