Способ коррекции микробиома кишечника для повышения резистентности организма рыб

Авторы патента:

Мирошникова Елена Петровна (RU)

Аринжанов Азамат Ерсаинович (RU)

Килякова Юлия Владимировна (RU)

Аринжанова Мария Сергеевна (RU)

A23K50/80 - Корма

Владельцы патента RU 2785408:

Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Оренбургский государственный университет" (RU)

Изобретение может быть использовано при выращивании рыбы. Способ включает скармливание комбикорма, тонкий слой которого опрыскивают пробиотическим препаратом «Соя-бифидум» в количестве 0,7 мл/кг корма. Изобретение позволяет нормализовать микробиоценоз кишечника рыб. 3 табл.

Изобретение относится к сельскому хозяйству, а именно к рыбоводству и может быть использовано для кормления рыб.

Известен питательный рацион (RU 2298945, A23K 1/165, 2007 г.), коррегирующий микробиоценоз желудочно-кишечного тракта, в который вводят биологически активную добавку к корму - пребиотическая добавка. Исходным сырьем для носителя микробных тел в добавке являются отруби зерновых культур. Они обработаны таким образом, что они представляют собой остатки цитоскелета клеточных мембран зерновых культур, образованных от их дезинтеграции. В качестве микробных тел взята биомасса Saccharomyces vini, остальное составляют биотрансформированные неорганические вещества.

Недостатком данного способа является ее ограниченная область применения, так как используется для сельскохозяйственных, пушных и домашних животных.

Известен способ снижения грамположительной микрофлоры в кишечнике (RU 2755817, A61K 31/60, A61K 31/365, A23K 20/00, 2021 г.), который предусматривает совместное использование 4-гидрокси-3-метоксибензойной кислоты 97% в дозировке 0,13 г/кг живой массы и гаммаокталактона в дозировке 0,1 мл/кг живой массы.

Недостатком данного способа является ее ограниченная область применения, так как используется только для птицы.

Известен корм с пробиотической кормовой добавкой для рыб (RU 2652833, A23K 50/80, 2018 г.), содержащий штамм бактерий Enterococcus faecium 1-35 с титром живых бактерий 1,3×10⁸-1,8×10⁸ КОЕ и штамм бактерий Bacillus megaterium В-4801 с титром живых бактерий 1,0×10⁸-3.3×10⁸ КОЕ, нанесенные в смеси в равных количествах на наполнитель.

Недостатком данной кормовой добавки является ее ограниченная область применения, так как используется только для холодолюбивых рыб.

Известна кормовая добавка «Лакто-плюс»‚ включающая смесь бактерий Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus bulgaricus, Lactobacillus helveticus, Lactobacillus brevis, Lactobacillus fermentum, Lactobacillus casei, Lactococcus lactis, Streptococcus cremoris, Streptococcus diacetilactis, Streptococcus salivarius, Leuconostoc citrovorum, Leuconostoc dextranicum, и смесь дрожжевых грибов Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces unisporus, Torulopsis sphaerica, Torulaspora delbrueskii, Candida kefir, Candida holmii, Candida friedrichii, Kluyveromyces lactis, Kluyveromyces marxianus.

Недостаток добавки является ее ограниченная область применения, так как используется только для кормления сельскохозяйственных животных.

Настоящее изобретение направлено на ингибирование развития патогенных бактерий в кишечнике рыб, в частности филума Firmicutes и бактерий рода Aeromonas.

Поставленная задача решается способом коррекции микробиома кишечника, для повышения резистентности организма рыб, включающий скармливание комбикорма. В корм путем опрыскивания тонкого слоя в количестве 0,7 мл/кг корма вводят пробиотический препарат «Соя-бифидум», содержащий штамм живых бактерий Bifidobacterium longum.

Для осуществления способа проведен эксперимент в условиях кафедры биотехнологии животного сырья и аквакультуры Оренбургского государственного университета, в рамках которого было сформированы 3 группы молоди карпа (n=30): контрольная группа получала основной рацион (ОР), I опытная - ОР + пробиотический препарат «Соя-бифидум» в количестве 0,7 мл/кг корма, II опытная - ОР + антибиотик ципрофлоксацин гидрохлорид в количестве 100 мг/кг корма. Продолжительность опыта 56 суток.

В качестве ОР использовался сбалансированный по основным питательным веществам корм для карповых рыб КРК-110-1 (ОАО «Оренбургский комбикормовый завод», г. Оренбург), содержащий 26,0% протеина.

Пробиотический препарат «Соя-бифидум» представляет собой штамм бактерий Bifidobacterium longum с титром живых бактерий не менее 1 × 10⁹КОЕ (ООО «НПФ «Экобиос», г. Оренбург).

Экспериментальные исследования и обслуживание рыб выполнены в соответствии с инструкциями Russian Regulations, 1987 (Order No.755 on 12.08.1977 the USSR Ministry of Health) и «The Guide for Care and Use of Laboratory Animals (National Academy Press Washington, D.С. 1966)». При выполнении исследований были приняты усилия, чтобы свести к минимуму страдания животных и уменьшения количества используемых образцов.

Суточная норма кормления определялась еженедельно с учетом массы рыбы, температуры воды и концентрации растворенного в воде кислорода (Пономарев С.В. Индустриальное рыбоводство: учебник / С.В. Пономарев, Ю.Н. Грозеску, А.А. Бахарева. - Санкт-Петербург: Лань, 2013. - 448 с.).

На 56 сутки эксперимента для оценки микробиома рыб были отобраны образцы содержимого кишечника, которые использовали для выделения очищенных препаратов ДНК. Концентрация ДНК измерялась трехкратно: после выделения ДНК, после первой полимеразной цепной реакции (ПЦР) со специфичными 16S прокариотическими праймерами и после второй ПЦР с адаптерами и индексами протоколов Nextera XT. Анализ микрофлоры осуществлялся методом метагеномного секвенирования (Illumina MiSeq, «Illumina», США) с набором реагентов MiSeq® Reagent Kit v3 (600 cycle). Для биоинформатической обработки результатов использована программа PEAR (Pair-End AssembeR, PEAR v0.9.8). Результаты секвенирования были обработаны с использованием пакета программ Microsoft Excel. Проверка соответствия полученных данных нормальному закону распределения определялась при помощи критерия согласия Колмогорова. Значение с Р≤0,05 считалось статистически значимым. В результатах учитывались таксоны, численность которых более 1%.

Исследование микробного разнообразия кишечника рыб показало, что включение в основной рацион пробиотического препарата «Соя-бифидум» сопряжено с наращиванием филума Actinobacteria до 5,2% (табл. 1), микроорганизмов обеспечивающих защиту от кишечных патогенов и модуляцию локального иммунного ответа. При этом филум Actinobacteria не был зафиксирован как в контрольной группе, так и во II опытной группе.

Таблица 1 - Филумы кишечника подопытных рыб, %
Наименование филума	Контроль	I опытная	II опытная
Fusobacteria	34,42 ± 1,32	30,27 ± 1,23	31,28 ± 1,36
Verrucomicrobia	30,7 ± 1,12	30,6 ± 1,34	28,34 ± 1,4
Proteobacteria	24,45 ± 0,88	22,56 ± 1,14	28,32 ± 1,39*
Firmicutes	7,08 ± 0,51	4,08 ± 0,41*	4,11 ± 0,38*
Actinobacteria	-	5,20 ± 0,45	-

Анализ данных показал снижение в I опытной группе грамположительных бактерий филума Firmicutes на 3% (P≤0,05) по сравнению с контролем (табл. 2). Кроме того, в I опытной группе обнаружены представителя семейства Bifidobacteriaceae (5,02%), в частности род Bifidobacterium, который является микроорганизмом, положительно влияющим на состав и численность микрофлоры в кишечнике животных, за счет продукции антибиотических веществ, препятствующих росту численности патогенов (Liu H., Li J., Guo X., Liang Y., & Wang W. (2018). Yeast culture dietary supplementation modulates gut microbiota, growth and biochemical parameters of grass carp. Microbial biotechnology, 11(3), 551-565). Этим объясняется снижение в кишечнике рыб условных патогенов: филума Firmicutes и бактерий рода Aeromonas, численность последнего была менее 1%.

Таблица 2 - Таксономический состав филумов Fusobacteria, Verrucomicrobia, Firmicutes, %
Группа	Филум Fusobacteria
Класс	Семейство	Род
Контроль	Fusobacteria 34,42 ±1,32	Fusobacteriaceae 34,98 ± 1,34	Cetobacterium 33,87 ± 1,16
I опытная	Fusobacteria 30,01 ± 1,13	Fusobacteriaceae 30,01 ± 1,13	Cetobacterium 29,96 ± 1,04
II опытная	Fusobacteria 30,22 ± 1,29	Fusobacteriaceae 28,47 ± 1,25	Cetobacterium 25,98 ± 1,27
	Филум Verrucomicrobia
Класс	Семейство	Род
Контроль	Verrucomicrobiae (30,7 ± 1,12%)	Verrucomicrobiaceae (29,76 ± 1,04%)	Luteolibacter (24,98 ± 1,0%)
Rubritalea (2,36 ± 0,16%)
I опытная	Verrucomicrobiae (30,6 ± 1,34%)	Verrucomicrobiaceae (28,98 ± 1,21%)	Luteolibacter (23,67 ± 1,11%)
Rubritalea (2,45 ± 2,45%)
II опытная	Verrucomicrobiae (28,34 ± 1,4%)	Verrucomicrobiaceae (27,54 ± 1,28%)	Luteolibacter (23,63 ± 1,04%)
	Филум Firmicutes
Класс	Семейство	Род
Контроль	Bacilli (5,99 ± 0,41%)	Streptococcaceae (6,1 ± 0,47%)	Lactococcus (5,15 ± 0,38%)
I опытная	Bacilli (3,99 ± 0,37%)	Streptococcaceae (3,21 ± 0,32%)	Lactococcus (3,09 ± 0,28%)
Bifidobacteriaceae (5,02 ±0,53%)	Bifidobacterium (4,87 ± 0,44%)
II опытная	Bacilli (3,97 ± 0,36%)	Streptococcaceae (2,1 ± 0,23%)	Lactococcus (1,21 ± 0,13%)

Примечание: * Различия с контролем статистически значимы при р ≤ 0,05.

При добавлении в рацион карпам антибиотика установлено увеличение численности Proteobacteria на 3,9% (P≤0,05) и входящего в его состав класса Gammaproteobacteria на 4,3% (P≤0,05), относительно контрольных значений, в частности бактерий рода Aeromonas и Pseudomonas, что свидетельствует о нарушении нормальной микрофлоры кишечника рыб и увеличении санитарно-неблагополучных микроорганизмов под действием антибиотика, что может привести к эпизоотиям.

Таблица 3 - Таксономический состав филума Proteobacteria, %
Наименование	Класс	Семейство	Род
Контроль	Alphaproteobacteria (19,52 ± 0,83%)	Xanthobacteraceae (6,17 ± 0,45%)	Devosia (2,52 ± 0,18%)
Контроль	Hyphomicrobiaceae (2,05 ± 0,14%)	Azorhizobium (2,65 ± 0,21%)
Gammaproteobacteria (4,38 ± 0,36%)	Aeromonadaceae (5,23 ± 0,39%)	Aeromonas (3,18 ± 0,26%)
I опытная	Alphaproteobacteria (18,46 ± 1,04%)	Xanthobacteraceae (3,25 ± 0,35%)	Devosia (2,31 ± 0,21%)
Hyphomicrobiaceae (2,13 ± 0,18%)	Azorhizobium (2,10 ± 0,17%)
II опытная	Alphaproteobacteria (18,33 ± 1,17%)	Xanthobacteraceae (5,20 ± 0,51%)	Devosia (1,52 ± 0,23%)
	Hyphomicrobiaceae (2,21± 0,37%)	Azorhizobium (2,09 ± 0,28%)
	Gammaproteobacteria (8,67 ± 0,89%)*	Aeromonadaceae (5,23 ± 0,47%)	Aeromonas (3,48 ± 0,31%)
Pseudomonadaceae (3,3 ± 0,29%)	Pseudomonas (3,22 ± 0,25%)

Примечание: * Различия с контролем статистически значимы при р ≤ 0,05.

Анализируя полученные данные, можно сделать следующие выводы:

- включение в основной рацион пробиотического препарата «Соя-бифидум» в количестве 0,7 мл/кг корма нормализует микробиом кишечника рыб, способствует увеличению филума Actinobacteria, а также численности бактерий рода Bifidobacterium,

- способ коррекции микробиома кишечника для повышения резистентности организма рыб путем включения в рацион пробиотического препарата «Соя-бифидум» в количестве 0,7 мл/кг корма подтвержден возможностью его осуществления с помощью описанных в заявке средств и методов,

- заявленное изобретение соответствует условию «промышленная применимость».

Способ коррекции микробиома кишечника, для повышения резистентности организма рыб, включающий скармливание комбикорма, отличающийся тем, что тонкий слой корма опрыскивают пробиотическим препаратом «Соя-бифидум» в количестве 0,7 мл/кг корма.

Изобретение относится к кормовой промышленности. Способ получения сухого экстракта череды трехраздельной для кормовой добавки для сельскохозяйственных животных и птицы, характеризующийся тем, что сырье измельчают и смачивают в 8-25%-ном водоэтанольном растворе в течение 9-13 ч, затем переносят в экстрактор, заливают 25-65%-ным водоэтанольным раствором, нагревают до 25°С и на первой стадии проводят экстракцию под вакуумом, после чего экстракт сливают, а массу повторно заливают 25-65%-ным водоэтанольным раствором, нагревают до 25°С и проводят экстракцию под вакуумом, после чего экстракт сливают, полученную массу на третьей стадии заливают дистиллированной водой и проводят экстракцию при модуле 1кг÷2 л в течение 30 мин при относительном давлении (-0,81)-(-0,97) кгс/см2, после чего экстракт также сливают, полученные экстракты объединяют и концентрируют в вакууме, а густой экстракт высушивают до сухого состояния.

Способ получения сухого экстракта тысячелистника для сельскохозяйственных животных и птицы // 2785165

Изобретение относится к кормовой промышленности. Способ получения сухого экстракта высушенных цветков тысячелистника обыкновенного для кормовой добавки для сельскохозяйственных животных и птиц, характеризующийся тем, что сырье измельчают и смачивают в 8-30 %-ном водоэтанольном растворе в течение 9-13 часов, затем переносят в экстрактор, заливают 8-25 %-ным водоэтанольным раствором, нагревают до 25°С и на первой стадии проводят экстракцию под вакуумом, после чего экстракт сливают, а массу повторно заливают 15-50 %-ным водоэтанольным раствором, нагревают до 25°С и проводят экстракцию под вакуумом, после чего экстракт сливают, полученную массу на третьей стадии заливают дистиллированной водой и проводят экстракцию при модуле 1 кг ÷ 2 л в течение 30 мин при относительном давлении (-0,92) - (-0,96) кгс/см2, после чего экстракт также сливают, полученные экстракты объединяют и концентрируют в вакууме, а густой экстракт высушивают до сухого состояния.

Способ получения сухого экстракта сныти обыкновенной для сельскохозяйственных животных и птиц // 2785163

Изобретение относится к кормовой промышленности. Способ получения сухого экстракта высушенных листьев сныти обыкновенной для кормовой добавки для сельскохозяйственных животных и птиц, характеризующийся тем, что сырье измельчают и смачивают в 30-80%-ном водоэтанольном растворе в течение 10 часов, затем переносят в экстрактор, заливают 45-80%-ным водоэтанольным раствором, нагревают до 25°С и на первой стадии проводят экстракцию под вакуумом, после чего экстракт сливают, а массу повторно заливают 45-80%-ным водоэтанольным раствором нагревают до 25°С и проводят экстракцию под вакуумом, после чего экстракт сливают, полученную массу на третьей стадии заливают дистиллированной водой и проводят экстракцию при модуле 1 кг÷2 л в течение 30 мин при относительном давлении (-0,9) - (-0,95) кгс/см2, после чего экстракт также сливают, полученные экстракты объединяют и концентрируют в вакууме, а густой экстракт высушивают до сухого состояния.

Способ получения сухого экстракта мать-и-мачехи для сельскохозяйственных животных и птицы // 2785162

Изобретение относится к кормовой промышленности. Способ получения сухого экстракта высушенных листьев мать-и-мачехи для кормовой добавки для сельскохозяйственных животных и птиц, характеризующийся тем, что сырье измельчают и смачивают в 8-25%-ном водоэтанольном растворе в течение 8-13 ч, затем переносят в экстрактор, заливают 18-33%-ным водоэтанольным раствором, нагревают до 25°С и на первой стадии проводят экстракцию под вакуумом, после чего экстракт сливают, а массу повторно заливают 50%-ным водоэтанольным раствором, нагревают до 25°С и проводят экстракцию под вакуумом, после чего экстракт сливают, полученную массу на третьей стадии заливают дистиллированной водой и проводят экстракцию при модуле 1 кг ÷ 2 л в течение 15-35 мин при относительном давлении (-0,80)-(-0,92) кгс/см2, после чего экстракт также сливают, полученные экстракты объединяют и концентрируют в вакууме, а густой экстракт высушивают до сухого состояния.

Способ получения кровяной муки из крови животных и птиц и система для получения кровяной муки из крови животных и птиц // 2785153

Группа изобретений относится к кормовой промышленности. Система для получения кровяной муки из крови животных и птиц содержит фильтр для очистки крови, соединенный с коагулятором, включающим форсунки, установленные вдоль продольной оси корпуса, связанные через распределительный цилиндр с парогенератором, шнек, установленный в корпусе коагулятора, выход коагулятора соединен с декантером, представляющим собой горизонтальную центрифугу со шнековой выгрузкой твердого вещества (продукта), выход для жидкого вещества декантера соединен с теплообменником и отстойником, воздуходувку, обеспечивающую нагнетание твердого вещества струей воздуха в барабанную сушилку, содержащую три сушильных барабана А, В и С, последовательно соединенных между собой.

Средство для коррекции теплового стресса у крупного рогатого скота // 2785121

Изобретение относится к области ветеринарии и животноводства, а именно к средству для коррекции теплового стресса, и может быть использовано для купирования теплового стресса у крупного рогатого скота для увеличения показателей сохранности и продуктивности поголовья. Средство для коррекции теплового стресса у крупного рогатого скота содержит бетаин, натрия хлорид, калия хлорид.

Композиция, стимулирующая репаративный остеогенез у собак и кошек // 2785118

Изобретение относится к ветеринарии, в частности к ветеринарной фармакологии и травматологии, и касается композиции, стимулирующей процессы репарации и замедленной консолидации при переломах костей мелких домашних животных, и может быть использовано для стимуляции остеогенеза. Композиция, стимулирующая процесс репаративного остеогенеза при переломах костей домашних животных, включает кальций и фосфор в виде кальция глицерофосфата, дополнительно содержит холекальциферол (витамин D3), дигидрокверцетин, хондроитина сульфат натрия, глюкозамина гидрохлорид, метилсульфонилметан и рисовую лузгу (шелуху) при заявленном соотношении компонентов.

Способ активации энергетического метаболизма при развитии патобиохимических процессов у животных // 2785115

Изобретение относится к ветеринарной медицине, в частности к способам и средствам нормализации энергометаболических процессов в организме животных. Способ активации энергетического метаболизма при развитии патобиохимических процессов у животных заключается в введении животным внутримышечных инъекций препарата, в котором в качестве активатора аэробного синтеза энергии используют сукцинат натрия, в качестве активатора энергетического обмена и метаболизма - йодные компоненты: йод и йодид калия или натрия, в качестве активатора эритропоэза - цианокобаламин.

Применение производных глутамина для приготовления кормовой добавки для животных // 2785037

Изобретение относится к животноводству, в частности к производству кормовых добавок и кормов. Предложено применение производного глутамина формулы (I) ,где Y представляет собой ОС1-С20 алкильную группу или ОН; X представляет собой NHC1-C20 алкильную группу; R1 представляет собой Н; R2 представляет собой R2aC(=O) или R2bC(=O); R2b представляет собой С1-С20 алкильную группу; R2a представляет собой С5-С12 арильную группу или С5-С12 арильную группу, необязательно замещенную одним, двумя, тремя, четырьмя или пятью R4; R4 представляет собой -ОН, -NH2, -NO2, -CN, -SH, -Х2, -С1-С5 алкокси группу, -C1-С5 алкильную группу или -С1-С5 алкильную группу, замещенную посредством Х2, при этом Х2 выбран из F, Cl, Br, или I, его рацемата, его стереоизомера, его геометрического изомера, его таутомера, его сольвата или его приемлемой для кормов соли для приготовления кормовых добавок для животных для повышения продуктивности животных и повышения эффективности усваивания кормовой добавки.

Способ получения устойчивой метанотрофной ассоциации для производства кормового белка на метане // 2784971

Изобретение относится к биотехнологии. Предложен способ получения устойчивой метанотрофной ассоциации для производства кормового белка на метане, включающий двухэтапное культивирование природного образца, в качестве которого применяют активный ил или осадок пресноводных водоемов, в полуторалитровом ферментере с объемом минеральной среды 1 л общей длительностью от нескольких недель до одного месяца: первый этап - накопительный рост до достижения мутности культуры оптической плотности OD600 0.5-4; второй этап - проточный режим культивирования со скоростью протока 0.05 ч-1 с последующим увеличением скорости потока ступенчато с шагом 0.05 ч-1 до достижения 0.2 ч-1, и дальнейшее культивирование в течение от 14 до 40 дней со средней оптической плотностью OD600=2.5-3.