Рекомбинантный ангиогенин в косметических и фармацевтических композициях

Группа изобретений относится к области медицины, к уходу за кожей, лечению травм и поражений тканей. Способ применения композиции на основе рекомбинантного ангиогенина для ухода за кожей, в котором в качестве композиции использован состав, содержащий дерматологически приемлимый носитель, консерванты, масла, эмоленты, эмульгаторы, структурообразователи и поверхностно-активные вещества и, непосредственно, рекомбинантный ангиогенин, при этом содержание рекомбинантного ангиогенина в составе композиции составляет от 0,1 до 20 мкг/мл, включает в себя следующие этапы: механическое нанесение на объект эффективного количества композиции, оставление композиции на объекте в течение от 20 минут до 10 часов, с периодичностью повторений 2 раза в сутки на протяжении не менее 15 суток. Также раскрыт другой вариант способа применения композиции на основе рекомбинантного ангиогенина для ухода за кожей. Группа изобретений обеспечивает получение стойкого выраженного лечебного и/или косметического эффектов в результате применения композиций. 2 н.п. ф-лы, 2 табл., 5 пр.

 

Заявляемая группа изобретений относится к области медицины и может быть использована самостоятельно, либо в составе косметических и фармацевтических композиций для ухода за кожей, лечения травм и поражений тканей.

Известен ангиогенин, или РНКаза5 - растворимый секретируемый негликозилированный белок с молекулярной массой 14 кДа, состоящий из 124 аминокислотных остатков, обладающий уникальной рибонуклеазной активностью. Он играет важную роль в ангиогенезе, стимулируя эндотелиальные клетки к образованию новых сосудов.

Использование ангиогенина в медицинских целях известно специалистам в данной области. Ангиогенин вызывает большой интерес как полифункциональный терапевтический белок, в частности, его применяют для стимуляции репарационных процессов, при заболеваниях, связанных с нарушением кровообращения.

Известен способ стимуляции диффенцировки мышечных клеток в мышечные трубочки (см. патент № RU 2519645, МПК A61K 38/19; A61P 21/00, опубл. 20.06.2014 г.), включающий введение эффективного количества ангиогенина. Эффект достигается за счет обеспечения ангиогенином роста и нормализации функции мышечной ткани.

Известно лечебное средство (см. заявку на патент № RU 2004135768, МПК A61K 9/06, опубл. 20.05.2006 г.), включающее основу в виде водорастворимого полимерного геля и рекомбинантный химерный белок ангиогенина человека при его концентрации в составе 0,5-1000 мкг/мл. При этом ангиогенин представляет собой генно-инженерный продукт, полученный культивированием бактерии Escherichia coli и штамм BL21(DE3) pZZSA, выделенный из культуральной жидкости с использованием методов хроматографии.

Известен способ лечения злокачественных новообразований с помощью ангиогенина или агониста ангиогенина (см. заявку на патент № RU 2014149807, МПК A61K 38/17, опубл. 10.07.2016 г.). Противоопухолевый эффект заключается в снижении опухолевого объема и массы, снижении опухолевой неоваскуляризации. Предлагается употреблять лекарство на его основе в виде экстракта молока, обогащенного ангиогенином.

Известен рекомбинантный химерный белок ангиогенина человека ZZ-ANG (см. патент RU 2658758, МПК C12N 1/19, C12N 15/63, C12N 15/81, опубл. 22.06.2018 г.), состоящий из аминокислотной последовательности двух IgG-связывающих доменов белка A (SEQ ID NO: 2) и ангиогенина человека (SEQ ID NO: 3), соединенных между собой пептидным линкером (SEQ ID NO: 4), полученный секрецией рекомбинантной плазмиды pPICZaA:ZZ-ANG, продуцентом которого является штамм дрожжей Pichia pastoris X-33/pPICZaA:ZZ-ANG, полученный путем трансформации дрожжей Pichia pastoris X-33 линеаризованной плазмидой pPICZaA:ZZ-ANG.

Задачами заявляемой группы изобретений являются создание композиции на основе химерного белка ангиогенина с целью применения в составе косметических средств, фармацевтических средств или медицинских изделий, применение которых обеспечивает широкий диапазон полезных эффектов при уходе за кожей, слизистыми оболочками, в терапии восстановления тканей.

Техническими результатами, достигаемыми при реализации заявленных изобретений, являются получение стойкого выраженного лечебного и/или косметического эффектов в результате применения композиций, обладающих заявляемыми составами. Стойкий эффект может выражаться в полном излечении и сохранении этого состояния навсегда (заживление обработанной раны, выравнивание рубцов и др.) либо в устранении эстетического дефекта кожи и сохранении достигнутого состояния в течение одного года и более с момента прохождения процедур с применением ангиогенина (выравнивание морщин, улучшение тонуса кожи, повышение упругости и т.д.).

Технические результаты достигаются за счет того, что композиция на основе рекомбинантного ангиогенина содержит дерматологически приемлемый носитель, консерванты, масла, эмоленты, эмульгаторы, структурообразователи и поверхностно-активные вещества и, непосредственно, рекомбинантный ангиогенин, при этом содержание рекомбинантного ангиогенина в составе композиции составляет от 0,1 до 20 мкг/мл.

Кроме того, композиция на основе рекомбинантного ангиогенина может содержать дополнительные компоненты, в качестве которых выступают увлажнители, УФ-поглотители, аминокислоты, пептиды, полисахариды, антиоксиданты, средства, замедляющие старение, витамины, экстракты, красители, кислоты, щелочи, ферменты, белки, неорганические соли.

Настоящая группа изобретений объединяет следующее.

Композиция на основе рекомбинантного ангиогенина, содержащая дерматологически приемлемый носитель, консерванты, масла, эмоленты, эмульгаторы, структурообразователи и поверхностно-активные вещества и, непосредственно, рекомбинантный ангиогенин, при этом содержание рекомбинантного ангиогенина в составе композиции составляет от 0,1 до 20 мкг/мл.

Композиция на основе рекомбинантного ангиогенина по п. 1, отличающаяся тем, что содержит дополнительные компоненты, в качестве которых выступают увлажнители, УФ-поглотители, аминокислоты, пептиды, полисахариды, антиоксиданты, средства, замедляющие старение, витамины, экстракты, красители, кислоты, щелочи, ферменты, белки, неорганические соли.

Способ применения композиции на основе рекомбинантного ангиогенина, включающий в себя следующие этапы:

- механическое нанесение на объект эффективного количества композиции,

- оставление композиции на объекте в течение от 20 минут до 10 часов,

с периодичностью повторений 2 раза в сутки на протяжении не менее 15 суток.

Способ применения композиции на основе рекомбинантного ангиогенина, заключающийся в интрадермальном внутрикожном введении композиции путем множественных внутридермальных микроинъекций с интервалом между вколами от 2 до 4 мм, с диаметром папулы 1-2 мм, объемом папулы 0,01-0,02 мл, с введением иглы под углом 45° к поверхности кожи, состоящем из не менее чем 4-х повторений внутрикожного введения, осуществляемых с интервалом от 5 до 7 суток между ними.

Способ применения композиции на основе рекомбинантного ангиогенина, заключающийся во внутрисуставном инъекционном введении композиции в объеме 2 мл в синовиальную полость сустава не менее чем 3-5 раз с интервалом от 5 до 7 суток.

В материалах данной заявки под термином «композиция» понимается дерматологически приемлемый носитель, а также активное действующее вещество - рекомбинантный ангиогенин предпочтительно в концентрации 0,1-20 мкг/мл и дополнительные компоненты. Композиция применяется для улучшения внешнего вида и состояния кожных покровов, может быть применена как для наружного нанесения на пораженный участок кожи, так и для нанесения на поврежденные поверхности слизистых оболочек, возможно также применение композиции в виде микроинъекций в область повреждения кожи или слизистых оболочек, в виде инъекций и инфузионных растворов, в виде инъекций в синовиальную сумку сустава.

Композиция проявила себя эффективной при лечении и заживлении ран и ожогов различной этиологии. Например, воспалительный дерматоз, акне, трофические язвы, стоматологические раны слизистых оболочек, фурункулы, сухость кожи и т.д. Композиция в составе гиалуроновых гелей проявила себя эффективной для восстановления суставов.

Обозначение «кожа/кожные покровы» в данном документе относится к любым участкам кожи, в том числе эпидермису, дерме, волосам, ногтям, кожным железам и т.д.

Под «дерматологически приемлемым носителем» в настоящем контексте обозначены один или несколько жидких, полутвердых или твердых растворителей, совместимых с рекомбинантным ангиогенином, а также с другими активными действующими веществами и дополнительными компонентами, подходящими для несения на любые участки кожи и слизистых оболочек либо для введения в кожу, суставы и ткани слизистых оболочек.

В качестве таких носителей, помимо прочих, могут быть применены растворители: дистиллированная вода, дипропиленгликоль, пропиленгликоль, пентиленгликоль, глицерин, диметилизосорбит, каприлгликоль, триглицериды каприлик/каприк, сорбитол, полиэтиленоксид, С 12-15 алкил бензоат, бутиленгликоль, минеральное масло, диметикон, пропандиол, изопропиловый спирт.

В качестве консервантов, помимо прочего, могут применяться феноксиэтанол, этилгексилглицерин.

В качестве масел, помимо прочего, могут применяться: масло ши, масло макадамии, масло миндаля, масло кедра, масло бабасу, масло кокоса, масло какао, эквивалент масла-какао, масло оливы, масло кедрового ореха, масло зародышей пшеницы масло пальмоядровое, масло виноградной косточки, масло кунжута, масло арганы, масло облепихи, масло жожоба, масло рисовых отрубей, масло семян черной смородины, масло авокадо, масло лавра, масло ним, масло моной, масло грецкого ореха, масло инка-инчи, масло подсолнечника, масло сливовой косточки, эфирное масло грейпфрута, эфирное масло чайного дерева, эфирное масло монарды, эфирное масло герани, эфирное масло апельсина, эфирное масло литсеи кубеба, эфирное масло эвкалипта.

В качестве эмолентов, помимо прочего, могут применяться: этилгексил оливат, изононил изононаноат, дикаприлил карбонат, С12-15 алкил бензоат.

В качестве эмульгаторов, помимо прочего, могут применяться: полисорбат 20, сополимер акрилатов натрия, лецитин, цетилгидроксиэтилцеллюлоза, цетеарил сульфосукцинат натрия, гидроксиэтилакрилат, сополимер акрилоилдиметилтаурата натрия, полиакрилат натрия, ксантановая камедь, гидроксиэтилцеллюлоза, гидроксипропилметилцеллюлоза, пуллулан, октилдодеканол, октилдодецил ксилозид, ПЭГ-30 диполигидроксистеарат.

В качестве структурообразователей, помимо прочего, могут применяться: воск, стеариновая кислота, крахмал кукурузный, крахмал тапиоки, рисовый крахмал, глина желтая, глина косметическая quercus, стеариновая кислота, цетеариловый спирт, гликоль дистеарат, ланолин, янтарная пудра, крапива сухая, сукрагель.

В качестве поверхностно-активных веществ, помимо прочего, могут применяться: кокоил глутамат натрия, кокоил глицинат натрия, C8-14 алкилглюкозид, кокоил изетионат натрия, эфир лимонной кислоты, эфир этоксилата лаурилового спирта.

Композиции настоящего изобретения могут содержать дополнительные компоненты. Такие дополнительные компоненты обычно используются индивидуально в объеме от 0,005 до 1% относительно веса всей композиции.

Дополнительными компонентами выступают увлажнители, УФ-поглотители, аминокислоты, пептиды, полисахариды, антиоксиданты, средства, замедляющие старение, витамины, экстракты, красители, кислоты, щелочи, ферменты, белки, неорганические соли.

В качестве увлажнителей, помимо прочего, могут использоваться: мочевина, алоэ, лактаты (соли молочной кислоты), аллантоин, Д-пантенол.

В качестве УФ-поглотителей, помимо прочего, могут использоваться: диоксид титана, оксид цинка, этилгексилметоксикиннамат, октокрилен, этилгексил салицилат, бутилметоксидибензойлметан, бензофенон-3.

В качестве аминокислот, помимо прочего, могут использоваться: глицин, аланин, пролин, аргинин, лизин, серин, треонин, глутаминовая кислота, бетаин, изолейцин, цистеин, тирозин, глутамин, аспарагиновая кислота.

В качестве пептидов, помимо прочего, могут использоваться: ацетилтетрапептид-33, ацетилгексапептид-8, трипептид меди, диффупорин, ацетилтетрапептид-3, пальмитоил олигопетид (глицин-гистидин-лизин), ацетил тетрапептид -15, серные пептиды, N-ацетил-тирозил-аргинил-О-гексадециловый эфир пальмитоил, гексапептид-12, ацетил-дипептид-13, ацетилтетрапептид-5, карнозин, пентапептид-25, пальмитоил тетрапептид-7.

В качестве полисахаридов, помимо прочего, могут использоваться: сахарида изомерат, ксилитилглюкозид, ангидроксилитол, ксилит, L-фукоза, D-галактоза, галактуроновая кислота, бета глюкан овса, каррагинан, глюкоза, пектин, инулин, альфа-глюкановый олигосахарид, хитозан (сукцинат).

В качестве замедляющих старение средств, помимо прочего, могут использоваться: антиоксиданты - витамин Е, дигидрокверцетин, липоевая кислота, ресвератрол; витамины - комплекс провитамина В5, витамина РР, витамина С, витамин А, витамин F; прочие вещества - натрия гиалуронат полиглюкуроновая кислота, гиалуроновая кислота, полидезоксирибонуклеотиды, диметиламиноэтанол, церамид, коэнзим А, кофеин, троксерутин, фитостеролы; растительные экстракты - гидролизованный дрожжевой экстракт, экстракт арники горной, экстракт гаммамелиса, экстракт эдельвейса альпийского, экстракт петрушки, экстракт корицы (кора), экстракт облепихи (плоды), экстракт амаранта (зерно), экстракт липы (цвет), экстракт брусники, экстракт подорожника, мелиссы, чабреца, ромашки, экстракты сигезбекии, шелкового дерева персидского, экстракты пории и тростника, экстракт морской ромашки, комплекс экстрактов (центеллы азиатской, коры шелковичного дерева, яблока, клевера треугольного, листьев камелии коры бумажного дерева, цветов камелии японской), экстракт из цветков маргаритки многолетней, экстракт эхинацеи, экстракт ромашки, экстракт календулы, экстракт прополиса, экстракт шалфея, экстракт душицы, экстракт ананаса, экстракт магнолии, экстракт стволовых клеток коры дуба, плацентарный экстракт, экстракт мимозы, экстракт кровохлебки лекарственной, имбиря, корицы, экстракт клопогона кистеневидного, экстракт горца японского, экстракт сои, экстракт граната, экстракт клевера лугового, экстракт пуэрарии дольчатой, экстракт пуэрарии мирифика, экстракт горичника ниспадающего, экстракт ламинарии, экстракт гуараны, экстракт красного перца, экстракт окопника, экстракт зверобоя, экстракт тысячелистника, экстракт зеленого чая, экстракт спирулины, экстракт морского нарцисса, экстракт хлореллы, донника сухой экстракт, экстракт василька, экстракт candida saitoana, экстракт фукус (водоросли), экстракт конского каштана (лист), экстракт хвоща (трава), экстракт плюща (побеги), экстракт кофе (зерна), экстракт мучели (рисовая мучка), экстракт лимона (цедра), экстракт яблока, экстракт винограда, экстракт лопуха.

В качестве кислот, помимо прочего, могут использоваться: гликолевая кислота, молочная кислота, салициловая кислота, феруловая кислота, азелаиновая кислота, пировиноградная кислота, миндальная кислота, лимонная кислота.

В качестве щелочей, помимо прочего, могут использоваться гидроксид натрия, гидроксид калия, гидроксид магния.

В качестве ферментов, помимо прочего, могут использоваться папаин, бромелайн, липаза, амилаза, кератиназа, супероксиддисмутаза.

В качестве подходящих протеинов, помимо прочего, могут использоваться: гидролизованный пшеничный белок, гидролизованный соевый белок, коллаген.

В качестве неорганических солей, помимо прочего, могут использоваться: хлорид натрия, сульфат магния, соли цинка, бикарбонат натрия, хлорид магния, динатрия гидрофосфат додекагидрат.

В заявляемом изобретении изготовление композиции осуществляют любыми известными способами. Указания по приготовлению композиций для настоящего изобретения можно найти в справочнике: Ремингтон: «Наука и практика фармацевтики», 20-е изд. («Remington: The science and practice of pharmacy», 20th ed. Mack Publishing, Easton PA, 2000 ISBN 0-912734-04-3), а также в «Энциклопедии фармацевтической технологии» («Encyclopaedia of Pharmaceutical Technology», под ред. Swarbrick, J.&J.C Boylan, Marcel Dekker, Inc., New York, 1988 ISBN 0-8247-2800-9 или в более свежей редакции).

Композиция может быть в форме крема, геля, мази, пасты, маски, сыворотки, тоника, скраба, пилинга, шампуня, геля для душа, бальзама для тела, бальзама для волос, средства для ополаскивания рта, спрея, раствора для инъекций и инфузий.

Композиции могут применяться в изделиях медицинского назначения, например, но, не ограничиваясь, в пластырях или повязках, гиалуроновых гелях.

Также технические результаты достигаются тем, что способ применения композиции на основе рекомбинантного ангиогенина включает в себя следующие этапы:

- механическое нанесение на объект эффективного количества композиции,

- оставление композиции на объекте в течение от 20 минут до 10 часов,

с периодичностью повторений 2 раза в сутки на протяжении не менее 15 суток.

В тексте данной заявки термин «объект» означает поверхности (кожи, волос или ногтей), подвергаемые воздействию композиции.

Также технические результаты достигаются тем, что способ применения композиции на основе рекомбинантного ангиогенина заключается в интрадермальном внутрикожном введении композиции путем множественных внутридермальных микроинъекций с интервалом между вколами от 2 до 4 мм, с диаметром папулы 1-2 мм, объемом папулы 0,01-0,02 мл, с введением иглы под углом 45° к поверхности кожи, состоящем из не менее, чем 4-х повторений внутрикожного введения, осуществляемых с интервалом от 5 до 7 суток между ними.

Введение композиции в среднюю часть кожи (дерму) позволяет легко проникнуть во внутренние слои кожи и доставить непосредственно во внеклеточное тканевое вещество препараты, необходимые для активизации метаболических процессов. Такой способ воздействия обеспечивает наилучшее распределение препарата, а вместе с нанесением локальной микротравмы (физической стимуляции) создает наиболее благоприятные условия для активации клеточного метаболизма и регенерации кожи. Достигаемое при применении такого способа пролонгированное действие препарата (замедление поступления вещества в кровоток) осуществляется за счет вариаций его концентраций.

Также технические результаты достигаются тем, что способ применения композиции на основе рекомбинантного ангиогенина заключается во внутрисуставном инъекционном введении композиции, состоящем из не менее, чем 3-5ти повторений внутрисуставного инъекционного введения, осуществляемых с интервалом от 5 до 7 суток между ними, объем однократной инъекции - 2 мл.

Введение композиции внутрисуставно позволяет устранить повреждения различной этиологии: наследственность, механические травмы суставного аппарата, возрастные изменения, эндокринные патологии, повышенные нагрузки, переохлаждение, воспалительные заболевания суставов и прочие. В результате применения способа происходит снижение выраженности болевого синдрома либо устранение его полностью, возвращение подвижности сустава, восстановление объема суставной синовиальной жидкости.

Химерный белок ангиогенина, полученный, в частности, экспрессией в дрожжах Pichia pastoris рекомбинантной плазмиды pPICZaA:ZZ_ANG, обладает специфической высокой ангиогенной активностью и свойствами, наиболее оптимальными для использования в косметических, лечебных средствах и медицинских изделиях, как для наружного, так и для инъекционного применения.

Устойчивый эффект применения композиции обусловлен свойством ангиогенина стимулировать рост капилляров, вследствие чего происходит восстановление в короткие сроки эффективности работы фибробластов путем улучшения кровоснабжения и питания соединительной ткани, ускорение естественного процесса обновления клеток, дальнейшее глубокое проникновение действующих веществ.

Применение косметической композиции, содержащей ангиогенин с концентрацией 0,1-20 мкг/мл характеризуется высокой эффективностью в улучшении состояния кожных покровов и/или волос и/или слизистых оболочек. Опытным путем было выявлено, что использование в составе средств данного назначения концентрации ангиогенина менее 0,1 мкг/мл не привело к видимому результату. При этом, содержание в составе средства ангиогенина с концентрацией более 20 мкг/мл является нецелесообразным, так как дальнейшее увеличение концентрации уже не приводит к пропорциональному увеличению эффективности воздействия, кроме того влечет значительное удорожание композиции.

Применение композиции, содержащей ангиогенин с концентрацией 0,5-20 мкг/мл характеризуется высоким ранозаживляющим и антибактериальным эффектом, что является его преимуществом в использовании в средствах подобного назначения. Опытным путем было выявлено, что использование в составе средств данного назначения концентрации ангиогенина менее 0,5 мкг/мл не повлияло на ускорение заживления. При этом, основываясь на теоретических данных, удалось сделать вывод, что содержание в составе средства ангиогенина с концентрацией более 20 мкг/мл, является нецелесообразным, так как дальнейшее увеличение концентрации уже не приводит к пропорциональному увеличению эффективности воздействия, кроме того влечет значительное удорожание композиции.

Для использования по назначению производят включение ангиогенина в соответствующую композицию, химический состав и консистенция которой зависит от вида, назначения и способа применения композиции.

Состав композиций, а именно, значение концентрации в них химерного белка ангиогенина был разработан, в частности, на основании экспериментальных данных. Результаты (в обобщенном виде) были занесены в Таблицу.

	Средства	Действие	Концентрация в продукте	Основание
Косметика	кремы, гели, маски, сыворотки тоники, скрабы, шампуни и гели для душа, бальзамы для тела и волос, бальзамы для ополаскивания рта	улучшает состояние кожных покровов, нормализует микрофлору кожи и волос, а также слизистых	концентрация ангиогенина в средствах 0,1-5 мкг/мл	экспериментальные данные
Мезотерапия	раствор, в составе гиалуронового геля, коктейля аминокислот витаминов и пептидов в различной их комбинации	в качестве базового набора входящих в состав аминокислот, улучшает питание тканей	концентрация ангиогенина в средствах 0,5-5 мкг/мл	экспериментальные данные
Изделия медицинского назначения для наружного применения	пластыри, повязки, гели, кремы и мази укрывающие, гели кремы, мази и пасты стоматологические и дентальные	нормализует микрофлору раны, антибактериальный эффект	концентрация ангиогенина в средствах 0,5-20 мкг/мл	экспериментальные данные
Наружные фармацевтические препараты	гели кремы и мази ранозаживляющие, ранозаживляющие повязки	нормализует микрофлору раны, антибактериальный эффект, ранозаживляющий эффект	концентрация ангиогенина в средствах 5-20 мкг/мл	экспериментальные данные
Инъекционные лекарственные формы	раствор, в составе гиалуронового геля и без него, в составе коктейля аминокислот витаминов и пептидов в различной их комбинации, инфузионные растворы	стимуляция неоваскуляризации, питание тканей необходимыми аминокислотами	концентрация ангиогенина в средствах 0,5-20 мкг/мл	экспериментальные данные

С целью демонстрации изобретения ниже приводятся примеры, которые только иллюстрируют изобретение, не ограничивая его масштаб.

Применение косметической композиции в косметических средствах по уходу за кожей для наружного применения.

Пример 1

Женщина, 49 лет. В результате предварительного визуального исследования состояния кожи установлены возрастные изменения: глубокие морщины в области глаз, истончение кожи по всему лицу, дряблость, снижение тонуса. Состояние кожи зафиксировано при помощи фотосъемки. Исследование длилось четыре недели. Участница исследования наносила на предварительно очищенную кожу лица, композицию в форме крема с ангиогенином в концентрации 2 мкг/мл. Нанесение осуществлялось ежедневно, утром и вечером, после очищающих процедур. По истечении указанного периода проведены сравнительные исследования состояния кожи лица участницы. Повторное исследование методом сравнения фотоснимков первичного осмотра (до применения композиции) и после окончания исследования показало уменьшение количества морщин в области глаз, уменьшение глубины морщин в носогубной складке, улучшение цвета лица, увеличение тонуса кожи.

Пример 2

Женщина, 23 года, наносила на предварительно очищенную кожу лица, исключая область вокруг глаз, композицию в форме геля с ангиогенином в концентрации 2 мкг/мл. Нанесение осуществлялось дважды в день, утром после умывания и вечером перед отходом ко сну. Перед началом применения проведено исследование состояния кожи пациентки, выявлены многочисленные рубцы после акне, а также развивающиеся элементы угревых воспалений. Состояние кожи зафиксировано на аппарате Antera 3d. В указанном режиме гель наносился на протяжении двух недель. После чего проведено повторное исследование состояния кожи, которое выявило значительное сокращение (более чем на 30%) очагов воспалений, а также видимое выравнивание рубцовой ткани по сравнению с неповрежденными участками кожи. Пациентка продолжила применение средства в том же режиме еще на один месяц. По истечении указанного периода, исследование состояния кожи на аппарате Antera 3d показало сокращение воспалений на 70% к первоначальному уровню, полное заживление части не глубоких рубцов (до 20%), выравнивание цвета постакне до цвета неповрежденных участков кожи, отсутствие новых очагов воспалений

Пример 3

Мужчина, 34 года. Предварительные исследования состояния кожи лица выявили наличие куперозных образований (расширенные капилляры, сосудистые звездочки на носу, на щеках, на подбородке), застойные пятна, значительное покраснение лица. Участник исследования наносил на предварительно очищенную кожу лица, исключая область вокруг глаз, композицию в форме сыворотки с ангиогенином в концентрации 2 мкг/мл. Нанесение осуществлялось дважды в день, утром после умывания и вечером перед отходом ко сну. В указанном режиме сыворотка применялась на протяжении трех недель. После чего проведено повторное исследование состояния кожи, которое выявило значительное сокращение выраженности сосудистой сетки, полное отсутствие новых застойных пятен, уменьшение цветности старых пятен. В целом цвет лица участника исследования стал более здоровым, покраснения сократились. Для фиксации эффекта, укрепления капилляров и повышения сопротивляемости кожи лица внешним воздействиям, участник согласился продолжить применение сыворотки на протяжении одного года. В настоящее время (по истечении шести) месяцев отмечается отсутствие видимости мелких сосудов. Зафиксировано только незначительное количество ранее образовавшихся крупных сосудистых звездочек, которые устраняются только более агрессивными методами воздействия (лазерные процедуры, микроиньекции). Исследование продолжается, пациент будет применять сыворотку еще на протяжении шести месяцев. После чего будут проведены дополнительные исследования и зафиксированы конечные результаты.

Пример 4

Женщина, 37 лет, страдает сухостью кожи, шелушениями, с ухудшением в зимний период. Перед началом исследования при помощи корнеометра установлены показатели гидратации рогового эпидермиса участницы. Исследование проводилось в зимний период, в помещении с центральным отоплением, с температурой воздуха около 23° и влажностью воздуха в помещении не более 25%. Результаты корнеометрии оценивали в условных единицах. Перед началом исследования показатель увлажненности кожи лица участницы составил 8,7 усл. ед. Участница наносила на лицо косметическую композицию в форме крема с ангиогенином в концентрации 4 мкг/мл на протяжении четырех недель, после очищения кожи, дважды в день, утром и вечером. После завершения исследования уровень увлажненности кожи участницы повысился более чем в 8 раз. Показатель увлажненности на момент завершения исследования составил 70,2 усл. ед.

Пример 5

Мужчина 41 год, диагноз: андрогенетическая алопеция (теменная и лобная области). По результатам первичной фототрихоскопии зафиксировано значительное поредение волос (более чем на 50%) по сравнению со здоровыми участками кожи головы. Пациент наносил композицию с ангиогенином в концентрации 4 мкг/мл на сухую кожу головы, в местах наибольшего поредения волос одновременно с массажем. По истечении трех месяцев участник исследования прошел промежуточное исследование. Фототрихоскопия показала увеличение количества волос на 20%. Пациент продолжил лечение еще на три месяца. По результатам фототрихоскопии зафиксировано увеличение волос в пораженных областях более чем на 35%. При этом на здоровых областях головы волосы стали толще, уменьшилась пористость, уменьшилось шелушение.

Применение композиций с ангиогенином в качестве ранозаживляющего и/или антибактериального средства в изделиях медицинского назначения

Пример 1

Пациентка 44 года, с 14 лет страдает сахарным диабетом второго типа. На фоне ангионейропатии образовалась трофическая язва правой стопы. Традиционное, в таких случаях, общее и местное лечение не привело к улучшению. Пациентке грозила ампутация двух пальцев. Регенерирующий крем с ангиогенином в концентрации 20 мкг/мл наносили два раза в сутки на язву и накладывали атравматичную стерильную повязку. К седьмым суткам лечения язва начала очищаться от нежизнеспособных тканей, грануляции приобрели здоровый розовый цвет. Заметна краевая эпителизация раны. Через три недели применения регенерирующего крема трофическая язва практически полностью эпителизовалась. Отпала необходимость в дальнейших хирургических вмешательствах. После выписки из больницы пациентка самостоятельно продолжила наносить регенерирующий крем с ангиогенином на стопу дважды в день. Через четыре недели язва полностью эпителизовалась.

Пример 2

Проведены предварительные клинические испытания на скорость регенерации донорских ран твердого неба. В ходе испытаний применена композиция в форме геля на основе ангиогенина в концентрации 10 мкг/мл. В исследовании приняли участие 20 пациентов в возрасте от 32 до 55 лет, из них 8 мужчин и 12 женщин. Пациенты разделены на две группы: 1-я группа - группа исследования (n=10), пациенты которой в послеоперационном периоде применяли стоматологический гель на основе ангиогенина, 2-я группа - контрольная (n=10), в которой гель на основе ангиогенина человека не применялся. Пациентам в обеих группах исследования проводилась вестибулопластика с одновременной пластикой прикрепленной кератинизированной десны свободным десенным трансплантатом из области твердого неба. Гистологические исследования показали, что местное применение геля, содержащего ангиогенин, приводило к быстрому снижению интенсивности воспаления в собственной пластинке и значимому уменьшению объемной плотности клеточных инфильтратов, ускорению регенерации. В первую очередь это происходило за счет усиления кровоснабжения поврежденной области, стимуляции выработки эпидермального фактора роста (EGF), фактора роста эндотелия сосудов (VEGF), а также за счет уменьшения выраженности местной воспалительной реакции.

Наиболее важным наблюдением стало увеличение скорости эпителизации донорских ран твердого неба. Две группы пациентов с донорскими ранами неба. Первой группе участников исследования на рану была наложена коллагеновая губка, пропитанная регенерирующим гелем с ангиогенином в концентрации 10 мкг/мл, губка зафиксирована на ране компрессионными швами. Второй (контрольной) группе на аналогичную рану аналогичным способом наложена коллагеновая губка без добавления препаратов. Через семь дней у пациентов первой группы определилась краевая эпителизация раны. Воспалительные явления выражены незначительно. У контрольной группы эпителизация практически незаметна. В ране определены выраженные воспалительные явления.

Осмотр через две недели зафиксировал полную эпителизацию раны у пациентов первой группы, у второй группы эпителизация в центре раны отсутствовала.

Далее было проведено микроскопическое исследование тканей. Для светооптического исследования образцы ткани фиксировали в 10% нейтральном водном растворе формалина, обезвоживали в серии этиловых спиртов возрастающей концентрации заключали в парафин. Срезы толщиной 4-5 мкм получали на ротационном микротоме HM355S (Microm, Германия), окрашивали по стандартным методикам гематоксилином и эозином и по Ван Гизон. Полученные гистологические срезы исследовали с помощью микроскопа AxioImagerA1 (Carl Zeiss, Германия). Морфометрический анализ образцов проводили с помощью закрытой тестовой системы из ста точек площадью 3,64×105 мкм².

Микроскопически на седьмые сутки в тканях участников первой группы нейтрофильная инфильтрация выражена незначительно, выявлены умеренные явления отека и дистрофии в эпителии и собственной пластинки слизистой оболочки. Клетки базального слоя не прерываются. Определяются молодые кровеносные сосуды. В тканях пациентов контрольной группы отчетливо заметна выраженная нейтрофильная инфильтрация, значительный отек, клеточная дистрофия. Базальная мембрана прерывиста. Невелико количество молодых кровеносных сосудов.

На четырнадцатые сутки в ткани первой группы выявлены: лимфацитарная инфильтрация, незначительные явления отека собственной пластинки слизистой оболочки. Значительное количество новых коллагеновых волокон в подслизистом слое. Множество молодых кровеносных сосудов. В ткани группы контроля на четырнадцатые сутки по-прежнему определяется выраженная нейтрофильная инфильтрация, выраженный отек и клеточная дистрофия. Базальная мембрана неоднородна. Невелико количество молодых кровеносных сосудов.

Пример 3

Высокую регенерирующую способность композиции в форме геля на основе ангиогенина подтвердили доклинические испытания. В ходе эксперимента моделировали долгозаживающую рану у крыс и использовали композицию с ангиогенином в форме геля (концентрация 20 мкг/мл) и адгезивная стоматологическая паста (не включающая ангиогенин) в качестве контроля. Сравнивали численность клеток эпителия, плотность сосудов седьмые и четырнадцатые сутки. Из результатов гистологического исследования видно, что ангиогенин в составе регенерирующего геля способствует восстановлению клеток и сосудов в два раза эффективнее стоматологической пасты без ангиогенина (см. Таблицу 1 ниже).

Кроме этого анализировали выраженность воспалительной реакции при использовании геля с ангигенином и стоматологической пасты. Из таблицы 2 видно, что ангиогенин оказывает выраженное противовоспалительное действие

Таблица 2 - Выраженность местной воспалительной реакции после адъювантного артрита
	Выраженность местной воспалительной реакции после индукции адъювантного артрита
0	3 с	6 с	9 с	12 с	15 с	18с	21 с
Контроль	0,02±0,04	0,06±0,08	0,02±0,04	0,08±0,08	0,16±0,11	0,1±0,07	0,1±0,07	0,06±0,05
Ангиогенин	-	0,1±0,12	0,14±0,16	0,12±0,10	0,1±0,12	0,08±0,13	0,1±0,1	0,08±0,08
Стоматологическая паста	0,02±0,04	0,02±0,04	0,04±0,05	0,25±0,05	0,25±0,05	0,25±0,05	0,25±0,05	0,25±0,0

Пример 4

Мужчина, 61 год, страдает пародонтозом на протяжении тридцати лет. На момент начала исследования зафиксированы симптомы: бледность десен, неприятный запах изо рта, расшатывание двух зубов, боль в области десен, кровоточивость во время чистки зубов и пережевывания пищи. Пациенту назначены аппликации (марлевые салфетки, смоченные композицией с ангиогенином в концентрации 10 мкг/мл) 1 раз в день в течение 20 минут на нижнюю правую часть челюсти и полоскание ротовой полости водным раствором композиции в концентрации 5 мл композиции на 50 мл теплой кипяченой воды после каждого приема пищи, утром и вечером после чистки зубов. Лечение проводилось в течение двух месяцев. Первые улучшения пациент отметил через семь дней: обозначил значительное снижение болевых ощущений во время приема пищи. Через месяц после начала лечения проведено повторное исследование. По всей полости рта отмечено насыщение десен цветом, что свидетельствует об улучшении кровообращения. Пациент обозначил практически полное отсутствие неприятного запаха изо рта. В месте, где проводились аппликации зафиксировано полное отсутствие кровоточивости, начавшееся восстановление плотности десны вокруг шатающегося зуба. Пациенту продолжена терапия согласно плану лечения. По истечении двух месяцев от начала лечения отмечено значительное уменьшение кровоточивости по всей поверхности десен, десна, попадающие под аппликации полностью перестали кровоточить. Неприятный запах изо рта полностью исчез. Десны приобрели здоровый цвет. Десны в месте наложения аппликаций полностью здоровы, без признаков воспаления, рыхлости.

Пример 5

Женщина, 58 лет, остеоартроз коленного сустава, второй степени, заболевание зафиксировано при проведении магнитно-резонансной томографии. Пациентке вводилась внутрисуставно композиция в форме гиалуронового геля с ангигенином в концентрации 10 мкг/мл. Инъекции вводились с интервалом 7 суток, всего проведено 4 процедуры. По окончании курса процедур проведено повторное магнитно-резонансное исследование. В результате выявлено полное восстановление объема суставной синовиальной жидкости, восстановление ее вязкоэластичных свойств. Пациентка отметила устранение хруста сустава, значительное снижение выраженности болевого синдрома. Для поддержания эффекта пациентке рекомендовано повторение курса инъекций ежегодно.

Пример 6

Проведено исследование оценки эффективности лечения ишемии конечностей на кроликах. Исследование проводилось на 20 кроликах одной породы, одинакового возраста. Всем животным искусственно сформирована 2,5 месячная ишемия конечности. На протяжении одного месяца одной (основной) группе животных на стороне сформированной ишемии ежедневно вводилась композиция с ангиогенином в концентрации 10 мг/мл, в контрольной группе - вводился физраствор. Эффективность лечения оценивалась путем исследования гистологического материала, забор которого осуществлялся еженедельно. На полученных образцах проводилась визуальная морфологическая оценка и морфометрия с определением объемной плотности капилляров в мышечной ткани. В контрольной группе изменений уровня плотности капилляров в мышечной ткани за время исследования не изменились. В основной группе отмечено нарастание объемной плотности капилляров в мышечной ткани с 0,00690±0,00015 в начале исследования до 0,011±0,001 к концу первой недели введения композиции с ангиогенином. К концу второй недели исследования уровень плотности капилляров превысил доишемический (0,013±0,001) и достиг показателя 0,015±0,001. Результаты исследования позволили сделать вывод, о том, что применение ангиогенина при ишемии конечностей является эффективным методом лечения, поскольку стимулируется формирование новых капилляров за счет чего улучшается питание тканей.

Использование композиций на основе ангиогенина для интрадермального введения

Пример 1

Был проведен цикл научно-исследовательских работ по исследованиям ангиогенной активности, токсичности и биосовместимости косметического средства на основе ангиогенина для микроинъекций. В условиях эксперимента лабораторным животным - крысам линии «Вистар» вводили исследуемый препарат на основе ангиогенина и эталонный препарат производителя «Эй Би Джи ЛАБ ЛЛК», США. По результатам введения анализировали морфологические характеристики рогового слоя и эпителия. Трехкратное введение композиции на основе ангиогенина (концентрация 2-4 мкг/мл) приводило к более значительному утолщению рогового слоя, увеличению количества фибробластов, сосудов дермы и объемной плотности коллагеновых волокон, чем введение препарата другого производителя.

Пример 2

Женщина, 57 лет, на лице в области глаз, носогубной складки, на лбу ярко выраженные возрастные изменения (морщины, глубокие заломы), пигментация, сухость, дряблость. Проведена диагностика аппаратом Antera 3d. Снимки с аппарата сохранены для дальнейшего сравнения. Проведен курс мезотерапии, участнице исследования вводили косметическую композицию в с ангиогенином в концентрации 5 мкг/мл. Первые результаты использования пациентка отметила уже после второй процедуры. Отмечалось видимое улучшение внешнего вида кожи: уменьшение выраженности морщин, сглаживание рельефа. Всего было введено пять доз препарата с промежутком две недели между введениями. После прохождения курса было проведено сравнительное исследование на аппарате Antera 3d. Результатом применения косметической композиции стало значительное уменьшение глубины морщин в межбровной области, полное исчезновение морщин на лбу, в носогубной области. Кожа в указанных областях подтянулась, стала более упругой, вернулся тонус.

Пример 3

Мужчина, 35 лет, первичные признаки андрогенетической алопеции (поредение волос в теменной области, истончение имеющихся волос до эффекта «просвечивания» кожи сквозь волосы). Состояние волос на начало исследования зафиксировано методом простой фотофиксации. Пациенту проведен курс мезотерапии: вводили косметическую композицию с ангиогенином в концентрации 5 мкг/мл, на участке кожи 5*5 см. Препарат вводили методом срединный наппаж (иглу с наклоном 45° вводится на глубину 1,5 мм срезом вверх, прокалывая дерму, интервал инъекций - до 1,5 см.). Всего было проведено пять процедур введения с интервалом между процедурами от семи до десяти дней. Повторное визуальное исследование показало, полное восстановление состояния волос до состояния здоровых участков головы. Теменная область полностью слилась по внешнему виду с остальной частью волосяного покрова головы.

Пример 4

Женщина, 27 лет, на животе и бедрах многочисленные послеродовые стрии (растяжки), с даты родов прошло 4,5 месяца, грудное вскармливание прекращено. Состояние кожи зафиксировано методом простой фотофиксации. Пациентке вводилась композиция (в форме мезококтейля) с ангигенином в концентрации 5 мкг/мл. Введение проводилось на протяжении десяти процедур, с промежутком семь дней между процедурами. Введение осуществлялось мультипунктурным методом (препарат вводился в дерму точечными уколами, непрерывной линией, активным веществом пропитывалась стрия по всей длине). По завершении курса процедур неглубокие и менее выраженные стрии исчезли полностью, первоначально ярко выраженные и синюшные утратили яркость, выровнялись по цвету с соседними участками кожи, на коже остались видны лишь незначительные изменения структуры в этом месте.

Пример 5

Женщина, 21 год, на щеках единичные глубокие рубцы от постакне. Пациентке проведен курс лечения из 11 процедур с интервалом между процедурами четырнадцать дней. Инъекции композиции в форме мезококтейля с ангиогенином в концентрации 0,5 мкг/мл вводились на глубину 2-4 мм непосредственно в рубец и под него. Всего проведено 10 процедур с интервалом семь дней между процедурами. По завершении курса рубцы полностью выровнялись со здоровыми участками кожи.

Таким образом, при нанесении на поврежденные участки эпидермиса заявляемой композиции происходит пролиферация сосудов эпидермиса, что влечет ускоренное заживление поражений, улучшение микроциркуляции крови в тканях. В случаях нанесения на неповрежденные участки эпидермиса композиции происходит улучшение состояния кожи, увеличение ее упругости, увлажненности, уменьшение признаков старения кожи.

Таким образом, при нанесении на поврежденные участки эпидермиса заявляемой композиции происходит пролиферация сосудов эпидермиса, что влечет ускоренное заживление поражений, улучшение микроциркуляции крови в тканях. В случаях нанесения на неповрежденные участки эпидермиса композиции происходит улучшение состояния кожи, увеличение ее упругости, увлажненности, уменьшение признаков старения кожи.

Также отмечено, полное отсутствие проявления побочных эффектов за все время проведения исследований с применением препаратов с ангиогенином.

Использование ангиогенина в составе приводит в том числе, но не исключительно, к ускорению эпителизации ран, снижению или предотвращению образования рубцов, в том числе после акне и хирургических вмешательств, улучшению состояния кожи, увеличению упругости кожи, разглаживанию морщин, замедлению процессов старения, повышению выработки кожей коллагена и эластина, увеличению плотности кожи.

1. Способ применения композиции на основе рекомбинантного ангиогенина для ухода за кожей, в котором в качестве композиции использован состав, содержащий дерматологически приемлемый носитель, консерванты, масла, эмоленты, эмульгаторы, структурообразователи и поверхностно-активные вещества и, непосредственно, рекомбинантный ангиогенин, при этом содержание рекомбинантного ангиогенина в составе композиции составляет от 0,1 до 20 мкг/мл, включающий в себя следующие этапы:

- механическое нанесение на объект эффективного количества композиции,

- оставление композиции на объекте в течение от 20 минут до 10 часов,

с периодичностью повторений 2 раза в сутки на протяжении не менее 15 суток.

2. Способ применения композиции на основе рекомбинантного ангиогенина для ухода за кожей, в котором в качестве композиции использован состав, содержащий дерматологически приемлемый носитель, консерванты, масла, эмоленты, эмульгаторы, структурообразователи и поверхностно-активные вещества и, непосредственно, рекомбинантный ангиогенин, при этом содержание рекомбинантного ангиогенина в составе композиции составляет от 0,1 до 20 мкг/мл, заключающийся в интрадермальном внутрикожном введении композиции путем множественных внутридермальных микроинъекций с интервалом между вколами от 2 до 4 мм, с диаметром папулы 1-2 мм, объемом папулы 0,01-0,02 мл, с введением иглы под углом 45° к поверхности кожи, состоящем из не менее чем 4-х повторений внутрикожного введения, осуществляемых с интервалом от 5 до 7 суток между ними.