Деплеция рнк на основе нуклеазы
Настоящее изобретение относится к области биотехнологии, более конкретно к новым способам и материалам для удаления нежелательных видов нуклеиновых кислот (в частности РНК) из образца целевой нуклеиновой кислоты. В изобретении раскрывается последовательность действий для эффективного удаления из препарата нуклеиновой кислоты нежелательных рРНК, тРНК, мРНК или других их видов, которые могут помешать анализу, манипулированию и исследованию молекул-мишеней РНК в образце. 4 н. и 45 з.п. ф-лы, 8 пр., 3 табл., 9 ил.
ПЕРЕКРЕСТНАЯ ССЫЛКА НА РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ
[0001] Настоящая заявка испрашивает преимущество приоритета предварительной заявки США № 62/783 869, поданной 21 декабря 2018 г., и 62/847 797, поданной 14 мая 2019 г., каждая из которых полностью включена в настоящий документ посредством ссылки для любых целей.
ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
[0002] Настоящая заявка подана вместе с перечнем последовательностей в электронном формате. Перечень последовательностей предоставлен в виде файла с названием «2019-12-09_01243-0012-00PCT_Sequence_Listing_ST25.txt», созданного 9 декабря 2019 г., размер которого составляет 94,208 байт. Информация, содержащаяся в электронном файле перечня последовательностей, полностью включена в настоящий документ путем ссылки.
ПРЕДПОСЫЛКИ СОЗДАНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ
[0003] Нежелательные молекулы РНК в образце нуклеиновой кислоты, например, отобранном из клеток или тканей человека, могут усложнить его анализ, например, анализ экспрессии генов, микроматричный анализ и расшифровку генетической последовательности образца. Поскольку рибосомная РНК (рРНК) составляет примерно 95% РНК в клетке, ее присутствие является одним из примеров тех видов РНК, которые могут помешать и скрыть результаты анализа нуклеиновой кислоты-мишени в образце, или тех нуклеиновых кислот, которые исследователь или диагност имеют намерение исследовать. Например, нежелательные виды рРНК могут затруднять анализ интересующих молекул РНК в образце, таком как тРНК или мРНК. Это постоянная проблема, особенно для тканей, которые были зафиксированы, например, образцы зафиксированные формалином и залитые парафином (FFPE - Formalin Fixed Paraffin Embedded) из биоптатов. Если нежелательные виды рРНК не удалять из тканей FFPE, они могут помешать измерению и характеризации РНК-мишени в ткани, тем самым чрезвычайно затрудняя получение медицинской информации из РНК-мишени, такой как идентификация заболевания и рака, возможные варианты лечения, а также диагностику и прогноз заболевания или рака. Несмотря на то, что в качестве примера приведена ткань FFPE, те же проблемы, связанные с рРНК, сохраняются для образцов всех видов, таких как кровь, клетки и прочие образцы, содержащие нуклеиновые кислоты.
[0004] Существующие в настоящее время на рынке способы удаления нежелательных молекул РНК из образца нуклеиновых кислот включают комплекты для деплеции РНК RiboZero® (Epicentre) и NEBNext® (NEB), а также способы, описанные в патентах США № 9 745 570 и 9 005 891. Однако эти способы, будучи полезными при деплеции РНК, имеют свои недостатки, включая сложность применения, высокие требования к входным образцам, время, затраченное техническим специалистом на их использование, стоимость и (или) эффективность удаления. Что необходимо, так это материалы и способы, которые могут более легко или экономично удалить нежелательные виды РНК из образца, тем самым разблокировав возможно скрытую информацию в РНК-мишени, например редкие или трудные для идентификации варианты последовательности. Простые и надежные способы, представленные в настоящем изобретении, могут значительно повысить доступность молекул-мишеней РНК в целях проведения исследований, позволяя обнаружить информацию, которую они хранят об образце и организме, из которого они получены.
КРАТКОЕ ИЗЛОЖЕНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ
[0005] Образцы, например, полученные из эукариот или прокариот, содержат множество нуклеиновых кислот, многие из которых не представляют интерес для исследователей. Довольно часто существует необходимость исследовать только специфический тип нуклеиновой кислоты, такой как ДНК или РНК. При изучении РНК интересующий образец может содержать множество различных типов РНК, которые могут подавлять и скрывать РНК-мишень, являющуюся предметом исследования. Таким образом, деплеция РНК относится к удалению нежелательных видов РНК и (или) ДНК из образца нуклеиновой кислоты, тем самым образец нуклеиновой кислоты для исследования остается обогащенным целевой РНК.
[0006] В настоящем изобретении предложено решение для деплеции избыточного количества нежелательных молекул РНК в образце нуклеиновой кислоты перед дальнейшим исследованием. Например, интересующий образец РНК включает не только исследуемую РНК-мишень, но также повторяющиеся транскрипты, такие как рРНК, глобиновая мРНК, вирусные загрязнения или любые другие нежелательные нуклеиновые кислоты, которые могут доминировать в образце и заглушать интересующую мишень, тем самым значительно снижая возможность для исследователя точно анализировать интересующую часть транскриптома.
[0007] Таким образом, удаление нежелательных молекул РНК из образца нуклеиновой кислоты перед анализом, таким как экспрессионные микроматрицы или секвенирование, повышает специфичность и точность анализа для интересующих РНК-мишеней. В настоящем изобретении деплеция РНК, не являющейся мишенью, посредством деградации специфических гибридов ДНК : РНК позволяет эффективно удалять нежелательные виды РНК из образца перед приготовлением и анализом библиотеки. Как только уровень нежелательных молекул РНК в образце снижен, оставшуюся РНК-мишень можно преобразовать в кДНК. Надежный образец позволит получить приемлемые данные, а также улучшить потенциальные варианты лечения, прогноз и диагностику рака, понимание микробиомы, ее значимости в наших и других эукариотических системах, а также улучшить анализ экспрессии интересующих генов и т.п.
[0008] В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения описан способ деплеции РНК, не являющейся мишенью, из образца нуклеиновой кислоты, который включает:
a) приведение образца нуклеиновой кислоты, содержащего по меньшей мере одну последовательность-мишень в структуре РНК или ДНК и по меньшей мере одну последовательность молекул РНК, не являющихся мишенью, в контакт с набором зондов, содержащим по меньшей мере два ДНК-зонда, комплементарных к несмежным последовательностям вдоль всей длины по меньшей мере одной последовательности молекулы РНК, не являющейся мишенью, тем самым гибридизируя ДНК-зонды с молекулами РНК, не являющимися мишенями, с образованием гибридов ДНК : РНК, при этом каждый гибрид ДНК : РНК разделен по меньшей мере на 5 оснований или по меньшей мере на 10 оснований вдоль заданной последовательности молекулы РНК, не являющейся мишенью, из другого гибрида ДНК : РНК; и
b) приведение гибридов ДНК : РНК в контакт с рибонуклеазой, расщепляющей РНК от гибридов ДНК : РНК, тем самым разрушая молекулы РНК, не являющиеся мишенями, в образце нуклеиновой кислоты с образованием расщепленной смеси.
[0009] В одном из вариантов осуществления настоящее изобретение относится к композиции с набором зондов, который включает по меньшей мере два ДНК-зонда, комплементарных к несмежным последовательностям вдоль всей длины по меньшей мере одной последовательности молекул РНК, не являющихся мишенью, (например, по меньшей мере на расстоянии 5 или 10 оснований друг от друга вдоль всей длины) в образце нуклеиновой кислоты. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения композиция также содержит рибонуклеазу, способную разлагать РНК в гибриде ДНК : РНК. В другом варианте осуществления настоящее изобретение относится к композиции с набором зондов, который включает по меньшей мере два ДНК-зонда, гибридизованных с по меньшей мере одной последовательностью молекул РНК, не являющихся мишенью, причем каждый ДНК-зонд гибридизуется на расстоянии по меньшей мере 5 или 10 оснований вдоль всей длины последовательности молекулы РНК, не являющейся мишенью, от другого ДНК-зонда из набора.
[0010] В одном из вариантов осуществления настоящее изобретение описывает комплект с набором зондов, который включает по меньшей мере два ДНК-зонда, комплементарных к несмежным последовательностям вдоль всей длины по меньшей мере одной последовательности молекул рРНК, не являющихся мишенью, (например, на расстоянии не менее 5 оснований друг от друга или не менее 10 оснований по всей длине) в образце нуклеиновой кислоты и рибонуклеазы, способной расщеплять РНК в гибриде ДНК : РНК.
[0011] В одном варианте осуществления настоящее изобретение описывает способ дополнения набора зондов для удаления молекул нуклеиновой кислоты РНК, не являющихся мишенью, из образца нуклеиновой кислоты. Способ включает следующее: a) приведение образца нуклеиновой кислоты, содержащего по меньшей мере одну последовательность-мишень в структуре РНК или ДНК и по меньшей мере одну последовательность молекул РНК первого вида, не являющихся мишенью, в контакт с набором зондов, содержащим по меньшей мере два ДНК-зонда, комплементарных к несмежным последовательностям вдоль всей длины по меньшей мере одной последовательности молекулы РНК второго вида, не являющейся мишенью, тем самым гибридизируя ДНК-зонды с молекулами РНК, не являющимися мишенями, с образованием гибридов ДНК : РНК, при этом каждый гибрид ДНК : РНК отделен по меньшей мере на 5 оснований или по меньшей мере на 10 оснований вдоль заданной последовательности молекулы РНК, не являющейся мишенью, от другого гибрида ДНК : РНК; b) приведение гибридов ДНК : РНК в контакт с рибонуклеазой, расщепляющей РНК от гибридов ДНК : РНК, тем самым разрушая молекулы РНК, не являющиеся мишенями, в образце нуклеиновой кислоты с образованием расщепленной смеси; c) отделение расщепленной рРНК от расщепленной смеси; d) секвенирование оставшейся РНК из образца; e) оценку оставшихся последовательностей РНК на наличие молекул РНК первого вида, не являющихся мишенью, таким образом определяя области последовательности бреши; и f) добавление в набор дополнительных ДНК-зондов, комплементарных к несмежным последовательностям в одной или более областях брешей.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ
[0012] На Фиг. 1 представлен пример рабочего процесса деплеции видов РНК из образца. Этап 1 включает денатурацию нуклеиновых кислот с последующим добавлением ДНК-зондов для деплеции и гибридизации зондов с нежелательными видами РНК и созданием таким образом гибридов ДНК : РНК. Этап 2 включает расщепление РНК из гибридов ДНК : РНК с использованием рибонуклеазы, такой как РНКаза H. Этап 3 включает расщепление остаточных ДНК-зондов из расщепленной смеси путем добавления ДНКазы. Этап 4 включает захват оставшейся РНК-мишени в образце с необязательными последующими дополнительными манипуляциями, которые в конечном итоге приводят к деплеции видов РНК в образце, который можно секвенировать, подвергать микроматричному анализу, кПЦР или другим методикам анализа.
[0013] На Фиг. 2A-2C представлены иллюстративные данные деплеции рРНК в образце b. subtilis при добавлении формамида в процесс деплеции рРНК (2A) 0% формамида, (2B) 25% формамида, (2C) 45% формамида). На каждой панели по оси X представлены обнаруженные виды рРНК, а по оси Y - данные деплеции рРНК согласно результатам прочтения последовательностей в процентом выражении.
[0014] На Фиг. 3 представлен пример данных последовательности секвенирования нового поколения (NGS - next-generation sequencing) для образцов РНК головного мозга человека (HBR - Human Brain RNA) с пониженным содержанием рРНК и универсальной РНК человека (UHR - Universal Human RNA), сравнивающих различные количества секвенированного образца (100 нг, 10 нг или 1 нг).
[0015] На Фиг. 4 представлен пример данных последовательности NGS для образцов с пониженным содержанием рРНК из мышиной и крысиной РНК при использовании различных концентраций формамида (0%, 25%, 45%), добавленных к рабочему процессу с пониженным содержанием рРНК.
[0016] На Фиг. 5 представлены примерные данные по удалению рРНК из различных видов микроорганизмов с применением низких входных образцов, в которых сравниваются методологии снижения уровня ферментативного удаления рРНК RiboZero® и РНКазы H. Значения глубин прочтения образцов нормализовали. На оси X представлен способ снижения уровня нежелательных молекул рРНК (RZ - RiboZero или ED - способ деплеции ферментами РНКазы H), а на оси Y представлены процентные значения прочтения рРНК.
[0017] На Фиг. 6 показаны примеры данных обнаружения транскриптов на разных глубинах прочтения для B. subtilis и E.coli после деплеции рРНК ферментами РНКазы H (ED) с левой стороны графика по сравнению с отсутствием деплеции рРНК (Отсутствует) с правой стороны графика. На оси X показаны значения прочтений секвенирования (M), а на оси Y показано количество обнаруженных транскриптов.
[0018] На Фиг. 7A-7B представлены примеры графиков данных попарной линейной регрессии экспрессии генов, демонстрирующих воспроизводимость описанных способов деплеции рРНК. На панели 7A показаны два уровня экспрессии генов E. coli, а на панели 7B показаны два уровня экспрессии генов b. subtilis. Оба типа бактерий демонстрируют высокую корреляцию между уровнями экспрессии генов после деплеции РНК ферментами РНКазы H.
[0019] На Фиг. 8 показаны примеры данных считывания рРНК в трех повторностях для смешанной пробы штамма 20 (MSA-2002, левая сторона) и штамма 12 (MSA-2006, правая сторона). В смешанных трех повторах образцов рРНК была удалена по способу RiboZero (RZ) или с помощью ферментов РНКазы H (ED), как описано в настоящем документе. Входная РНК для образцов MSA2002 составляла 10 нг, тогда как для MSA2006-80 нг. На оси X показан способ деплеции рРНК, а на оси Y представлены процентные значения прочтений рРНК.
[0020] На Фиг. 9 показано покрытие считывания секвенирования мышиных локусов 12S рРНК (mt-Rnr1 и 16S (mt-Rnr2) (внизу рисунка) и влияние набора из 333 ДНК-зондов (номера SEQ ID NO: 1-333) при деплеции мышиной 16S рРНК из образцов универсальной мышиной эталонной РНК (UMR - universal mouse reference RNA). Квадраты показывают расположение 90% совпадения по длине основания 50 или 70% совпадения по длине пары оснований 30 с набором из 333 ДНК-зондов. При отсутствии дополнительных зондов мыши и крысы бреши без покрытия зонда соответствуют пикам на остаточном или недеплецированном уровне рРНК для двух реплик (Rep 1 и Rep 2), показанным в верхней части рисунка.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ
[0021] Создание библиотек нуклеиновых кислот из РНК для секвенирования часто затруднено из-за большого количества нежелательных транскриптов, таких как рибосомная РНК, мРНК глобина, вирусные загрязнения и т.п., которые могут доминировать в образце и подавлять интересующие последовательности РНК. Если нежелательные транскрипты не удалены, анализ транскриптома с возможным прогностическим, диагностическим или исследовательским эффектом может быть нарушен. Таким образом, удаление нежелательных молекул РНК из образца нуклеиновой кислоты перед анализом, таким как секвенирование или другими применениями со стороны 3'-концов, может повысить специфичность и точность желаемого анализа.
[0022] В настоящем изобретении представлены способы и материалы, используемые для удаления нежелательных видов РНК из образца нуклеиновой кислоты, чтобы исследовать и не потерять важные данные РНК среди значительного количества нежелательных РНК-транскриптов.
[0023] В описанном способе деплеции РНК, по сравнению с существующими, можно использовать меньшие объемы входного общего образца РНК, сохраняя при этом схожие показатели эффективности. Таким образом, описанный способ может быть использован, когда исследователь имеет небольшой объем исходного материала, который не подойдет для других способов. Кроме того, описанный способ может быть реализован с одним пулом зондов, нацеленных одновременно на множество разных организ менных нежелательных видов РНК, без ущерба для эффективности деплеции. Например, настоящее изобретение может одновременно удалять нежелательные виды эукариотической и прокариотической РНК из образца РНК, включая, без ограничений, человеческие, бактериальные, вирусные и (или) Archaea источники нежелательной РНК.
[0024] Термин «образец или смесь нуклеиновых кислот» означает образец, содержащий РНК или ДНК или и то и другое, включая нежелательные (не являющиеся мишенями) и требуемые (мишени) нуклеиновые кислоты. ДНК или РНК в образце могут быть либо немодифицированными, либо модифицированными и включают, без ограничений, одно-или двухспиральную ДНК, или РНК, или их производные (например, некоторые области ДНК или РНК являются двухспиральными, в то время как другие области ДНК или РНК являются односпиральными) и т.п. Как правило, образец нуклеиновой кислоты включает в себя все химически, ферментативно и (или) метаболически модифицированные формы нуклеиновых кислот, а также все немодифицированные формы нуклеиновых кислот или их комбинации. Образец нуклеиновой кислоты может содержать как желательные, так и нежелательные нуклеиновые кислоты, такие как геномная ДНК, или общая клеточная РНК, или их комбинацию. Нежелательные нуклеиновые кислоты включают нуклеиновые кислоты из эукариот, которые не являются мишенями для исследования, а также загрязнение нуклеиновых кислот из бактерий, вирусов, видов Archaea и т. п. Желательными или необходимыми нуклеиновыми кислотами являются нуклеиновые кислоты, являющиеся основой или фокусом исследования - нуклеиновые кислоты-мишени. Например, исследователю может потребоваться провести анализ экспрессии мРНК, причем рРНК, тРНК и ДНК можно считать нежелательными нуклеиновыми кислотами, а мРНК - нуклеиновой кислотой-мишенью. Кроме того, может потребоваться изучение общей РНК, тогда как рРНК, мРНК и ДНК будут считаться нежелательными или не необходимыми нуклеиновыми кислотами, а общая РНК - нуклеиновой кислотой-мишенью. Нежелательная РНК включает в себя, без ограничений, рибосомную РНК (рРНК), митохондриальную рРНК, ядерную рРНК, мРНК, такую как глобиновые РНК, или транспортную тРНК, или их смесь. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения РНК, не являющаяся мишенью, представляет собой рРНК. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения РНК, не являющаяся мишенью, представляет собой мРНК глобина.
[0025] Например, образец нуклеиновой кислоты может содержать необходимую информационную РНК (мРНК) или общую РНК, в то же время включая нежелательную рибосомную РНК (рРНК), транспортные РНК (тРНК) и, возможно, нежелательную ДНК. Общие способы извлечения РНК из макроскопического образца, такого как кровь, ткань, клетки, фиксированные ткани и т.д., хорошо известны в данной области, как описано работе Current Protocols for Molecular Biology («Текущие протоколы по молекулярной биологии», издательство John Wiley & Sons) и в многочисленных руководствах по методикам в молекулярной биологии. Выделение РНК может быть выполнено с помощью имеющихся в продаже наборов для очистки, например мини-колонок Qiagen RNeasy, комплектов для очистки ДНК и РНК MasterPure Complete (Epicenter), набора для выделения РНК Parrafin Block RNA (Ambion), RNA-Stat-60 (Tel-Test) или центрифугирования в градиенте плотности хлорида цезия. Настоящие способы не ограничиваются выделением РНК из образца перед деплецией РНК.
[0026] Существует естественный скептицизм в отношении того, что смешивание зондов, нацеленных на бактериальную рРНК и рРНК человека в один и тот же пул, приведет к значительному нецелевому удалению желаемых транскриптов (Mauro et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1997, 94:422-427; Mignone и Pesole, Appl. Bioinformatics 2002, 1:145-54). Удивительно, но исследования, проведенные при разработке изобретенных способов, демонстрируют, что это не так, поскольку специфичность гибридизации ДНК-зонда с нежелательными транскриптами РНК приводит к тому, что нежелательные виды РНК эффективно удаляются из образца. Также было обнаружено, что добавление дестабилизатора, такого как формамид, помогает удалить некоторое количество нежелательной РНК, которая, как было показано, является более проблематичной для деплеции при отсутствии формамида. Не смотря на то, что отсутствует необходимость понимания, каким образом формамид помогает в удалении этих РНК, считается, что формамид может служить для ослабления структурных барьеров в нежелательной РНК, чтобы ДНК-зонды могли связываться более эффективно. Кроме того, добавление формамида продемонстрировало дополнительное преимущество, связанное с улучшением обнаружения некоторых нецелевых транскриптов, возможно, путем денатурации/релаксации областей мРНК, например, имеющих очень стабильные вторичные или третичные структуры и, как правило, плохо представленных в других способах получения библиотеки.
Образцы или смеси нуклеиновых кислот
[0027] Настоящее изобретение не ограничено источником образца нуклеиновой кислоты, например, источником может быть эукариоты или прокариоты, включая, без ограничений, человека, не относящихся к человеку приматов, млекопитающих, птиц, рептилий, растения, бактерии, вирусы, нуклеиновые кислоты, присутствующие в почвах, воде или других жидкостях, а также другие образцы окружающей среды. Образец может быть получен из клеток, тканей, органов, окружающей среды, лизатов и т.п. Он может быть свежеприготовленным, замороженным, лиофилизированным и восстановленным или фиксированным, таким как зафиксированный формалином образец ткани или биопсии в парафине (FFPE) или подверженный другим цитологическим или гистологическим манипуляциям.
[0028] Вид образца нуклеиновой кислоты, для которого могут быть полезны способы деплеции РНК, может быть эукариотическим или прокариотическим (например, образцы человека, не относящиеся к человеку, мыши, крысы, микроорганизмов и т.д.). В одном образце могут содержаться один или несколько видов. Кроме того, настоящие способы деплеции можно использовать для свежеприготовленных или фиксированных образцов биопсии или ткани, включая обработанные с использованием формалина и помещенные в парафин (FFPE). В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения приведены образцы нуклеиновой кислоты человеческого или нечеловеческого происхождения, например не относящиеся к человеку эукариоты, бактерии, вирусы, растения, почва или их смесь. После удаления нежелательных видов РНК из образца оставшиеся желаемые мишени можно преобразовать в кДНК для дальнейшей обработки на усмотрение квалифицированных специалистов в данной области.
[0029] В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения приведены образцы нуклеиновой кислоты человеческого происхождения или не относящегося к человеку примата. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения образец нуклеиновой кислоты получен от крысы или мыши. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения образец нуклеиновой кислоты содержит нуклеиновые кислоты нечеловеческого происхождения. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения нуклеиновые кислоты нечеловеческого происхождения получены из не относящихся к человеку эукариотов, бактерий, вирусов, растений, почвы или их смеси.
Способы деплеции
[0030] Нежелательная РНК в образце нуклеиновой кислоты удаляется описанными способами. Нежелательную РНК преобразуют в гибрид ДНК : РНК путем гибридизации частично или полностью комплементарных ДНК-зондов с нежелательными молекулами РНК. Способы гибридизации зондов нуклеиновых кислот с нуклеиновыми кислотами хорошо известны науке. Независимо от того, является ли зонд частично или полностью комплементарным последовательности партнера, тот факт, что ДНК-зонд гибридизуется с нежелательными видами РНК после промывок и других манипуляций с образцом, демонстрирует возможность использовать ДНК-зонд в способах настоящего изобретения. Для использования набора деплеции РНК подходят образцы любых эукариотических видов, например, человека, мышей, крыс и т.п. Деплеция РНК образца оказывает благоприятное влияние на последующие исследования со стороны 3'-концов, таких как секвенирование (например, улучшение результатов, сниженных из-за наличия нежелательных видов нуклеиновых кислот). ДНК также можно рассматривать как нежелательную нуклеиновую кислоту, если мишенью для исследования является РНК, в которой ДНК может быть удалена путем деплеции.
[0031] В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения описан способ деплеции РНК, не являющейся мишенью, из образца нуклеиновой кислоты, который включает:
a) приведение образца нуклеиновой кислоты, содержащего по меньшей мере одну последовательность-мишень в структуре РНК или ДНК и по меньшей мере одну последовательность молекул РНК, не являющихся мишенью, в контакт с набором зондов, содержащим по меньшей мере два ДНК-зонда, комплементарных к несмежным последовательностям вдоль всей длины по меньшей мере одной последовательности молекулы РНК, не являющейся мишенью, тем самым гибридизируя ДНК-зонды с молекулами РНК, не являющимися мишенями, с образованием гибридов ДНК : РНК, при этом каждый гибрид ДНК : РНК разделен по меньшей мере на 5 оснований или по меньшей мере на 10 оснований вдоль заданной последовательности молекулы РНК, не являющейся мишенью, из другого гибрида ДНК : РНК; и
b) приведение гибридов ДНК : РНК в контакт с рибонуклеазой, расщепляющей РНК от гибридов ДНК : РНК, тем самым разрушая молекулы РНК, не являющиеся мишенями, в образце нуклеиновой кислоты с образованием расщепленной смеси.
[0032] В одном варианте осуществления настоящего изобретения образец РНК денатурируют в присутствии ДНК-зондов. Пример рабочего процесса представлен на Фиг. 1. В примере на Фиг. 1 ДНК-зонды добавляют к образцу денатурированной РНК (при 95°C в течение 2 мин), после чего реакционную смесь охлаждают до 37°C в течение 15-30 мин. Это приводит к гибридизации ДНК-зондов с соответствующими последовательностями-мишенями РНК, таким образом создавая гибридные молекулы ДНК : РНК.
[0033] В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения приведение в контакт с набором зондов включает обработку образца нуклеиновой кислоты дестабилизатором. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения дестабилизатор представляет собой термостабилизатор или химическое вещество для дестабилизации нуклеиновой кислоты. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения химическое вещество для дестабилизации нуклеиновой кислоты представляет собой бетаин, ДМСО, формамид, глицерин или их производное, или их смесь. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения химическое вещество для дестабилизации нуклеиновой кислоты представляет собой формамид или его производное, причем формамид или его производное необязательно будет присутствовать в концентрации от прибл. 10 до 45% от общего объема реакции гибридизации. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения при обработке образца нагреванием используется температура выше уровня плавления по меньшей мере одного гибрида ДНК : РНК.
[0034] В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения в реакцию гибридизации добавляют формамид независимо от источника образца РНК (например, человек, мышь, крыса и т. д.). Например, в некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения гибридизацию с ДНК-зондами выполняют с по меньшей мере 3%, 5%, 10%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40% или 45% объема формамида. В одном варианте осуществления настоящего изобретения реакция гибридизации для деплеции РНК включает в себя приблизительно от 25 до 45 об.% формамида.
[0035] После реакции гибридизации в реакцию добавляют рибонуклеазу, расщепляющую РНК из гибрида ДНК : РНК. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения рибонуклеаза представляет собой РНКазу H или гибридазу. РНКаза H (NEB) или гибридаза (Lucigen) являются примерами ферментов, расщепляющих РНК из гибрида ДНК : РНК. Расщепление рибонуклеазой, такой как РНКаза H или гибридаза, расщепляет РНК на малые молекулы, которые затем можно удалить. Например, сообщается, что РНКаза H расщепляет РНК из гибрида ДНК : РНК приблизительно каждые 7-21 оснований (Schultz et al., J. Biol. Chem. 2006, 281:1943-1955; Champoux и Schultz, FEBS J. 2009, 276:1506-1516). В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения расщепление РНК гибрида ДНК : РНК может происходить при 37°C в течение приблизительно 30 мин, как показано на Фиг. 1, этап 2 и пример 1.
[0036] В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения после расщепления гибридной молекулы ДНК : РНК оставшиеся ДНК-зонды и любая ДНК, не являющаяся мишенью, в образце нуклеиновой кислоты расщепляются. Таким образом, в некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения способы включают приведение в контакт расщепленной рибонуклеазой смеси с ферментом, расщепляющим ДНК, тем самым расщепляя ДНК в смеси. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения расщепленный образец подвергают воздействию расщепляющего ДНК фермента, такого как ДНКаза I, который расщепляет ДНК-зонды. Реакцию расщепления ДНК ДНКазой инкубируют, например, при 37°C в течение 30 минут, после чего фермент ДНКазы можно денатурировать при 75°C в течение времени, необходимого для денатурации ДНКазы, например до 20 минут.
[0037] В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения способ деплеции включает отделение расщепленной РНК от расщепленной смеси. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения отделение включает очистку РНК-мишени от расщепленной РНК (и расщепленной ДНК, при наличии), например, с использованием среды для очистки нуклеиновых кислот, такой как гранулы захвата РНК, такие как RNAClean XP (Beckman Coulter). Таким образом, в некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения после ферментативного(-ых) расщепления(-ий) РНК-мишень может быть обогащена путем удаления расщепленных продуктов, оставляя после себя желаемую и более длинную РНК-мишень. Подходящие способы обогащения содержат обработку расщепленной смеси магнитными микроносителями, связывающимися с фрагментом обогащенных РНК-мишеней, спин-колонками и т.п. В некоторых вариантах осуществления можно использовать магнитные гранулы, такие как гранулы AMPure XP, SPRISelect, RNAClean XP (Beckman Coulter), при условии, что они не содержат РНКаз (например, качество контролируется без РНКаз). Эти гранулы обеспечивают различные варианты выбора размера для связывания нуклеиновых кислот, например, гранулы RNAClean XP нацелены на фрагменты нуклеиновых кислот длиной 100 или более нуклеотидов, а гранулы SPRISelect нацелены на фрагменты нуклеиновых кислот от 150 до 800 нуклеотидов и не нацелены на более короткие нуклеотидные последовательности, такие как расщепленная РНК и ДНК, полученная в результате ферментативного расщепления РНКазы H и ДНКазы. Если мРНК является исследуемой РНК-мишенью, то мРНК можно дополнительно обогатить путем захвата с использованием, например, гранул, которые содержат последовательности oligodT для захвата аденилированных «хвостов» мРНК. Способы захвата мРНК хорошо известны специалистам в данной области.
[0038] После очистки РНК-мишени от компонентов реакции, включая нежелательные расщепленные нуклеиновые кислоты, можно выполнить дополнительные манипуляции с образцами. В настоящем изобретении в примерах 2 и 3 описаны рабочие процессы для синтеза кДНК из обогащенной общей РНК-мишени и последующий технологический процесс получения библиотеки, типичный для дальнейшего секвенирования, например, с использованием секвенатора Illumina. Однако следует понимать, что эти технологические процессы приведены только в качестве примера, и специалисту в данной области будет понятно, что обогащенную РНК можно использовать для множества дополнительных применений, таких как ПЦР, кПЦР, микроматричный анализ и т.п., непосредственно или после дополнительных манипуляций, таких как преобразование РНК в кДНК с использованием установленных и понятных протоколов.
[0039] Способы деплеции РНК, описанные в настоящем документе, приводят к получению образца, обогащенного молекулами РНК-мишени. Например, способы, описанные в настоящем документе, позволяют получить очищенный образец РНК, содержащий менее 15%, 13%, 11%, 9%, 7%, 5%, 3%, 2% или 1% (или в любом диапазоне между) нежелательных видов РНК. Затем обогащенный образец РНК будет содержать по меньшей мере 99%, 98%, 97%, 95%, 93%, 91%, 89% или 87% (или в любом диапазоне между) общей РНК-мишени. После обогащения образца его можно использовать для подготовки библиотеки или других манипуляций со стороны 3'-концов.
Наборы ДНК-зондов/ДНК-зонды
[0040] Термин «ДНК-зонд» относится к односпиральному ДНК-олигонуклеотиду, последовательность которого комплементарна нежелательным видам РНК. Последовательность ДНК-зонда может быть частично или полностью комплементарна нежелательной РНК для деплеции образца нуклеиновой кислоты. Нежелательная РНК для деплеции включает, без ограничений, рРНК, тРНК и мРНК, а также их смеси. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения каждый ДНК-зонд имеет длину от приблизительно 10 до 100 нуклеотидов, или от приблизительно 20 до 80 нуклеотидов, или от приблизительно 40 до 60 нуклеотидов, или приблизительно 50 нуклеотидов. ДНК-зонды способны гибридизоваться с нежелательными видами РНК, таким образом создавая гибридные молекулы ДНК : РНК. Хотя в некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения по меньшей мере два ДНК-зонда гибридизуются с конкретной молекулой РНК, не являющейся мишенью, ДНК-зонды не охватывают всю длину последовательности нежелательной молекулы РНК. Например, в некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения набор зондов выходит из брешей или областей нежелательной РНК без комплементарного ДНК-зонда в наборе зондов. ДНК-зонды полностью или частично гибридизуются с нежелательной РНК без перекрытия, оставляя бреши из по меньшей мере 5, 10, 15, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80 или более нуклеотидов между полученными гибридами ДНК : РНК. Таким образом, в некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения каждый ДНК-зонд гибридизуется на расстоянии по меньшей мере 5 или 10 оснований вдоль всей длины по меньшей мере одной молекулы РНК-мишени от любого другого ДНК-зонда в наборе зондов. Таким образом, нежелательная РНК в целом не полностью гибридизуется с ДНК-зондами. Кроме того, в настоящем изобретении предложено множество ДНК-зондов, которые гибридизуются с одной РНК для деплеции. Как таковое понятие «один ДНК-зонд для одной РНК» отсутствует, вместо этого используется множество прерывистых ДНК-зондов в наборе зондов, нацеленных на данную нежелательную РНК. Например, в некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения при данном наборе РНК для деплеции используют набор ДНК-зондов, где каждый зонд имеет длину приблизительно 20-80 нуклеотидов и гибридизуется с нежелательной РНК в любом месте на расстоянии 5-15 нуклеотидов от другого зонда ДНК в наборе. ДНК-зонд может быть полностью или частично комплементарным конкретному местоположению на РНК, подлежащей деплеции, например, последовательность ДНК-зонда может быть по меньшей мере на 80%, 85%, 90%, 95% или 100% комплементарна целевому местоположению на РНК-транскрипте, подлежащему деплеции. Единственным ограничением комплементарности является то, что ДНК-зонд должен гибридизоваться с РНК-мишенью для деплеции таким образом, чтобы гибрид ДНК : РНК приводил к ферментативному расщеплению, как описано в настоящем документе. В некоторых случаях мРНК является интересующей мишенью и не нацелена на деплецию, тогда ДНК-зонды не будут содержать последовательность поли-T и, как следствие, не будут гибридизоваться с видами мРНК. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения ДНК-зонды не содержат метку с фрагментом для захвата, таким как биотин, авидин, стрептавидин или магнитная гранула, позволяющую выполнять деплецию гибрида физическими способами, в то время как в других вариантах осуществления ДНК-зонды содержат метку с фрагментом для захвата, такую как биотин, авидин, стрептавидин или магнитная гранула, обеспечивающую деплецию гибрида физическими способами.
[0041] В некоторых вариантах осуществления набор зондов содержит по меньшей мере ДНК-зонды, которые гибридизуются с молекулами РНК, не являющимися мишенями, источником которых является человек и микроорганизмы. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения набор зондов содержит по меньшей мере ДНК-зонды, которые гибридизуются с молекулами РНК, не являющимися мишенями, источником которых является человек, микроорганизмы и Archaea. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения набор зондов содержит по меньшей мере ДНК-зонды, которые гибридизуются с молекулами РНК, не являющимися мишенями, источником которых является человек, микроорганизмы, мыши и крысы. В некоторых вариантах осуществления набор зондов содержит по меньшей мере ДНК-зонды, которые гибридизуются с молекулами РНК, не являющимися мишенями, источником которых является человек, микроорганизмы, мыши, крысы и Archaea. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения источником молекул РНК, не являющихся мишенью, являются микроорганизмы, грамположительные или грамотрицательные бактерии или их смеси. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения набор зондов содержит по меньшей мере два ДНК-зонда, которые гибридизуются с одной или несколькими молекулами РНК, не являющимися мишенями, источником которых являются виды Archaea. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения набор зондов содержит по меньшей мере два ДНК-зонда, комплементарных двум или более последовательностям рРНК видов Archaea.
[0042] В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения набор зондов содержит по меньшей мере два ДНК-зонда, которые гибридизуются с по меньшей мере одной или по меньшей мере двумя молекулами РНК, не являющимися мишенью, выбранными из 28S, 23S, 18S, 5.8S, 5S, 16S, 12S, HBA-A1, HBA-A2, HBB, HBB-B1, HBB-B2, HBG1 и HBG2. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения набор зондов содержит по меньшей мере два ДНК-зонда, комплементарных двум или более последовательностям рРНК, выбранных из группы, состоящей из 28S, 23S, 18S, 5.8S, 5S, 16S, 12S, HBA-A1, HBA-A2, HBB, HBB-B1, HBB-B2, HBG1 и HBG2. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения набор зондов содержит по меньшей мере два ДНК-зонда, которые гибридизуются с одной или более или двумя или более молекулами РНК, не являющимися мишенью, выбранными из фрагментов 28S, 18S, 5.8S, 5S, 16S и 12S человеческого происхождения. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения набор зондов содержит по меньшей мере два ДНК-зонда, которые гибридизуются с одной или более или двумя или более молекулами РНК крысы и (или) мыши, не являющимися мишенью, при необходимости выбранными из фрагментов 16S крысы, 28S крысы, 16S мыши, 28S мыши и их комбинаций. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения набор зондов содержит по меньшей мере два ДНК-зонда, которые гибридизуются с одной или более молекулами РНК, не являющимися мишенью, выбранными из HBA-A1, HBA-A2, HBB, HBB-B1, HBB-B2, HBG1 и HBG2 из гемоглобина. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения набор зондов содержит по меньшей мере два ДНК-зонда, которые гибридизуются с одной или более молекулами РНК, не являющимися мишенью, выбранными из 23S, 16S и 5S из грамположительных и (или) грамотрицательных бактерий. мРНК глобина для деплеции могут включать в себя, без ограничений, мРНК у мышей или крыс, включая HBA-A1, HBA-A2, HBB, HBB-B1, HBB-B2, а также у человека, включая HBA-A1, HBA-A2, HBB, HGB1 и HGB2. Митохондриальные рРНК, приемлемые для деплеции, включают в себя 18S и 12S (человека и грызунов). Ядерные рРНК, подходящие для деплеции, включают 28S, 18S, 5.8S и 5S (человека и грызунов) и прокариотические рРНК, включающие 5S, 16S и 23S. В некоторых образцах также может быть желательной деплеция рРНК видов Archaea, например 23S, 16S или 5S рРНК. В дополнительных вариантах осуществления настоящего изобретения набор зондов содержит по меньшей мере два ДНК-зонда, комплементарных двум или более последовательностям рРНК, выбранным из группы, состоящей из грамположительных или грамотрицательных бактериальных 5S, 16S и 23S рРНК. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения набор зондов содержит по меньшей мере два (или пять, или 10 или 20) ДНК-зонда, комплементарных каждому из 28S, 18S, 5.8S, 5S, 16S и 12S мРНК глобина HBA-A1, HBA-A2, HBB, HBG1 и HBG2 человека и грамположительных или грамотрицательных бактериальных 5S, 16S и 23S рРНК. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения зонды к конкретной молекуле РНК, которая не является мишенью, комплементарны к ее последовательности приблизительно на 80-85%, причем бреши между каждым местом гибридизации зонда составляют по меньшей мере 5 или 10 оснований.
[0043] В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения набор зондов содержит две или более, или пять или более, или 10 или более, или 25 или более, или 50 или более, или 100 или более, или 150 или более, или 200 или более, или 250 или более, или 300 или более, или 333 последовательности из номеров SEQ ID NO: 1-333 (человека, грамположительных и грамотрицательных бактерий). В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения набор зондов содержит две или более, или пять или более, или 10 или более, или 25 или более, или 50 или более, или 100 или более, или 150 или более, или 200 или более, или 250 или более, или 300 или более, или 350 или более, или 400 или более, или 428 последовательностей из номеров SEQ ID NO: 1-428 (человека, грамположительных и грамотрицательных бактерий, Archaea, мыши и крысы). В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения набор зондов содержит две или более, или пять или более, или 10 или более, или 25 или более, или 50 или более, или 100 или более, или 150 или более, или 200 или более, или 250 или более, или 300 или более, или 350 или более, или 377 последовательностей из номеров SEQ ID NO: 1-377 (человека, грамположительных и грамотрицательных бактерий и Archaea). В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения набор зондов содержит две или более, или пять или более, или 10 или более, или 25 или более, или 50 или более, или 100 или более, или 150 или более, или 200 или более, или 250 или более, или 300 или более, или 350 или более, или 384 последовательности из номеров SEQ ID NO: 1-333 (человека, грамположительных и грамотрицательных бактерий) и номеров SEQ ID NO: 378-428 (мыши и крысы). В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения набор зондов содержит две или более, или пять или более, или 10 или более, или 25 или более, или 44 последовательности из номеров SEQ ID NO: 334-377 (Archaea). В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения набор зондов содержит две или более, или пять или более, или 10 или более, или 25 или более, или 50 или более, или 51 последовательность из номеров SEQ ID NO: 378-428 (мыши и крысы).
[0044] В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения ДНК-зонды частично или полностью комплементарны и содержат последовательности, которые гибридизуются с 28S, 18S, 5.8S и (или) 5S рРНК человека, например последовательности ДНК-зондов согласно таблице 1, от SEQ ID NO: 40 до SEQ ID NO: 150. Во втором варианте осуществления настоящего изобретения ДНК-зонды включают последовательности, которые гибридизуются с митохондриальными 16S и (или) 12S рРНК, например последовательности ДНК-зонда, как показано в таблице 1, от SEQ ID NO: 1 до SEQ ID NO: 39. В других вариантах осуществления настоящего изобретения ДНК-зонды включают последовательности, которые гибридизуются с мРНК гемоглобина, включая HBA-A1, HBA-A2, HBB, HBB-B1, HBB-B2, HBG1 и (или) HBG2, например последовательности ДНК-зондов, показанные в таблице 1, от SEQ ID NO: 151 до SEQ ID NO: 194. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения ДНК-зонды включают последовательности, которые гибридизуются с бактериальными рРНК, такими как грамположительные и (или) грамотрицательные бактериальные рРНК 23S, 16S и (или) 5S, например последовательности ДНК-зондов, как показано в таблице 1, от SEQ ID NO: 195 до SEQ ID NO: 262 (грамотрицательный бактериальный представитель E. coli) и от SEQ ID NO: 263 до SEQ ID NO: 333 (грамположительный бактериальный представитель Bacillus subtilis). В других вариантах осуществления настоящего изобретения ДНК-зонды включают последовательности, гибридизующиеся с рРНК Archaea, такие как рРНК 23S, 16S и (или) 5S, например последовательности ДНК-зонда, показанные в таблице 1, от SEQ ID NO: 334 до SEQ ID NO: 384, которые гибридизуются с рРНК из видов Archaea Methanobrevibacter smithii. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения ДНК-зонды включают последовательности, которые гибридизуются с мышиными рРНК, такими как 16S и (или) 28S мыши, например последовательности ДНК-зонда, показанные в таблице 1, от SEQ ID NO: 385 до SEQ ID NO: 393 и от SEQ ID NO: 400 до SEQ ID NO: 419. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения ДНК-зонды включают последовательности, которые гибридизуются с крысиными рРНК, такие как 16S и (или) 28S крысы, например последовательности ДНК-зонда, показанные в таблице 1, от SEQ ID NO: 394 до SEQ ID NO: 399 и от SEQ ID NO: 420 до SEQ ID NO: 428.
Таблица 1. Последовательности ДНК-зонда для удаления нежелательных молекул РНК
| SEQ ID NO | Название зонда | Последовательность зонда 5'-3' |
| 1 | 12S_P1 | GTTCGTCCAAGTGCACTTTCCAGTACACTTACCATGTTACGACTTGTCTC |
| 2 | 12S_P2 | TAGGGGTTTTAGTTAAATGTCCTTTGAAGTATACTTGAGGAGGGTGACGG |
| 3 | 12S_P3 | TTCAGGGCCCTGTTCAACTAAGCACTCTACTCTCAGTTTACTGCTAAATC |
| 4 | 12S_P4 | AGTTTCATAAGGGCTATCGTAGTTTTCTGGGGTAGAAAATGTAGCCCATT |
| 5 | 12S_P5 | GGCTACACCTTGACCTAACGTCTTTACGTGGGTACTTGCGCTTACTTTGT |
| 6 | 12S_P6 | TTGCTGAAGATGGCGGTATATAGGCTGAGCAAGAGGTGGTGAGGTTGATC |
| 7 | 12S_P7 | CAGAACAGGCTCCTCTAGAGGGATATGAAGCACCGCCAGGTCCTTTGAGT |
| 8 | 12S_P8 | GTAGTGTTCTGGCGAGCAGTTTTGTTGATTTAACTGTTGAGGTTTAGGGC |
| 9 | 12S_P9 | ATCTAATCCCAGTTTGGGTCTTAGCTATTGTGTGTTCAGATATGTTAAAG |
| 10 | 12S_P10 | ATTTTGTGTCAACTGGAGTTTTTTACAACTCAGGTGAGTTTTAGCTTTAT |
| 11 | 12S_P11 | CTAAAACACTCTTTACGCCGGCTTCTATTGACTTGGGTTAATCGTGTGAC |
| 12 | 12S_P12 | GAAATTGACCAACCCTGGGGTTAGTATAGCTTAGTTAAACTTTCGTTTAT |
| 13 | 12S_P13 | ACTGCTGTTTCCCGTGGGGGTGTGGCTAGGCTAAGCGTTTTGAGCTGCAT |
| 14 | 12S_P14 | GCTTGTCCCTTTTGATCGTGGTGATTTAGAGGGTGAACTCACTGGAACGG |
| 15 | 12S_P15 | TAATCTTACTAAGAGCTAATAGAAAGGCTAGGACCAAACCTATTTGTTTA |
| 16 | 16S_P1 | AAACCCTGTTCTTGGGTGGGTGTGGGTATAATACTAAGTTGAGATGATAT |
| 17 | 16S_P2 | GCGCTTTGTGAAGTAGGCCTTATTTCTCTTGTCCTTTCGTACAGGGAGGA |
| 18 | 16S_P3 | AAACCGACCTGGATTACTCCGGTCTGAACTCAGATCACGTAGGACTTTAA |
| 19 | 16S_P4 | ACCTTTAATAGCGGCTGCACCATCGGGATGTCCTGATCCAACATCGAGGT |
| 20 | 16S_P5 | TGATATGGACTCTAGAATAGGATTGCGCTGTTATCCCTAGGGTAACTTGT |
| 21 | 16S_P6 | ATTGGATCAATTGAGTATAGTAGTTCGCTTTGACTGGTGAAGTCTTAGCA |
| 22 | 16S_P7 | TTGGGTTCTGCTCCGAGGTCGCCCCAACCGAAATTTTTAATGCAGGTTTG |
| 23 | 16S_P8 | TGGGTTTGTTAGGTACTGTTTGCATTAATAAATTAAAGCTCCATAGGGTC |
| 24 | 16S_P9 | GTCATGCCCGCCTCTTCACGGGCAGGTCAATTTCACTGGTTAAAAGTAAG |
| 25 | 16S_P10 | CGTGGAGCCATTCATACAGGTCCCTATTTAAGGAACAAGTGATTATGCTA |
| 26 | 16S_P11 | GGTACCGCGGCCGTTAAACATGTGTCACTGGGCAGGCGGTGCCTCTAATA |
| 27 | 16S_P12 | GTGATGTTTTTGGTAAACAGGCGGGGTAAGGTTTGCCGAGTTCCTTTTAC |
| 28 | 16S_P13 | CTTATGAGCATGCCTGTGTTGGGTTGACAGTGAGGGTAATAATGACTTGT |
| 29 | 16S_P14 | ATTGGGCTGTTAATTGTCAGTTCAGTGTTTTGATCTGACGCAGGCTTATG |
| 30 | 16S_P15 | TCATGTTACTTATACTAACATTAGTTCTTCTATAGGGTGATAGATTGGTC |
| 31 | 16S_P16 | AGTTCAGTTATATGTTTGGGATTTTTTAGGTAGTGGGTGTTGAGCTTGAA |
| 32 | 16S_P17 | TGGCTGCTTTTAGGCCTACTATGGGTGTTAAATTTTTTACTCTCTCTACA |
| 33 | 16S_P18 | GTCCAAAGAGCTGTTCCTCTTTGGACTAACAGTTAAATTTACAAGGGGAT |
| 34 | 16S_P19 | GGCAAATTTAAAGTTGAACTAAGATTCTATCTTGGACAACCAGCTATCAC |
| 35 | 16S_P20 | TGTCGCCTCTACCTATAAATCTTCCCACTATTTTGCTACATAGACGGGTG |
| 36 | 16S_P21 | TCTTAGGTAGCTCGTCTGGTTTCGGGGGTCTTAGCTTTGGCTCTCCTTGC |
| 37 | 16S_P22 | TAATTCATTATGCAGAAGGTATAGGGGTTAGTCCTTGCTATATTATGCTT |
| 38 | 16S_P23 | TCTTTCCCTTGCGGTACTATATCTATTGCGCCAGGTTTCAATTTCTATCG |
| 39 | 16S_P24 | GGTAAATGGTTTGGCTAAGGTTGTCTGGTAGTAAGGTGGAGTGGGTTTGG |
| 40 | 18S_P1 | TAATGATCCTTCCGCAGGTTCACCTACGGAAACCTTGTTACGACTTTTAC |
| 41 | 18S_P2 | AAGTTCGACCGTCTTCTCAGCGCTCCGCCAGGGCCGTGGGCCGACCCCGG |
| 42 | 18S_P3 | GGCCTCACTAAACCATCCAATCGGTAGTAGCGACGGGCGGTGTGTACAAA |
| 43 | 18S_P4 | CAACGCAAGCTTATGACCCGCACTTACTCGGGAATTCCCTCGTTCATGGG |
| 44 | 18S_P5 | CCGATCCCCATCACGAATGGGGTTCAACGGGTTACCCGCGCCTGCCGGCG |
| 45 | 18S_P6 | CTGAGCCAGTCAGTGTAGCGCGCGTGCAGCCCCGGACATCTAAGGGCATC |
| 46 | 18S_P7 | CTCAATCTCGGGTGGCTGAACGCCACTTGTCCCTCTAAGAAGTTGGGGGA |
| 47 | 18S_P8 | GGTCGCGTAACTAGTTAGCATGCCAGAGTCTCGTTCGTTATCGGAATTAA |
| 48 | 18S_P9 | CACCAACTAAGAACGGCCATGCACCACCACCCACGGAATCGAGAAAGAGC |
| 49 | 18S_P10 | CCTGTCCGTGTCCGGGCCGGGTGAGGTTTCCCGTGTTGAGTCAAATTAAG |
| 50 | 18S_P11 | CTGGTGGTGCCCTTCCGTCAATTCCTTTAAGTTTCAGCTTTGCAACCATA |
| 51 | 18S_P12 | AAAGACTTTGGTTTCCCGGAAGCTGCCCGGCGGGTCATGGGAATAACGCC |
| 52 | 18S_P13 | GGCATCGTTTATGGTCGGAACTACGACGGTATCTGATCGTCTTCGAACCT |
| 53 | 18S_P14 | GATTAATGAAAACATTCTTGGCAAATGCTTTCGCTCTGGTCCGTCTTGCG |
| 54 | 18S_P15 | CACCTCTAGCGGCGCAATACGAATGCCCCCGGCCGTCCCTCTTAATCATG |
| 55 | 18S_P16 | ACCAACAAAATAGAACCGCGGTCCTATTCCATTATTCCTAGCTGCGGTAT |
| 56 | 18S_P17 | CTGCTTTGAACACTCTAATTTTTTCAAAGTAAACGCTTCGGGCCCCGCGG |
| 57 | 18S_P18 | GCATCGAGGGGGCGCCGAGAGGCAAGGGGCGGGGACGGGCGGTGGCTCGC |
| 58 | 18S_P19 | CCGCCCGCTCCCAAGATCCAACTACGAGCTTTTTAACTGCAGCAACTTTA |
| 59 | 18S_P20 | GCTGGAATTACCGCGGCTGCTGGCACCAGACTTGCCCTCCAATGGATCCT |
| 60 | 18S_P21 | AGTGGACTCATTCCAATTACAGGGCCTCGAAAGAGTCCTGTATTGTTATT |
| 61 | 18S_P22 | CCCGGGTCGGGAGTGGGTAATTTGCGCGCCTGCTGCCTTCCTTGGATGTG |
| 62 | 18S_P23 | GCTCCCTCTCCGGAATCGAACCCTGATTCCCCGTCACCCGTGGTCACCAT |
| 63 | 18S_P24 | TACCATCGAAAGTTGATAGGGCAGACGTTCGAATGGGTCGTCGCCGCCAC |
| 64 | 18S_P25 | GGCCCGAGGTTATCTAGAGTCACCAAAGCCGCCGGCGCCCGCCCCCCGGC |
| 65 | 18S_P26 | GCTGACCGGGTTGGTTTTGATCTGATAAATGCACGCATCCCCCCCGCGAA |
| 66 | 18S_P27 | TCGGCATGTATTAGCTCTAGAATTACCACAGTTATCCAAGTAGGAGAGGA |
| 67 | 18S_P28 | AACCATAACTGATTTAATGAGCCATTCGCAGTTTCACTGTACCGGCCGTG |
| 68 | 18S_P29 | ATGGCTTAATCTTTGAGACAAGCATATGCTACTGGCAGGATCAACCAGGT |
| 69 | 28S_P1 | GACAAACCCTTGTGTCGAGGGCTGACTTTCAATAGATCGCAGCGAGGGAG |
| 70 | 28S_P2 | CGAAACCCCGACCCAGAAGCAGGTCGTCTACGAATGGTTTAGCGCCAGGT |
| 71 | 28S_P3 | GGTGCGTGACGGGCGAGGGGGCGGCCGCCTTTCCGGCCGCGCCCCGTTTC |
| 72 | 28S_P4 | CTCCGCACCGGACCCCGGTCCCGGCGCGCGGCGGGGCACGCGCCCTCCCG |
| 73 | 28S_P5 | AGGGGGGGGCGGCCCGCCGGCGGGGACAGGCGGGGGACCGGCTATCCGAG |
| 74 | 28S_P6 | GCGGCGCTGCCGTATCGTTCGCCTGGGCGGGATTCTGACTTAGAGGCGTT |
| 75 | 28S_P7 | AGATGGTAGCTTCGCCCCATTGGCTCCTCAGCCAAGCACATACACCAAAT |
| 76 | 28S_P8 | TCCTCTCGTACTGAGCAGGATTACCATGGCAACAACACATCATCAGTAGG |
| 77 | 28S_P9 | CTCACGACGGTCTAAACCCAGCTCACGTTCCCTATTAGTGGGTGAACAAT |
| 78 | 28S_P10 | TTCTGCTTCACAATGATAGGAAGAGCCGACATCGAAGGATCAAAAAGCGA |
| 79 | 28S_P11 | TTGGCCGCCACAAGCCAGTTATCCCTGTGGTAACTTTTCTGACACCTCCT |
| 80 | 28S_P12 | GGTCAGAAGGATCGTGAGGCCCCGCTTTCACGGTCTGTATTCGTACTGAA |
| 81 | 28S_P13 | AGCTTTTGCCCTTCTGCTCCACGGGAGGTTTCTGTCCTCCCTGAGCTCGC |
| 82 | 28S_P14 | TTACCGTTTGACAGGTGTACCGCCCCAGTCAAACTCCCCACCTGGCACTG |
| 83 | 28S_P15 | GCGCCCGGCCGGGCGGGCGCTTGGCGCCAGAAGCGAGAGCCCCTCGGGCT |
| 84 | 28S_P16 | CCGGGTCAGTGAAAAAACGATCAGAGTAGTGGTATTTCACCGGCGGCCCG |
| 85 | 28S_P17 | CGCCCCGGGCCCCTCGCGGGGACACCGGGGGGGCGCCGGGGGCCTCCCAC |
| 86 | 28S_P18 | CATGTCTCTTCACCGTGCCAGACTAGAGTCAAGCTCAACAGGGTCTTCTT |
| 87 | 28S_P19 | CCAAGCCCGTTCCCTTGGCTGTGGTTTCGCTGGATAGTAGGTAGGGACAG |
| 88 | 28S_P20 | TCCATTCATGCGCGTCACTAATTAGATGACGAGGCATTTGGCTACCTTAA |
| 89 | 28S_P21 | TCCCGCCGTTTACCCGCGCTTCATTGAATTTCTTCACTTTGACATTCAGA |
| 90 | 28S_P22 | CACATCGCGTCAACACCCGCCGCGGGCCTTCGCGATGCTTTGTTTTAATT |
| 91 | 28S_P23 | CCTGGTCCGCACCAGTTCTAAGTCGGCTGCTAGGCGCCGGCCGAGGCGAG |
| 92 | 28S_P24 | CGGCCCCGGGGGCGGACCCGGCGGGGGGGACCGGCCCGCGGCCCCTCCGC |
| 93 | 28S_P25 | CCGCCGCGCGCCGAGGAGGAGGGGGGAACGGGGGGCGGACGGGGCCGGGG |
| 94 | 28S_P26 | ACGAACCGCCCCGCCCCGCCGCCCGCCGACCGCCGCCGCCCGACCGCTCC |
| 95 | 28S_P27 | CGCGCGCGACCGAGACGTGGGGTGGGGGTGGGGGGCGCGCCGCGCCGCCG |
| 96 | 28S_P28 | GCGGCCGCGACGCCCGCCGCAGCTGGGGCGATCCACGGGAAGGGCCCGGC |
| 97 | 28S_P29 | GCGCCGCCGCCGGCCCCCCGGGTCCCCGGGGCCCCCCTCGCGGGGACCTG |
| 98 | 28S_P30 | CCGGCGGCCGCCGCGCGGCCCCTGCCGCCCCGACCCTTCTCCCCCCGCCG |
| 99 | 28S_P31 | CTCCCCCGGGGAGGGGGGAGGACGGGGAGCGGGGGAGAGAGAGAGAGAGA |
| 100 | 28S_P32 | AGGGAGCGAGCGGCGCGCGCGGGTGGGGCGGGGGAGGGCCGCGAGGGGGG |
| 101 | 28S_P33 | GGGGGCGCGCGCCTCGTCCAGCCGCGGCGCGCGCCCAGCCCCGCTTCGCG |
| 102 | 28S_P34 | CCCAGCCCTTAGAGCCAATCCTTATCCCGAAGTTACGGATCCGGCTTGCC |
| 103 | 28S_P35 | CATTGTTCCAACATGCCAGAGGCTGTTCACCTTGGAGACCTGCTGCGGAT |
| 104 | 28S_P36 | CGCGAGATTTACACCCTCTCCCCCGGATTTTCAAGGGCCAGCGAGAGCTC |
| 105 | 28S_P37 | AACCGCGACGCTTTCCAAGGCACGGGCCCCTCTCTCGGGGCGAACCCATT |
| 106 | 28S_P38 | CTTCACAAAGAAAAGAGAACTCTCCCCGGGGCTCCCGCCGGCTTCTCCGG |
| 107 | 28S_P39 | CGCACTGGACGCCTCGCGGCGCCCATCTCCGCCACTCCGGATTCGGGGAT |
| 108 | 28S_P40 | TTTCGATCGGCCGAGGGCAACGGAGGCCATCGCCCGTCCCTTCGGAACGG |
| 109 | 28S_P41 | CAGGACCGACTGACCCATGTTCAACTGCTGTTCACATGGAACCCTTCTCC |
| 110 | 28S_P42 | GTTCTCGTTTGAATATTTGCTACTACCACCAAGATCTGCACCTGCGGCGG |
| 111 | 28S_P43 | CGCCCTAGGCTTCAAGGCTCACCGCAGCGGCCCTCCTACTCGTCGCGGCG |
| 112 | 28S_P44 | TCCGGGGGCGGGGAGCGGGGCGTGGGCGGGAGGAGGGGAGGAGGCGTGGG |
| 113 | 28S_P45 | AGGACCCCACACCCCCGCCGCCGCCGCCGCCGCCGCCCTCCGACGCACAC |
| 114 | 28S_P46 | GCGCGCCGCCCCCGCCGCTCCCGTCCACTCTCGACTGCCGGCGACGGCCG |
| 115 | 28S_P47 | CTCCAGCGCCATCCATTTTCAGGGCTAGTTGATTCGGCAGGTGAGTTGTT |
| 116 | 28S_P48 | GATTCCGACTTCCATGGCCACCGTCCTGCTGTCTATATCAACCAACACCT |
| 117 | 28S_P49 | GAGCGTCGGCATCGGGCGCCTTAACCCGGCGTTCGGTTCATCCCGCAGCG |
| 118 | 28S_P50 | AAAAGTGGCCCACTAGGCACTCGCATTCCACGCCCGGCTCCACGCCAGCG |
| 119 | 28S_P51 | CCATTTAAAGTTTGAGAATAGGTTGAGATCGTTTCGGCCCCAAGACCTCT |
| 120 | 28S_P52 | CGGATAAAACTGCGTGGCGGGGGTGCGTCGGGTCTGCGAGAGCGCCAGCT |
| 121 | 28S_P53 | TCGGAGGGAACCAGCTACTAGATGGTTCGATTAGTCTTTCGCCCCTATAC |
| 122 | 28S_P54 | GATTTGCACGTCAGGACCGCTACGGACCTCCACCAGAGTTTCCTCTGGCT |
| 123 | 28S_P55 | ATAGTTCACCATCTTTCGGGTCCTAACACGTGCGCTCGTGCTCCACCTCC |
| 124 | 28S_P56 | AGACGGGCCGGTGGTGCGCCCTCGGCGGACTGGAGAGGCCTCGGGATCCC |
| 125 | 28S_P57 | CGCGCCGGCCTTCACCTTCATTGCGCCACGGCGGCTTTCGTGCGAGCCCC |
| 126 | 28S_P58 | TTAGACTCCTTGGTCCGTGTTTCAAGACGGGTCGGGTGGGTAGCCGACGT |
| 127 | 28S_P59 | GCGCTCGCTCCGCCGTCCCCCTCTTCGGGGGACGCGCGCGTGGCCCCGAG |
| 128 | 28S_P60 | CCCGACGGCGCGACCCGCCCGGGGCGCACTGGGGACAGTCCGCCCCGCCC |
| 129 | 28S_P61 | GCACCCCCCCCGTCGCCGGGGCGGGGGCGCGGGGAGGAGGGGTGGGAGAG |
| 130 | 28S_P62 | AGGGGTGGCCCGGCCCCCCCACGAGGAGACGCCGGCGCGCCCCCGCGGGG |
| 131 | 28S_P63 | GGGGATTCCCCGCGGGGGTGGGCGCCGGGAGGGGGGAGAGCGCGGCGACG |
| 132 | 28S_P64 | GCCCCGGGATTCGGCGAGTGCTGCTGCCGGGGGGGCTGTAACACTCGGGG |
| 133 | 28S_P65 | CCGCCCCCGCCGCCGCCGCCACCGCCGCCGCCGCCGCCGCCCCGACCCGC |
| 134 | 28S_P66 | AGGACGCGGGGCCGGGGGGCGGAGACGGGGGAGGAGGAGGACGGACGGAC |
| 135 | 28S_P67 | AGCCACCTTCCCCGCCGGGCCTTCCCAGCCGTCCCGGAGCCGGTCGCGGC |
| 136 | 28S_P68 | AAATGCGCCCGGCGGCGGCCGGTCGCCGGTCGGGGGACGGTCCCCCGCCG |
| 137 | 28S_P69 | CCGCCCGCCCACCCCCGCACCCGCCGGAGCCCGCCCCCTCCGGGGAGGAG |
| 138 | 28S_P70 | GGGAAGGGAGGGCGGGTGGAGGGGTCGGGAGGAACGGGGGGCGGGAAAGA |
| 139 | 28S_P71 | ACACGGCCGGACCCGCCGCCGGGTTGAATCCTCCGGGCGGACTGCGCGGA |
| 140 | 28S_P72 | TCTTAACGGTTTCACGCCCTCTTGAACTCTCTCTTCAAAGTTCTTTTCAA |
| 141 | 28S_P73 | CTTGTTGACTATCGGTCTCGTGCCGGTATTTAGCCTTAGATGGAGTTTAC |
| 142 | 28S_P74 | GCATTCCCAAGCAACCCGACTCCGGGAAGACCCGGGCGCGCGCCGGCCGC |
| 143 | 28S_P75 | GTCCACGGGCTGGGCCTCGATCAGAAGGACTTGGGCCCCCCACGAGCGGC |
| 144 | 28S_P76 | TTCCGTACGCCACATGTCCCGCGCCCCGCGGGGCGGGGATTCGGCGCTGG |
| 145 | 28S_P77 | CTCGCCGTTACTGAGGGAATCCTGGTTAGTTTCTTTTCCTCCGCTGACTA |
| 146 | 28S_P78 | GCGGGTCGCCACGTCTGATCTGAGGTCGCGTCTCGGAGGGGGACGGGCCG |
| 147 | 5.8S_P1 | AAGCGACGCTCAGACAGGCGTAGCCCCGGGAGGAACCCGGGGCCGCAAGT |
| 148 | 5.8S_P3 | GCAGCTAGCTGCGTTCTTCATCGACGCACGAGCCGAGTGATCCACCGCTA |
| 149 | 5S_P1 | AAAGCCTACAGCACCCGGTATTCCCAGGCGGTCTCCCATCCAAGTACTAA |
| 150 | 5S_P3 | TTCCGAGATCAGACGAGATCGGGCGCGTTCAGGGTGGTATGGCCGTAGAC |
| 151 | HBA1_P1 | GCCGCCCACTCAGACTTTATTCAAAGACCACGGGGGTACGGGTGCAGGAA |
| 152 | HBA1_P2 | GGGGGAGGCCCAAGGGGCAAGAAGCATGGCCACCGAGGCTCCAGCTTAAC |
| 153 | HBA1_P3 | GCACGGTGCTCACAGAAGCCAGGAACTTGTCCAGGGAGGCGTGCACCGCA |
| 154 | HBA1_P4 | GGGAGGTGGGCGGCCAGGGTCACCAGCAGGCAGTGGCTTAGGAGCTTGAA |
| 155 | HBA1_P5 | CCGAAGCTTGTGCGCGTGCAGGTCGCTCAGGGCGGACAGCGCGTTGGGCA |
| 156 | HBA1_P6 | CCACGGCGTTGGTCAGCGCGTCGGCCACCTTCTTGCCGTGGCCCTTAACC |
| 157 | HBA1_P7 | CTCAGGTCGAAGTGCGGGAAGTAGGTCTTGGTGGTGGGGAAGGACAGGAA |
| 158 | HBA1_P8 | CTCCGCACCATACTCGCCAGCGTGCGCGCCGACCTTACCCCAGGCGGCCT |
| 159 | HBA1_P9 | CGGCAGGAGACAGCACCATGGTGGGTTCTCTCTGAGTCTGTGGGGACCAG |
| 160 | HBA2_P1 | GAGGGGAGGAGGGCCCGTTGGGAGGCCCAGCGGGCAGGAGGAACGGCTAC |
| 161 | HBA2_P2 | ACGGTATTTGGAGGTCAGCACGGTGCTCACAGAAGCCAGGAACTTGTCCA |
| 162 | HBA2_P3 | CAGGGGTGAACTCGGCGGGGAGGTGGGCGGCCAGGGTCACCAGCAGGCAG |
| 163 | HBA2_P4 | AAGTTGACCGGGTCCACCCGAAGCTTGTGCGCGTGCAGGTCGCTCAGGGC |
| 164 | HBA2_P5 | CATGTCGTCCACGTGCGCCACGGCGTTGGTCAGCGCGTCGGCCACCTTCT |
| 165 | HBA2_P6 | CCTGGGCAGAGCCGTGGCTCAGGTCGAAGTGCGGGAAGTAGGTCTTGGTG |
| 166 | HBA2_P7 | AACATCCTCTCCAGGGCCTCCGCACCATACTCGCCAGCGTGCGCGCCGAC |
| 167 | HBA2_P8 | CTTGACGTTGGTCTTGTCGGCAGGAGACAGCACCATGGTGGGTTCTCTCT |
| 168 | HBB_P1 | GCAATGAAAATAAATGTTTTTTATTAGGCAGAATCCAGATGCTCAAGGCC |
| 169 | HBB_P2 | CAGTTTAGTAGTTGGACTTAGGGAACAAAGGAACCTTTAATAGAAATTGG |
| 170 | HBB_P3 | GCTTAGTGATACTTGTGGGCCAGGGCATTAGCCACACCAGCCACCACTTT |
| 171 | HBB_P4 | CACTGGTGGGGTGAATTCTTTGCCAAAGTGATGGGCCAGCACACAGACCA |
| 172 | HBB_P5 | GCCTGAAGTTCTCAGGATCCACGTGCAGCTTGTCACAGTGCAGCTCACTC |
| 173 | HBB_P6 | CCCTTGAGGTTGTCCAGGTGAGCCAGGCCATCACTAAAGGCACCGAGCAC |
| 174 | HBB_P7 | CTTCACCTTAGGGTTGCCCATAACAGCATCAGGAGTGGACAGATCCCCAA |
| 175 | HBB_P8 | TCTGGGTCCAAGGGTAGACCACCAGCAGCCTGCCCAGGGCCTCACCACCA |
| 176 | HBB_P9 | ACCTTGCCCCACAGGGCAGTAACGGCAGACTTCTCCTCAGGAGTCAGATG |
| 177 | HBG1_P1 | GTGATCTCTCAGCAGAATAGATTTATTATTTGTATTGCTTGCAGAATAAA |
| 178 | HBG1_P2 | CTCTGAATCATGGGCAGTGAGCTCAGTGGTATCTGGAGGACAGGGCACTG |
| 179 | HBG1_P3 | ATCTTCTGCCAGGAAGCCTGCACCTCAGGGGTGAATTCTTTGCCGAAATG |
| 180 | HBG1_P4 | CACCAGCACATTTCCCAGGAGCTTGAAGTTCTCAGGATCCACATGCAGCT |
| 181 | HBG1_P5 | CACTCAGCTGGGCAAAGGTGCCCTTGAGATCATCCAGGTGCTTTGTGGCA |
| 182 | HBG1_P6 | AGCACCTTCTTGCCATGTGCCTTGACTTTGGGGTTGCCCATGATGGCAGA |
| 183 | HBG1_P7 | GCCAAAGCTGTCAAAGAACCTCTGGGTCCATGGGTAGACAACCAGGAGCC |
| 184 | HBG1_P8 | CTCCAGCATCTTCCACATTCACCTTGCCCCACAGGCTTGTGATAGTAGCC |
| 185 | HBG1_P9 | AAATGACCCATGGCGTCTGGACTAGGAGCTTATTGATAACCTCAGACGTT |
| 186 | HBG2_P1 | GTGATCTCTTAGCAGAATAGATTTATTATTTGATTGCTTGCAGAATAAAG |
| 187 | HBG2_P2 | TCTGCATCATGGGCAGTGAGCTCAGTGGTATCTGGAGGACAGGGCACTGG |
| 188 | HBG2_P3 | TCTTCTGCCAGGAAGCCTGCACCTCAGGGGTGAATTCTTTGCCGAAATGG |
| 189 | HBG2_P4 | ACCAGCACATTTCCCAGGAGCTTGAAGTTCTCAGGATCCACATGCAGCTT |
| 190 | HBG2_P5 | ACTCAGCTGGGCAAAGGTGCCCTTGAGATCATCCAGGTGCTTTATGGCAT |
| 191 | HBG2_P6 | GCACCTTCTTGCCATGTGCCTTGACTTTGGGGTTGCCCATGATGGCAGAG |
| 192 | HBG2_P7 | CCAAAGCTGTCAAAGAACCTCTGGGTCCATGGGTAGACAACCAGGAGCCT |
| 193 | HBG2_P8 | TCCAGCATCTTCCACATTCACCTTGCCCCACAGGCTTGTGATAGTAGCCT |
| 194 | HBG2_P9 | AATGACCCATGGCGTCTGGACTAGGAGCTTATTGATAACCTCAGACGTTC |
| 195 | 5S_GNbac_P1 | ATGCCTGGCAGTTCCCTACTCTCGCATGGGGAGACCCCACACTACCATCG |
| 196 | 5S_GNbac_P2 | ACTTCTGAGTTCGGCATGGGGTCAGGTGGGACCACCGCGCTACGGCCGCC |
| 197 | 16S_GNbac_P1 | GGTTACCTTGTTACGACTTCACCCCAGTCATGAATCACAAAGTGGTAAGT |
| 198 | 16S_GNbac_P2 | AAGCTACCTACTTCTTTTGCAACCCACTCCCATGGTGTGACGGGCGGTGT |
| 199 | 16S_GNbac_P3 | ACGTATTCACCGTGGCATTCTGATCCACGATTACTAGCGATTCCGACTTC |
| 200 | 16S_GNbac_P4 | AGACTCCAATCCGGACTACGACGCACTTTATGAGGTCCGCTTGCTCTCGC |
| 201 | 16S_GNbac_P5 | TGTATGCGCCATTGTAGCACGTGTGTAGCCCTGGTCGTAAGGGCCATGAT |
| 202 | 16S_GNbac_P6 | CCACCTTCCTCCAGTTTATCACTGGCAGTCTCCTTTGAGTTCCCGGCCGG |
| 203 | 16S_GNbac_P7 | GGATAAGGGTTGCGCTCGTTGCGGGACTTAACCCAACATTTCACAACACG |
| 204 | 16S_GNbac_P8 | TGCAGCACCTGTCTCACGGTTCCCGAAGGCACATTCTCATCTCTGAAAAC |
| 205 | 16S_GNbac_P9 | GACCAGGTAAGGTTCTTCGCGTTGCATCGAATTAAACCACATGCTCCACC |
| 206 | 16S_GNbac_P10 | CGTCAATTCATTTGAGTTTTAACCTTGCGGCCGTACTCCCCAGGCGGTCG |
| 207 | 16S_GNbac_P11 | TCCGGAAGCCACGCCTCAAGGGCACAACCTCCAAGTCGACATCGTTTACG |
| 208 | 16S_GNbac_P12 | GTATCTAATCCTGTTTGCTCCCCACGCTTTCGCACTGAGCGTCAGTCTTC |
| 209 | 16S_GNbac_P13 | TTCGCCACCGGTATTCCTCCAGATCTCTACGCATTTCACCGCTACACCTG |
| 210 | 16S_GNbac_P14 | CTACGAGACTCAAGCTTGCCAGTATCAGATGCAGTTCCCAGGTTGAGCCC |
| 211 | 16S_GNbac_P15 | GACTTAACAAACCGCCTGCGTGCGCTTTACGCCCAGTAATTCCGATTAAC |
| 212 | 16S_GNbac_P16 | ATTACCGCGGCTGCTGGCACGGAGTTAGCCGGTGCTTCTTCTGCGGGTAA |
| 213 | 16S_GNbac_P17 | GTATTAACTTTACTCCCTTCCTCCCCGCTGAAAGTACTTTACAACCCGAA |
| 214 | 16S_GNbac_P18 | CGCGGCATGGCTGCATCAGGCTTGCGCCCATTGTGCAGTATTCCCCACTG |
| 215 | 16S_GNbac_P19 | GTCTGGACCGTGTCTCAGTTCCAGTGTGGCTGGTCATCCTCTCAGACCAG |
| 216 | 16S_GNbac_P20 | TAGGTGAGCCGTTACCCCACCTACTAGCTAATCCCATCTGGGCACATCCG |
| 217 | 16S_GNbac_P21 | AAGGTCCCCCTCTTTGGTCTTGCGACGTTATGCGGTATTAGCTACCGTTT |
| 218 | 16S_GNbac_P22 | CTCCATCAGGCAGTTTCCCAGACATTACTCACCCGTCCGCCACTCGTCAG |
| 219 | 23S_GNbac_P1 | AAGGTTAAGCCTCACGGTTCATTAGTACCGGTTAGCTCAACGCATCGCTG |
| 220 | 23S_GNbac_P2 | CCTATCAACGTCGTCGTCTTCAACGTTCCTTCAGGACCCTTAAAGGGTCA |
| 221 | 23S_GNbac_P3 | GGGGCAAGTTTCGTGCTTAGATGCTTTCAGCACTTATCTCTTCCGCATTT |
| 222 | 23S_GNbac_P4 | CCATTGGCATGACAACCCGAACACCAGTGATGCGTCCACTCCGGTCCTCT |
| 223 | 23S_GNbac_P5 | CCCCCTCAGTTCTCCAGCGCCCACGGCAGATAGGGACCGAACTGTCTCAC |
| 224 | 23S_GNbac_P6 | GCTCGCGTACCACTTTAAATGGCGAACAGCCATACCCTTGGGACCTACTT |
| 225 | 23S_GNbac_P7 | ATGAGCCGACATCGAGGTGCCAAACACCGCCGTCGATATGAACTCTTGGG |
| 226 | 23S_GNbac_P8 | ATCCCCGGAGTACCTTTTATCCGTTGAGCGATGGCCCTTCCATTCAGAAC |
| 227 | 23S_GNbac_P9 | ACCTGCTTTCGCACCTGCTCGCGCCGTCACGCTCGCAGTCAAGCTGGCTT |
| 228 | 23S_GNbac_P10 | CCTCCTGATGTCCGACCAGGATTAGCCAACCTTCGTGCTCCTCCGTTACT |
| 229 | 23S_GNbac_P11 | GCCCCAGTCAAACTACCCACCAGACACTGTCCGCAACCCGGATTACGGGT |
| 230 | 23S_GNbac_P12 | AAACATTAAAGGGTGGTATTTCAAGGTCGGCTCCATGCAGACTGGCGTCC |
| 231 | 23S_GNbac_P13 | CCACCTATCCTACACATCAAGGCTCAATGTTCAGTGTCAAGCTATAGTAA |
| 232 | 23S_GNbac_P14 | TTCCGTCTTGCCGCGGGTACACTGCATCTTCACAGCGAGTTCAATTTCAC |
| 233 | 23S_GNbac_P15 | GACAGCCTGGCCATCATTACGCCATTCGTGCAGGTCGGAACTTACCCGAC |
| 234 | 23S_GNbac_P16 | CTTAGGACCGTTATAGTTACGGCCGCCGTTTACCGGGGCTTCGATCAAGA |
| 235 | 23S_GNbac_P17 | ACCCCATCAATTAACCTTCCGGCACCGGGCAGGCGTCACACCGTATACGT |
| 236 | 23S_GNbac_P18 | CACAGTGCTGTGTTTTTAATAAACAGTTGCAGCCAGCTGGTATCTTCGAC |
| 237 | 23S_GNbac_P19 | CCGCGAGGGACCTCACCTACATATCAGCGTGCCTTCTCCCGAAGTTACGG |
| 238 | 23S_GNbac_P20 | TTCCTTCACCCGAGTTCTCTCAAGCGCCTTGGTATTCTCTACCTGACCAC |
| 239 | 23S_GNbac_P21 | GTACGATTTGATGTTACCTGATGCTTAGAGGCTTTTCCTGGAAGCAGGGC |
| 240 | 23S_GNbac_P22 | ACCGTAGTGCCTCGTCATCACGCCTCAGCCTTGATTTTCCGGATTTGCCT |
| 241 | 23S_GNbac_P23 | ACGCTTAAACCGGGACAACCGTCGCCCGGCCAACATAGCCTTCTCCGTCC |
| 242 | 23S_GNbac_P24 | ACCAAGTACAGGAATATTAACCTGTTTCCCATCGACTACGCCTTTCGGCC |
| 243 | 23S_GNbac_P25 | ACTCACCCTGCCCCGATTAACGTTGGACAGGAACCCTTGGTCTTCCGGCG |
| 244 | 23S_GNbac_P26 | CGCTTTATCGTTACTTATGTCAGCATTCGCACTTCTGATACCTCCAGCAT |
| 245 | 23S_GNbac_P27 | TTCGCAGGCTTACAGAACGCTCCCCTACCCAACAACGCATAAGCGTCGCT |
| 246 | 23S_GNbac_P28 | CATGGTTTAGCCCCGTTACATCTTCCGCGCAGGCCGACTCGACCAGTGAG |
| 247 | 23S_GNbac_P29 | TAAATGATGGCTGCTTCTAAGCCAACATCCTGGCTGTCTGGGCCTTCCCA |
| 248 | 23S_GNbac_P30 | AACCATGACTTTGGGACCTTAGCTGGCGGTCTGGGTTGTTTCCCTCTTCA |
| 249 | 23S_GNbac_P31 | CCCGCCGTGTGTCTCCCGTGATAACATTCTCCGGTATTCGCAGTTTGCAT |
| 250 | 23S_GNbac_P32 | GGATGACCCCCTTGCCGAAACAGTGCTCTACCCCCGGAGATGAATTCACG |
| 251 | 23S_GNbac_P33 | AGCTTTCGGGGAGAACCAGCTATCTCCCGGTTTGATTGGCCTTTCACCCC |
| 252 | 23S_GNbac_P34 | CGCTAATTTTTCAACATTAGTCGGTTCGGTCCTCCAGTTAGTGTTACCCA |
| 253 | 23S_GNbac_P35 | ATGGCTAGATCACCGGGTTTCGGGTCTATACCCTGCAACTTAACGCCCAG |
| 254 | 23S_GNbac_P36 | CCTTCGGCTCCCCTATTCGGTTAACCTTGCTACAGAATATAAGTCGCTGA |
| 255 | 23S_GNbac_P37 | GTACGCAGTCACACGCCTAAGCGTGCTCCCACTGCTTGTACGTACACGGT |
| 256 | 23S_GNbac_P38 | ACTCCCCTCGCCGGGGTTCTTTTCGCCTTTCCCTCACGGTACTGGTTCAC |
| 257 | 23S_GNbac_P39 | AGTATTTAGCCTTGGAGGATGGTCCCCCCATATTCAGACAGGATACCACG |
| 258 | 23S_GNbac_P40 | ATCGAGCTCACAGCATGTGCATTTTTGTGTACGGGGCTGTCACCCTGTAT |
| 259 | 23S_GNbac_P41 | ACGCTTCCACTAACACACACACTGATTCAGGCTCTGGGCTGCTCCCCGTT |
| 260 | 23S_GNbac_P42 | GGGGAATCTCGGTTGATTTCTTTTCCTCGGGGTACTTAGATGTTTCAGTT |
| 261 | 23S_GNbac_P43 | ATTAACCTATGGATTCAGTTAATGATAGTGTGTCGAAACACACTGGGTTT |
| 262 | 23S_GNbac_P44 | GCCGGTTATAACGGTTCATATCACCTTACCGACGCTTATCGCAGATTAGC |
| 263 | 5S_GPbac_P1 | GCTTGGCGGCGTCCTACTCTCACAGGGGGAAACCCCCGACTACCATCGGC |
| 264 | 5S_GPbac_P2 | TTCCGTGTTCGGTATGGGAACGGGTGTGACCTCTTCGCTATCGCCACCAA |
| 265 | 16S_GPbac_P1 | TAGAAAGGAGGTGATCCAGCCGCACCTTCCGATACGGCTACCTTGTTACG |
| 266 | 16S_GPbac_P2 | TCTGTCCCACCTTCGGCGGCTGGCTCCTAAAAGGTTACCTCACCGACTTC |
| 267 | 16S_GPbac_P3 | TCGTGGTGTGACGGGCGGTGTGTACAAGGCCCGGGAACGTATTCACCGCG |
| 268 | 16S_GPbac_P4 | ATTACTAGCGATTCCAGCTTCACGCAGTCGAGTTGCAGACTGCGATCCGA |
| 269 | 16S_GPbac_P5 | GTGGGATTGGCTTAACCTCGCGGTTTCGCTGCCCTTTGTTCTGTCCATTG |
| 270 | 16S_GPbac_P6 | CCAGGTCATAAGGGGCATGATGATTTGACGTCATCCCCACCTTCCTCCGG |
| 271 | 16S_GPbac_P7 | CACCTTAGAGTGCCCAACTGAATGCTGGCAACTAAGATCAAGGGTTGCGC |
| 272 | 16S_GPbac_P8 | ACCCAACATCTCACGACACGAGCTGACGACAACCATGCACCACCTGTCAC |
| 273 | 16S_GPbac_P9 | GACGTCCTATCTCTAGGATTGTCAGAGGATGTCAAGACCTGGTAAGGTTC |
| 274 | 16S_GPbac_P10 | ATTAAACCACATGCTCCACCGCTTGTGCGGGCCCCCGTCAATTCCTTTGA |
| 275 | 16S_GPbac_P11 | CCGTACTCCCCAGGCGGAGTGCTTAATGCGTTAGCTGCAGCACTAAGGGG |
| 276 | 16S_GPbac_P12 | ACTTAGCACTCATCGTTTACGGCGTGGACTACCAGGGTATCTAATCCTGT |
| 277 | 16S_GPbac_P13 | TCGCTCCTCAGCGTCAGTTACAGACCAGAGAGTCGCCTTCGCCACTGGTG |
| 278 | 16S_GPbac_P14 | ACGCATTTCACCGCTACACGTGGAATTCCACTCTCCTCTTCTGCACTCAA |
| 279 | 16S_GPbac_P15 | ATGACCCTCCCCGGTTGAGCCGGGGGCTTTCACATCAGACTTAAGAAACC |
| 280 | 16S_GPbac_P16 | ACGCCCAATAATTCCGGACAACGCTTGCCACCTACGTATTACCGCGGCTG |
| 281 | 16S_GPbac_P17 | CCGTGGCTTTCTGGTTAGGTACCGTCAAGGTACCGCCCTATTCGAACGGT |
| 282 | 16S_GPbac_P18 | ACAACAGAGCTTTACGATCCGAAAACCTTCATCACTCACGCGGCGTTGCT |
| 283 | 16S_GPbac_P19 | CCATTGCGGAAGATTCCCTACTGCTGCCTCCCGTAGGAGTCTGGGCCGTG |
| 284 | 16S_GPbac_P20 | GGCCGATCACCCTCTCAGGTCGGCTACGCATCGTCGCCTTGGTGAGCCGT |
| 285 | 16S_GPbac_P21 | CTAATGCGCCGCGGGTCCATCTGTAAGTGGTAGCCGAAGCCACCTTTTAT |
| 286 | 16S_GPbac_P22 | TTCAAACAACCATCCGGTATTAGCCCCGGTTTCCCGGAGTTATCCCAGTC |
| 287 | 16S_GPbac_P23 | CCACGTGTTACTCACCCGTCCGCCGCTAACATCAGGGAGCAAGCTCCCAT |
| 288 | 16S_GPbac_P24 | GCATGTATTAGGCACGCCGCCAGCGTTCGTCCTGAGCCAGGATCAAACTC |
| 289 | 23S_GPbac_P1 | TGGTTAAGTCCTCGATCGATTAGTATCTGTCAGCTCCATGTGTCGCCACA |
| 290 | 23S_GPbac_P2 | TATCAACCTGATCATCTTTCAGGGATCTTACTTCCTTGCGGAATGGGAAA |
| 291 | 23S_GPbac_P3 | GGCTTCATGCTTAGATGCTTTCAGCACTTATCCCGTCCGCACATAGCTAC |
| 292 | 23S_GPbac_P4 | GCAGAACAACTGGTACACCAGCGGTGCGTCCATCCCGGTCCTCTCGTACT |
| 293 | 23S_GPbac_P5 | CAAATTTCCTGCGCCCGCGACGGATAGGGACCGAACTGTCTCACGACGTT |
| 294 | 23S_GPbac_P6 | GTACCGCTTTAATGGGCGAACAGCCCAACCCTTGGGACTGACTACAGCCC |
| 295 | 23S_GPbac_P7 | CGACATCGAGGTGCCAAACCTCCCCGTCGATGTGGACTCTTGGGGGAGAT |
| 296 | 23S_GPbac_P8 | GGGGTAGCTTTTATCCGTTGAGCGATGGCCCTTCCATGCGGAACCACCGG |
| 297 | 23S_GPbac_P9 | TTTCGTCCCTGCTCGACTTGTAGGTCTCGCAGTCAAGCTCCCTTGTGCCT |
| 298 | 23S_GPbac_P10 | GATTTCCAACCATTCTGAGGGAACCTTTGGGCGCCTCCGTTACCTTTTAG |
| 299 | 23S_GPbac_P11 | GTCAAACTGCCCACCTGACACTGTCTCCCCGCCCGATAAGGGCGGCGGGT |
| 300 | 23S_GPbac_P12 | GCCAGGGTAGTATCCCACCGATGCCTCCACCGAAGCTGGCGCTCCGGTTT |
| 301 | 23S_GPbac_P13 | ATCCTGTACAAGCTGTACCAACATTCAATATCAGGCTGCAGTAAAGCTCC |
| 302 | 23S_GPbac_P14 | CCTGTCGCGGGTAACCTGCATCTTCACAGGTACTATAATTTCACCGAGTC |
| 303 | 23S_GPbac_P15 | GCCCAGATCGTTGCGCCTTTCGTGCGGGTCGGAACTTACCCGACAAGGAA |
| 304 | 23S_GPbac_P16 | ACCGTTATAGTTACGGCCGCCGTTTACTGGGGCTTCAATTCGCACCTTCG |
| 305 | 23S_GPbac_P17 | CCTCTTAACCTTCCAGCACCGGGCAGGCGTCAGCCCCTATACTTCGCCTT |
| 306 | 23S_GPbac_P18 | CCTGTGTTTTTGCTAAACAGTCGCCTGGGCCTATTCACTGCGGCTCTCTC |
| 307 | 23S_GPbac_P19 | CAGAGCACCCCTTCTCCCGAAGTTACGGGGTCATTTTGCCGAGTTCCTTA |
| 308 | 23S_GPbac_P20 | ATCACCTTAGGATTCTCTCCTCGCCTACCTGTGTCGGTTTGCGGTACGGG |
| 309 | 23S_GPbac_P21 | TAGAGGCTTTTCTTGGCAGTGTGGAATCAGGAACTTCGCTACTATATTTC |
| 310 | 23S_GPbac_P22 | TCAGCCTTATGGGAAACGGATTTGCCTATTTCCCAGCCTAACTGCTTGGA |
| 311 | 23S_GPbac_P23 | CCGCGCTTACCCTATCCTCCTGCGTCCCCCCATTGCTCAAATGGTGAGGA |
| 312 | 23S_GPbac_P24 | TCAACCTGTTGTCCATCGCCTACGCCTTTCGGCCTCGGCTTAGGTCCCGA |
| 313 | 23S_GPbac_P25 | CGAGCCTTCCTCAGGAAACCTTAGGCATTCGGTGGAGGGGATTCTCACCC |
| 314 | 23S_GPbac_P26 | TACCGGCATTCTCACTTCTAAGCGCTCCACCAGTCCTTCCGGTCTGGCTT |
| 315 | 23S_GPbac_P27 | GCTCTCCTACCACTGTTCGAAGAACAGTCCGCAGCTTCGGTGATACGTTT |
| 316 | 23S_GPbac_P28 | TCGGCGCAGAGTCACTCGACCAGTGAGCTATTACGCACTCTTTAAATGGT |
| 317 | 23S_GPbac_P29 | AACATCCTGGTTGTCTAAGCAACTCCACATCCTTTTCCACTTAACGTATA |
| 318 | 23S_GPbac_P30 | TGGCGGTCTGGGCTGTTTCCCTTTCGACTACGGATCTTATCACTCGCAGT |
| 319 | 23S_GPbac_P31 | AAGTCATTGGCATTCGGAGTTTGACTGAATTCGGTAACCCGGTAGGGGCC |
| 320 | 23S_GPbac_P32 | GCTCTACCTCCAAGACTCTTACCTTGAGGCTAGCCCTAAAGCTATTTCGG |
| 321 | 23S_GPbac_P33 | TCCAGGTTCGATTGGCATTTCACCCCTACCCACACCTCATCCCCGCACTT |
| 322 | 23S_GPbac_P34 | TTCGGGCCTCCATTCAGTGTTACCTGAACTTCACCCTGGACATGGGTAGA |
| 323 | 23S_GPbac_P35 | TCTACGACCACGTACTCATGCGCCCTATTCAGACTCGCTTTCGCTGCGGC |
| 324 | 23S_GPbac_P36 | TAACCTTGCACGGGATCGTAACTCGCCGGTTCATTCTACAAAAGGCACGC |
| 325 | 23S_GPbac_P37 | GGCTCTGACTACTTGTAGGCACACGGTTTCAGGATCTCTTTCACTCCCCT |
| 326 | 23S_GPbac_P38 | ACCTTTCCCTCACGGTACTGGTTCACTATCGGTCACTAGGGAGTATTTAG |
| 327 | 23S_GPbac_P39 | CTCCCGGATTCCGACGGAATTTCACGTGTTCCGCCGTACTCAGGATCCAC |
| 328 | 23S_GPbac_P40 | GTTTTGACTACAGGGCTGTTACCTCCTATGGCGGGCCTTTCCAGACCTCT |
| 329 | 23S_GPbac_P41 | CTTTGTAACTCCGTACAGAGTGTCCTACAACCCCAAGAGGCAAGCCTCTT |
| 330 | 23S_GPbac_P42 | CGTTTCGCTCGCCGCTACTCAGGGAATCGCATTTGCTTTCTCTTCCTCCG |
| 331 | 23S_GPbac_P43 | CAGTTCCCCGGGTCTGCCTTCTCATATCCTATGAATTCAGATATGGATAC |
| 332 | 23S_GPbac_P44 | GGTGGGTTTCCCCATTCGGAAATCTCCGGATCAAAGCTTGCTTACAGCTC |
| 333 | 23S_GPbac_P45 | TGTTCGTCCCGTCCTTCATCGGCTCCTAGTGCCAAGGCATCCACCGTGCG |
| 334 | 16S:A1 | AAACTAGATTCGAATATAACAAAACATTACATCCTCATCCAATCCCTTTT |
| 335 | 16S:A2 | GCGGTGTGTGCAAGGAGCAGGGACGTATTCACCGCGCGATTGTGACACGC |
| 336 | 16S:A3 | GCCTTTCGGCGTCGGAACCCATTGTCTCAGCCATTGTAGCCCGCGTGTTG |
| 337 | 16S:A4 | GCATACGGACCTACCGTCGTCCACTCCTTCCTCCTATTTATCATAGGCGG |
| 338 | 16S:A5 | CGGCATCCAAAAAAGGATCCGCTGGTAACTAAGAGCGTGGGTCTCGCTCG |
| 339 | 16S: A6 | CAACCTGGCTATCATACAGCTGTCGCCTCTGGTGAGATGTCCGGCGTTGA |
| 340 | 16S:A7 | AGGCTCCACGCGTTGTGGTGCTCCCCCGCCAATTCCTTTAAGTTTCAGTC |
| 341 | 16S:A8 | CCAGGCGGCGGACTTAACAGCTTCCCTTCGGCACTGGGACAGCTCAAAGC |
| 342 | 16S:A9 | TCCGCATCGTTTACAGCTAGGACTACCCGGGTATCTAATCCGGTTCGCGC |
| 343 | 16S:A10 | TTCCCACAGTTAAGCTGCAGGATTTCACCAGAGACTTATTAAACCGGCTA |
| 344 | 16S:A12 | CTCTTATTCCAAAAGCTCTTTACACTAATGAAAAGCCATCCCGTTAAGAA |
| 345 | 16S:A13 | CCCCCGTCGCGATTTCTCACATTGCGGAGGTTTCGCGCCTGCTGCACCCC |
| 346 | 16S:A14 | TTGTCTCAGGTTCCATCTCCGGGCTCTTGCTCTCACAACCCGTACCGATC |
| 347 | 16S:A16 | CATTACCTAACCAACTACCTAATCGGCCGCAGACCCATCCTTAGGCGAAA |
| 348 | 16S:A17 | AAACCATTACAGGAATAATTGCCTATCCAGTATTATCCCCAGTTTCCCAG |
| 349 | 16S:A18 | AAGGGTAGGTTATCCACGTGTTACTGAGCCGTACGCCACGAGCCTAAACT |
| 350 | 23S:A1 | ACCTAGCGCGTAGCTGCCCGGCACTGCCTTATCAGACAACCGGTCGACCA |
| 351 | 23S:A2 | CGTTCCTCTCGTACTGGAGCCACCTTCCCCTCAGACTACTAACACATCCA |
| 352 | 23S:A3 | CCTGTCTCACGACGGTCTAAACCCAGCTCACGTTCCCCTTTAATGGGCGA |
| 353 | 23S:A4 | GGTGCTGCTGCACACCCAGGATGGAAAGAACCGACATCGAAGTAGCAAGC |
| 354 | 23S:A5 | GGCTCTTGCCTGCGACCACCCAGTTATCCCCGAGGTAGTTTTTCTGTCAT |
| 355 | 23S:A6 | AGGAGGACTCTGAGGTTCGCTAGGCCCGGCTTTCGCCTCTGGATTTCTTG |
| 356 | 23S:A7 | CAAAGTAAGTTAGAAACACAGTCATAAGAAAGTGGTGTCTCAAGAACGAA |
| 357 | 23S:A8 | GACTTATAATCGAATTCTCCCACTTACACTGCATACCTATAACCAAGCTT |
| 358 | 23S:A9 | GTAAAACTCTACGGGGTCTTCGCTTCCCAATGGAAGACTCTGGCTTGTGC |
| 359 | 23S:A10 | TCACTAAGTTCTAGCTAGGGACAGTGGGGACCTCGTTCTACCATTCATGC |
| 360 | 23S:A11 | CGACAAGGCATTTCGCTACCTTAAGAGGGTTATAGTTACCCCCGCCGTTT |
| 361 | 23S:A12 | AACTGAACTCCAGCTTCACGTGCCAGCACTGGGCAGGTGTCGCCCTCTGT |
| 362 | 23S:A13 | CTAGCAGAGAGCTATGTTTTTATTAAACAGTCGGGCCCCCCTAGTCACTG |
| 363 | 23S:A14 | TTAAAACGCCTTAGCCTACTCAGCTAGGGGCACCTGTGACGGATCTCGGT |
| 364 | 23S:A15 | ACAAAACTAACTCCCTTTTCAAGGACTCCATGAATCAGTTAAACCAGTAC |
| 365 | 23S:A16 | ATAATGCCTACACCTGGTTCTCGCTATTACACCTCTCCCCAGGCTTAAAC |
| 366 | 23S:A17 | CAATCCTACAAAACATATCTCGAAGTGTCAGAAATTAGCCCTCAACGTCA |
| 367 | 23S:A18 | CTTTGCTGCTACTACTACCAGGATCCACATACCTGCAAGGTCCAAAGGAA |
| 368 | 23S:A19 | CAACCCACACAGGTCGCCACTCTACACAATCACCAAAAAAAAGGTGTTCC |
| 369 | 23S:A20 | GGATTAATTCCCGTCCATTTTAGGTGCCTCTGACCTCGATGGGTGATCTG |
| 370 | 23S:A21 | AGGGTGGCTGCTTCTAAGCCCACCTTCCCATTGTCTTGGGCCAAAGACTC |
| 371 | 23S:A22 | GTATTTAGGGGCCTTAACCATAGTCTGAGTTGTTTCTCTTTCGGGACACA |
| 372 | 23S:A23 | CCTCACTCCAACCTTCTACGACGGTGACGAGTTCGGAGTTTTACAGTACG |
| 373 | 23S:A24 | CCCTAAACGTCCAATTAGTGCTCTACCCCGCCACCAACCTCCAGTCAGGC |
| 374 | 23S:A25 | AATAGATCGACCGGCTTCGGGTTTCAATGCTGTGATTCCAGGCCCTATTA |
| 375 | 23S:A26 | ACAACGCTGCGGGCATATCGGTTTCCCTACGACTACAAGGATAAAAACCT |
| 376 | 23S:A27 | ACAAAGAACTCCCTGGCCCGTGTTTCAAGACGGACGATGCAACACTAGTC |
| 377 | 23S:A28 | ACAATGTTACCACTGATTCTTTCGGAAGAATTCATTCCTTACGCGCCACA |
| 378 | 23S:A29 | CTGGTTTCAGGTACTTTTCACCCCCCTATAGGGGTACTTTTCAGCATTCC |
| 379 | 23S:A30 | CTCTATCGGTCTTGAGACGTATTTAGAATTGGAAGTTGATGCCTCCCACA |
| 380 | 23S:A31 | ATCACCCTCTACGGTTCTAAAATTCCAAATAAAATTCGATTTATCCCACG |
| 381 | 23S:A32 | TCTATACACCACATCTCCCTAATATTACTAAAAGGGATTCAGTTTGTTCT |
| 382 | 23S:A33 | GCCGTTACTAACGACATCGCATATTGCTTTCTTTTCCTCCGCCTACTAAG |
| 383 | 23S:A34 | GGGTTCCCAATCCTACACGGATCAACACAAAAAAAATGTGCTAGGAAGTC |
| 384 | 5S:A1 | ACTACTGGGATCGAAACGAGACCAGGTATAACCCCCATGCTATGACCGCA |
| 385 | MM_16S_P10 | GCGTATGCCTGGAGAATTGGAATTCTTGTTACTCATACTAACAGTGTTGC |
| 386 | MM_16S_P11 | GATTAACCCAATTTTAAGTTTAGGAAGTTGGTGTAAATTATGGAATTAAT |
| 387 | MM_16S_P12 | AGCTTGAACGCTTTCTTTATTGGTGGCTGCTTTTAGGCCTACAATGGTTA |
| 388 | MM_16S_P13 | ATTATTCACTATTAAAGGTTTTTTCCGTTCCAGAAGAGCTGTCCCTCTTT |
| 389 | MM_16S_P14 | CTTACTTTTTGATTTTGTTGTTTTTTTAGCAAGTTTAAAATTGAACTTAA |
| 390 | MM_16S_P15 | AACCAGCTATCACCAAGCTCGTTAGGCTTTTCACCTCTACCTAAAAATCT |
| 391 | MM_16S_P7 | AATACTTGTAATGCTAGAGGTGATGTTTTTGGTAAACAGGCGGGGTTCTT |
| 392 | MM_16S_P8 | TTTATCTTTTTGGATCTTTCCTTTAGGCATTCCGGTGTTGGGTTAACAGA |
| 393 | MM_16S_P9 | TTATTTATAGTGTGATTATTGCCTATAGTCTGATTAACTAACAATGGTTA |
| 394 | RN_16S_P4 | AGTGATTGTAGTTGTTTATTCACTATTTAAGGTTTTTTCCTTTTCCTAAA |
| 395 | RN_16S_P5 | TGGCTATATTTTAAGTTTACATTTTGATTTGTTGTTCTGATGGTAAGCTT |
| 396 | RN_16S_P6 | TTTTTTTAATCTTTCCTTAAAGCACGCCTGTGTTGGGCTAACGAGTTAGG |
| 397 | RN_16S_P7 | TGTTGGGTTAGTACCTATGATTCGATAATTGACAATGGTTATCCGGGTTG |
| 398 | RN_16S_P8 | AGGAGAATTGGTTCTTGTTACTCATATTAACAGTATTTCATCTATGGATC |
| 399 | RN_16S_P9 | TTTGTGATATAGGAATTTATTGAGGTTTGTGGAATTAGTGTGTGTAAGTA |
| 400 | MM_28S_P1 | GCCGGGGAGTGGGTCTTCCGTACGCCACATTTCCCACGCCGCGACGCGCG |
| 401 | MM_28S_P10 | ACCTCGGGCCCCCGGGCGGGGCCCTTCACCTTCATTGCGCCACGGCGGCT |
| 402 | MM_28S_P14 | TCGCGTCCAGAGTCGCCGCCGCCGCCGGCCCCCCGAGTGTCCGGGCCCCC |
| 403 | MM_28S_P15 | CGCTGGTTCCTCCCGCTCCGGAACCCCCGCGGGGTTGGACCCGCCGCCCC |
| 404 | MM_28S_P16 | CGCCGACCCCCGACCCGCCCCCCGACGGGAAGAAGGAGGGGGGAAGAGAG |
| 405 | MM_28S_P17 | GGGACGACGGGGCCCCGCGGGGAAGAGGGGAGGGCGGGCCCGGGCGGAAA |
| 406 | MM_28S_P18 | GGCGCCGCGCGGAAAACCGCGGCCCGGGGGGCGGACCCGGCGGGGGAACA |
| 407 | MM_28S_P19 | CCCCCACACGCGCGGGACACGCCCGCCCGCCCCCGCCACGCACCTCGGGA |
| 408 | MM_28S_P2 | CACCCGCTTTGGGCTGCATTCCCAAGCAACCCGACTCCGGGAAGACCCGA |
| 409 | MM_28S_P20 | TGGAGCGAGGCCCCGCGGGGAGGGGACCCGCGCCGGCACCCGCCGGGCTC |
| 410 | MM_28S_P21 | CGAGGCCGGCGTGCCCCGACCCCGACGCGAGGACGGGGCCGGGCGCCGGG |
| 411 | MM_28S_P22 | TCCCCGGAGCGGGTCGCGCCCGCCCGCACGCGCGGGACGGACGCTTGGCG |
| 412 | MM_28S_P23 | TCCACACGAACGTGCGTTCAACGTGACGGGCGAGAGGGCGGCCCCCTTTC |
| 413 | MM_28S_P24 | TCCCAAGACGAACGGCTCTCCGCACCGGACCCCGGTCCCGACGCCCGGCG |
| 414 | MM_28S_P25 | CCGCCGCGGGGACGACGCGGGGACCCCGCCGAGCGGGGACGGACGGGGAC |
| 415 | MM_28S_P3 | GCACCGCCACGGTGGAAGTGCGCCCGGCGGCGGCCGGTCGCCGGCCGGGG |
| 416 | MM_28S_P6 | CCCACCGGGCCCCGAGAGAGGCGACGGAGGGGGGTGGGAGAGCGGTCGCG |
| 417 | MM_28S_P7 | CCCGGCCCCCACCCCCACGCCCGCCCGGGAGGCGGACGGGGGGAGAGGGA |
| 418 | MM_28S_P8 | TATCTGGCTTCCTCGGCCCCGGGATTCGGCGAAAGCGCGGCCGGAGGGCT |
| 419 | MM_28S_P9 | CGCCGCCGACCCCGTGCGCTCGGCTTCGTCGGGAGACGCGTGACCGACGG |
| 420 | RN_28S_P12 | GCGCCCCCCCGCACCCGCCCCGTCCCCCCCGCGGACGGGGAAGAAGGGAG |
| 421 | RN_28S_P14 | CGAACCCCGGGAACCCCCGACCCCGCGGAGGGGGAAGGGGGAGGACGAGG |
| 422 | RN_28S_P16 | CACCCGGGGGGGCGACGAGGCGGGGACCCGCCGGACGGGGACGGACGGGG |
| 423 | RN_28S_P17 | GCCAACCGAGGCTCCTTCGGCGCTGCCGTATCGTTCCGCTTGGGCGGATT |
| 424 | RN_28S_P4 | CCCGGGCCCCCGGACCCCCGAGAGGGACGACGGAGGCGACGGGGGGTGGG |
| 425 | RN_28S_P5 | TGGGAGGGGCGGCCCGGCCCCCGCGACCGCCCCCCTTTCCGCCACCCCAC |
| 426 | RN_28S_P6 | GGGAGAGGCCGGGGGGAGAGCGCGGCGACGGGTATCCGGCTCCCTCGGCC |
| 427 | RN_28S_P7 | CGCTGCTGCCGGGGGGCTGTAACACTCGGGGCGGGGTGGTCCGGCGCCCA |
| 428 | RN_28S_P8 | CGCCGCCGACCCCGTGCGCTCGGCTTCGCTCCCCCCCACCCCGAGAAGGG |
[0045] В одном варианте осуществления настоящего изобретения образец РНК получен от человека, а набор ДНК-зондов включает зонды, специфичные к нежелательным видам РНК человека, таким как рРНК и митохондриальные РНК-транскрипты, как описано в настоящем документе. В другом варианте осуществления настоящего изобретения набор ДНК-зондов для удаления нежелательных молекул РНК из образца РНК человека включает зонды, специфичные для рРНК человека и митохондриальных мРНК-транскриптов, а также зонды, специфичные для грамположительных и грамотрицательных нежелательных РНК-транскриптов, как описано в настоящем документе. В дополнительном варианте осуществления настоящего изобретения набор ДНК-зондов для удаления нежелательных молекул РНК из образца РНК человека включает зонды, специфичные для бактериальных видов Archaea, примером которых является M. smithii, как описано в настоящем описании. Таким образом, в некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения набор ДНК-зондов для деплеции рРНК из образца РНК человека содержит только зонды, направленные на нежелательные виды РНК человека, или смешанный набор ДНК-зондов, которые также нацелены на транскрипты нежелательной РНК, не относящейся к человеку. Квалифицированному специалисту будет понятно, что набор зондов, который будет использоваться для деплеции РНК, будет зависеть от исследовательских целей, среды, из которой образец был отобран, и других факторов экспериментального плана деплеции образца РНК.
[0046] В одном варианте осуществления настоящего изобретения образец РНК получен из не относящегося к человеку эукариота, а набор ДНК-зондов включает зонды, специфичные к нежелательной РНК в полученном от этого эукариотическом образце. Например, если образец РНК получен от мыши или крысы, набор ДНК-зондов будет включать зонды, специфичные для нежелательных видов РНК мыши или крысы, которые могут также включать ДНК-зонды, специфичные для нежелательных грамположительных и грамотрицательных видов бактериальной РНК, или других бактериальных видов, таких как виды Archaea.
[0047] В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения ДНК-зонды не гибридизуются со всей непрерывной длиной молекул РНК, подлежащих удалению. В ходе экспериментов неожиданно было обнаружено, что для полноразмерной последовательности видов РНК-мишеней для деплеции, не обязательно использовать полноразмерный ДНК-зонд или набор зондов, который будет непрерывно перекрывать всю последовательность РНК; действительно, описанные в настоящем документе ДНК-зонды оставляют бреши, так что образованные гибриды ДНК : РНК не являются смежными. Неожиданно было обнаружено, что бреши размером по меньшей мере 5 нт, 10 нт, 15 нт или 20 нт между гибридами ДНК : РНК обеспечивали эффективную деплецию РНК. Кроме того, наборы зондов, оставляющие бреши, могут более эффективно гибридизоваться с нежелательной РНК, поскольку ДНК-зонды не препятствуют гибридизации соседних зондов, что потенциально может происходить с зондами, которые покрывают всю последовательность РНК-мишени для деплеции, или с зондами, перекрывающимися друг с другом.
[0048] Кроме того, наборы зондов могут быть дополнены для улучшения способов деплеции РНК для данного вида. Способ дополнения набора зондов для удаления молекул нуклеиновой кислоты РНК, не являющихся мишенью, из образца нуклеиновой кислоты может включать следующее: a) приведение образца нуклеиновой кислоты, содержащего по меньшей мере одну последовательность-мишень в структуре РНК или ДНК и по меньшей мере одну последовательность молекул РНК первого вида, не являющихся мишенью, в контакт с набором зондов, содержащим по меньшей мере два ДНК-зонда, комплементарных к несмежным последовательностям вдоль всей длины по меньшей мере одной последовательности молекулы РНК второго вида, не являющейся мишенью, тем самым гибридизуя ДНК-зонды с молекулами РНК, не являющимися мишенями, с образованием гибридов ДНК : РНК, при этом каждый гибрид ДНК : РНК разделен по меньшей мере на 5 оснований или по меньшей мере на 10 оснований вдоль заданной последовательности молекулы РНК, не являющейся мишенью, из другого гибрида ДНК : РНК; b) приведение гибридов ДНК : РНК в контакт с рибонуклеазой, расщепляющей РНК от гибридов ДНК : РНК, тем самым разрушая молекулы РНК, не являющиеся мишенями, в образце нуклеиновой кислоты с образованием расщепленной смеси; c) отделение расщепленной РНК из образца; d) секвенирование оставшейся РНК из образца; e) оценку оставшихся последовательностей РНК на наличие молекул РНК первого вида, не являющихся мишенью, таким образом определяя области последовательности бреши; и f) добавление в набор по меньшей мере одного ДНК-зонда, комплементарного к несмежным последовательностям в одной или более областях брешей. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения области последовательности бреши содержат по меньшей мере 50, 60 или 70 пар нуклеотидов. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения первый вид не относится, а второй вид относится к человеку. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения первый вид представляет собой крыс или мышей. Иллюстративные способы добавления набора зондов для улучшения удаления нежелательных молекул нуклеиновых кислот рРНК в образцах мыши представлены в примере 8 и на Фиг. 9.
[0049] В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения первый вид не относится, а второй вид относится к человеку. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения первый вид представляет собой крыс или мышей. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения второй вид представляет собой человека, грамположительные бактерии, грамотрицательные бактерии или их смесь.
Композиции и наборы
[0050] В одном варианте осуществления настоящее изобретения относится к композициям, содержащим набор зондов, как описано в настоящем документе. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения композиция содержит набор зондов и рибонуклеазу, способную расщеплять РНК в гибриде ДНК : РНК, таком как РНКаза H или гибридаза. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения набор зондов содержит по меньшей мере два ДНК-зонда, комплементарных по меньшей мере одной молекуле рРНК, не являющейся мишенью, в образце нуклеиновой кислоты, причем зонды не перекрываются и не являются смежными по отношению к ее длине (например, находятся по меньшей мере на 5 или по меньшей мере на 10 оснований друг от друга вдоль всей длины). В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения композиция содержит набор зондов, содержащий по меньшей мере два ДНК-зонда, гибридизуемых с по меньшей мере одной молекулой РНК, не являющейся мишенью, причем каждый ДНК-зонд гибридизуется на расстоянии по меньшей мере 5 или по меньшей мере 10 оснований друг от друга вдоль длины молекулы РНК, не являющейся мишенью, любого другого ДНК-зонда в наборе. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения композиция содержит химическое вещество, дестабилизирующее нуклеиновую кислоту, такое как формамид, бетаин, ДМСО, глицерин, их производные или смеси. В одном варианте осуществления настоящего изобретения дестабилизирующим химическим веществом является формамид или его производное, концентрация которого в общем объеме реакции гибридизации составляет 10-45%.
[0051] В одном из вариантов осуществления настоящее изобретение описывает комплект с набором зондов, который включает по меньшей мере два ДНК-зонда, комплементарных к несмежным последовательностям вдоль всей длины по меньшей мере одной последовательности молекул рРНК, не являющихся мишенью, (например, на расстоянии не менее 5 оснований друг от друга или не менее 10 оснований по всей длине) в образце нуклеиновой кислоты и рибонуклеазы, способной расщеплять РНК в гибриде ДНК : РНК. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения набор зондов содержит любой из ДНК-зондов, описанных в настоящем документе, или любую их комбинацию.
[0052] В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения комплект содержит буфер и среду для очистки нуклеиновых кислот. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения комплект включает один или больше буферов, сред для очистки нуклеиновой кислоты и набор ДНК-зондов, как описано в настоящем документе. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения набор зондов содержит две или более последовательностей номеров SEQ ID NO: 1-333. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения набор зондов содержит две или более последовательностей номеров SEQ ID NO: 1-428. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения набор зондов содержит две или более, или пять или более, или 10 или более, или 25 или более, или 50 или более, или 100 или более, или 150 или более, или 200 или более, или 250 или более, или 300 или более, или 350 или более, или 377 последовательностей из номеров SEQ ID NO: 1-377 (человека, грамположительных и грамотрицательных бактерий и Archaea). В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения набор зондов содержит две или более, или пять или более, или 10 или более, или 25 или более, или 50 или более, или 100 или более, или 150 или более, или 200 или более, или 250 или более, или 300 или более, или 350 или более, или 384 последовательности из номеров SEQ ID NO: 1-333 и номеров SEQ ID NO: 378-428 (человека, грамположительных бактерий, грамотрицательных бактерий, мышей и крыс). В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения набор зондов содержит две или более, или пять или более, или 10 или более, или 25 или более, или 44 последовательности из номеров SEQ ID NO: 334-377 (Archaea). В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения набор зондов содержит две или более, или пять или более, или 10 или более, или 25 или более, или 50 или более, или 51 последовательность из номеров SEQ ID NO: 378-428 (мыши и крысы).
[0053] В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения комплект включает: 1) набор зондов, как описано в настоящем документе; 2) рибонуклеаза; 3) ДНКаза; и 4) гранулы для очистки РНК. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения комплект включает буфер деплеции РНК, буфер зонда деплеции и буфер для удаления зонда.
Анализ деплецированных образцов
[0054] Описанные способы также находят применение при анализе транскриптомов из отдельных или смешанных образцов. Транскриптомному анализу может препятствовать высокое относительное содержание рибосомной РНК, например, образец может содержать ≥ 85% молекул рРНК в общей РНК из бактериальных клеток. При таком большом количестве рРНК, конкурирующих за секвенирование, или других реагентов для анализа, может быть трудно сосредоточиться на более информативных частях транскриптома, которые могут потеряться на фоне анализа нежелательной рРНК. Описанные способы могут способствовать расширенному транскриптомному анализу микробных или эукариотических изолятов, например, при небольшом объеме образца ДНК, приводя к меньшему количеству прочтений секвенирования рРНК, обеспечивая более низкие затраты на секвенирование и позволяя проводить метатранскриптомный анализ образцов с низкой биомассой. Это показано в примере 4, в котором небольшой объем (< 80 нг) в смешанных образцах оценивали с использованием способов деплеции рРНК РНКазы H, описанных в настоящем документе. Описанные в настоящем документе способы можно использовать в сочетании с различными применениями со стороны 3'-концов, такими как создание библиотек для методик секвенирования нуклеиновых кислот, использование обогащенных образцов для ОТ-ПЦР с последующим проведением микроматричного анализа, ПЦР, кПЦР и т.д. Однако следует понимать, что обогащенные образцы РНК, полученные способами деплеции РНК, описанными в настоящем документе, не ограничены каким-либо конкретным последующим применением, таким как секвенирование.
[0055] Например, РНК образцы после деплеции можно использовать для создания библиотек секвенирования таким образом, чтобы созданные библиотеки можно было присоединять в фиксированных местоположениях на чипе таким образом, чтобы их относительные положения не изменялись, а чип многократно визуализировался. В частности, применимы варианты осуществления, в которых изображения получают в разных цветовых каналах, например, совпадающих с разными метками, используемыми для отличия одного типа нуклеотидного основания от другого. В некоторых вариантах осуществления процесс определения нуклеотидной последовательности нуклеиновой кислоты-мишени может представлять собой автоматический процесс. Предпочтительные варианты осуществления включают методики последовательного синтеза (SBS - sequencing-by-synthesis).
[0056] Методики SBS по существу включают ферментативное удлинение зарождающейся цепи нуклеиновой кислоты путем итерационного добавления нуклеотидов к цепи матрицы. В традиционных способах SBS однонуклеотидный мономер можно вводить в нуклеотид-мишень в присутствии полимеразы при каждой доставке. В SBS могут использоваться нуклеотидные мономеры с терминаторной функциональной группой или без нее. Способы использования нуклеотидных мономеров без терминаторов включают, например, пиросеквенирование и секвенирование с использованием γ-фосфат-меченных нуклеотидов. В способах использования нуклеотидных мономеров, не содержащих терминаторов, число добавляемых в каждом цикле нуклеотидов по существу варьируется и зависит от матричной последовательности и способа доставки нуклеотидов. В случае методик SBS, в которых используются нуклеотидные мономеры с терминальной функциональной группой, терминатор может быть эффективно необратимым при условиях секвенирования, как в случае традиционного секвенирования по Сэнгеру с использованием дидезоксинуклеотидов, или терминатор может быть обратимым, как в случае способов секвенирования, разработанных компанией Solexa (в настоящее время Illumina, Inc.).
[0057] Методологии секвенирования, при которых можно использовать процессы деплеции РНК и обогащенные РНК образцы, включают, без ограничений, секвенирование цикла, которое выполняют путем поэтапного добавления обратимых терминаторных нуклеотидов, содержащих, например, расщепляемый или фотовыщелачиваемый краситель. Примеры приборов Illumina, которые могут использовать способы, описанные в настоящем документе, включают доступные в продаже приборы HiSeqTM, MiSeqTM, NextSeqTM, NovaSeqTM, NextSeqTM и iSeqTM.
[0058] Дополнительные методики секвенирования включают способ лигирования. В таких способах используется ДНК-лигаза для включения олигонуклеотидов и идентификации их включения.
[0059] Кроме того, при секвенировании нанопор для получения библиотеки можно также использовать описанные образцы РНК после деплеции. Способы секвенирования нанопор определяют последовательность нити нуклеиновых кислот, которые проходят через пору, при этом изменение, протекающее через пору, характерно для того, какой нуклеотид проходит через нее.
[0060] Кроме того, при секвенировании с использованием мониторинга активности ДНК-полимеразы в реальном времени можно использовать образцы РНК после деплеции.
[0061] Дополнительные методики SBS по созданию библиотек для секвенирования с использованием образцов РНК после деплеции, описанных в настоящем документе, включают в себя обнаружение протона, высвобождаемого при встраивании нуклеотида в продукт достройки. Например, при секвенировании на основе обнаружения высвобожденных протонов можно использовать электрический детектор и связанные с ним решения, которые доступны в продаже от компании Ion Torrent (дочерняя компания Life Technologies, Guilford, CT (Гуилфорд, штат Коннектикут)).
[0062] К дополнительным применениям со стороны 3'-концов, в которых могут использоваться обогащенные образцы РНК после деплеции, как описано в настоящем документе, относятся ПЦР, кПЦР, микроматричный анализ и т.д. Например, микроматричный анализ представляет собой эффективный способ исследования экспрессии генов. Обогащенные образцы можно использовать в микроматричном анализе путем превращения обогащенной РНК в кДНК способами, известными специалистам в данной области (например, ОТ-ПЦР полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией). Затем кДНК можно иммобилизовать на субстратах, применять микроматричные зонды и определять экспрессионный анализ, следуя любому из множества способов микроматричного анализа (например, Agilent, Affymetrix и Illumina, а также многие другие продают коммерческие системы анализа микрочипов). В полимеразной цепной реакции (ПЦР) или количественной ПЦР (кПЦР) также можно использовать обогащенный образец в качестве субстрата в соответствии с установленными методиками (текущие протоколы по молекулярной биологии).
[0063] Таким образом, образцы с пониженным содержанием РНК, полученные способами, описанными в настоящем документе, можно использовать для создания библиотек секвенирования, продуктов амплификации и т.п., которые можно использовать для методологий анализа со стороны 3'-концов. Описанные способы не ограничиваются каким-либо применением со стороны 3'-концов.
ПРИМЕРЫ
[0064] Приведенные ниже примеры являются только иллюстративными и не предназначены для ограничения объема заявки. Модификации будут очевидны и понятны специалистам в данной области и включены в сущность и объем изобретения, описанного в настоящей заявке.
ПРИМЕР 1. Деплеция нежелательных видов РНК из образца
[0065] В данном примере общая РНК представляет собой нуклеиновую кислоту-мишень в образце, а деплеция РНК включает четыре основных этапа: 1) гибридизация, 2) обработка РНКазой H, 3) обработка ДНКазой и 4) очистка РНК-мишени.
[0066] Гибридизацию проводят путем отжига определенного ДНК-зонда, установленного на денатурированную РНК, в образце. Образец РНК, 10-100 нг, инкубируют в пробирке с 1 мкл набора 1 мкМ/олиго- ДНК олигонуклеотидных зондов (зонды, соответствующие номерам SEQ ID NO: 1-333, как указано в таблице 1), 3 мкл 5X буфера для гибридизации (500 мМ Трис-HCl pH 7,5 и 1000 мМ KCl), 2,5 мкл 100% формамида и достаточным количеством воды для общего реакционного объема 15 мкл. Реакционную смесь гибридизации инкубируют при 95°C в течение 2 минут для денатурации нуклеиновых кислот, медленно охлаждают до 37°C путем снижения температуры на 0,1°C/сек и выдерживают при 37°C. После достижения реакционной смесью температуры 37°C время для инкубации не требуется. Общее время, необходимое для достижения денатурацией 37°C, составляет приблизительно 15 мин.
[0067] После гибридизации в реакционную пробирку добавляют следующие компоненты для удаления нежелательных видов РНК из дуплекса ДНК : РНК; 4 мкл 5X буфера РНКазы H (100 мМ Трис pH 7,5, 5 мМ ДТТ, 40 мМ MgCl2) и 1 мкл фермента РНКазы H. Ферментативную реакционную смесь инкубируют при 37°C в течение 30 минут. Реакционная пробирка может удерживаться на льду.
[0068] После удаления РНК из гибрида ДНК : РНК ДНК-зонды расщепляются. В реакционную пробирку объемом 20 мкл добавляют следующие компоненты: 3 мкл 10X буфера Turbo DNase (200 мМ Трис pH 7,5, 50 мМ CaCl2, 20 мМ MgCl2), 1,5 мкл Turbo DNase (Thermo Fisher Scientific) и 5,5 мкл H2O до общего объема 30 мкл. Ферментативную реакционную смесь инкубируют при 37°C в течение 30 минут, а затем при 75°C в течение 15 минут. Инкубация при 75°C может использоваться для фрагментации общей РНК-мишени до требуемых размеров вставок в целях дальнейшей обработки со стороны 3'-концов. В данном примере размер целевой вставки составляет приблизительно 200 нт от общей РНК. Время этой стадии инкубации можно регулировать в зависимости от размера вставки, необходимого для последующих реакций, на усмотрение квалифицированного специалиста. После инкубации реакционную пробирку можно хранить на льду.
[0069] После гибридизации зондов с нежелательной РНК, удаления РНК и удаления ДНК общую РНК-мишень в образце можно выделить из условий реакции. Реакционную пробирку достают из среды хранения при 4°C и дают ей нагреться до комнатной температуры, добавляют 60 мкл гранул RNAClean XP (Beckman Coulter) и инкубируют в течение 5 мин. После инкубации пробирку помещают на магнит на 5 мин, после чего супернатант осторожно удаляют и выбрасывают. Не снимая с магнита, гранулы с присоединенной общей РНК дважды промывают в 175 мкл свежеприготовленного 80% этанола. После второго промывания гранулы центрифугируют в микроцентрифуге для осаждения гранул на дне пробирки. После чего пробирку помещают обратно на магнит и удаляют как можно больше остаточного этанола, соблюдая особую осторожность и сохраняя целостность гранул. Гранулы высушивают на воздухе в течение нескольких минут, ресуспендируют в 9,5 мкл буфера ELB (Illumina), оставляют еще несколько минут при комнатной темп и помещают обратно на магнит для сбора гранул. 8,5 мкл супернатанта переносят в неиспользованную пробирку и помещают на лед для дальнейшей дополнительной обработки со стороны 3'-концов, такой как создание кДНК из общей РНК-мишени.
[0070] В другом примере 100 нг общей РНК разводят в 11 мкл сверхчистой воды без нуклеаз в каждой лунке 96-луночного планшета для ПЦР. В каждую лунку с буфером для гибридизации добавляют 4 мкл ДНК-зондов (номера SEQ ID NO: 1-333). Содержимое лунок перемешивают, а также центрифугируют при необходимости. Планшет нагревают при 95°C в течение 2 мин, а затем снижают температуру со скоростью 0,1°C/сек до тех пор, пока температура не достигнет 37°C, а затем удерживают при 37°C для гибридизации зондов. Планшет центрифугируют при 280xg в течение 10 секунд. Для разложения гибридов ДНК : РНК в каждую лунку добавляют по 5 мкл РНКазы в буфере и содержимое лунок перемешивают. Планшет нагревают при 37°C в течение 15 мин, а затем выдерживают при 4°C. В каждую лунку добавляют 10 мкл ДНКазы в буфере и содержимое лунки перемешивают. Планшет нагревают при 37°C в течение 15 мин, а затем выдерживают при 4°C. Планшет с образцами центрифугируют при 280xg в течение 10 секунд. В каждую лунку добавляют 60 мкл гранул RNAClean XP и содержимое лунок перемешивают. Планшет инкубируют при комнатной температуре в течение 5 мин. Планшет помещают на магнитную стойку до достижения прозрачности супернатантом (приблизительно 5 мин). Супернатант извлекают из каждой лунки и утилизируют. Гранулы дважды промывают 80% этанолом. Остаточный этанол удаляют из каждой лунки. Планшет сушат на воздухе на магнитной стойке в течение 1 мин. В каждую лунку добавляют 10,5 мкл элюирующего буфера, содержимое лунки перемешивают. Планшет инкубируют при комнатной температуре в течение 2 мин. Затем его запечатывают и центрифугируют при 280xg в течение 10 секунд. Планшет помещают на магнитную стойку до достижения прозрачности супернатантом (приблизительно 2 мин). Из каждой лунки переносят 8,5 мкл супернатанта в соответствующую лунку нового планшета.
ПРИМЕР 2. Синтез кДНК
[0071] При дальнейшем процессинге РНК из примера 1 можно получить библиотеку препаратов из нуклеиновых кислот РНК-мишени, которые можно секвенировать, например, способами секвенирования следующего поколения (NGS - next generation sequencing). К 8,5 мкл конечной реакции из примера 1 добавляют 8,5 мкл элюата добавляют первичный буфер для смеси случайных гексамеров с высокой концентрацией (буфер EPH, TruSeq Stranded Total RNA Kit, Illumina) до общего объема 17 мкл. Образец инкубируют при 65°C в течение 2 мин для денатурации нуклеиновых кислот. После денатурации реакционную пробирку можно хранить на льду. Синтез первой цепи выполняют путем добавления 8 мкл смеси ферментов для обратной транскрипции (9 мкл смеси для синтеза первой нити (FSA, TruSeq Straned Total RNA Kit, Illumina) и 1 мкл смеси для обратной транскрипции II RT (NEB)) к денатурированному образцу до общего объема 25 мкл. Реакционную смесь инкубируют в термоциклере с нагретой крышкой при следующих условиях: 25°C в течение 5 мин, 42°C в течение 25 мин, 70 °C в течение 15 мин. После завершения реакции синтеза первой цепи реакционную трубку можно хранить на льду.
[0072] Синтез кДНК второй цепи можно выполнить путем добавления 5 мкл буфера для ресуспендирования (RSB, TruSeq Straned Total RNA Kit, Illumina) и 20 мкл второй смеси для маркирования нити (буфер SSM, TruSeq Straned Total RNA Kit, Illumina) к образцу, хранимому на льду. Реакционную пробирку инкубируют при 16°C в течение 60 мин, а затем образец можно хранить на льду.
[0073] После стадий синтеза можно очистить и отделить кДНК от реакционных компонентов, например, путем добавления 90 мкл SPB (Illumina) в реакционную пробирку и инкубирования в течение 5 мин при комнатной температуре. После инкубации пробирку помещают на магнит примерно на 8 минут, чтобы собрать парамагнитные микроносители. Супернатант осторожно удаляют и утилизируют. Не снимая с магнита, гранулы дважды промывают 175 мкл свежеприготовленного 80% этанола. После промывки гранулы центрифугируют в направлении дна пробирки. Пробирку помещают обратно на магнит, а этанол осторожно удаляют и утилизируют. Гранулы высушивают в течение нескольких минут и ресуспендируют в 18,5 мкл ресуспендирующего буфера (RSB - Resuspension Buffer), хорошо перемешивают и инкубируют при комнатной температуре в течение приблизительно 5 мин, после чего помещают обратно на магнит. В зависимости от применений со стороны 3'-концов требуемое количество очищенной кДНК можно переместить в неиспользованную пробирку. В этом примере выполняется подготовка библиотеки для секвенирования со стороны 3'-концов, поэтому 17,5 мкл супернатанта переносят в неиспользованную пробирку, которую можно хранить на льду.
ПРИМЕР 3. Подготовка библиотеки для секвенирования следующего поколения
[0074] Один способ получения библиотеки для секвенирования включает в себя A-хвосты фрагментов кДНК, лигирующие адаптеры, амплификацию целевых фрагментов и количественную оценку полученных фрагментов перед секвенированием.
[0075] Для обработки использовали пробирку с 17,5 мкл очищенной кДНК из примера 2. К очищенной кДНК добавляют 12,5 мкл буфера ATL (Illumina) для добавления аденина к 3'-концу фрагментированной ДНК. Реакционную пробирку инкубируют при 37°C в течение 30 мин с последующей инкубацией при 70°C в течение 5 мин и возвращают пробирку на лед. Адаптеры лигируют с образцом, к 3'-концу фрагментированной ДНК которого добавлено аденин, путем добавления по порядку: 2,5 мкл ресуспендирующего буфера, 2,5 мкл адаптеров индекса (TruSeq Straned Total RNA Kit, Illumina) и 2,5 мкл лигирующего буфера (Illumina). Реакционную пробирку инкубируют при 30°C в течение 10 мин, после чего добавляют 5 мкл останавливающего лигирующего буфера (Illumina). Реакционную смесь хранят на льду.
[0076] По завершении реакции лигирования адаптера лигированные фрагменты отделяют от реакционных компонентов. Для очистки лигированных с адаптером фрагментов в реакционную пробирку добавляют 34 мкл SPB и инкубируют при комнатной температуре в течение приблизительно 5 мин. Затем пробирку помещают на магнит для улавливания парамагнитных гранул и дважды их промывают 175 мкл 80% EtOH. EtOH осторожно удаляют после второй промывки. Через 3 мин высушивания на воздухе гранулы ресуспендируют в 52 мкл RSB. Суспензию перемешивают, оставляют при комнатной температуре на еще 5 мин и помещают обратно на магнит. Супернатант (50 мкл) переносят в неиспользованную пробирку для второго цикла очистки гранул.
[0077] Во втором цикле 40 мкл SPB добавляют к 50 мкл образца и повторяют описанный выше способ, за исключением того, что конечные очищенные фрагменты ресуспендируют в 21 мкл RSB и 20 мкл конечного очищенного образца и переносят в новую реакционную пробирку для последующей амплификации, которая увеличивает количество целевой последовательности для оптимизации результатов секвенирования.
[0078] К 20 мкл очищенного образца, лигированного с адаптером, добавляют 5 мкл смеси праймеров для ПЦР (PPC, TruSeq Straned Total RNA Kit, Illumina) и 25 мкл смеси праймеров и зондов (TruSeq Straned Total RNA Kit, Illumina) и выполняют следующую программу амплификации в термоциклере с нагретой крышкой: При температуре 98°C в течение 30 сек с последующей циклической программой 98°C в течение 10 сек, 60°C в течение 30 сек, 72°C в течение 30 сек. Количество циклов амплификации зависит от количества РНК в начале всего процесса. Например, для 100 нг РНК может потребоваться приблизительно 12-13 циклов, для 10 нг - 15-16 циклов, а для 1 нг - 17-18 циклов. Число циклов амплификации, как правило, оптимизируют для любого препарата, на усмотрение квалифицированного специалиста.
[0079] Ампликоны можно очистить от условий реакции путем добавления в реакционную пробирку 50 мкл SPB, инкубирования при комнатной температуре, центрифугирования пробирки для осаждения гранул и захвата гранул магнитным полем. Супернатант можно сливать, а гранулы промывать, как указано выше, с последующим ресуспендированием промытых гранул в 26 мкл RSB, захватом магнитных гранул и переносом супернатанта, содержащего библиотеку ДНК, для секвенирования в неиспользованную пробирку. Библиотеку, как правило, количественно определяют и анализируют перед секвенированием, например, путем измерения аликвоты с использованием набора QubitTM High Sensitivity kit (Thermo Fisher Scientific) и (или) проведения аликвоты на биоанализаторе (Agilent). Квалифицированному специалисту в данной области будет понятно множество способов количественного определения нуклеиновых кислот в образце.
[0080] Затем полученную библиотеку можно использовать для секвенирования следующего поколения, микроматричного анализа или других применений со стороны 3'-концов. В таких областях применения, как секвенирование, методологию получения библиотеки определяют с помощью используемого прибора для секвенирования и способа получения вспомогательной библиотеки для данного прибора для секвенирования. В данном примере способ получения библиотеки является характеристикой создания библиотеки при секвенировании на приборах Illumina. Квалифицированному специалисту в данной области будет понятно, что способы получения библиотек могут варьироваться в зависимости от аппаратуры секвенирования, поэтому настоящие примеры являются иллюстративными, а способы деплеции РНК не ограничены каким-либо конкретным рабочим процессом получения библиотеки. Благодаря настоящим способам использование образца РНК после удаления нежелательных видов РНК окажет положительное влияние на любые применения по ходу транскрипции.
ПРИМЕР 4. Транскриптомный анализ микроорганизмов
[0081] В этом примере микробные изоляты, смешанный образец бактериальных видов и стандартная клеточная смесь были получены из АТСС для тестирования.
| Тип образца | Тестируемые виды микроорганизмов |
| Изоляты микроорганизмов | E. coli, B. subtilis, S. Epidermidis, E. cloacae и B. cereus |
| ATCC-MSA2002 Смесь 20 штаммов | A. Baumannii, A. odontolyhticus, B. cereus, B. vulgatus, B. adolescentis, C. beijerinckii, C. acnes, D. radiodurans, E. faecalis, E. coli, H. pylori, L. gasseri., N. meningitidis, P. ginvalis, P. aeruginosa, R. sphaeroides, S. aureus, S. epidermidis, S. agalactiae, S. mutans |
| ATCC MSA2006 Смесь образцов из кишечника человека | B. tragilis, B. vulgatus, B. adolescentis, C. difficile, E. faecalis, L. plantarum, E. cloacae, E. coli, H. pylori, S. enterica, y. enterococolitica, F. ucleatum |
[0082] Общую РНК можно извлечь с помощью комплекта RNeasy Power Microbiome Kit (Qiagen) в соответствии с протоколом производителя и оценить целостность, а также количественно оценить с помощью электрофореза Bioanalyzer RNA Electrophoresis (Agilent). Для уменьшения концентрации рРНК в каждом образце можно использовать 10-250 нг общей РНК в соответствии с методикой RiboZero (Illumina, следуя протоколу производителя) или способами, описанными в настоящем документе, с применением ферментативного расщепления РНКазой H нежелательной рРНК. Образцы с удаленной рРНК и прочими нежелательными видами РНК (контрольные) можно приготовить к секвенированию с использованием комплекта подготовки образцов TruSeq Straned Total RNA (Illumina) согласно инструкциям производителя. Библиотеки можно объединять и секвенировать, например, на анализаторах секвенирования MiSeq или NextSeq (Illumina) для парных конечных прочтений 2 × 76.
[0083] Фильтрование, выравнивание и покрытие транскриптов может быть выполнено с использованием концентратора последовательностей BaseSpace (BSSH - BaseSpace Sequencing Hub) и следующих примеров обработки, например: 1) приложение для разделения последовательности рРНК Partition rRNA Sequences (анализ последовательностей рРНК для обозначения повторяющихся последовательностей), 2) приложение-конструктор для созданная генома РНК RNA Custom Genome Builder (создание STAR-совместимого микробного транскриптома) и 3) приложение выравнивание последовательности РНК RNA-Seq Alignment (STAR-выравнивание и количественная оценка Salmon-транскрипта). Для количественной оценки рРНК в нескольких штаммах микробных образцов последовательности рРНК можно извлечь из аннотированных Национальным центром биотехнологической информации США (NCBI - National Center for Biotechnological Information) геномов и использовать в качестве исходных данных для рабочего процесса BSSH.
[0084] Транскриптомы микробных изолятов, микробных смесей и контрольных образцов были секвенированы и сравнены с % считываний рРНК. Ферментный способ РНКазы H, описанный в настоящем документе, высокоэффективен при удалении нежелательной рРНК в тестируемых видах (<5% прочтений рРНК). Удаление рибосомной РНК наиболее значимо для образца E. coli с низким объемом (10 нг) при использовании способа РНКазы H в сравнении с установленным способом RiboZero; <0,5% против 13% средних прочтений рРНК, соответственно (Фиг. 5).
[0085] Данные использовались для получения доступа к обогащению биологически важных прочтений РНК при применении способов деплеции рРНК ферментами РНКазы H, и сравнивались с данными образца без удаления рРНК. На Фиг. 6 представлены результаты оценки, при которой в целом наблюдали 20-50-кратное уменьшение глубины прочтения для образца b. subtilis или E. coli, если рРНК удалялась до получения препаратов библиотеки и секвенирования с применением способов РНКазы H по сравнению с образцом без удаления рРНК.
[0086] Собранные данные оценивали для определения воспроизводимости экспериментальных усилий по секвенированию микробного транскриптома. Попарную линейную регрессию уровней экспрессии генов определяли между репликами с удаленной рРНК ферментами РНКазы H для E. coli и B. subtilis в качестве примеров систем. Высокая корреляция (R2>0,99) показала способность способа деплеции рРНК ферментами РНКазы H воспроизводимо удалять рРНК из образцов (Фиг. 7).
[0087] Для оценки того, подходит ли способ деплеции рРНК ферментами РНКазы H для удаления рРНК смешанных образцов, на Фиг. 8 показаны примеры данных для смешанных образцов 20 штаммов MSA2002 и кишечника человека MSA2006 в трех повторностях. Для способов удаления рРНК использовали пробы с низким содержанием - 10 мг общей РНК из MSA2002 или 80 нг общей РНК из MSA2006. Для 20 штаммовых образцов MSA2002 способ удаления рРНК ферментами РНКазы H снизил количество прочтений рРНК на 83% или <2% прочтений последовательности, в то время как способ удаления рРНК RiboZero привел к более вариабельному и высокому содержанию рРНК по сравнению с образцами без деплеции. Для 12-штаммовых образцов MSA2006 наблюдался такой же результат, когда способ РНКазы H снизил количество прочтений рРНК примерно на 95% до <13% прочтений секвенирования по сравнению с образцами без деплеции, способ RiboZero дал более вариабельные результаты.
[0088] Таким образом, было определено, что в экспериментах по оценке образцов (смешанных или пр.) способ деплеции рРНК ферментами РНКазы H обеспечивает надежный и эффективный рабочий процесс для удаления нежелательной рРНК в образцах для высококачественного исследования микробного цельного транскриптома. Способ удаления рРНК ферментами РНКазы H также был очень эффективен и совместим с образцами небольших объемов.
ПРИМЕР 5. Влияние формамида на деплецию РНК
[0089] На Фиг. 2 представлены примеры данных образца РНК, в котором были удалены нежелательные виды РНК. Из образца была удалена нежелательная РНК с использованием описанных здесь способов, при этом выполнялась оценка влияния концентрации формамида на деплецию РНК. В данном примере ДНК-зонды нацелены на удаление нежелательных видов рРНК из грамположительных бактерий (23S, 16S, 5S), грамотрицательных бактерий (23S, 16S, 5S, включая), митохондрий человека (16S, 12S), рРНК человека (28S, 18S, 5.8S, 5S), мРНК гемоглобина человека (HBA-A1, HBA-A2, HBB, HBG1, HBG2), тогда как виды РНК-мишени представляют собой общую РНК из b. subtilis. По мере увеличения концентрации формамида процентная доля нежелательных видов РНК значительно снижается. Например, формамид при деплеции РНК не приводил к считыванию РНК, не являющейся мишенью, грамположительных бактерий 23S и 16S и грамотрицательных бактерий (включая E. coli) 23S и 16S, включая специфичные последовательности E. coli. Добавление 25% формамида в реакцию гибридизации привело к необнаружимым нецелевым считываниям грамотрицательных 23S и 16S (при этом значительное снижение числа нецелевых считываний соответствует E. coli) и к значительному снижению числа нецелевых считываний для грамположительных 23S и 16S. Добавление формамида к 45% реакции гибридизации привело к дополнительному значительному снижению нецелевых считываний для грамположительных нежелательных рРНК 23S и 16S, а также дальнейшее снижение нецелевых считываний E. coli. Таким образом, показано, что добавление формамида в реакцию гибридизации с РНК увеличивает количество грамположительных и грамотрицательных нежелательных РНК, на что указывает снижение числа нецелевых считываний для этих видов. В целом было обнаружено, что добавление формамида улучшает удаление нежелательных транскриптов рРНК. При использовании РНК B. subtilis в качестве РНК-мишени для анализа, например, анализ на наличие последовательностей E. coli и рРНК человека может служить показателем потенциального загрязнения.
ПРИМЕР 6. Различные варианты исходного материала
[0090] Проведены эксперименты по выявлению влияния вводимого исходного материала на истощение РНК и последующий анализ со стороны 3'-концов, как показано на Фиг. 3, где для создания библиотек секвенирования на приборе Illumina NextSeqTM 500 или 550 использовали РНК после удаления нежелательных видов РНК и обогащенные РНК человеческого мозга (HBR -human brain RNA) и универсальную человеческую РНК (UHR - universal human RNA). После уменьшения концентрации РНК с использованием 100 нг, 10 нг или 1 нг исходных образцов были приготовлены библиотеки секвенирования, как показано в примерах 1-3. Секвенирование было выполнено в соответствии с рекомендациями руководства пользователя NextSeqTM, после чего был проведен анализ данных с использованием двух приложений BaseSpace (Illumina), приложения RNASeq Alignment и приложения RNAExpress. Анализ данных на наличие B. subtilis и E. coli также проводили с помощью модифицированного инструмента Fastqscreen (https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastq_screen/). Данные, показывающие, что деплеция РНК остается постоянной как для HBR, так и для UHR, независимо от количества входного образца РНК и % общего выравнивания для РНК-мишени, хотя и наблюдается сокращение с уменьшением объема, все же демонстрируют, что действенные и полезные данные о последовательности могут быть собраны даже при использовании 1 нг входного образца. Кроме того, в сравнительном эксперименте текущий способ деплеции РНК приводит к меньшему процентному содержанию нецелевых считываний при всех входных уровнях (100 нг ~ 3%, 25 нг ~ 4%, 10 нг ~ 3% и 1 нг ~ 3%) по сравнению с данными при использовании комплекта для деплеции рРНК RiboZero (Epicentre) (100 нг ~ 3%; 25 нг ~ 5%, 10 нг ~ 8% и 1 нг ~ 35%) или способы деплеции рРНК NEBext (NEB) (100 нг ~ 8%, 25 нг ~ 8%, 10 нг ~ 9% и 1 нг ~ 30%).
ПРИМЕР 7. Деплеция РНК в образцах РНК мыши и крысы
[0091] Чтобы продемонстрировать, что способы деплеции РНК могут использоваться на образцах РНК не относящихся к человеку, для способов деплеции РНК использовали образцы РНК мыши и крысы. На Фиг. 4 нежелательная РНК была удалена из образцов РНК мыши или крысы с использованием эквивалентных способов и ДНК-зондов, что и при деплеции РНК образцов человека. Значение формамида снова варьировалось у каждого вида грызунов, включая его отсутствие в реакции гибридизации (25% или 45% формамида). Хотя увеличение формамида не влияет на общий % совмещенных прочтений, может наблюдаться тенденция к увеличению нецелевых прочтений по мере увеличения количества формамида. Таким образом, добавление формамида в реакцию гибридизации может быть полезным для некоторых типов образцов, поскольку это может улучшить обнаружение некоторых транскриптов. Добавление формамида должно быть оптимизировано.
ПРИМЕР 8. Получение дополнительных мышиных зондов
[0092] В пуле из 333 ДНК-зондов, описанных выше для ферментативного удаления нежелательных последовательностей (номера SEQ ID NO.: 1-333), олигонуклеотиды ДНК для эукариотического удаления рРНК были разработаны на основе основных транскриптов человеческой рРНК, а именно 5S, 5,8S, 18S и 28S, а также двух последовательностей митохондриальной рРНК (12S и 16S). При тестировании на общей РНК человека данный пул из 333 ДНК-зондов был очень эффективен в удалении рочтений рРНК. Однако при тестировании образцов общей РНК мыши (Mus musculus) или крысы (Rattus norvegicus) деплеция была менее устойчивой, что позволяет предположить, что зонды не гибридизуются и не удаляют некоторые области последовательностей рРНК грызунов эффективно, поскольку эти области у мышей и крыс отличаются от последовательностей человека.
[0093] Файлы FASTRQ, содержащие общие прочтения секвенирования, полученные в эксперименте с 333 ДНК-зондами, были сопоставлены с последовательностями рибосомных РНК мыши и крысы и с последовательностями 333 ДНК-зондов. Результаты выравнивания показали, что охват зондов по всем последовательностям рибосомной РНК был по существу хорошим, но существуют некоторые области, в которых последовательности зондов не выравнивались также как с РНК грызунов. Более конкретно, большинство считываний рРНК мыши и крысы, которые не совпадают с картой пула зондов, принадлежат транскриптам 28S или 16S рРНК грызунов (таблица 2). Выравнивание проводили с помощью программы Bowtie2 (см. Langmead и Salzberg, Nature Methods 2012, 9:357-359), версия 2.1.0, с настройками по умолчанию. Большая часть рибосомной РНК, которая не была удалена ферментативным способом с помощью 333 ДНК-зондов, была из тех же областей, в которых отсутствует выравнивание зонда (Фиг. 9).
Таблица 2. Использованные для исследования данные генетических последовательностей мышей и крыс из хранилища GenBank
| Геном | 16S | 28S |
| Mus musculus | NC_005089.1:1094-2675 | NR_003279.1 |
| Rattus norvegicus | NC_001665.2:1094-2664 | NR_046246.1 |
[0094] Для более эффективной деплеции этих областей были разработаны дополнительные зонды, покрывающие области, описанные выше, для последовательностей рибосомной РНК мышей и крыс. Чтобы свести к минимуму количество дополнительных зондов и их избыточности, были разработаны дополнительные зонды, покрывающие бреши в последовательностях рРНК мыши. Затем эти данные были информативно объединены вместе с набором из 333 ДНК-зондов для выявления оставшихся брешей в рРНК крыс путем сопоставления объединенного пула с транскриптами рРНК крысы. В результате этого последовательного процесса получали в общей сложности 44 дополнительных олигонуклеотидных зондов для обеспечения дополнительного пула из 377 зондов. Эксперименты по секвенированию, как описано выше, повторяли с набором из 377 ДНК-зондов. Добавление новых 44 зондов как в образцах мыши, так и крысы привело к снижению процента прочтений рРНК из библиотек по сравнению с набором из 333 ДНК-зондов, что показывает повышенную эффективность деплеции (таблица 3).
Таблица 3. Процентное содержание рибосомной РНК в прочтениях секвенирования с использованием наборов из 333 и 377 зондов
| Набор зондов РНКазы H | Образец мыши | Образец крысы |
| Набор из 333 ДНК-зондов | 9,5% | 5,3% |
| Набор из 377 ДНК-зондов | 7,0% | 3,7% |
[0095] Добавление дополнительных зондов в пул из 333 ДНК-зондов к определенным последовательностям грызунов повышало уровень удаления рРНК в исследуемых образцах грызунов. Примеры зондов к 16S мышей включают номера SEQ ID NO: 385-393. Примеры зондов к 28S мышей включают номера SEQ ID NO: 400-419. Примеры зондов против 16S крыс включают номера SEQ ID NO: 394-399. Примеры зондов против 28S крыс включают номера SEQ ID NO: 420-428.
--->
ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
<110> EPICENTRE TECHNOLOGIES CORPORATION
<120> ДЕПЛЕЦИЯ РНК НА ОСНОВЕ НУКЛЕАЗЫ
<130> 01243-0012-00PCT
<150> US 62/783,869
<151> 2018-12-21
<150> US 62/847,797
<151> 2019-05-14
<160> 428
<170> Версия патента — 3.5
<210> 1
<211> 50
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> ДНК-зонд
<400> 1
gttcgtccaa gtgcactttc cagtacactt accatgttac gacttgtctc 50
<210> 2
<211> 50
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> ДНК-зонд
<400> 2
taggggtttt agttaaatgt cctttgaagt atacttgagg agggtgacgg 50
<210> 3
<211> 50
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> ДНК-зонд
<400> 3
ttcagggccc tgttcaacta agcactctac tctcagttta ctgctaaatc 50
<210> 4
<211> 50
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> ДНК-зонд
<400> 4
agtttcataa gggctatcgt agttttctgg ggtagaaaat gtagcccatt 50
<210> 5
<211> 50
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> ДНК-зонд
<400> 5
ggctacacct tgacctaacg tctttacgtg ggtacttgcg cttactttgt 50
<210> 6
<211> 50
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> ДНК-зонд
<400> 6
ttgctgaaga tggcggtata taggctgagc aagaggtggt gaggttgatc 50
<210> 7
<211> 50
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> ДНК-зонд
<400> 7
cagaacaggc tcctctagag ggatatgaag caccgccagg tcctttgagt 50
<210> 8
<211> 50
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> ДНК-зонд
<400> 8
gtagtgttct ggcgagcagt tttgttgatt taactgttga ggtttagggc 50
<210> 9
<211> 50
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> ДНК-зонд
<400> 9
atctaatccc agtttgggtc ttagctattg tgtgttcaga tatgttaaag 50
<210> 10
<211> 50
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> ДНК-зонд
<400> 10
attttgtgtc aactggagtt ttttacaact caggtgagtt ttagctttat 50
<210> 11
<211> 50
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> ДНК-зонд
<400> 11
ctaaaacact ctttacgccg gcttctattg acttgggtta atcgtgtgac 50
<210> 12
<211> 50
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> ДНК-зонд
<400> 12
gaaattgacc aaccctgggg ttagtatagc ttagttaaac tttcgtttat 50
<210> 13
<211> 50
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> ДНК-зонд
<400> 13
actgctgttt cccgtggggg tgtggctagg ctaagcgttt tgagctgcat 50
<210> 14
<211> 50
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> ДНК-зонд
<400> 14
gcttgtccct tttgatcgtg gtgatttaga gggtgaactc actggaacgg 50
<210> 15
<211> 50
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> ДНК-зонд
<400> 15
taatcttact aagagctaat agaaaggcta ggaccaaacc tatttgttta 50
<210> 16
<211> 50
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> ДНК-зонд
<400> 16
aaaccctgtt cttgggtggg tgtgggtata atactaagtt gagatgatat 50
<210> 17
<211> 50
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> ДНК-зонд
<400> 17
gcgctttgtg aagtaggcct tatttctctt gtcctttcgt acagggagga 50
<210> 18
<211> 50
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> ДНК-зонд
<400> 18
aaaccgacct ggattactcc ggtctgaact cagatcacgt aggactttaa 50
<210> 19
<211> 50
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> ДНК-зонд
<400> 19
acctttaata gcggctgcac catcgggatg tcctgatcca acatcgaggt 50
<210> 20
<211> 50
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> ДНК-зонд
<400> 20
tgatatggac tctagaatag gattgcgctg ttatccctag ggtaacttgt 50
<210> 21
<211> 50
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> ДНК-зонд
<400> 21
attggatcaa ttgagtatag tagttcgctt tgactggtga agtcttagca 50
<210> 22
<211> 50
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> ДНК-зонд
<400> 22
ttgggttctg ctccgaggtc gccccaaccg aaatttttaa tgcaggtttg 50
<210> 23
<211> 50
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> ДНК-зонд
<400> 23
tgggtttgtt aggtactgtt tgcattaata aattaaagct ccatagggtc 50
<210> 24
<211> 50
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> ДНК-зонд
<400> 24
gtcatgcccg cctcttcacg ggcaggtcaa tttcactggt taaaagtaag 50
<210> 25
<211> 50
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> ДНК-зонд
<400> 25
cgtggagcca ttcatacagg tccctattta aggaacaagt gattatgcta 50
<210> 26
<211> 50
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> ДНК-зонд
<400> 26
ggtaccgcgg ccgttaaaca tgtgtcactg ggcaggcggt gcctctaata 50
<210> 27
<211> 50
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> ДНК-зонд
<400> 27
gtgatgtttt tggtaaacag gcggggtaag gtttgccgag ttccttttac 50
<210> 28
<211> 50
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> ДНК-зонд
<400> 28
cttatgagca tgcctgtgtt gggttgacag tgagggtaat aatgacttgt 50
<210> 29
<211> 50
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> ДНК-зонд
<400> 29
attgggctgt taattgtcag ttcagtgttt tgatctgacg caggcttatg 50
<210> 30
<211> 50
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> ДНК-зонд
<400> 30
tcatgttact tatactaaca ttagttcttc tatagggtga tagattggtc 50
<210> 31
<211> 50
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> ДНК-зонд
<400> 31
agttcagtta tatgtttggg attttttagg tagtgggtgt tgagcttgaa 50
<210> 32
<211> 50
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> ДНК-зонд
<400> 32
tggctgcttt taggcctact atgggtgtta aattttttac tctctctaca 50
<210> 33
<211> 50
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> ДНК-зонд
<400> 33
gtccaaagag ctgttcctct ttggactaac agttaaattt acaaggggat 50
<210> 34
<211> 50
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> ДНК-зонд
<400> 34
ggcaaattta aagttgaact aagattctat cttggacaac cagctatcac 50
<210> 35
<211> 50
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> ДНК-зонд
<400> 35
tgtcgcctct acctataaat cttcccacta ttttgctaca tagacgggtg 50
<210> 36
<211> 50
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> ДНК-зонд
<400> 36
tcttaggtag ctcgtctggt ttcgggggtc ttagctttgg ctctccttgc 50
<210> 37
<211> 50
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> ДНК-зонд
<400> 37
taattcatta tgcagaaggt ataggggtta gtccttgcta tattatgctt 50
<210> 38
<211> 50
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> ДНК-зонд
<400> 38
tctttccctt gcggtactat atctattgcg ccaggtttca atttctatcg 50
<210> 39
<211> 50
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> ДНК-зонд
<400> 39
ggtaaatggt ttggctaagg ttgtctggta gtaaggtgga gtgggtttgg 50
<210> 40
<211> 50
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> ДНК-зонд
<400> 40
taatgatcct tccgcaggtt cacctacgga aaccttgtta cgacttttac 50
<210> 41
<211> 50
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> ДНК-зонд
<400> 41
aagttcgacc gtcttctcag cgctccgcca gggccgtggg ccgaccccgg 50
<210> 42
<211> 50
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> ДНК-зонд
<400> 42
ggcctcacta aaccatccaa tcggtagtag cgacgggcgg tgtgtacaaa 50
<210> 43
<211> 50
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> ДНК-зонд
<400> 43
caacgcaagc ttatgacccg cacttactcg ggaattccct cgttcatggg 50
<210> 44
<211> 50
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> ДНК-зонд
<400> 44
ccgatcccca tcacgaatgg ggttcaacgg gttacccgcg cctgccggcg 50
<210> 45
<211> 50
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> ДНК-зонд
<400> 45
ctgagccagt cagtgtagcg cgcgtgcagc cccggacatc taagggcatc 50
<210> 46
<211> 50
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> ДНК-зонд
<400> 46
ctcaatctcg ggtggctgaa cgccacttgt ccctctaaga agttggggga 50
<210> 47
<211> 50
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> ДНК-зонд
<400> 47
ggtcgcgtaa ctagttagca tgccagagtc tcgttcgtta tcggaattaa 50
<210> 48
<211> 50
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> ДНК-зонд
<400> 48
caccaactaa gaacggccat gcaccaccac ccacggaatc gagaaagagc 50
<210> 49
<211> 50
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> ДНК-зонд
<400> 49
cctgtccgtg tccgggccgg gtgaggtttc ccgtgttgag tcaaattaag 50
<210> 50
<211> 50
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> ДНК-зонд
<400> 50
ctggtggtgc ccttccgtca attcctttaa gtttcagctt tgcaaccata 50
<210> 51
<211> 50
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> ДНК-зонд
<400> 51
aaagactttg gtttcccgga agctgcccgg cgggtcatgg gaataacgcc 50
<210> 52
<211> 50
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> ДНК-зонд
<400> 52
ggcatcgttt atggtcggaa ctacgacggt atctgatcgt cttcgaacct 50
<210> 53
<211> 50
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> ДНК-зонд
<400> 53
gattaatgaa aacattcttg gcaaatgctt tcgctctggt ccgtcttgcg 50
<210> 54
<211> 50
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> ДНК-зонд
<400> 54
cacctctagc ggcgcaatac gaatgccccc ggccgtccct cttaatcatg 50
<210> 55
<211> 50
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> ДНК-зонд
<400> 55
accaacaaaa tagaaccgcg gtcctattcc attattccta gctgcggtat 50
<210> 56
<211> 50
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> ДНК-зонд
<400> 56
ctgctttgaa cactctaatt ttttcaaagt aaacgcttcg ggccccgcgg 50
<210> 57
<211> 50
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> ДНК-зонд
<400> 57
gcatcgaggg ggcgccgaga ggcaaggggc ggggacgggc ggtggctcgc 50
<210> 58
<211> 50
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> ДНК-зонд
<400> 58
ccgcccgctc ccaagatcca actacgagct ttttaactgc agcaacttta 50
<210> 59
<211> 50
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> ДНК-зонд
<400> 59
gctggaatta ccgcggctgc tggcaccaga cttgccctcc aatggatcct 50
<210> 60
<211> 50
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> ДНК-зонд
<400> 60
agtggactca ttccaattac agggcctcga aagagtcctg tattgttatt 50
<210> 61
<211> 50
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> ДНК-зонд
<400> 61
cccgggtcgg gagtgggtaa tttgcgcgcc tgctgccttc cttggatgtg 50
<210> 62
<211> 50
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> ДНК-зонд
<400> 62
gctccctctc cggaatcgaa ccctgattcc ccgtcacccg tggtcaccat 50
<210> 63
<211> 50
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> ДНК-зонд
<400> 63
taccatcgaa agttgatagg gcagacgttc gaatgggtcg tcgccgccac 50
<210> 64
<211> 50
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> ДНК-зонд
<400> 64
ggcccgaggt tatctagagt caccaaagcc gccggcgccc gccccccggc 50
<210> 65
<211> 50
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> ДНК-зонд
<400> 65
gctgaccggg ttggttttga tctgataaat gcacgcatcc cccccgcgaa 50
<210> 66
<211> 50
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> ДНК-зонд
<400> 66
tcggcatgta ttagctctag aattaccaca gttatccaag taggagagga 50
<210> 67
<211> 50
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> ДНК-зонд
<400> 67
aaccataact gatttaatga gccattcgca gtttcactgt accggccgtg 50
<210> 68
<211> 50
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> ДНК-зонд
<400> 68
atggcttaat ctttgagaca agcatatgct actggcagga tcaaccaggt 50
<210> 69
<211> 50
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> ДНК-зонд
<400> 69
gacaaaccct tgtgtcgagg gctgactttc aatagatcgc agcgagggag 50
<210> 70
<211> 50
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> ДНК-зонд
<400> 70
cgaaaccccg acccagaagc aggtcgtcta cgaatggttt agcgccaggt 50
<210> 71
<211> 50
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> ДНК-зонд
<400> 71
ggtgcgtgac gggcgagggg gcggccgcct ttccggccgc gccccgtttc 50
<210> 72
<211> 50
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> ДНК-зонд
<400> 72
ctccgcaccg gaccccggtc ccggcgcgcg gcggggcacg cgccctcccg 50
<210> 73
<211> 50
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> ДНК-зонд
<400> 73
aggggggggc ggcccgccgg cggggacagg cgggggaccg gctatccgag 50
<210> 74
<211> 50
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> ДНК-зонд
<400> 74
gcggcgctgc cgtatcgttc gcctgggcgg gattctgact tagaggcgtt 50
<210> 75
<211> 50
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> ДНК-зонд
<400> 75
agatggtagc ttcgccccat tggctcctca gccaagcaca tacaccaaat 50
<210> 76
<211> 50
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> ДНК-зонд
<400> 76
tcctctcgta ctgagcagga ttaccatggc aacaacacat catcagtagg 50
<210> 77
<211> 50
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> ДНК-зонд
<400> 77
ctcacgacgg tctaaaccca gctcacgttc cctattagtg ggtgaacaat 50
<210> 78
<211> 50
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> ДНК-зонд
<400> 78
ttctgcttca caatgatagg aagagccgac atcgaaggat caaaaagcga 50
<210> 79
<211> 50
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> ДНК-зонд
<400> 79
ttggccgcca caagccagtt atccctgtgg taacttttct gacacctcct 50
<210> 80
<211> 50
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> ДНК-зонд
<400> 80
ggtcagaagg atcgtgaggc cccgctttca cggtctgtat tcgtactgaa 50
<210> 81
<211> 50
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> ДНК-зонд
<400> 81
agcttttgcc cttctgctcc acgggaggtt tctgtcctcc ctgagctcgc 50
<210> 82
<211> 50
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> ДНК-зонд
<400> 82
ttaccgtttg acaggtgtac cgccccagtc aaactcccca cctggcactg 50
<210> 83
<211> 50
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> ДНК-зонд
<400> 83
gcgcccggcc gggcgggcgc ttggcgccag aagcgagagc ccctcgggct 50
<210> 84
<211> 50
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> ДНК-зонд
<400> 84
ccgggtcagt gaaaaaacga tcagagtagt ggtatttcac cggcggcccg 50
<210> 85
<211> 50
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> ДНК-зонд
<400> 85
cgccccgggc ccctcgcggg gacaccgggg gggcgccggg ggcctcccac 50
<210> 86
<211> 50
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> ДНК-зонд
<400> 86
catgtctctt caccgtgcca gactagagtc aagctcaaca gggtcttctt 50
<210> 87
<211> 50
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> ДНК-зонд
<400> 87
ccaagcccgt tcccttggct gtggtttcgc tggatagtag gtagggacag 50
<210> 88
<211> 50
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> ДНК-зонд
<400> 88
tccattcatg cgcgtcacta attagatgac gaggcatttg gctaccttaa 50
<210> 89
<211> 50
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> ДНК-зонд
<400> 89
tcccgccgtt tacccgcgct tcattgaatt tcttcacttt gacattcaga 50
<210> 90
<211> 50
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> ДНК-зонд
<400> 90
cacatcgcgt caacacccgc cgcgggcctt cgcgatgctt tgttttaatt 50
<210> 91
<211> 50
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> ДНК-зонд
<400> 91
cctggtccgc accagttcta agtcggctgc taggcgccgg ccgaggcgag 50
<210> 92
<211> 50
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> ДНК-зонд
<400> 92
cggccccggg ggcggacccg gcggggggga ccggcccgcg gcccctccgc 50
<210> 93
<211> 50
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> ДНК-зонд
<400> 93
ccgccgcgcg ccgaggagga ggggggaacg gggggcggac ggggccgggg 50
<210> 94
<211> 50
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> ДНК-зонд
<400> 94
acgaaccgcc ccgccccgcc gcccgccgac cgccgccgcc cgaccgctcc 50
<210> 95
<211> 50
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> ДНК-зонд
<400> 95
cgcgcgcgac cgagacgtgg ggtgggggtg gggggcgcgc cgcgccgccg 50
<210> 96
<211> 50
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> ДНК-зонд
<400> 96
gcggccgcga cgcccgccgc agctggggcg atccacggga agggcccggc 50
<210> 97
<211> 50
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> ДНК-зонд
<400> 97
gcgccgccgc cggccccccg ggtccccggg gcccccctcg cggggacctg 50
<210> 98
<211> 50
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> ДНК-зонд
<400> 98
ccggcggccg ccgcgcggcc cctgccgccc cgacccttct ccccccgccg 50
<210> 99
<211> 50
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> ДНК-зонд
<400> 99
ctcccccggg gaggggggag gacggggagc gggggagaga gagagagaga 50
<210> 100
<211> 50
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> ДНК-зонд
<400> 100
agggagcgag cggcgcgcgc gggtggggcg ggggagggcc gcgagggggg 50
<210> 101
<211> 50
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> ДНК-зонд
<400> 101
gggggcgcgc gcctcgtcca gccgcggcgc gcgcccagcc ccgcttcgcg 50
<210> 102
<211> 50
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> ДНК-зонд
<400> 102
cccagccctt agagccaatc cttatcccga agttacggat ccggcttgcc 50
<210> 103
<211> 50
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> ДНК-зонд
<400> 103
cattgttcca acatgccaga ggctgttcac cttggagacc tgctgcggat 50
<210> 104
<211> 50
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> ДНК-зонд
<400> 104
cgcgagattt acaccctctc ccccggattt tcaagggcca gcgagagctc 50
<210> 105
<211> 50
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> ДНК-зонд
<400> 105
aaccgcgacg ctttccaagg cacgggcccc tctctcgggg cgaacccatt 50
<210> 106
<211> 50
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> ДНК-зонд
<400> 106
cttcacaaag aaaagagaac tctccccggg gctcccgccg gcttctccgg 50
<210> 107
<211> 50
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> ДНК-зонд
<400> 107
cgcactggac gcctcgcggc gcccatctcc gccactccgg attcggggat 50
<210> 108
<211> 50
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> ДНК-зонд
<400> 108
tttcgatcgg ccgagggcaa cggaggccat cgcccgtccc ttcggaacgg 50
<210> 109
<211> 50
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> ДНК-зонд
<400> 109
caggaccgac tgacccatgt tcaactgctg ttcacatgga acccttctcc 50
<210> 110
<211> 50
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> ДНК-зонд
<400> 110
gttctcgttt gaatatttgc tactaccacc aagatctgca cctgcggcgg 50
<210> 111
<211> 50
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> ДНК-зонд
<400> 111
cgccctaggc ttcaaggctc accgcagcgg ccctcctact cgtcgcggcg 50
<210> 112
<211> 50
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> ДНК-зонд
<400> 112
tccgggggcg gggagcgggg cgtgggcggg aggaggggag gaggcgtggg 50
<210> 113
<211> 50
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> ДНК-зонд
<400> 113
aggaccccac acccccgccg ccgccgccgc cgccgccctc cgacgcacac 50
<210> 114
<211> 50
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> ДНК-зонд
<400> 114
gcgcgccgcc cccgccgctc ccgtccactc tcgactgccg gcgacggccg 50
<210> 115
<211> 50
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> ДНК-зонд
<400> 115
ctccagcgcc atccattttc agggctagtt gattcggcag gtgagttgtt 50
<210> 116
<211> 50
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> ДНК-зонд
<400> 116
gattccgact tccatggcca ccgtcctgct gtctatatca accaacacct 50
<210> 117
<211> 50
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> ДНК-зонд
<400> 117
gagcgtcggc atcgggcgcc ttaacccggc gttcggttca tcccgcagcg 50
<210> 118
<211> 50
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> ДНК-зонд
<400> 118
aaaagtggcc cactaggcac tcgcattcca cgcccggctc cacgccagcg 50
<210> 119
<211> 50
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> ДНК-зонд
<400> 119
ccatttaaag tttgagaata ggttgagatc gtttcggccc caagacctct 50
<210> 120
<211> 50
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> ДНК-зонд
<400> 120
cggataaaac tgcgtggcgg gggtgcgtcg ggtctgcgag agcgccagct 50
<210> 121
<211> 50
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> ДНК-зонд
<400> 121
tcggagggaa ccagctacta gatggttcga ttagtctttc gcccctatac 50
<210> 122
<211> 50
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> ДНК-зонд
<400> 122
gatttgcacg tcaggaccgc tacggacctc caccagagtt tcctctggct 50
<210> 123
<211> 50
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> ДНК-зонд
<400> 123
atagttcacc atctttcggg tcctaacacg tgcgctcgtg ctccacctcc 50
<210> 124
<211> 50
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> ДНК-зонд
<400> 124
agacgggccg gtggtgcgcc ctcggcggac tggagaggcc tcgggatccc 50
<210> 125
<211> 50
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> ДНК-зонд
<400> 125
cgcgccggcc ttcaccttca ttgcgccacg gcggctttcg tgcgagcccc 50
<210> 126
<211> 50
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> ДНК-зонд
<400> 126
ttagactcct tggtccgtgt ttcaagacgg gtcgggtggg tagccgacgt 50
<210> 127
<211> 50
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> ДНК-зонд
<400> 127
gcgctcgctc cgccgtcccc ctcttcgggg gacgcgcgcg tggccccgag 50
<210> 128
<211> 50
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> ДНК-зонд
<400> 128
cccgacggcg cgacccgccc ggggcgcact ggggacagtc cgccccgccc 50
<210> 129
<211> 50
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> ДНК-зонд
<400> 129
gcaccccccc cgtcgccggg gcgggggcgc ggggaggagg ggtgggagag 50
<210> 130
<211> 50
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> ДНК-зонд
<400> 130
aggggtggcc cggccccccc acgaggagac gccggcgcgc ccccgcgggg 50
<210> 131
<211> 50
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> ДНК-зонд
<400> 131
ggggattccc cgcgggggtg ggcgccggga ggggggagag cgcggcgacg 50
<210> 132
<211> 50
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> ДНК-зонд
<400> 132
gccccgggat tcggcgagtg ctgctgccgg gggggctgta acactcgggg 50
<210> 133
<211> 50
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> ДНК-зонд
<400> 133
ccgcccccgc cgccgccgcc accgccgccg ccgccgccgc cccgacccgc 50
<210> 134
<211> 50
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> ДНК-зонд
<400> 134
aggacgcggg gccggggggc ggagacgggg gaggaggagg acggacggac 50
<210> 135
<211> 50
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> ДНК-зонд
<400> 135
agccaccttc cccgccgggc cttcccagcc gtcccggagc cggtcgcggc 50
<210> 136
<211> 50
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> ДНК-зонд
<400> 136
aaatgcgccc ggcggcggcc ggtcgccggt cgggggacgg tcccccgccg 50
<210> 137
<211> 50
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> ДНК-зонд
<400> 137
ccgcccgccc acccccgcac ccgccggagc ccgccccctc cggggaggag 50
<210> 138
<211> 50
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> ДНК-зонд
<400> 138
gggaagggag ggcgggtgga ggggtcggga ggaacggggg gcgggaaaga 50
<210> 139
<211> 50
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> ДНК-зонд
<400> 139
acacggccgg acccgccgcc gggttgaatc ctccgggcgg actgcgcgga 50
<210> 140
<211> 50
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> ДНК-зонд
<400> 140
tcttaacggt ttcacgccct cttgaactct ctcttcaaag ttcttttcaa 50
<210> 141
<211> 50
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> ДНК-зонд
<400> 141
cttgttgact atcggtctcg tgccggtatt tagccttaga tggagtttac 50
<210> 142
<211> 50
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> ДНК-зонд
<400> 142
gcattcccaa gcaacccgac tccgggaaga cccgggcgcg cgccggccgc 50
<210> 143
<211> 50
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> ДНК-зонд
<400> 143
gtccacgggc tgggcctcga tcagaaggac ttgggccccc cacgagcggc 50
<210> 144
<211> 50
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> ДНК-зонд
<400> 144
ttccgtacgc cacatgtccc gcgccccgcg gggcggggat tcggcgctgg 50
<210> 145
<211> 50
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> ДНК-зонд
<400> 145
ctcgccgtta ctgagggaat cctggttagt ttcttttcct ccgctgacta 50
<210> 146
<211> 50
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> ДНК-зонд
<400> 146
gcgggtcgcc acgtctgatc tgaggtcgcg tctcggaggg ggacgggccg 50
<210> 147
<211> 50
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> ДНК-зонд
<400> 147
aagcgacgct cagacaggcg tagccccggg aggaacccgg ggccgcaagt 50
<210> 148
<211> 50
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> ДНК-зонд
<400> 148
gcagctagct gcgttcttca tcgacgcacg agccgagtga tccaccgcta 50
<210> 149
<211> 50
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> ДНК-зонд
<400> 149
aaagcctaca gcacccggta ttcccaggcg gtctcccatc caagtactaa 50
<210> 150
<211> 50
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> ДНК-зонд
<400> 150
ttccgagatc agacgagatc gggcgcgttc agggtggtat ggccgtagac 50
<210> 151
<211> 50
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> ДНК-зонд
<400> 151
gccgcccact cagactttat tcaaagacca cgggggtacg ggtgcaggaa 50
<210> 152
<211> 50
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> ДНК-зонд
<400> 152
gggggaggcc caaggggcaa gaagcatggc caccgaggct ccagcttaac 50
<210> 153
<211> 50
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> ДНК-зонд
<400> 153
gcacggtgct cacagaagcc aggaacttgt ccagggaggc gtgcaccgca 50
<210> 154
<211> 50
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> ДНК-зонд
<400> 154
gggaggtggg cggccagggt caccagcagg cagtggctta ggagcttgaa 50
<210> 155
<211> 50
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> ДНК-зонд
<400> 155
ccgaagcttg tgcgcgtgca ggtcgctcag ggcggacagc gcgttgggca 50
<210> 156
<211> 50
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> ДНК-зонд
<400> 156
ccacggcgtt ggtcagcgcg tcggccacct tcttgccgtg gcccttaacc 50
<210> 157
<211> 50
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> ДНК-зонд
<400> 157
ctcaggtcga agtgcgggaa gtaggtcttg gtggtgggga aggacaggaa 50
<210> 158
<211> 50
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> ДНК-зонд
<400> 158
ctccgcacca tactcgccag cgtgcgcgcc gaccttaccc caggcggcct 50
<210> 159
<211> 50
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> ДНК-зонд
<400> 159
cggcaggaga cagcaccatg gtgggttctc tctgagtctg tggggaccag 50
<210> 160
<211> 50
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> ДНК-зонд
<400> 160
gaggggagga gggcccgttg ggaggcccag cgggcaggag gaacggctac 50
<210> 161
<211> 50
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> ДНК-зонд
<400> 161
acggtatttg gaggtcagca cggtgctcac agaagccagg aacttgtcca 50
<210> 162
<211> 50
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> ДНК-зонд
<400> 162
caggggtgaa ctcggcgggg aggtgggcgg ccagggtcac cagcaggcag 50
<210> 163
<211> 50
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> ДНК-зонд
<400> 163
aagttgaccg ggtccacccg aagcttgtgc gcgtgcaggt cgctcagggc 50
<210> 164
<211> 50
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> ДНК-зонд
<400> 164
catgtcgtcc acgtgcgcca cggcgttggt cagcgcgtcg gccaccttct 50
<210> 165
<211> 50
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> ДНК-зонд
<400> 165
cctgggcaga gccgtggctc aggtcgaagt gcgggaagta ggtcttggtg 50
<210> 166
<211> 50
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> ДНК-зонд
<400> 166
aacatcctct ccagggcctc cgcaccatac tcgccagcgt gcgcgccgac 50
<210> 167
<211> 50
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> ДНК-зонд
<400> 167
cttgacgttg gtcttgtcgg caggagacag caccatggtg ggttctctct 50
<210> 168
<211> 50
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> ДНК-зонд
<400> 168
gcaatgaaaa taaatgtttt ttattaggca gaatccagat gctcaaggcc 50
<210> 169
<211> 50
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> ДНК-зонд
<400> 169
cagtttagta gttggactta gggaacaaag gaacctttaa tagaaattgg 50
<210> 170
<211> 50
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> ДНК-зонд
<400> 170
gcttagtgat acttgtgggc cagggcatta gccacaccag ccaccacttt 50
<210> 171
<211> 50
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> ДНК-зонд
<400> 171
cactggtggg gtgaattctt tgccaaagtg atgggccagc acacagacca 50
<210> 172
<211> 50
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> ДНК-зонд
<400> 172
gcctgaagtt ctcaggatcc acgtgcagct tgtcacagtg cagctcactc 50
<210> 173
<211> 50
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> ДНК-зонд
<400> 173
cccttgaggt tgtccaggtg agccaggcca tcactaaagg caccgagcac 50
<210> 174
<211> 50
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> ДНК-зонд
<400> 174
cttcacctta gggttgccca taacagcatc aggagtggac agatccccaa 50
<210> 175
<211> 50
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> ДНК-зонд
<400> 175
tctgggtcca agggtagacc accagcagcc tgcccagggc ctcaccacca 50
<210> 176
<211> 50
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> ДНК-зонд
<400> 176
accttgcccc acagggcagt aacggcagac ttctcctcag gagtcagatg 50
<210> 177
<211> 50
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> ДНК-зонд
<400> 177
gtgatctctc agcagaatag atttattatt tgtattgctt gcagaataaa 50
<210> 178
<211> 50
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> ДНК-зонд
<400> 178
ctctgaatca tgggcagtga gctcagtggt atctggagga cagggcactg 50
<210> 179
<211> 50
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> ДНК-зонд
<400> 179
atcttctgcc aggaagcctg cacctcaggg gtgaattctt tgccgaaatg 50
<210> 180
<211> 50
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> ДНК-зонд
<400> 180
caccagcaca tttcccagga gcttgaagtt ctcaggatcc acatgcagct 50
<210> 181
<211> 50
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> ДНК-зонд
<400> 181
cactcagctg ggcaaaggtg cccttgagat catccaggtg ctttgtggca 50
<210> 182
<211> 50
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> ДНК-зонд
<400> 182
agcaccttct tgccatgtgc cttgactttg gggttgccca tgatggcaga 50
<210> 183
<211> 50
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> ДНК-зонд
<400> 183
gccaaagctg tcaaagaacc tctgggtcca tgggtagaca accaggagcc 50
<210> 184
<211> 50
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> ДНК-зонд
<400> 184
ctccagcatc ttccacattc accttgcccc acaggcttgt gatagtagcc 50
<210> 185
<211> 50
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> ДНК-зонд
<400> 185
aaatgaccca tggcgtctgg actaggagct tattgataac ctcagacgtt 50
<210> 186
<211> 50
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> ДНК-зонд
<400> 186
gtgatctctt agcagaatag atttattatt tgattgcttg cagaataaag 50
<210> 187
<211> 50
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> ДНК-зонд
<400> 187
tctgcatcat gggcagtgag ctcagtggta tctggaggac agggcactgg 50
<210> 188
<211> 50
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> ДНК-зонд
<400> 188
tcttctgcca ggaagcctgc acctcagggg tgaattcttt gccgaaatgg 50
<210> 189
<211> 50
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> ДНК-зонд
<400> 189
accagcacat ttcccaggag cttgaagttc tcaggatcca catgcagctt 50
<210> 190
<211> 50
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> ДНК-зонд
<400> 190
actcagctgg gcaaaggtgc ccttgagatc atccaggtgc tttatggcat 50
<210> 191
<211> 50
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> ДНК-зонд
<400> 191
gcaccttctt gccatgtgcc ttgactttgg ggttgcccat gatggcagag 50
<210> 192
<211> 50
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> ДНК-зонд
<400> 192
ccaaagctgt caaagaacct ctgggtccat gggtagacaa ccaggagcct 50
<210> 193
<211> 50
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> ДНК-зонд
<400> 193
tccagcatct tccacattca ccttgcccca caggcttgtg atagtagcct 50
<210> 194
<211> 50
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> ДНК-зонд
<400> 194
aatgacccat ggcgtctgga ctaggagctt attgataacc tcagacgttc 50
<210> 195
<211> 50
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> ДНК-зонд
<400> 195
atgcctggca gttccctact ctcgcatggg gagaccccac actaccatcg 50
<210> 196
<211> 50
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> ДНК-зонд
<400> 196
acttctgagt tcggcatggg gtcaggtggg accaccgcgc tacggccgcc 50
<210> 197
<211> 50
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> ДНК-зонд
<400> 197
ggttaccttg ttacgacttc accccagtca tgaatcacaa agtggtaagt 50
<210> 198
<211> 50
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> ДНК-зонд
<400> 198
aagctaccta cttcttttgc aacccactcc catggtgtga cgggcggtgt 50
<210> 199
<211> 50
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> ДНК-зонд
<400> 199
acgtattcac cgtggcattc tgatccacga ttactagcga ttccgacttc 50
<210> 200
<211> 50
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> ДНК-зонд
<400> 200
agactccaat ccggactacg acgcacttta tgaggtccgc ttgctctcgc 50
<210> 201
<211> 50
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> ДНК-зонд
<400> 201
tgtatgcgcc attgtagcac gtgtgtagcc ctggtcgtaa gggccatgat 50
<210> 202
<211> 50
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> ДНК-зонд
<400> 202
ccaccttcct ccagtttatc actggcagtc tcctttgagt tcccggccgg 50
<210> 203
<211> 50
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> ДНК-зонд
<400> 203
ggataagggt tgcgctcgtt gcgggactta acccaacatt tcacaacacg 50
<210> 204
<211> 50
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> ДНК-зонд
<400> 204
tgcagcacct gtctcacggt tcccgaaggc acattctcat ctctgaaaac 50
<210> 205
<211> 50
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> ДНК-зонд
<400> 205
gaccaggtaa ggttcttcgc gttgcatcga attaaaccac atgctccacc 50
<210> 206
<211> 50
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> ДНК-зонд
<400> 206
cgtcaattca tttgagtttt aaccttgcgg ccgtactccc caggcggtcg 50
<210> 207
<211> 50
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> ДНК-зонд
<400> 207
tccggaagcc acgcctcaag ggcacaacct ccaagtcgac atcgtttacg 50
<210> 208
<211> 50
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> ДНК-зонд
<400> 208
gtatctaatc ctgtttgctc cccacgcttt cgcactgagc gtcagtcttc 50
<210> 209
<211> 50
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> ДНК-зонд
<400> 209
ttcgccaccg gtattcctcc agatctctac gcatttcacc gctacacctg 50
<210> 210
<211> 50
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> ДНК-зонд
<400> 210
ctacgagact caagcttgcc agtatcagat gcagttccca ggttgagccc 50
<210> 211
<211> 50
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> ДНК-зонд
<400> 211
gacttaacaa accgcctgcg tgcgctttac gcccagtaat tccgattaac 50
<210> 212
<211> 50
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> ДНК-зонд
<400> 212
attaccgcgg ctgctggcac ggagttagcc ggtgcttctt ctgcgggtaa 50
<210> 213
<211> 50
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> ДНК-зонд
<400> 213
gtattaactt tactcccttc ctccccgctg aaagtacttt acaacccgaa 50
<210> 214
<211> 50
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> ДНК-зонд
<400> 214
cgcggcatgg ctgcatcagg cttgcgccca ttgtgcagta ttccccactg 50
<210> 215
<211> 50
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> ДНК-зонд
<400> 215
gtctggaccg tgtctcagtt ccagtgtggc tggtcatcct ctcagaccag 50
<210> 216
<211> 50
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> ДНК-зонд
<400> 216
taggtgagcc gttaccccac ctactagcta atcccatctg ggcacatccg 50
<210> 217
<211> 50
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> ДНК-зонд
<400> 217
aaggtccccc tctttggtct tgcgacgtta tgcggtatta gctaccgttt 50
<210> 218
<211> 50
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> ДНК-зонд
<400> 218
ctccatcagg cagtttccca gacattactc acccgtccgc cactcgtcag 50
<210> 219
<211> 50
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> ДНК-зонд
<400> 219
aaggttaagc ctcacggttc attagtaccg gttagctcaa cgcatcgctg 50
<210> 220
<211> 50
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> ДНК-зонд
<400> 220
cctatcaacg tcgtcgtctt caacgttcct tcaggaccct taaagggtca 50
<210> 221
<211> 50
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> ДНК-зонд
<400> 221
ggggcaagtt tcgtgcttag atgctttcag cacttatctc ttccgcattt 50
<210> 222
<211> 50
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> ДНК-зонд
<400> 222
ccattggcat gacaacccga acaccagtga tgcgtccact ccggtcctct 50
<210> 223
<211> 50
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> ДНК-зонд
<400> 223
ccccctcagt tctccagcgc ccacggcaga tagggaccga actgtctcac 50
<210> 224
<211> 50
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> ДНК-зонд
<400> 224
gctcgcgtac cactttaaat ggcgaacagc catacccttg ggacctactt 50
<210> 225
<211> 50
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> ДНК-зонд
<400> 225
atgagccgac atcgaggtgc caaacaccgc cgtcgatatg aactcttggg 50
<210> 226
<211> 50
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> ДНК-зонд
<400> 226
atccccggag taccttttat ccgttgagcg atggcccttc cattcagaac 50
<210> 227
<211> 50
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> ДНК-зонд
<400> 227
acctgctttc gcacctgctc gcgccgtcac gctcgcagtc aagctggctt 50
<210> 228
<211> 50
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> ДНК-зонд
<400> 228
cctcctgatg tccgaccagg attagccaac cttcgtgctc ctccgttact 50
<210> 229
<211> 50
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> ДНК-зонд
<400> 229
gccccagtca aactacccac cagacactgt ccgcaacccg gattacgggt 50
<210> 230
<211> 50
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> ДНК-зонд
<400> 230
aaacattaaa gggtggtatt tcaaggtcgg ctccatgcag actggcgtcc 50
<210> 231
<211> 50
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> ДНК-зонд
<400> 231
ccacctatcc tacacatcaa ggctcaatgt tcagtgtcaa gctatagtaa 50
<210> 232
<211> 50
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> ДНК-зонд
<400> 232
ttccgtcttg ccgcgggtac actgcatctt cacagcgagt tcaatttcac 50
<210> 233
<211> 50
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> ДНК-зонд
<400> 233
gacagcctgg ccatcattac gccattcgtg caggtcggaa cttacccgac 50
<210> 234
<211> 50
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> ДНК-зонд
<400> 234
cttaggaccg ttatagttac ggccgccgtt taccggggct tcgatcaaga 50
<210> 235
<211> 50
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> ДНК-зонд
<400> 235
accccatcaa ttaaccttcc ggcaccgggc aggcgtcaca ccgtatacgt 50
<210> 236
<211> 50
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> ДНК-зонд
<400> 236
cacagtgctg tgtttttaat aaacagttgc agccagctgg tatcttcgac 50
<210> 237
<211> 50
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> ДНК-зонд
<400> 237
ccgcgaggga cctcacctac atatcagcgt gccttctccc gaagttacgg 50
<210> 238
<211> 50
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> ДНК-зонд
<400> 238
ttccttcacc cgagttctct caagcgcctt ggtattctct acctgaccac 50
<210> 239
<211> 50
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> ДНК-зонд
<400> 239
gtacgatttg atgttacctg atgcttagag gcttttcctg gaagcagggc 50
<210> 240
<211> 50
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> ДНК-зонд
<400> 240
accgtagtgc ctcgtcatca cgcctcagcc ttgattttcc ggatttgcct 50
<210> 241
<211> 50
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> ДНК-зонд
<400> 241
acgcttaaac cgggacaacc gtcgcccggc caacatagcc ttctccgtcc 50
<210> 242
<211> 50
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> ДНК-зонд
<400> 242
accaagtaca ggaatattaa cctgtttccc atcgactacg cctttcggcc 50
<210> 243
<211> 50
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> ДНК-зонд
<400> 243
actcaccctg ccccgattaa cgttggacag gaacccttgg tcttccggcg 50
<210> 244
<211> 50
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> ДНК-зонд
<400> 244
cgctttatcg ttacttatgt cagcattcgc acttctgata cctccagcat 50
<210> 245
<211> 50
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> ДНК-зонд
<400> 245
ttcgcaggct tacagaacgc tcccctaccc aacaacgcat aagcgtcgct 50
<210> 246
<211> 50
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> ДНК-зонд
<400> 246
catggtttag ccccgttaca tcttccgcgc aggccgactc gaccagtgag 50
<210> 247
<211> 50
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> ДНК-зонд
<400> 247
taaatgatgg ctgcttctaa gccaacatcc tggctgtctg ggccttccca 50
<210> 248
<211> 50
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> ДНК-зонд
<400> 248
aaccatgact ttgggacctt agctggcggt ctgggttgtt tccctcttca 50
<210> 249
<211> 50
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> ДНК-зонд
<400> 249
cccgccgtgt gtctcccgtg ataacattct ccggtattcg cagtttgcat 50
<210> 250
<211> 50
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> ДНК-зонд
<400> 250
ggatgacccc cttgccgaaa cagtgctcta cccccggaga tgaattcacg 50
<210> 251
<211> 50
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> ДНК-зонд
<400> 251
agctttcggg gagaaccagc tatctcccgg tttgattggc ctttcacccc 50
<210> 252
<211> 50
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> ДНК-зонд
<400> 252
cgctaatttt tcaacattag tcggttcggt cctccagtta gtgttaccca 50
<210> 253
<211> 50
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> ДНК-зонд
<400> 253
atggctagat caccgggttt cgggtctata ccctgcaact taacgcccag 50
<210> 254
<211> 50
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> ДНК-зонд
<400> 254
ccttcggctc ccctattcgg ttaaccttgc tacagaatat aagtcgctga 50
<210> 255
<211> 50
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> ДНК-зонд
<400> 255
gtacgcagtc acacgcctaa gcgtgctccc actgcttgta cgtacacggt 50
<210> 256
<211> 50
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> ДНК-зонд
<400> 256
actcccctcg ccggggttct tttcgccttt ccctcacggt actggttcac 50
<210> 257
<211> 50
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> ДНК-зонд
<400> 257
agtatttagc cttggaggat ggtcccccca tattcagaca ggataccacg 50
<210> 258
<211> 50
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> ДНК-зонд
<400> 258
atcgagctca cagcatgtgc atttttgtgt acggggctgt caccctgtat 50
<210> 259
<211> 50
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> ДНК-зонд
<400> 259
acgcttccac taacacacac actgattcag gctctgggct gctccccgtt 50
<210> 260
<211> 50
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> ДНК-зонд
<400> 260
ggggaatctc ggttgatttc ttttcctcgg ggtacttaga tgtttcagtt 50
<210> 261
<211> 50
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> ДНК-зонд
<400> 261
attaacctat ggattcagtt aatgatagtg tgtcgaaaca cactgggttt 50
<210> 262
<211> 50
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> ДНК-зонд
<400> 262
gccggttata acggttcata tcaccttacc gacgcttatc gcagattagc 50
<210> 263
<211> 50
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> ДНК-зонд
<400> 263
gcttggcggc gtcctactct cacaggggga aacccccgac taccatcggc 50
<210> 264
<211> 50
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> ДНК-зонд
<400> 264
ttccgtgttc ggtatgggaa cgggtgtgac ctcttcgcta tcgccaccaa 50
<210> 265
<211> 50
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> ДНК-зонд
<400> 265
tagaaaggag gtgatccagc cgcaccttcc gatacggcta ccttgttacg 50
<210> 266
<211> 50
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> ДНК-зонд
<400> 266
tctgtcccac cttcggcggc tggctcctaa aaggttacct caccgacttc 50
<210> 267
<211> 50
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> ДНК-зонд
<400> 267
tcgtggtgtg acgggcggtg tgtacaaggc ccgggaacgt attcaccgcg 50
<210> 268
<211> 50
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> ДНК-зонд
<400> 268
attactagcg attccagctt cacgcagtcg agttgcagac tgcgatccga 50
<210> 269
<211> 50
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> ДНК-зонд
<400> 269
gtgggattgg cttaacctcg cggtttcgct gccctttgtt ctgtccattg 50
<210> 270
<211> 50
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> ДНК-зонд
<400> 270
ccaggtcata aggggcatga tgatttgacg tcatccccac cttcctccgg 50
<210> 271
<211> 50
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> ДНК-зонд
<400> 271
caccttagag tgcccaactg aatgctggca actaagatca agggttgcgc 50
<210> 272
<211> 50
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> ДНК-зонд
<400> 272
acccaacatc tcacgacacg agctgacgac aaccatgcac cacctgtcac 50
<210> 273
<211> 50
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> ДНК-зонд
<400> 273
gacgtcctat ctctaggatt gtcagaggat gtcaagacct ggtaaggttc 50
<210> 274
<211> 50
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> ДНК-зонд
<400> 274
attaaaccac atgctccacc gcttgtgcgg gcccccgtca attcctttga 50
<210> 275
<211> 50
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> ДНК-зонд
<400> 275
ccgtactccc caggcggagt gcttaatgcg ttagctgcag cactaagggg 50
<210> 276
<211> 50
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> ДНК-зонд
<400> 276
acttagcact catcgtttac ggcgtggact accagggtat ctaatcctgt 50
<210> 277
<211> 50
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> ДНК-зонд
<400> 277
tcgctcctca gcgtcagtta cagaccagag agtcgccttc gccactggtg 50
<210> 278
<211> 50
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> ДНК-зонд
<400> 278
acgcatttca ccgctacacg tggaattcca ctctcctctt ctgcactcaa 50
<210> 279
<211> 50
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> ДНК-зонд
<400> 279
atgaccctcc ccggttgagc cgggggcttt cacatcagac ttaagaaacc 50
<210> 280
<211> 50
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> ДНК-зонд
<400> 280
acgcccaata attccggaca acgcttgcca cctacgtatt accgcggctg 50
<210> 281
<211> 50
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> ДНК-зонд
<400> 281
ccgtggcttt ctggttaggt accgtcaagg taccgcccta ttcgaacggt 50
<210> 282
<211> 50
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> ДНК-зонд
<400> 282
acaacagagc tttacgatcc gaaaaccttc atcactcacg cggcgttgct 50
<210> 283
<211> 50
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> ДНК-зонд
<400> 283
ccattgcgga agattcccta ctgctgcctc ccgtaggagt ctgggccgtg 50
<210> 284
<211> 50
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> ДНК-зонд
<400> 284
ggccgatcac cctctcaggt cggctacgca tcgtcgcctt ggtgagccgt 50
<210> 285
<211> 50
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> ДНК-зонд
<400> 285
ctaatgcgcc gcgggtccat ctgtaagtgg tagccgaagc caccttttat 50
<210> 286
<211> 50
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> ДНК-зонд
<400> 286
ttcaaacaac catccggtat tagccccggt ttcccggagt tatcccagtc 50
<210> 287
<211> 50
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> ДНК-зонд
<400> 287
ccacgtgtta ctcacccgtc cgccgctaac atcagggagc aagctcccat 50
<210> 288
<211> 50
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> ДНК-зонд
<400> 288
gcatgtatta ggcacgccgc cagcgttcgt cctgagccag gatcaaactc 50
<210> 289
<211> 50
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> ДНК-зонд
<400> 289
tggttaagtc ctcgatcgat tagtatctgt cagctccatg tgtcgccaca 50
<210> 290
<211> 50
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> ДНК-зонд
<400> 290
tatcaacctg atcatctttc agggatctta cttccttgcg gaatgggaaa 50
<210> 291
<211> 50
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> ДНК-зонд
<400> 291
ggcttcatgc ttagatgctt tcagcactta tcccgtccgc acatagctac 50
<210> 292
<211> 50
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> ДНК-зонд
<400> 292
gcagaacaac tggtacacca gcggtgcgtc catcccggtc ctctcgtact 50
<210> 293
<211> 50
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> ДНК-зонд
<400> 293
caaatttcct gcgcccgcga cggataggga ccgaactgtc tcacgacgtt 50
<210> 294
<211> 50
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> ДНК-зонд
<400> 294
gtaccgcttt aatgggcgaa cagcccaacc cttgggactg actacagccc 50
<210> 295
<211> 50
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> ДНК-зонд
<400> 295
cgacatcgag gtgccaaacc tccccgtcga tgtggactct tgggggagat 50
<210> 296
<211> 50
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> ДНК-зонд
<400> 296
ggggtagctt ttatccgttg agcgatggcc cttccatgcg gaaccaccgg 50
<210> 297
<211> 50
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> ДНК-зонд
<400> 297
tttcgtccct gctcgacttg taggtctcgc agtcaagctc ccttgtgcct 50
<210> 298
<211> 50
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> ДНК-зонд
<400> 298
gatttccaac cattctgagg gaacctttgg gcgcctccgt taccttttag 50
<210> 299
<211> 50
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> ДНК-зонд
<400> 299
gtcaaactgc ccacctgaca ctgtctcccc gcccgataag ggcggcgggt 50
<210> 300
<211> 50
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> ДНК-зонд
<400> 300
gccagggtag tatcccaccg atgcctccac cgaagctggc gctccggttt 50
<210> 301
<211> 50
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> ДНК-зонд
<400> 301
atcctgtaca agctgtacca acattcaata tcaggctgca gtaaagctcc 50
<210> 302
<211> 50
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> ДНК-зонд
<400> 302
cctgtcgcgg gtaacctgca tcttcacagg tactataatt tcaccgagtc 50
<210> 303
<211> 50
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> ДНК-зонд
<400> 303
gcccagatcg ttgcgccttt cgtgcgggtc ggaacttacc cgacaaggaa 50
<210> 304
<211> 50
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> ДНК-зонд
<400> 304
accgttatag ttacggccgc cgtttactgg ggcttcaatt cgcaccttcg 50
<210> 305
<211> 50
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> ДНК-зонд
<400> 305
cctcttaacc ttccagcacc gggcaggcgt cagcccctat acttcgcctt 50
<210> 306
<211> 50
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> ДНК-зонд
<400> 306
cctgtgtttt tgctaaacag tcgcctgggc ctattcactg cggctctctc 50
<210> 307
<211> 50
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> ДНК-зонд
<400> 307
cagagcaccc cttctcccga agttacgggg tcattttgcc gagttcctta 50
<210> 308
<211> 50
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> ДНК-зонд
<400> 308
atcaccttag gattctctcc tcgcctacct gtgtcggttt gcggtacggg 50
<210> 309
<211> 50
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> ДНК-зонд
<400> 309
tagaggcttt tcttggcagt gtggaatcag gaacttcgct actatatttc 50
<210> 310
<211> 50
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> ДНК-зонд
<400> 310
tcagccttat gggaaacgga tttgcctatt tcccagccta actgcttgga 50
<210> 311
<211> 50
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> ДНК-зонд
<400> 311
ccgcgcttac cctatcctcc tgcgtccccc cattgctcaa atggtgagga 50
<210> 312
<211> 50
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> ДНК-зонд
<400> 312
tcaacctgtt gtccatcgcc tacgcctttc ggcctcggct taggtcccga 50
<210> 313
<211> 50
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> ДНК-зонд
<400> 313
cgagccttcc tcaggaaacc ttaggcattc ggtggagggg attctcaccc 50
<210> 314
<211> 50
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> ДНК-зонд
<400> 314
taccggcatt ctcacttcta agcgctccac cagtccttcc ggtctggctt 50
<210> 315
<211> 50
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> ДНК-зонд
<400> 315
gctctcctac cactgttcga agaacagtcc gcagcttcgg tgatacgttt 50
<210> 316
<211> 50
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> ДНК-зонд
<400> 316
tcggcgcaga gtcactcgac cagtgagcta ttacgcactc tttaaatggt 50
<210> 317
<211> 50
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> ДНК-зонд
<400> 317
aacatcctgg ttgtctaagc aactccacat ccttttccac ttaacgtata 50
<210> 318
<211> 50
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> ДНК-зонд
<400> 318
tggcggtctg ggctgtttcc ctttcgacta cggatcttat cactcgcagt 50
<210> 319
<211> 50
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> ДНК-зонд
<400> 319
aagtcattgg cattcggagt ttgactgaat tcggtaaccc ggtaggggcc 50
<210> 320
<211> 50
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> ДНК-зонд
<400> 320
gctctacctc caagactctt accttgaggc tagccctaaa gctatttcgg 50
<210> 321
<211> 50
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> ДНК-зонд
<400> 321
tccaggttcg attggcattt cacccctacc cacacctcat ccccgcactt 50
<210> 322
<211> 50
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> ДНК-зонд
<400> 322
ttcgggcctc cattcagtgt tacctgaact tcaccctgga catgggtaga 50
<210> 323
<211> 50
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> ДНК-зонд
<400> 323
tctacgacca cgtactcatg cgccctattc agactcgctt tcgctgcggc 50
<210> 324
<211> 50
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> ДНК-зонд
<400> 324
taaccttgca cgggatcgta actcgccggt tcattctaca aaaggcacgc 50
<210> 325
<211> 50
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> ДНК-зонд
<400> 325
ggctctgact acttgtaggc acacggtttc aggatctctt tcactcccct 50
<210> 326
<211> 50
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> ДНК-зонд
<400> 326
acctttccct cacggtactg gttcactatc ggtcactagg gagtatttag 50
<210> 327
<211> 50
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> ДНК-зонд
<400> 327
ctcccggatt ccgacggaat ttcacgtgtt ccgccgtact caggatccac 50
<210> 328
<211> 50
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> ДНК-зонд
<400> 328
gttttgacta cagggctgtt acctcctatg gcgggccttt ccagacctct 50
<210> 329
<211> 50
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> ДНК-зонд
<400> 329
ctttgtaact ccgtacagag tgtcctacaa ccccaagagg caagcctctt 50
<210> 330
<211> 50
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> ДНК-зонд
<400> 330
cgtttcgctc gccgctactc agggaatcgc atttgctttc tcttcctccg 50
<210> 331
<211> 50
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> ДНК-зонд
<400> 331
cagttccccg ggtctgcctt ctcatatcct atgaattcag atatggatac 50
<210> 332
<211> 50
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> ДНК-зонд
<400> 332
ggtgggtttc cccattcgga aatctccgga tcaaagcttg cttacagctc 50
<210> 333
<211> 50
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> ДНК-зонд
<400> 333
tgttcgtccc gtccttcatc ggctcctagt gccaaggcat ccaccgtgcg 50
<210> 334
<211> 50
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> ДНК-зонд
<400> 334
aaactagatt cgaatataac aaaacattac atcctcatcc aatccctttt 50
<210> 335
<211> 50
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> ДНК-зонд
<400> 335
gcggtgtgtg caaggagcag ggacgtattc accgcgcgat tgtgacacgc 50
<210> 336
<211> 50
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> ДНК-зонд
<400> 336
gcctttcggc gtcggaaccc attgtctcag ccattgtagc ccgcgtgttg 50
<210> 337
<211> 50
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> ДНК-зонд
<400> 337
gcatacggac ctaccgtcgt ccactccttc ctcctattta tcataggcgg 50
<210> 338
<211> 50
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> ДНК-зонд
<400> 338
cggcatccaa aaaaggatcc gctggtaact aagagcgtgg gtctcgctcg 50
<210> 339
<211> 50
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> ДНК-зонд
<400> 339
caacctggct atcatacagc tgtcgcctct ggtgagatgt ccggcgttga 50
<210> 340
<211> 50
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> ДНК-зонд
<400> 340
aggctccacg cgttgtggtg ctcccccgcc aattccttta agtttcagtc 50
<210> 341
<211> 50
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> ДНК-зонд
<400> 341
ccaggcggcg gacttaacag cttcccttcg gcactgggac agctcaaagc 50
<210> 342
<211> 50
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> ДНК-зонд
<400> 342
tccgcatcgt ttacagctag gactacccgg gtatctaatc cggttcgcgc 50
<210> 343
<211> 50
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> ДНК-зонд
<400> 343
ttcccacagt taagctgcag gatttcacca gagacttatt aaaccggcta 50
<210> 344
<211> 50
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> ДНК-зонд
<400> 344
ctcttattcc aaaagctctt tacactaatg aaaagccatc ccgttaagaa 50
<210> 345
<211> 50
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> ДНК-зонд
<400> 345
cccccgtcgc gatttctcac attgcggagg tttcgcgcct gctgcacccc 50
<210> 346
<211> 50
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> ДНК-зонд
<400> 346
ttgtctcagg ttccatctcc gggctcttgc tctcacaacc cgtaccgatc 50
<210> 347
<211> 50
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> ДНК-зонд
<400> 347
cattacctaa ccaactacct aatcggccgc agacccatcc ttaggcgaaa 50
<210> 348
<211> 50
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> ДНК-зонд
<400> 348
aaaccattac aggaataatt gcctatccag tattatcccc agtttcccag 50
<210> 349
<211> 50
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> ДНК-зонд
<400> 349
aagggtaggt tatccacgtg ttactgagcc gtacgccacg agcctaaact 50
<210> 350
<211> 50
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> ДНК-зонд
<400> 350
acctagcgcg tagctgcccg gcactgcctt atcagacaac cggtcgacca 50
<210> 351
<211> 50
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> ДНК-зонд
<400> 351
cgttcctctc gtactggagc caccttcccc tcagactact aacacatcca 50
<210> 352
<211> 50
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> ДНК-зонд
<400> 352
cctgtctcac gacggtctaa acccagctca cgttcccctt taatgggcga 50
<210> 353
<211> 50
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> ДНК-зонд
<400> 353
ggtgctgctg cacacccagg atggaaagaa ccgacatcga agtagcaagc 50
<210> 354
<211> 50
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> ДНК-зонд
<400> 354
ggctcttgcc tgcgaccacc cagttatccc cgaggtagtt tttctgtcat 50
<210> 355
<211> 50
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> ДНК-зонд
<400> 355
aggaggactc tgaggttcgc taggcccggc tttcgcctct ggatttcttg 50
<210> 356
<211> 50
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> ДНК-зонд
<400> 356
caaagtaagt tagaaacaca gtcataagaa agtggtgtct caagaacgaa 50
<210> 357
<211> 50
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> ДНК-зонд
<400> 357
gacttataat cgaattctcc cacttacact gcatacctat aaccaagctt 50
<210> 358
<211> 50
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> ДНК-зонд
<400> 358
gtaaaactct acggggtctt cgcttcccaa tggaagactc tggcttgtgc 50
<210> 359
<211> 50
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> ДНК-зонд
<400> 359
tcactaagtt ctagctaggg acagtgggga cctcgttcta ccattcatgc 50
<210> 360
<211> 50
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> ДНК-зонд
<400> 360
cgacaaggca tttcgctacc ttaagagggt tatagttacc cccgccgttt 50
<210> 361
<211> 50
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> ДНК-зонд
<400> 361
aactgaactc cagcttcacg tgccagcact gggcaggtgt cgccctctgt 50
<210> 362
<211> 50
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> ДНК-зонд
<400> 362
ctagcagaga gctatgtttt tattaaacag tcgggccccc ctagtcactg 50
<210> 363
<211> 50
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> ДНК-зонд
<400> 363
ttaaaacgcc ttagcctact cagctagggg cacctgtgac ggatctcggt 50
<210> 364
<211> 50
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> ДНК-зонд
<400> 364
acaaaactaa ctcccttttc aaggactcca tgaatcagtt aaaccagtac 50
<210> 365
<211> 50
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> ДНК-зонд
<400> 365
ataatgccta cacctggttc tcgctattac acctctcccc aggcttaaac 50
<210> 366
<211> 50
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> ДНК-зонд
<400> 366
caatcctaca aaacatatct cgaagtgtca gaaattagcc ctcaacgtca 50
<210> 367
<211> 50
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> ДНК-зонд
<400> 367
ctttgctgct actactacca ggatccacat acctgcaagg tccaaaggaa 50
<210> 368
<211> 50
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> ДНК-зонд
<400> 368
caacccacac aggtcgccac tctacacaat caccaaaaaa aaggtgttcc 50
<210> 369
<211> 50
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> ДНК-зонд
<400> 369
ggattaattc ccgtccattt taggtgcctc tgacctcgat gggtgatctg 50
<210> 370
<211> 50
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> ДНК-зонд
<400> 370
agggtggctg cttctaagcc caccttccca ttgtcttggg ccaaagactc 50
<210> 371
<211> 50
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> ДНК-зонд
<400> 371
gtatttaggg gccttaacca tagtctgagt tgtttctctt tcgggacaca 50
<210> 372
<211> 50
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> ДНК-зонд
<400> 372
cctcactcca accttctacg acggtgacga gttcggagtt ttacagtacg 50
<210> 373
<211> 50
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> ДНК-зонд
<400> 373
ccctaaacgt ccaattagtg ctctaccccg ccaccaacct ccagtcaggc 50
<210> 374
<211> 50
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> ДНК-зонд
<400> 374
aatagatcga ccggcttcgg gtttcaatgc tgtgattcca ggccctatta 50
<210> 375
<211> 50
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> ДНК-зонд
<400> 375
acaacgctgc gggcatatcg gtttccctac gactacaagg ataaaaacct 50
<210> 376
<211> 50
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> ДНК-зонд
<400> 376
acaaagaact ccctggcccg tgtttcaaga cggacgatgc aacactagtc 50
<210> 377
<211> 50
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> ДНК-зонд
<400> 377
acaatgttac cactgattct ttcggaagaa ttcattcctt acgcgccaca 50
<210> 378
<211> 50
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> ДНК-зонд
<400> 378
ctggtttcag gtacttttca cccccctata ggggtacttt tcagcattcc 50
<210> 379
<211> 50
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> ДНК-зонд
<400> 379
ctctatcggt cttgagacgt atttagaatt ggaagttgat gcctcccaca 50
<210> 380
<211> 50
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> ДНК-зонд
<400> 380
atcaccctct acggttctaa aattccaaat aaaattcgat ttatcccacg 50
<210> 381
<211> 50
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> ДНК-зонд
<400> 381
tctatacacc acatctccct aatattacta aaagggattc agtttgttct 50
<210> 382
<211> 50
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> ДНК-зонд
<400> 382
gccgttacta acgacatcgc atattgcttt cttttcctcc gcctactaag 50
<210> 383
<211> 50
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> ДНК-зонд
<400> 383
gggttcccaa tcctacacgg atcaacacaa aaaaaatgtg ctaggaagtc 50
<210> 384
<211> 50
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> ДНК-зонд
<400> 384
actactggga tcgaaacgag accaggtata acccccatgc tatgaccgca 50
<210> 385
<211> 50
<212> БЕЛОК
<213> Mus musculus
<400> 385
Gly Cys Gly Thr Ala Thr Gly Cys Cys Thr Gly Gly Ala Gly Ala Ala
1 5 10 15
Thr Thr Gly Gly Ala Ala Thr Thr Cys Thr Thr Gly Thr Thr Ala Cys
20 25 30
Thr Cys Ala Thr Ala Cys Thr Ala Ala Cys Ala Gly Thr Gly Thr Thr
35 40 45
Gly Cys
50
<210> 386
<211> 50
<212> БЕЛОК
<213> Mus musculus
<400> 386
Gly Ala Thr Thr Ala Ala Cys Cys Cys Ala Ala Thr Thr Thr Thr Ala
1 5 10 15
Ala Gly Thr Thr Thr Ala Gly Gly Ala Ala Gly Thr Thr Gly Gly Thr
20 25 30
Gly Thr Ala Ala Ala Thr Thr Ala Thr Gly Gly Ala Ala Thr Thr Ala
35 40 45
Ala Thr
50
<210> 387
<211> 50
<212> БЕЛОК
<213> Mus musculus
<400> 387
Ala Gly Cys Thr Thr Gly Ala Ala Cys Gly Cys Thr Thr Thr Cys Thr
1 5 10 15
Thr Thr Ala Thr Thr Gly Gly Thr Gly Gly Cys Thr Gly Cys Thr Thr
20 25 30
Thr Thr Ala Gly Gly Cys Cys Thr Ala Cys Ala Ala Thr Gly Gly Thr
35 40 45
Thr Ala
50
<210> 388
<211> 50
<212> БЕЛОК
<213> Mus musculus
<400> 388
Ala Thr Thr Ala Thr Thr Cys Ala Cys Thr Ala Thr Thr Ala Ala Ala
1 5 10 15
Gly Gly Thr Thr Thr Thr Thr Thr Cys Cys Gly Thr Thr Cys Cys Ala
20 25 30
Gly Ala Ala Gly Ala Gly Cys Thr Gly Thr Cys Cys Cys Thr Cys Thr
35 40 45
Thr Thr
50
<210> 389
<211> 50
<212> БЕЛОК
<213> Mus musculus
<400> 389
Cys Thr Thr Ala Cys Thr Thr Thr Thr Thr Gly Ala Thr Thr Thr Thr
1 5 10 15
Gly Thr Thr Gly Thr Thr Thr Thr Thr Thr Thr Ala Gly Cys Ala Ala
20 25 30
Gly Thr Thr Thr Ala Ala Ala Ala Thr Thr Gly Ala Ala Cys Thr Thr
35 40 45
Ala Ala
50
<210> 390
<211> 50
<212> БЕЛОК
<213> Mus musculus
<400> 390
Ala Ala Cys Cys Ala Gly Cys Thr Ala Thr Cys Ala Cys Cys Ala Ala
1 5 10 15
Gly Cys Thr Cys Gly Thr Thr Ala Gly Gly Cys Thr Thr Thr Thr Cys
20 25 30
Ala Cys Cys Thr Cys Thr Ala Cys Cys Thr Ala Ala Ala Ala Ala Thr
35 40 45
Cys Thr
50
<210> 391
<211> 50
<212> БЕЛОК
<213> Mus musculus
<400> 391
Ala Ala Thr Ala Cys Thr Thr Gly Thr Ala Ala Thr Gly Cys Thr Ala
1 5 10 15
Gly Ala Gly Gly Thr Gly Ala Thr Gly Thr Thr Thr Thr Thr Gly Gly
20 25 30
Thr Ala Ala Ala Cys Ala Gly Gly Cys Gly Gly Gly Gly Thr Thr Cys
35 40 45
Thr Thr
50
<210> 392
<211> 50
<212> БЕЛОК
<213> Mus musculus
<400> 392
Thr Thr Thr Ala Thr Cys Thr Thr Thr Thr Thr Gly Gly Ala Thr Cys
1 5 10 15
Thr Thr Thr Cys Cys Thr Thr Thr Ala Gly Gly Cys Ala Thr Thr Cys
20 25 30
Cys Gly Gly Thr Gly Thr Thr Gly Gly Gly Thr Thr Ala Ala Cys Ala
35 40 45
Gly Ala
50
<210> 393
<211> 50
<212> БЕЛОК
<213> Mus musculus
<400> 393
Thr Thr Ala Thr Thr Thr Ala Thr Ala Gly Thr Gly Thr Gly Ala Thr
1 5 10 15
Thr Ala Thr Thr Gly Cys Cys Thr Ala Thr Ala Gly Thr Cys Thr Gly
20 25 30
Ala Thr Thr Ala Ala Cys Thr Ala Ala Cys Ala Ala Thr Gly Gly Thr
35 40 45
Thr Ala
50
<210> 394
<211> 50
<212> БЕЛОК
<213> Rattus norvegicus
<400> 394
Ala Gly Thr Gly Ala Thr Thr Gly Thr Ala Gly Thr Thr Gly Thr Thr
1 5 10 15
Thr Ala Thr Thr Cys Ala Cys Thr Ala Thr Thr Thr Ala Ala Gly Gly
20 25 30
Thr Thr Thr Thr Thr Thr Cys Cys Thr Thr Thr Thr Cys Cys Thr Ala
35 40 45
Ala Ala
50
<210> 395
<211> 50
<212> БЕЛОК
<213> Rattus norvegicus
<400> 395
Thr Gly Gly Cys Thr Ala Thr Ala Thr Thr Thr Thr Ala Ala Gly Thr
1 5 10 15
Thr Thr Ala Cys Ala Thr Thr Thr Thr Gly Ala Thr Thr Thr Gly Thr
20 25 30
Thr Gly Thr Thr Cys Thr Gly Ala Thr Gly Gly Thr Ala Ala Gly Cys
35 40 45
Thr Thr
50
<210> 396
<211> 50
<212> БЕЛОК
<213> Rattus norvegicus
<400> 396
Thr Thr Thr Thr Thr Thr Thr Ala Ala Thr Cys Thr Thr Thr Cys Cys
1 5 10 15
Thr Thr Ala Ala Ala Gly Cys Ala Cys Gly Cys Cys Thr Gly Thr Gly
20 25 30
Thr Thr Gly Gly Gly Cys Thr Ala Ala Cys Gly Ala Gly Thr Thr Ala
35 40 45
Gly Gly
50
<210> 397
<211> 50
<212> БЕЛОК
<213> Rattus norvegicus
<400> 397
Thr Gly Thr Thr Gly Gly Gly Thr Thr Ala Gly Thr Ala Cys Cys Thr
1 5 10 15
Ala Thr Gly Ala Thr Thr Cys Gly Ala Thr Ala Ala Thr Thr Gly Ala
20 25 30
Cys Ala Ala Thr Gly Gly Thr Thr Ala Thr Cys Cys Gly Gly Gly Thr
35 40 45
Thr Gly
50
<210> 398
<211> 50
<212> БЕЛОК
<213> Rattus norvegicus
<400> 398
Ala Gly Gly Ala Gly Ala Ala Thr Thr Gly Gly Thr Thr Cys Thr Thr
1 5 10 15
Gly Thr Thr Ala Cys Thr Cys Ala Thr Ala Thr Thr Ala Ala Cys Ala
20 25 30
Gly Thr Ala Thr Thr Thr Cys Ala Thr Cys Thr Ala Thr Gly Gly Ala
35 40 45
Thr Cys
50
<210> 399
<211> 50
<212> БЕЛОК
<213> Rattus norvegicus
<400> 399
Thr Thr Thr Gly Thr Gly Ala Thr Ala Thr Ala Gly Gly Ala Ala Thr
1 5 10 15
Thr Thr Ala Thr Thr Gly Ala Gly Gly Thr Thr Thr Gly Thr Gly Gly
20 25 30
Ala Ala Thr Thr Ala Gly Thr Gly Thr Gly Thr Gly Thr Ala Ala Gly
35 40 45
Thr Ala
50
<210> 400
<211> 50
<212> БЕЛОК
<213> Mus musculus
<400> 400
Gly Cys Cys Gly Gly Gly Gly Ala Gly Thr Gly Gly Gly Thr Cys Thr
1 5 10 15
Thr Cys Cys Gly Thr Ala Cys Gly Cys Cys Ala Cys Ala Thr Thr Thr
20 25 30
Cys Cys Cys Ala Cys Gly Cys Cys Gly Cys Gly Ala Cys Gly Cys Gly
35 40 45
Cys Gly
50
<210> 401
<211> 50
<212> БЕЛОК
<213> Mus musculus
<400> 401
Ala Cys Cys Thr Cys Gly Gly Gly Cys Cys Cys Cys Cys Gly Gly Gly
1 5 10 15
Cys Gly Gly Gly Gly Cys Cys Cys Thr Thr Cys Ala Cys Cys Thr Thr
20 25 30
Cys Ala Thr Thr Gly Cys Gly Cys Cys Ala Cys Gly Gly Cys Gly Gly
35 40 45
Cys Thr
50
<210> 402
<211> 50
<212> БЕЛОК
<213> Mus musculus
<400> 402
Thr Cys Gly Cys Gly Thr Cys Cys Ala Gly Ala Gly Thr Cys Gly Cys
1 5 10 15
Cys Gly Cys Cys Gly Cys Cys Gly Cys Cys Gly Gly Cys Cys Cys Cys
20 25 30
Cys Cys Gly Ala Gly Thr Gly Thr Cys Cys Gly Gly Gly Cys Cys Cys
35 40 45
Cys Cys
50
<210> 403
<211> 50
<212> БЕЛОК
<213> Mus musculus
<400> 403
Cys Gly Cys Thr Gly Gly Thr Thr Cys Cys Thr Cys Cys Cys Gly Cys
1 5 10 15
Thr Cys Cys Gly Gly Ala Ala Cys Cys Cys Cys Cys Gly Cys Gly Gly
20 25 30
Gly Gly Thr Thr Gly Gly Ala Cys Cys Cys Gly Cys Cys Gly Cys Cys
35 40 45
Cys Cys
50
<210> 404
<211> 50
<212> БЕЛОК
<213> Mus musculus
<400> 404
Cys Gly Cys Cys Gly Ala Cys Cys Cys Cys Cys Gly Ala Cys Cys Cys
1 5 10 15
Gly Cys Cys Cys Cys Cys Cys Gly Ala Cys Gly Gly Gly Ala Ala Gly
20 25 30
Ala Ala Gly Gly Ala Gly Gly Gly Gly Gly Gly Ala Ala Gly Ala Gly
35 40 45
Ala Gly
50
<210> 405
<211> 50
<212> БЕЛОК
<213> Mus musculus
<400> 405
Gly Gly Gly Ala Cys Gly Ala Cys Gly Gly Gly Gly Cys Cys Cys Cys
1 5 10 15
Gly Cys Gly Gly Gly Gly Ala Ala Gly Ala Gly Gly Gly Gly Ala Gly
20 25 30
Gly Gly Cys Gly Gly Gly Cys Cys Cys Gly Gly Gly Cys Gly Gly Ala
35 40 45
Ala Ala
50
<210> 406
<211> 50
<212> БЕЛОК
<213> Mus musculus
<400> 406
Gly Gly Cys Gly Cys Cys Gly Cys Gly Cys Gly Gly Ala Ala Ala Ala
1 5 10 15
Cys Cys Gly Cys Gly Gly Cys Cys Cys Gly Gly Gly Gly Gly Gly Cys
20 25 30
Gly Gly Ala Cys Cys Cys Gly Gly Cys Gly Gly Gly Gly Gly Ala Ala
35 40 45
Cys Ala
50
<210> 407
<211> 50
<212> БЕЛОК
<213> Mus musculus
<400> 407
Cys Cys Cys Cys Cys Ala Cys Ala Cys Gly Cys Gly Cys Gly Gly Gly
1 5 10 15
Ala Cys Ala Cys Gly Cys Cys Cys Gly Cys Cys Cys Gly Cys Cys Cys
20 25 30
Cys Cys Gly Cys Cys Ala Cys Gly Cys Ala Cys Cys Thr Cys Gly Gly
35 40 45
Gly Ala
50
<210> 408
<211> 50
<212> БЕЛОК
<213> Mus musculus
<400> 408
Cys Ala Cys Cys Cys Gly Cys Thr Thr Thr Gly Gly Gly Cys Thr Gly
1 5 10 15
Cys Ala Thr Thr Cys Cys Cys Ala Ala Gly Cys Ala Ala Cys Cys Cys
20 25 30
Gly Ala Cys Thr Cys Cys Gly Gly Gly Ala Ala Gly Ala Cys Cys Cys
35 40 45
Gly Ala
50
<210> 409
<211> 50
<212> БЕЛОК
<213> Mus musculus
<400> 409
Thr Gly Gly Ala Gly Cys Gly Ala Gly Gly Cys Cys Cys Cys Gly Cys
1 5 10 15
Gly Gly Gly Gly Ala Gly Gly Gly Gly Ala Cys Cys Cys Gly Cys Gly
20 25 30
Cys Cys Gly Gly Cys Ala Cys Cys Cys Gly Cys Cys Gly Gly Gly Cys
35 40 45
Thr Cys
50
<210> 410
<211> 50
<212> БЕЛОК
<213> Mus musculus
<400> 410
Cys Gly Ala Gly Gly Cys Cys Gly Gly Cys Gly Thr Gly Cys Cys Cys
1 5 10 15
Cys Gly Ala Cys Cys Cys Cys Gly Ala Cys Gly Cys Gly Ala Gly Gly
20 25 30
Ala Cys Gly Gly Gly Gly Cys Cys Gly Gly Gly Cys Gly Cys Cys Gly
35 40 45
Gly Gly
50
<210> 411
<211> 50
<212> БЕЛОК
<213> Mus musculus
<400> 411
Thr Cys Cys Cys Cys Gly Gly Ala Gly Cys Gly Gly Gly Thr Cys Gly
1 5 10 15
Cys Gly Cys Cys Cys Gly Cys Cys Cys Gly Cys Ala Cys Gly Cys Gly
20 25 30
Cys Gly Gly Gly Ala Cys Gly Gly Ala Cys Gly Cys Thr Thr Gly Gly
35 40 45
Cys Gly
50
<210> 412
<211> 50
<212> БЕЛОК
<213> Mus musculus
<400> 412
Thr Cys Cys Ala Cys Ala Cys Gly Ala Ala Cys Gly Thr Gly Cys Gly
1 5 10 15
Thr Thr Cys Ala Ala Cys Gly Thr Gly Ala Cys Gly Gly Gly Cys Gly
20 25 30
Ala Gly Ala Gly Gly Gly Cys Gly Gly Cys Cys Cys Cys Cys Thr Thr
35 40 45
Thr Cys
50
<210> 413
<211> 50
<212> БЕЛОК
<213> Mus musculus
<400> 413
Thr Cys Cys Cys Ala Ala Gly Ala Cys Gly Ala Ala Cys Gly Gly Cys
1 5 10 15
Thr Cys Thr Cys Cys Gly Cys Ala Cys Cys Gly Gly Ala Cys Cys Cys
20 25 30
Cys Gly Gly Thr Cys Cys Cys Gly Ala Cys Gly Cys Cys Cys Gly Gly
35 40 45
Cys Gly
50
<210> 414
<211> 50
<212> БЕЛОК
<213> Mus musculus
<400> 414
Cys Cys Gly Cys Cys Gly Cys Gly Gly Gly Gly Ala Cys Gly Ala Cys
1 5 10 15
Gly Cys Gly Gly Gly Gly Ala Cys Cys Cys Cys Gly Cys Cys Gly Ala
20 25 30
Gly Cys Gly Gly Gly Gly Ala Cys Gly Gly Ala Cys Gly Gly Gly Gly
35 40 45
Ala Cys
50
<210> 415
<211> 50
<212> БЕЛОК
<213> Mus musculus
<400> 415
Gly Cys Ala Cys Cys Gly Cys Cys Ala Cys Gly Gly Thr Gly Gly Ala
1 5 10 15
Ala Gly Thr Gly Cys Gly Cys Cys Cys Gly Gly Cys Gly Gly Cys Gly
20 25 30
Gly Cys Cys Gly Gly Thr Cys Gly Cys Cys Gly Gly Cys Cys Gly Gly
35 40 45
Gly Gly
50
<210> 416
<211> 50
<212> БЕЛОК
<213> Mus musculus
<400> 416
Cys Cys Cys Ala Cys Cys Gly Gly Gly Cys Cys Cys Cys Gly Ala Gly
1 5 10 15
Ala Gly Ala Gly Gly Cys Gly Ala Cys Gly Gly Ala Gly Gly Gly Gly
20 25 30
Gly Gly Thr Gly Gly Gly Ala Gly Ala Gly Cys Gly Gly Thr Cys Gly
35 40 45
Cys Gly
50
<210> 417
<211> 50
<212> БЕЛОК
<213> Mus musculus
<400> 417
Cys Cys Cys Gly Gly Cys Cys Cys Cys Cys Ala Cys Cys Cys Cys Cys
1 5 10 15
Ala Cys Gly Cys Cys Cys Gly Cys Cys Cys Gly Gly Gly Ala Gly Gly
20 25 30
Cys Gly Gly Ala Cys Gly Gly Gly Gly Gly Gly Ala Gly Ala Gly Gly
35 40 45
Gly Ala
50
<210> 418
<211> 50
<212> БЕЛОК
<213> Mus musculus
<400> 418
Thr Ala Thr Cys Thr Gly Gly Cys Thr Thr Cys Cys Thr Cys Gly Gly
1 5 10 15
Cys Cys Cys Cys Gly Gly Gly Ala Thr Thr Cys Gly Gly Cys Gly Ala
20 25 30
Ala Ala Gly Cys Gly Cys Gly Gly Cys Cys Gly Gly Ala Gly Gly Gly
35 40 45
Cys Thr
50
<210> 419
<211> 50
<212> БЕЛОК
<213> Mus musculus
<400> 419
Cys Gly Cys Cys Gly Cys Cys Gly Ala Cys Cys Cys Cys Gly Thr Gly
1 5 10 15
Cys Gly Cys Thr Cys Gly Gly Cys Thr Thr Cys Gly Thr Cys Gly Gly
20 25 30
Gly Ala Gly Ala Cys Gly Cys Gly Thr Gly Ala Cys Cys Gly Ala Cys
35 40 45
Gly Gly
50
<210> 420
<211> 50
<212> БЕЛОК
<213> Mus musculus
<400> 420
Gly Cys Gly Cys Cys Cys Cys Cys Cys Cys Gly Cys Ala Cys Cys Cys
1 5 10 15
Gly Cys Cys Cys Cys Gly Thr Cys Cys Cys Cys Cys Cys Cys Gly Cys
20 25 30
Gly Gly Ala Cys Gly Gly Gly Gly Ala Ala Gly Ala Ala Gly Gly Gly
35 40 45
Ala Gly
50
<210> 421
<211> 50
<212> БЕЛОК
<213> Mus musculus
<400> 421
Cys Gly Ala Ala Cys Cys Cys Cys Gly Gly Gly Ala Ala Cys Cys Cys
1 5 10 15
Cys Cys Gly Ala Cys Cys Cys Cys Gly Cys Gly Gly Ala Gly Gly Gly
20 25 30
Gly Gly Ala Ala Gly Gly Gly Gly Gly Ala Gly Gly Ala Cys Gly Ala
35 40 45
Gly Gly
50
<210> 422
<211> 50
<212> БЕЛОК
<213> Mus musculus
<400> 422
Cys Ala Cys Cys Cys Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Cys Gly Ala Cys
1 5 10 15
Gly Ala Gly Gly Cys Gly Gly Gly Gly Ala Cys Cys Cys Gly Cys Cys
20 25 30
Gly Gly Ala Cys Gly Gly Gly Gly Ala Cys Gly Gly Ala Cys Gly Gly
35 40 45
Gly Gly
50
<210> 423
<211> 50
<212> БЕЛОК
<213> Mus musculus
<400> 423
Gly Cys Cys Ala Ala Cys Cys Gly Ala Gly Gly Cys Thr Cys Cys Thr
1 5 10 15
Thr Cys Gly Gly Cys Gly Cys Thr Gly Cys Cys Gly Thr Ala Thr Cys
20 25 30
Gly Thr Thr Cys Cys Gly Cys Thr Thr Gly Gly Gly Cys Gly Gly Ala
35 40 45
Thr Thr
50
<210> 424
<211> 50
<212> БЕЛОК
<213> Mus musculus
<400> 424
Cys Cys Cys Gly Gly Gly Cys Cys Cys Cys Cys Gly Gly Ala Cys Cys
1 5 10 15
Cys Cys Cys Gly Ala Gly Ala Gly Gly Gly Ala Cys Gly Ala Cys Gly
20 25 30
Gly Ala Gly Gly Cys Gly Ala Cys Gly Gly Gly Gly Gly Gly Thr Gly
35 40 45
Gly Gly
50
<210> 425
<211> 50
<212> БЕЛОК
<213> Mus musculus
<400> 425
Thr Gly Gly Gly Ala Gly Gly Gly Gly Cys Gly Gly Cys Cys Cys Gly
1 5 10 15
Gly Cys Cys Cys Cys Cys Gly Cys Gly Ala Cys Cys Gly Cys Cys Cys
20 25 30
Cys Cys Cys Thr Thr Thr Cys Cys Gly Cys Cys Ala Cys Cys Cys Cys
35 40 45
Ala Cys
50
<210> 426
<211> 50
<212> БЕЛОК
<213> Mus musculus
<400> 426
Gly Gly Gly Ala Gly Ala Gly Gly Cys Cys Gly Gly Gly Gly Gly Gly
1 5 10 15
Ala Gly Ala Gly Cys Gly Cys Gly Gly Cys Gly Ala Cys Gly Gly Gly
20 25 30
Thr Ala Thr Cys Cys Gly Gly Cys Thr Cys Cys Cys Thr Cys Gly Gly
35 40 45
Cys Cys
50
<210> 427
<211> 50
<212> БЕЛОК
<213> Mus musculus
<400> 427
Cys Gly Cys Thr Gly Cys Thr Gly Cys Cys Gly Gly Gly Gly Gly Gly
1 5 10 15
Cys Thr Gly Thr Ala Ala Cys Ala Cys Thr Cys Gly Gly Gly Gly Cys
20 25 30
Gly Gly Gly Gly Thr Gly Gly Thr Cys Cys Gly Gly Cys Gly Cys Cys
35 40 45
Cys Ala
50
<210> 428
<211> 50
<212> БЕЛОК
<213> Mus musculus
<400> 428
Cys Gly Cys Cys Gly Cys Cys Gly Ala Cys Cys Cys Cys Gly Thr Gly
1 5 10 15
Cys Gly Cys Thr Cys Gly Gly Cys Thr Thr Cys Gly Cys Thr Cys Cys
20 25 30
Cys Cys Cys Cys Cys Ala Cys Cys Cys Cys Gly Ala Gly Ala Ala Gly
35 40 45
Gly Gly
50
<---
1. Способ удаления молекул РНК, которые не являются мишенью, из образца нуклеиновой кислоты, включающий:
(a) приведение образца нуклеиновой кислоты, содержащего по меньшей мере одну последовательность РНК- или ДНК-мишени и по меньшей мере одну молекулу РНК, не являющуюся мишенью, в контакт с набором зондов, содержащим 50 или более ДНК-зондов, комплементарных к несмежным последовательностям вдоль всей длины по меньшей мере одной последовательности молекулы РНК, не являющейся мишенью, тем самым гибридизируя 50 или более ДНК-зондов с молекулами РНК, не являющимися мишенями, с образованием гибридов ДНК : РНК, отличающееся тем, что
i) каждый из 50 или более ДНК-зондов составляет от 40 до 60 оснований в длину, и
ii) каждый гибрид ДНК : РНК разделен по меньшей мере на от 5 до 40 оснований вдоль заданной последовательности молекулы РНК, не являющейся мишенью, из любого другого гибрида ДНК : РНК; и
(b) приведение гибридов ДНК : РНК в контакт с рибонуклеазой, расщепляющей РНК от гибридов ДНК : РНК, тем самым разрушая молекулы РНК, не являющиеся мишенями, в образце нуклеиновой кислоты с образованием расщепленной смеси.
2. Способ по п. 1, включающий:
(c) необязательное расщепление оставшихся ДНК-зондов путем контакта расщепленной смеси с ферментом, расщепляющим ДНК, с образованием расщепленной ДНК-смеси, при этом фермент, расщепляющий ДНК, может необязательно представлять собой ДНКазу I; и
(d) отделение расщепленной РНК от расщепленной смеси или расщепленной ДНК-смеси.
3. Способ по п. 1 или 2, в котором приведение в контакт с набором зондов включает обработку образца нуклеиновой кислоты дестабилизатором.
4. Способ по п. 3, в котором дестабилизатор представляет собой нагревание или дестабилизирующее нуклеиновую кислоту химическое вещество, при этом дестабилизирующее нуклеиновую кислоту химическое вещество необязательно представляет собой бетаин, ДМСО, формамид, глицерин, их производные или их смесь.
5. Способ по п. 4, в котором дестабилизирующее нуклеиновую кислоту химическое вещество представляет собой формамид, при этом необязательно формамид присутствует во время контакта с набором зондов в концентрации от приблизительно 10 до 45 об.%.
6. Способ по п. 4, в котором обработка образца нагреванием включает применение нагрева выше температуры плавления по меньшей мере одного гибрида ДНК : РНК.
7. Способ по любому из пп. 1-6, в котором рибонуклеаза представляет собой РНКазу H или гибридазу.
8. Способ по любому из пп. 1-7, в котором образец нуклеиновой кислоты получен от человека или примата, отличного от человека.
9. Способ по любому из пп. 1-7, в котором образец нуклеиновой кислоты получен от крысы или мыши.
10. Способ по любому из пп. 1-8, в котором образец нуклеиновой кислоты содержит нуклеиновые кислоты нечеловеческого происхождения.
11. Способ по п. 10, в котором нуклеиновые кислоты нечеловеческого происхождения получены из не относящихся к человеку эукариот, бактерий, вирусов, растений, почвы или их смеси.
12. Способ по любому из пп. 1-11, в котором РНК, не являющаяся мишенью, представляет собой рРНК, мРНК, тРНК или их смесь.
13. Способ по п. 12, в котором РНК, не являющаяся мишенью, представляет собой рРНК и мРНК глобина.
14. Способ по любому из пп. 1-12, в котором набор зондов содержит по меньшей мере два ДНК-зонда, которые гибридизуются с по меньшей мере одной молекулой РНК, не являющейся мишенью, выбранной из 28S, 23S, 18S, 5.8S, 5S, 16S, 12S, HBA-A1, HBA-A2, HBB, HBB-B1, HBB-B2, HBG1 и HBG2.
15. Способ по п. 14, в котором набор зондов содержит по меньшей мере два ДНК-зонда, которые гибридизуются с двумя или более молекулами РНК, не являющимися мишенью, выбранными из 28S, 18S, 5.8S, 5S, 16S и 12S человека.
16. Способ по любому из пп. 1-15, в котором набор зондов содержит по меньшей мере два ДНК-зонда, которые гибридизуются с одной или более молекулами РНК, не являющимися мишенью, выбранными из HBA-A1, HBA-A2, HBB, HBG1 и HBG2 гемоглобина и 23S, 16S и 5S грамположительных или грамотрицательных бактерий.
17. Способ по любому из пп. 1-16, в котором набор зондов содержит по меньшей мере два ДНК-зонда, которые гибридизуются с одной или более молекулами РНК, не являющимися мишенью, полученными из видов Archaea.
18. Способ по любому из пп. 1-17, в котором набор зондов содержит по меньшей мере два ДНК-зонда, которые гибридизуются с одной или более молекулами РНК, не являющимися мишенью, крысы и (или) мыши, которые при этом могут выбираться из 16S крысы, 28S крысы, 16S мыши, 28S мыши и их комбинаций.
19. Способ по любому из пп. 1-18, в котором зонды для конкретной молекулы РНК, не являющейся мишенью, комплементарны примерно от 80 до 85% последовательности молекулы РНК, не являющейся мишенью.
20. Способ по любому из пп. 1-11, в котором ДНК-зонды содержат:
(a) две или более, или пять или более, или 10 или более, или 25 или более, или 50 или более, или 100 или более, или 150 или более, или 200 или более, или 250 или более, или 300 или более, или 333 последовательности, выбранные из SEQ ID NO: 1-333; или
(b) две или более, или пять или более, или 10 или более, или 25 или более, или 50 или более, или 100 или более, или 150 или более, или 200 или более, или 250 или более, или 300 или более, или 350 или более, или 400 или более, или 428 последовательностей, выбранных из SEQ ID NO: 1-428; или
(c) две или более, или пять или более, или 10 или более, или 25 или более, или 50 или более, или 100 или более, или 150 или более, или 200 или более, или 250 или более, или 300 или более, или 350 или более, или 377 последовательностей, выбранные из SEQ ID NO: 1-377; или
(d) две или более, или пять или более, или 10 или более, или 25 или более, или 50 или более, или 100 или более, или 150 или более, или 200 или более, или 250 или более, или 300 или более, или 350 или более, или 384 последовательности, выбранные из SEQ ID NO: 1-333 и SEQ ID NO: 378-428; или
(e) две или более, или пять или более, или 10 или более, или 25 или более, или 44 последовательности, выбранные из SEQ ID NO: 334-377; или
(f) две или более, или пять или более, или 10 или более, или 25 или более, или 50 или более, или 51 последовательность, выбранные из SEQ ID NO: 378-428;
или их комбинации.
21. Композиция для удаления молекул РНК, которые не являются мишенью, из образца нуклеиновой кислоты, содержащая набор зондов, содержащий
(a) 50 или более ДНК-зондов, комплементарных несмежным последовательностям, которые находятся на расстоянии от 5 до 40 оснований друг от друга вдоль всей длины по меньшей мере одной молекулы РНК, не являющейся мишенью, в образце нуклеиновой кислоты; где каждый из 50 или более ДНК-зондов составляет от 40 до 60 оснований в длину; и (b) рибонуклеазу, способную расщеплять РНК в гибриде ДНК : РНК.
22. Композиция по п. 21, в которой рибонуклеаза представляет собой РНКазу H.
23. Композиция по любому из пп. 21-22, содержащая дестабилизирующее химическое вещество.
24. Композиция по п. 23, в которой дестабилизирующее химическое вещество представляет собой формамид.
25. Композиция по любому из пп. 21-24, в которой РНК, не являющаяся мишенью, представляет собой рРНК, мРНК, тРНК или их смесь.
26. Композиция по п. 25, в которой РНК, не являющаяся мишенью, представляет собой рРНК и мРНК глобина.
27. Композиция по любому из пп. 21-26, в которой набор зондов содержит по меньшей мере два ДНК-зонда, которые гибридизуются с по меньшей мере одной молекулой РНК, не являющейся мишенью, выбранной из 28S, 23S, 18S, 5.8S, 5S, 16S, 12S, HBA-A1, HBA-A2, HBB, HBG1 и HBG2.
28. Композиция по п. 27, в которой набор зондов содержит по меньшей мере два ДНК-зонда, которые гибридизуются с двумя или более молекулами РНК, не являющимися мишенью, выбранными из 28S, 18S, 5.8S, 5S, 16S и 12S человека.
29. Композиция по любому из пп. 21-28, в которой набор зондов содержит по меньшей мере два зонда ДНК, которые гибридизуются с одной или более молекулами РНК, не являющимися мишенью, выбранными из HBA-A1, HBA-A2, HBB, HBG1 и HBG2 гемоглобина и 23S, 16S и 5S грамположительных или грамотрицательных бактерий.
30. Композиция по любому из пп. 21-29, в которой набор зондов содержит по меньшей мере два ДНК-зонда, комплементарных одной или более молекулам рРНК видов Archaea.
31. Композиция по любому из пп. 21-30, в которой набор зондов содержит ДНК-зонды, которые гибридизуются с одной или более молекулами РНК, не являющимися мишенью, крысы и (или) мыши, которые необязательно выбраны из 16S крысы, 28S крысы, 16S мыши, 28S мыши и их комбинаций.
32. Композиция по любому из пп. 21-31, в которой ДНК-зонды содержат:
(a) две или более, или пять или более, или 10 или более, или 25 или более, или 50 или более, или 100 или более, или 150 или более, или 200 или более, или 250 или более, или 300 или более, или 333 последовательности, выбранные из SEQ ID NO: 1-333; или
(b) две или более, или пять или более, или 10 или более, или 25 или более, или 50 или более, или 100 или более, или 150 или более, или 200 или более, или 250 или более, или 300 или более, или 350 или более, или 400 или более, или 428 последовательностей, выбранных из SEQ ID NO: 1-428; или
(c) две или более, или пять или более, или 10 или более, или 25 или более, или 50 или более, или 100 или более, или 150 или более, или 200 или более, или 250 или более, или 300 или более, или 350 или более, или 377 последовательностей, выбранных из SEQ ID NO: 1-377; или
(d) две или более, или пять или более, или 10 или более, или 25 или более, или 50 или более, или 100 или более, или 150 или более, или 200 или более, или 250 или более, или 300 или более, или 350 или более, или 384 последовательности, выбранных из SEQ ID NO: 1-333 и SEQ ID NO: 378-428; или
(e) две или более, или пять или более, или 10 или более, или 25 или более, или 44 последовательности, выбранные из -SEQ ID NO: 334-377; или
(f) две или более, или пять или более, или 10 или более, или 25 или более, или 50 или более, или 51 последовательность, выбранные из -SEQ ID NO: 378-428;
или их комбинации.
33. Набор для удаления молекул РНК, которые не являются мишенью, из образца нуклеиновой кислоты, содержащий набор зондов с 50 или более ДНК-зондами, комплементарными несмежным последовательностям, которые находятся на расстоянии от 5 до 40 оснований друг от друга вдоль всей длины по меньшей мере одной молекулы РНК, не являющейся мишенью, в образце нуклеиновой кислоты, где
каждый из 50 или более ДНК-зондов составляет от 40 до 60 оснований в длину;
(b) рибонуклеазу, способную расщеплять РНК в гибриде ДНК : РНК;
(c) буфер;
(d) среду для очистки нуклеиновых кислот и (e) дестабилизирующее химическое вещество.
34. Набор по п. 33, в котором РНК, не являющаяся мишенью, представляет собой рРНК, мРНК, тРНК или их смесь.
35. Набор по п. 34, в котором РНК, не являющаяся мишенью, представляет собой рРНК и мРНК глобина.
36. Набор по любому одному из пп. 33-35, в котором набор зондов содержит по меньшей мере два ДНК-зонда, гибридизующихся с по меньшей мере одной молекулой РНК, не являющейся мишенью, отобранной из 28S, 23S, 18S, 5.8S, 5S, 16S, 12S, HBA-A1, HBA-A2, HBB, HBG1 и HBG2.
37. Набор по п. 36, в котором набор зондов содержит по меньшей мере два ДНК-зонда, которые гибридизуются с двумя или более молекулами РНК, не являющимися мишенью, отобранными из 28S, 18S, 5.8S, 5S, 16S и 12S человека.
38. Набор по любому из пп. 33-37, в котором набор зондов содержит по меньшей мере два ДНК-зонда, которые гибридизуются с одной или более молекулами РНК, не являющимися мишенью, отобранными из HBA-A1, HBA-A2, HBB, HBG1 и HBG2 гемоглобина и 23S, 16S и 5S грамположительных или грамотрицательных бактерий.
39. Набор по любому из пп. 33-38, в котором набор зондов содержит по меньшей мере два зонда ДНК, комплементарных одной или более молекулам рРНК видов Archaea.
40. Набор по любому из пп. 33-39, в котором набор зондов содержит ДНК-зонды, которые гибридизуются с одной или более молекулами РНК, не являющимися мишенью, крысы и (или) мыши, которые при этом могут выбираться из 16S крысы, 28S крысы, 16S мыши, 28S мыши и их комбинаций.
41. Набор по любому из пп. 33-40, в котором ДНК-зонды содержат:
(a) две или более, или пять или более, или 10 или более, или 25 или более, или 50 или более, или 100 или более, или 150 или более, или 200 или более, или 250 или более, или 300 или более, или 333 последовательности, выбранные из -SEQ ID NO: 1-333; или
(b) две или более, или пять или более, или 10 или более, или 25 или более, или 50 или более, или 100 или более, или 150 или более, или 200 или более, или 250 или более, или 300 или более, или 350 или более, или 400 или более, или 428 последовательностей, выбранных из SEQ ID NO: 1-428; или
(c) две или более, или пять или более, или 10 или более, или 25 или более, или 50 или более, или 100 или более, или 150 или более, или 200 или более, или 250 или более, или 300 или более, или 350 или более, или 377 последовательностей, выбранных из SEQ ID NO: 1-377; или
(d) две или более, или пять или более, или 10 или более, или 25 или более, или 50 или более, или 100 или более, или 150 или более, или 200 или более, или 250 или более, или 300 или более, или 350 или более, или 384 последовательности, выбранных из номеров SEQ ID NO: 1-333 и номеров SEQ ID NO: 378-428; или
(e) две или более, или пять или более, или 10 или более, или 25 или более, или 44 последовательности, выбранные из SEQ ID NO: 334-377; или
(f) две или более, или пять или более, или 10 или более, или 25 или более, или 50 или более, или 51 последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 378-428;
или их комбинации.
42. Набор по п. 33, содержащий:
(a) набор зондов, содержащий SEQ ID NO: 1-333;
(b) рибонуклеазу, которая при этом может представлять собой РНКазу H;
(c) ДНКазу; и
(d) гранулы для очистки РНК;
при этом возможно наличие дополнительного буфера деплеции РНК, буфера деплеции зонда и буфера для удаления зонда.
43. Способ пополнения набора зондов для использования при удалении молекул нуклеиновых кислот РНК, не являющихся мишенью, из образца нуклеиновой кислоты, включающий:
(a) приведение образца нуклеиновой кислоты, содержащего по меньшей мере одну последовательность РНК- или ДНК-мишени и по меньшей мере одну молекулу РНК, не являющуюся мишенью, от первого вида в контакт с набором зондов, содержащим 50 или более ДНК-зондов, комплементарных к несмежным последовательностям вдоль всей длины по меньшей мере одной последовательности молекулы РНК, не являющейся мишенью, от второго вида, тем самым гибридизируя 50 или более ДНК-зондов с молекулами РНК, не являющимися мишенями, с образованием гибридов ДНК : РНК, при этом
i) каждый из 50 или более ДНК-зондов составляет от 40 до 60 оснований в длину, и
ii) каждый гибрид ДНК : РНК отделен друг от друга на расстояние от 5 до 40 оснований вдоль заданной последовательности молекулы РНК, не являющейся мишенью, из любого другого гибрида ДНК : РНК;
(b) приведение гибридов ДНК : РНК в контакт с рибонуклеазой, расщепляющей РНК от гибридов ДНК : РНК, тем самым разрушая молекулы РНК, не являющиеся мишенями, в образце нуклеиновой кислоты с образованием расщепленной смеси;
(c) отделение расщепленной РНК от расщепленной смеси;
(d) секвенирование оставшейся РНК из образца;
(e) оценку оставшихся последовательностей РНК на наличие молекул РНК первого вида, не являющихся мишенью, таким образом определяя области последовательности бреши; и
(f) пополнение набора зондов дополнительными ДНК-зондами, комплементарными к несмежным последовательностям в одной или более областях последовательности брешей.
44. Способ по п. 43, в котором участки с брешами в последовательности содержат 50 или более пар оснований.
45. Способ по п. 43 или 44, в котором первый вид не относится к человеку, а второй - представляет собой человека.
46. Способ по п. 45, в котором первый вид представляет собой крысу или мышь.
47. Способ по п. 45 или 46, в котором композицию по любому из пп. 21-33 используют для снабжения рибонуклеазой, а набор зондов содержит ДНК-зонды, комплементарные несмежным последовательностям вдоль всей длины по меньшей мере одной молекулы РНК человека, не являющейся мишенью.
48. Способ по п. 46 или 47, в котором используется метод для идентификации ДНК-зондов, которые гибридизуются с одной или более молекулами РНК, не являющимися мишенью, крысы и (или) мыши, которые необязательно выбраны из 16S крысы, 28S крысы, 16S мыши, 28S мыши и их комбинаций.
49. Способ по любому из пп. 43-48, где рибонуклеаза представляет собой РНКазу H.
