Стабильный рекомбинантный протективный антиген для вакцины против сибирской язвы

Настоящее изобретение относится к иммунологии и биотехнологии, в частности к методам получения иммунобиологических препаратов, которые могут быть использованы как основа для профилактической вакцины против сибирской язвы. Предложен модифицированный полноразмерный рекомбинантный протективный антиген rPA83m для профилактической вакцины против сибирской язвы. Он представляет собой белок, включающий аминокислотную последовательность протективного антигена Bacillus anthracis со следующими модификациями: замена 164NSRKKR167 на 164QSSNKE167; делеция 313FF314; замена Asn713 и Asn719 на Gln713 и Gln719, которые обеспечивают его повышенную стабильность при хранении. Также предложен рекомбинантный вектор pQE-rPA83m, содержащий нуклеотидную последовательность Seq ID № 1 и обеспечивающий экспрессию рекомбинантного антигена rPA83m в клетках Escherichia coli. Техническим результатом является создание стабильного протективного антигена Bacillus anthracis для рекомбинантной вакцины против сибирской язвы посредством синтеза белка, представляющего собой модифицированный протективный антиген Bacillus anthracis с мутациями в сайтах протеолиза и спонтанного дезаминирования, а также создание генетической конструкции, обеспечивающей высокий уровень его экспрессии в культуре клеток продуцентов. 2 н.п. ф-лы, 10 ил., 5 пр.

 

Область техники

Настоящее изобретение относится к иммунологии и биотехнологии, в частности к методам получения иммунобиологических препаратов, которые могут быть использованы как основа для профилактической вакцины против сибирской язвы.

Уровень техники

Сибирская язва - острое зоонозное инфекционное заболевание, возбудителем которого является бактерия Bacillus anthracis. Инфицированию подвержены теплокровные животные, в особенности восприимчивы к ней травоядные млекопитающие, а также человек (Sternbach G. The history of anthrax // The Journal of emergency medicine. 2003. V. 24. № 4. P. 463-467; Turnbull P.C.B. Introduction: anthrax history, disease and ecology // Anthrax. Springer, Berlin, Heidelberg, 2002. P. 1-19). Для человека существуют четыре пути заражения сибирской язвой: через микротравмы кожных покровов, аспирационный путь (при вдыхании зараженной спорами возбудителя пыли), алиментарный путь (при употреблении в пищу не прошедших надлежащей термической обработки зараженных мясопродуктов) и факультативно-трансмиссивный путь (передача через насекомых-переносчиков, в организме которых не происходит размножения возбудителя) (Лобзин Ю.В., Волжанин В.М., Захаренко С.М. Сибирская язва // Клиническая микробиология и антимикробная химиотерапия. 2002. Т. 4. № 2. С. 104-126; Ясюкевич, В. В., Ясюкевич, Н. В. Сибирская язва // Проблемы экологического мониторинга и моделирования экосистем. 2016. Т. 27. № 2. С. 87-101). В зависимости от пути заражения сибирская язва проявляется в одной из трёх форм: кожной, лёгочной или гастроэнтеральной. Кожная форма является наиболее распространённой и составляет 95% от общего числа заражений. Лёгочная форма является наиболее тяжёлой с наибольшим количеством летальных исходов (Turnbull P.C.B. Introduction: anthrax history, disease and ecology // Anthrax. Springer, Berlin, Heidelberg, 2002. P. 1-19). Индивидуальные споры или небольшие агрегаты спор B. anthracis, имеющие диаметр между 2 и 5 мкм, способны проникать в альвеолы лёгких и транспортироваться макрофагами в лимфатические узлы. После прорастания спор в лимфатических узлах продуцируется большое количество токсина сибирской язвы, затем следует системная циркуляция токсина по организму, что приводит к отёкам, некрозам и септическому шоку (Shafazand S., Doyle R., Ruoss S., Weinacker A., Raffin T.A. Inhalational anthrax: epidemiology, diagnosis, and management // Chest. 1999. V. 116. № 5. P. 1369-1376).

B. anthracis - грамположительная спорообразующая палочковидная бактерия (Baillie L., Read T. D. Bacillus anthracis, a bug with attitude! // Current opinion in microbiology. 2001. V. 4. №. 1. P. 78-81), относится к роду Bacillus, семейства Bacillaceae. Геном B. anthracis представлен кольцевой молекулой ДНК, состоящей из 5 227 293 пар оснований. Вирулентные штаммы бактерии содержат две плазмиды вирулентности. Малая плазмида рХО2 содержит 94 829 пар оснований, кодирует белки синтеза капсулы из поли-γ-D-глутаминовой кислоты (Read T.D., Peterson S.N., Tourasse, N., Baillie L.W., Paulsen I.T., Nelson K.E., Tettelin H., Fouts D.E., Eisen J.A., Gill S.R., Holtzapple E.K., Okstad O.A., Helgason E., Rilstone J., Wu M., Kolonay J.F., Beanan M.J., Dodson R.J., Brinkac L.M., Gwinn M., DeBoy R.T., Madpu R., Daugherty S.C., Durkin A.S., Haft D.H., Nelson W.C., Peterson J.D., Pop M., Khouri H.M., Radune D., Benton J.L., Mahamoud Y., Jiang L., Hance I.R., Weidman J.F., 94 Berry K.J., Plaut R.D., Wolf A.M., Watkins K.L., Nierman W.C., Hazen A., Cline R., Redmond C., Thwaite J.E., White O., Salzberg S.L., Thomason B., Frielander A.M., Koehler T.M., Hanna P.C., Kolsto A.-B., Fraser C.M. The genome sequence of Bacillus anthracis Ames and comparison to closely related bacteria // Nature. 2003. V. 423. № 6935. P. 81-86). Капсула делает бактерию невосприимчивой к фагоцитозу и к воздействию системы комплемента плазмы крови. Большая плазмида рХО1 содержит 181 167 пар оснований и кодирует три компонента токсина сибирской язвы - фактор летальности (lethal factor - LF), фактор отёчности (Edema factor - EF) и протективный антиген (protective antigen - PA). LF - Zn²⁺ зависимая металлопротеаза, способная специфически расщеплять большинство изоформ митоген-активируемых киназ, участвующих в ключевых процессах жизнедеятельности клетки хозяина (Duesbery N.S., Webb C.P., Leppla S.H., Gordon V.M., Klimpel K.R., Copeland T.D., Ahn N.G., Oskarsson M.K., Fukasawa K., Paull K.D., Vande Woude G.F. Proteolytic inactivation of MAP-kinase-kinase by anthrax lethal factor // Science. 1998. V. 280. № 5364. P. 734-737; Bromberg-White J., Lee C.S., Duesbery N. Consequences and utility of the zinc-dependent metalloprotease activity of anthrax lethal toxin // Toxins. 2010. V. 2. № 5. P. 1038-1053). EF - кальций- и кальмодулин-зависимая аденилатциклаза, в результате работы которой повышается концентрация цАМФ в цитоплазме хозяйской клетки, что ведёт к нарушению водного гомеостаза (Abrami L., Reig N., van der Goot F.G. Anthrax toxin: the long and winding road that leads to the kill // Trends in microbiology. 2005. V. 13. № 2. P. 72- 78; Tang W.J., Guo Q. The adenylyl cyclase activity of anthrax edema factor // Molecular aspects of medicine. 2009. P. 30. № 6. P. 423-430). Для проникновения в клетку как LF, так и EF требуется PA, обеспечивающий функцию эндоцитоз-опосредованной транслокации LF и EF через цитоплазматическую мембрану хозяина. РА является абсолютно безопасным белком в отсутствие патогенных компонентов токсина. В комплексе с PA LF формирует летальный токсин (LeTx), а EF - токсин отёчности (EdTx, его основная роль - угнетение функции фагоцитов) - так называемые бинарные токсины.

Вакцинация - наиболее эффективная превентивная мера против сибирской язвы. В настоящее время лицензированы два вида вакцин против данной инфекции: живые аттенуированные вакцины и препараты, основанные на бесклеточных фильтратах культур B. anthracis, адсорбированных на алюмосодержащий адъювант. Живые аттенуированные вакцины лицензированы в России (содержит живые споры аттенуированного штамма B. anthracis STI-1 - pXO1⁺, pXO2^-) и Китае (содержит авирулентный штамм B. anthracis A16R - pXO1⁺, pXO2^-) (Shlyakhov E.N., Rubinstein E. Human live anthrax vaccine in the former USSR // Vaccine. 1994. V. 12. № 8. P. 727-730; WHO (World Health Organization) Information sheet observed rate of vaccine reactions anthrax vaccines to humans. 2012. [Электронный ресурс] URL: https://www.who.int/vaccine_safety/initiative/tools/Anthrax_Vaccine_rates_information_sheet.pdf?ua=1 (дата обращения 10.02.2022). Потенциальные побочные эффекты, вызываемые применением Российской и Китайской вакцин, могут быть связаны с наличием у аттенуированных штаммов бактерии большой плазмиды вирулентности pXO1 и экспрессией всех трёх компонентов токсина сибирской язвы. Данные вакцины не используются в Европе и США. Существует две вакцины, основанные на фильтратах культур инактивированных штаммов B. anthracis: лицензированная в Великобритании Anthrax Vaccine Precipitated (AVA, штамм Sterne 34F2, адсорбированный на сульфате калия-алюминия) и лицензированная в США и производимая компанией Emergent BioSolutions Inc. под торговой маркой BioThrax® Anthrax Vaccine Adsorbed (AVP, штамм V770-NP1-R, адсорбированный на гель гидроксида алюмииния) (Friedlander A.M., Little S.F. Advances in the development of next-generation anthrax vaccines // Vaccine. 2009. V. 27. P. D28-D32; Kaur M., Singh S., Bhatnagar R. Anthrax vaccines: present status and future prospects // Expert review of vaccines. 2013. V. 12. № 8. P. 955-970; Modi T., Gervais D., Smith, S., Miller J., Subramaniam S., Thalassinos K., Shepherd A. Characterization of the UK anthrax vaccine and human immunogenicity // Human vaccines & immunotherapeutics. 2021. V. 17. №. 3. P. 747-758; WHO (World Health Organization) Information sheet observed rate of vaccine reactions anthrax vaccines to humans. 2012. [Электронный ресурс] URL: https://www.who.int/vaccine_safety/initiative/tools/Anthrax_Vaccine_rates_information_sheet.pdf?ua=1 (дата обращения 10.02.2022). Оба препарата предполагают вакцинацию несколькими дозами в течение длительного промежутка времени (4 дозы для AVP и 5 доз для AVA). Было показано, что использование AVA связано с рядом побочных эффектов, проявляющихся с высокой / очень высокой частотой, подробный список побочных эффектов был опубликован Всемирной Организацией Здравоохранения (WHO (World Health Organization) Information sheet observed rate of vaccine reactions anthrax vaccines to humans. 2012. [Электронный ресурс] URL: https://www.who.int/vaccine_safety/initiative/tools/Anthrax_Vaccine_rates_information_sheet.pdf?ua=1 (дата обращения 10.02.2022). Основным иммуногеном в AVA и AVP является PA. При этом AVP также содержит недетерминированные количества прочих бактериальных белков (в особенности, LF и EF), безопасность и вклад в протективность которых не до конца понятен (Dumas E.K., Garman L., Cuthberston H., Charlton S., Hallis B., Engler R.J.M., Choudhari S., Picking W.D., James J.A., Farris A.D. Lethal factor antibodies contribute to lethal toxin neutralization in recipients of anthrax vaccine precipitated // Vaccine. 2017a. V. 35. № 26. P. 3416-3422; Dumas E.K., Gross T., Larabee J., Pate L., Cuthberston H., Charlton S., Hallis B., Engler R.J.M., Collins L.C. Jr., Spooner C.E., Chen H., Ballard J., James J.A., Farris A.D. Anthrax vaccine precipitated induces edema toxinneutralizing, edema factor-specific antibodies in human recipients // Clinical and Vaccine Immunology. 2017b. V. 24. № 11; Modi T., Gervais D., Smith, S., Miller J., Subramaniam S., Thalassinos K., Shepherd A. Characterization of the UK anthrax vaccine and human immunogenicity // Human vaccines & immunotherapeutics. 2021. V. 17. №. 3. P. 747-758). Кроме того, было показано, что гидроксид алюминия, используемый в составе AVA в качестве адъюванта, оказывает негативное влияние на адсорбированный на его поверхности PA и ускоряет деградацию последнего (Wagner L., Verma A., Meade B.D., Reiter K., Narum D.L., Brafy R.A., Little S.F., Burns D.L. Structural and immunological analysis of anthrax recombinant protective antigen adsorbed to aluminum hydroxide adjuvant // Clinical and Vaccine Immunology. 2012. V. 19. №. 9. P. 1465-1473; Kondakova O.A., Nikitin N.A., Evtushenko E.A., Ryabchevskaya E.M., Atabekov J.G., Karpova, O.V. Vaccines against anthrax based on recombinant protective antigen: problems and solutions // Expert review of vaccines. 2019. V. 18. №. 8. P.813-828).

Существуют разработки вакцин, содержащие все три компонента токсина (так, запатентован метод приготовления генетически инактивированных PA, EF и LF с целью использования в вакцинах против сибирской язвы - WO Patent № 2003048390A1, 12.06.2003), EF и его части (запатентован N-концевой некаталитический домен EF в качестве основы для вакцины - WO Patent № 2007011411A2, 25.01.2007) и даже материал капсулы бактерии. Однако современные разработки в области вакцин против сибирской язвы в основном направлены на создание препаратов, основанных преимущественно на рекомбинантном PA (rPA). PA - это крупный (83 кДА) четырёхдоменный белок. Антител к PA достаточно для формирования протективного иммунного ответа (Taft S.C., Weiss A.A. Neutralizing activity of vaccine-induced antibodies to two Bacillus anthracis toxin components, lethal factor and edema factor // Clinical and Vaccine Immunology. 2008. V. 15. № 1. P. 71-75). РА безопасен в отсутствие LF и EF, в связи с чем использование рекомбинантного rPA целесообразно и позволяет избежать труднопрогнозируемых последствий, связанных с нерегулируемым содержанием в фильтратах культур B. anthracis прочих компонентов токсина сибирской язвы и других бактериальных белков.

Широко представлены разработки вакцины против сибирской язвы на основе бактериальных векторов, продуцирующих rPA. В качестве векторов в данном случае могут выступать аттенуированные штаммы Salmonella (напр., работа Sim B.K.L., Li M., Ososrio M., Wu Y., Wai T.T., Peterson J.W., James E.R., Chakravarty S., Gao L., Xu R., KC N., Stafford E., Lawrence W.S., Yeager L.A., Peel J.E., Sivasubramani S.K., Chopra A.K., Filipova S., Hoffman S.L. Protection against inhalation anthrax by immunization with Salmonella enterica serovar Typhi Ty21a stably producing protective antigen of Bacillus anthracis // NPJ vaccines. 2017. V. 2. № 1. P. 1-7 и запатентованные живые оральные вакцинные кандидаты против сибирской язвы US Patent № 7947268B2, 24.05.2011), PXO1^-, PXO2^- штаммы B. anthracis (напр., Aloni-Grinstein, R., Gat, O., Altboum, Z., Velan, B., Cohen, S., Shafferman, A. Oral spore vaccine based on live attenuated nontoxinogenic Bacillus anthracis expressing recombinant mutant protective antigen // Infection and immunity. 2005. V. 73. № 7. P. 4043-4053), Bacillus subtilis (напр., Duc L.H., Hong H.A., Atkins H.S., Flick-Smith H.S., Durrami Z., Pijkema S., Titball R.W., Cutting S.M. Immunization against anthrax using Bacillus subtilis spores expressing the anthrax protective antigen // Vaccine. 2007. P. 25. № 2. P. 346-355), Lactobacillus acidophilus (напр., Mohamadzadeh M., Duong T., Sandwick S. J., Hoover, T., Klaenhammer T.R. Dendritic cell targeting of Bacillus anthracis protective antigen expressed by Lactobacillus acidophilus protects mice from lethal challenge // Proceedings of the National Academy of Sciences. 2009. V. 106. № 11. P. 4331-4336) и др. При этом в векторах может экспрессироваться как не модифицированный относительного дикого типа rPA (как в случае работы Duc et al., 2007), так и модифицированный rPA. В качестве примера можно привести изобретение CN patent №105797148B, 14.01.2020 - инактивированный вариант B. anthracis штамма Sterne, не способный синтезировать LF и EF, однако продуцирующий РА с инактивированной функцией связывания EF и LF для достижения большего уровня безопасности препарата (мутации R178A и K197A). Существуют разработки вакцин на основе векторов, экспрессирующих PA, слитый с другими функционально активными белками (так, экспортируемый белок ClyA был добавлен к rPA в вакцинном кандидате, основанном на экспрессии антигена в Salmonella enterica serovar Typhi - Galen J.E., Chinchilla M., Pasetti M.F., Wang J.Y., Zhao L., ArciniegaMartinez I., Silverman D.J., Levine M.M. Mucosal immunization with attenuated Salmonella enterica serovar Typhi expressing protective antigen of 88 anthrax toxin (PA83) primes monkeys for accelerated serum antibody responses to parenteral PA83 vaccine // The Journal of Infectious Diseases. 2009. V. 199. P. 326-335) или с иными изменениями. Отдельный интерес представляют разработки вакцинных кандидатов на основе векторов, обеспечивающих экспрессию лишь отдельных доменов PA. В качестве примера можно привести интегрируемую в хромосому бактерии ДНК-конструкцию, кодирующую первый домен PA и предназначенную как для получения и очистки PA, так и для использования содержащих данную конструкцию бактерий в качестве вакцинной субстанции. Данная разработка была запатентована в 2017 году (RU patent №2622085C2, 09.06.2017). Наряду с разработками на основе бактериальных векторов существуют разработки вакцин против сибирской язвы на основе вирусных векторов. Как правило, в качестве вектора используется нереплицирующийся аденовирус пятого серотипа (Ad5) (Krishnan V., Andersen B.H., Shoemaker C., Sivko G.S., Tordoff K.P., Stark G.V., Zhang J., Feng T., Duchars M., Roberts M.S. Efficacy and immunogenicity of single-dose AdVAV intranasal anthrax vaccine compared to anthrax vaccine absorbed in an aerosolized spore rabbit challenge model // Clinical and Vaccine Immunology. 2015. V. 22. № 4. P. 430-439). Однако успех подобных разработок может быть ограничен наличием у большой части населения иммунитета против Ad5 (Fausther-Bovendo H., Kobinger G.P. Pre-existing immunity against Ad vectors: humoral, cellular, and innate response, what's important? // Human vaccines & immunotherapeutics. 2014. V. 10. № 10. P. 2875-2884). Также развивающейся областью исследований является создание ДНК-вакцин против сибирской язвы, экспрессирующих различные компоненты токсина (напр., Hermanson G., Whitlow V., Parker S., Tonsky K., Rusalov D., Ferrari M., Lalor P., Komai M., Mere R., Bell M., Brenneman K., Mateczun A., Evans T., Kasslow D., Galloway D., Hobart P. A cationic lipid-formulated plasmid DNA vaccine confers sustained antibody-mediated protection against aerosolized anthrax spores // Proceedings of the National Academy of Sciences. 2004. V. 101. № 37. P. 13601-13606).

Наиболее перспективным направлением в разработке вакцин против сибирской язвы считаются субъединичные вакцины, содержащие rPA в качестве антигена. Субъединичные вакцины, как правило, более дёшевы и удобны в производстве и хранении, чем векторные и ДНК-вакцины, а также их использование позволяет более точно предсказывать влияние препарата на организм реципиента после вакцинации. В качестве примеров разработок вакцин с полноразмерным rPA, идентичным нативному, можно привести работы Campbell J. D., Clement K.H., Wasserman S.A., Donegan S., Chrisley L., Kotloff, K. L. Safety, reactogenicity, and immunogenicity of a recombinant protective antigen anthrax vaccine given to healthy adults // Human vaccines. 2007. V. 3. № 5. P. 205-211 и Gorse G.J., Keitel W., Keyserling H., Taylor D.N., Lock M., Alves K., Kenner J., Deans L., Gurwith M. Immunogenicity and tolerance of ascending doses of a recombinant protective antigen (rPA102) anthrax vaccine: a randomized, double-blinded, controlled, multicenter trial // Vaccine. 2006. V. 24. №. 33- 34. P. 5950-5959. Для последней разработки, представляющей собой адсорбированный на гель гидроксида алюминия очищенный rPA, была проведена первая фаза клинических испытаний. В 2019 году была успешно завершена II фаза клинических испытаний рекомбинантной вакцины GC1109 (GC Pharma, Korea), содержащей очищенный rPA (Kang C.K., Kim N.H., Kim C.J., Rhie G.E., Jo S. K., Ahn M., Kang J., Choe P.G., Park W.B., Kim N.-J., Oh, M. D. Immunogenicity and safety of a novel recombinant protective antigen anthrax vaccine (GC1109), a randomized, single-blind, placebo controlled phase II clinical study // Vaccine. 2019. V. 37. №. 29. P. 3820-3824), - вакцина продемонстрировала высокую иммуногенность. В 2020 году была запатентована бивалентная вакцина на основе биологически инактивированных и не способных взаимодействовать друг с другом rPA и рекомбинантного LF, адсорбированных на гель гидроксида алюминия (CN patent №105749265B, 27.03.2020). Стоит отдельно отметить запатентованную в 1998 году вакцину против сибирской язвы, в состав которой входили как споры патогена штамма STI, так и rPA, что позволило добиться существенно более высокой эффективности по сравнению с лицензированными живыми вакцинами. (RU Patent № 2115433C1, 20.07.1998). Также исследуется возможность создания сибиреязвенных вакцин с отдельными доменами rPA. Например, IV домен PA, содержащий наибольшее количество протективных эпитопов (McComb R.C., Martchenko M. Neutralizing antibody and functional mapping of Bacillus anthracis protective antigen-the first step toward a rationally designed anthrax vaccine // Vaccine. 2016. V. 34. № 1. P. 13-19), продемонстрировал протективность в составе субъединичной вакцины в работе Flick-Smith H.C., Walker N.J., Gibson P., Bullifent H., Hayward S., Miller J., Titball R.W., Williamson E.D. A recombinant carboxy-terminal domain of the protective antigen of Bacillus anthracis protects mice against anthrax infection // Infection and immunity. 2002. V. 70. № 3. P. 1653-1656.

Главной проблемой при создании субъединичных вакцин на основе rPA является его крайне низкая стабильность - белок сильно подвержен протеолизу в сайтах расщепления фурином (протеолитический сайт в составе I домена) и химотрипсином (протеолитический сайт в составе второго домена) и спонтанному дезаминированию остатков аспарагина (Powell B.S., Enama J.T., Ribot W.J., Wbster W., Little S., Hoover T., Adamovicz J.J., Andrews G.P. Multiple asparagine deamidation of Bacillus anthracis protective antigen causes charge isoforms whose complexity correlates with reduced biological activity // PROTEINS: Structure, Function, and Bioinformatics. 2007. V. 68. № 2. P. 458-479; Ramirez D.M., Leppla S.H., Schneerson R., Shiloach J. Production, recovery and immunogenicity of the protective antigen from a recombinant strain of Bacillus anthracis // Journal of Industrial Microbiology and Biotechnology. 2002. V. 28. № 4. P. 232-238; Zomber G., Reuveny S., Garti N., Shafferman A., Elhanany E. Effects of spontaneous deamidation on the cytotoxic activity of the Bacillus anthracis protective antigen // Journal of Biological Chemistry. 2005. V. 280. № 48. P. 39897-39906). Нестабильность rPA определяет трудности при его хранении. Среди 68 подверженных дезаминированию остатков аспарагина в составе rPA несколько являются наиболее примечательными с точки зрения их времени полураспада и влияния на свойства PA (Powell B.S., Enama J.T., Ribot W.J., Wbster W., Little S., Hoover T., Adamovicz J.J., Andrews G.P. Multiple asparagine deamidation of Bacillus anthracis protective antigen causes charge isoforms whose complexity correlates with reduced biological activity // PROTEINS: Structure, Function, and Bioinformatics. 2007. V. 68. № 2. P. 458-479; Zomber G., Reuveny S., Garti N., Shafferman A., Elhanany E. Effects of spontaneous deamidation on the cytotoxic activity of the Bacillus anthracis protective antigen // Journal of Biological Chemistry. 2005. V. 280. № 48. P. 39897-39906). Было показано, что замена 713 и 719 остатков аспарагина на остатки глутамина существенно увеличивает стабильность rPA, причём модифицированный белок способен после длительного хранения стимулировать выработку антител на уровне, схожим с уровнем антител после иммунизации свежеполученным немодифицированным rPA (Verma A., Burns D.L. Improving the stability of recombinant anthrax protective antigen vaccine // Vaccine. 2018. V. 36. № 43. P. 6379-6382). Внесение замен в сайты расщепления белка протеазами (замена ¹⁶⁴RKKR¹⁶⁷ на ¹⁶⁴SNKE¹⁶⁷ в сайте расщепления фурином и делеция ³¹³FF³¹⁴ в сайте расщепления химотрипсином и заменой Glu308 на Asp308) также позволило получить более стабильный rPA (Ramirez D.M., Leppla S.H., Schneerson R., Shiloach J. Production, recovery and immunogenicity of the protective antigen from a recombinant strain of Bacillus anthracis // Journal of Industrial Microbiology and Biotechnology. 2002. V. 28. № 4. P. 232-238). Методика получения устойчивого к воздействию протеаз rPA для использования в вакцинных препаратах была запатентована (US Patent № 20040076638A1, 22.04.2004). Подобные стабилизирующие модификации rPA - существенный шаг на пути создания пригодных для длительного хранения субъединичных вакцин против сибирской язвы.

Прототипом данного изобретения является устойчивый к протеолизу модифицированный rPA, аминокислотная последовательность которого включает последовательность нативного протективного антигена Bacillus anthracis с заменой остатков ¹⁶⁴RKKR¹⁶⁷ на ¹⁶⁴SNKE¹⁶⁷ в сайте расщепления фурином и делецией остатков ³¹³FF³¹⁴ в сайте расщепления химотрипсином, а также заменой Q308N (US Patent № 20040076638A1, 22.04.2004).

Технической проблемой является получение рекомбинантного протективного антигена Bacillus anthracis, который был бы аналогичен по своим антигенным свойствам нативному протективному антигену Bacillus anthracis, но при этом был бы более стабилен при хранении в широком температурном диапазоне, мог бы быть легко выделен в больших количествах из культуры клеток-продуцентов и очищенный препарат которого не содержал бы примесей других компонентов токсина Bacillus anthracis.

Раскрытие сущности изобретения

Техническим результатом является создание стабильного протективного антигена Bacillus anthracis для рекомбинантной вакцины против сибирской язвы посредством синтеза белка, представляющего собой модифицированный протективный антиген Bacillus anthracis с мутациями в сайтах протеолиза (замена ¹⁶⁴NSRKKR¹⁶⁷ на ¹⁶⁴QSSNKE¹⁶⁷ и делеция ³¹³FF³¹⁴) и спонтанного дезаминирования (замена Asn⁷¹³ и Asn⁷¹⁹ на остатки глутамина) а также создание генетической конструкции, обеспечивающей высокий уровень его экспрессии в культуре клеток продуцентов.

Поставленная задача решается за счёт создания генетической конструкции pQE-30-rPA83m для экспрессии в культуре клеток E.coli, которая обеспечивает высокий уровень эксперессии модифицированного протективного антигена сибирской язвы (rPA83m) с последовательностью аминокислот Seq ID 02, включающей в себя последовательность полноразмерного протективного антигена Bacillus anthracis c мутациями, инактивирующими сайты протеолиза и дезаминирования, и накопления rPA83m в бактериальных клетках, его выделения и очистки. Степень чистоты выделенного препарата подтверждается методом электрофоретического анализа в денатурирующих условиях, с помощью которого также определяется, что молекулярная масса rPA83m располагается в диапазоне 70-100 кДа, что согласуется с расчётной молекулярной массой rPA83m, которая составляет 84 кДа. Антигенные свойства выделенного и очищенного rPA83m подтверждаются иммуноблот анализом с поликлональной антисывороткой к немодифицированному rPA83, а также с химерными моноклинальными антителами к РА, обладающими нейтрализующей активностью (Панина А.А., Алиев Т.К., Топорова В.А., Шемчукова О.Б., Бикетов С.Ф., Долгих Д.А., Свешников П.Г. Нейтрализующие антитела против компонентов экзотоксина Bacillus anthracis // Тезисы докладов V Российского симпозиума «Белки и пептиды». 2011. С. 80). Стабильность полноразмерного rPA83m при хранении при +4°С как минимум в течение 264 дней подтверждается методом электрофоретического анализа в денатурирующих условиях. Аналогичным образом подтверждается, что не менее 50% rPA83m остаётся стабильным при хранении при +25°С в течение 2 месяцев.

Ключевым отличием предложенной разработки в сравнении с приведённым прототипом является наличие в дополнение к заменам в сайтах протеолиза (замена ¹⁶⁴RKKR¹⁶⁷ на ¹⁶⁴SNKE¹⁶⁷ и делеция ³¹³FF³¹⁴) ещё и замен наиболее подверженных дезаминированию остатков аспарагина (Asp162, Asp713 и Asp719) на остатки глутамина. Таким образом, в рамках предложенного изобретения два подхода к стабилизации протективного антигена путём внесения замен в сайты протеолиза и дезаминирования впервые реализованы одновременно. Также в рамках данного изобретения разработан уникальный дизайн и синтезирована нуклеотидная последовательность кодирующая предложенный рекомбинантный антиген и обеспечивающая высокий уровень его экспрессии именно в клетках E.coli.

Краткое описание чертежей

Фиг. 1 представляет собой нуклеотидную последовательность, кодирующую rPA83m. Фрагменты вектора pQE-30 выделены курсивом. Стартовый кодон ATG и терминирующий кодон TAA выделены жирным шрифтом и подчёркнуты. Последовательность, кодирующая шесть гистидинов (His₆) выделена жирным шрифтом. Надстрочными индексами ¹ и ² обособлена последовательность, кодирующая I и II домены модифицированного протективного антигена и включённая в вектор pQE-30-rPA1+2 путём клонирования по сайтам BamHI и HindIII. Надстрочными индексами ³ и ⁴ обособлена последовательность кодирующая III и IV домены модифицированного протективного антигена и включённая в вектор pQE-30-rPA3+4 путём клонирования по сайтам BamHI и HindIII. Сайты разрезания эндонуклеазами рестрикции, которые были использованы для создания конструкции pQE-rPA83m, содержащей ген rPA83m, подчёркнуты. Последовательности соответствующие праймерам SphIFwd, rPA3+4Fwd и PstIRev выделены светло-серым. Последовательность, соответствующая праймеру rPA1+2Rev и также входящая в состав праймера rPA3+4Fwd выделена тёмно-серым.

Фиг. 2 представляет собой аминокислотную последовательность рекомбинантного белка rPA83m. Отмечены модификации, внесённые в последовательность по сравнению с нативным РА Bacillus anthracis: замена ¹⁶²NSRKKR¹⁶⁷ на ¹⁶²QSSNKE¹⁶⁷; делеция ³¹³FF³¹⁴; замены Asp⁷¹³ и Asp⁷¹⁹ на Gln. Модифицированные остатки, соответствующие нативному РА, зачёркнуты. Остатки, соответствующие модифицированному белку, выделены светло-серым. Аминокислотные остатки, кодируемые последовательностями вектора pQE-30, выделены курсивом. Шесть гистидинов (His₆) выделены жирным шрифтом. Аминокислотные остатки, кодируемые сайтами рестрикции BamHI и HindIII, фланкирующими последовательность РА, подчёркнуты. Нумерация аминокислотных остатков рекомбинантного rPA83m не учитывает последовательность MRGSHHHHHHGS, кодируемую вектором pQE-30.

Фиг. 3 представляет собой схему получения генетической конструкции pQE-30-rPA83m для экспрессии рекомбинантного модифицированного протективного антигена сибирской язвы (rPA83m).

А. Схема получения фланкированной сайтами рестрикции SphI и PstI последовательности PCR3, включающей 3'-концевой участок гена rPA1+2 и 5'-концевой участок гена rPA3+4. Более тёмным цветом отмечены сайты рестрикции, входящие в состав праймеров. Представлен электрофоретический анализ очищенных продуктов PCR1 и PCR2, а также ПЦР-смеси, содержащей фрагмент PCR3 в 1% агарозном геле. М. - маркёры длин ДНК GeneRuler DNA Ladder Mix (длины маркерных нуклеиновых кислот указаны справа в п.н.). Окрашивание бромистым этидием.

Б. Схема рестрикции вектора pQE-30-rPA1+2, pQE-30-rPA3+4 и фрагмента PCR3, и последующего лигирования продуктов рестрикции с образованием вектора pQE-30-rPA83m. Более тёмным цветом отмечены сайты рестрикции, использованные для получения ДНК-фрагментов, которые были затем лигированы.

Фиг. 4 представляет собой электрофоретический анализ в 1% агарозном геле продуктов аналитической рестрикции плазмидной ДНК семи различных клонов клеток, полученных после трансформации лигазной смесью. 1-7. - Продукты рестрикции, полученные при анализе плазмидной ДНК клонов 1-7 соответственно. М. - маркёры длин ДНК GeneRuler DNA Ladder Mix (длины маркерных нуклеиновых кислот указаны справа в п.н.). Рестрикцию проводили по сайтам BamHI и HindIII. Окрашивание бромистым этидием.

Фиг. 5 представляет собой анализ эффективности экспрессии белка rPA83m в зависимости от температуры культивирования. Клетки E. coli штамма SG13009, трансформированные плазмидой pQE-30-rPA83m и культивируемые: 1. - при +37°С в течение 3 часов до добавления индуктора и в течение 4 часов при +37°С после добавления ИПТГ; 2. - в течение 3 часов при +37°С без добавления индуктора (неиндуцированный контроль); 3. - при +37°С в течение 3 часов до добавления индуктора и при +20°С в течение 4 часов после добавления ИПТГ; 4. - ВТМ (отрицательный контроль). М. - Маркёры молекулярной массы PageRuler™ Plus Prestained Protein Ladder (10-250 кДа) («Thermo Fisher Scientific», США) (справа указаны значения молекулярной массы маркеров в кДа).

А. Вестрн-блот анализ с поликлональной антисывороткой к немодифицированному rPA83. Белки разделяли методом электрофореза в градиентном ДСН-ПААГ (8-20%), после чего переносили на мембрану Hybond-P («GE Healthcare», США). Первичные антитела использовали в разведении 1/5000. Конъюгированные с пероксидазой хрена вторичные антитела к иммуноглобулинам мыши («Jackson ImmunoResearch», США) использовали в разведении 1/10000. Визуализировали с помощью ECL системы («GE Healthcare», США). Б. Мембрана, окрашенная амидовым чёрным.

Фиг. 6 представляет собой электрофоретический анализ фракций, полученных после хроматографической очистки экспрессированного белка rPA83m. 1. - Фракция 1 (pH=5.9). 2. - Фракция 2 (pH=5.9). 3. - Фракция 3 (5.9>pH>4.5). 4. - Фракция 4 (pH=4.5). 5. - Фракция 5 (pH=4.5). 6. - Фракция 6 (pH=4.5). 7. - Фракция 7 (4.5>pH>3.5). 8. - Фракция 8 (pH=3.5). 9. - Фракция 9 (pH=3.5). 10. - Фракция 10 (pH=3.5). Градиент 8-20% ДСН-ПААГ. Гель окрашен Кумасси G-250.

Фиг. 7 представляет собой электрофоретический анализ очищенного водного препарата rPA83m после диализа и мембранной фильтрации с помощью шприцевых фильтрующих насадок CHROMAFIL® CA-20/25(S, 729024). 1. - Препарат rPA83m после диализа; 2. - Препарат rPA83m после диализа и фильтрации. М. - Маркеры молекулярной массы PageRuler™ Plus Prestained Protein Ladder (10-250 кДа) («Thermo Fisher Scientific», США) (слева указаны молекулярные массы белковых маркеров в кДа). Градиент 8-20% ДСН-ПААГ. Гель окрашен Кумасси G-250.

Фиг. 8 представляет собой анализ взаимодействия рекомбинантного модифицированного протективного антигена сибирской язвы (rPA83m) с поликлональной антисывороткой к рекомбинантному немодифицированному rPA83 (Б) и химерными моноклинальными нейтрализующими антителами к РА (Панина А.А., Алиев Т.К., Топорова В.А., Шемчукова О.Б., Бикетов С.Ф., Долгих Д.А., Свешников П.Г. Нейтрализующие антитела против компонентов экзотоксина Bacillus anthracis // Тезисы докладов V Российского симпозиума «Белки и пептиды». 2011. С. 80) (В) методом иммуноблот анализа. 1. - rPA83m. 2. - ВТМ. 3. - rPA63. 4. - лизат клеток E. coli. М. - маркеры молекулярной массы Precision Plus Protein™ Dual Xtra («Bio-Rad», США) (слева указаны молекулярные массы маркеров в кДа). Белки разделяли методом электрофореза в градиентном ДСН-ПААГ (8-20%), после чего переносили на мембрану Hybond-P (GE Healthcare Life Sciences). Первичные антитела использовали в разведении 1/5000. Конъюгированные с пероксидазой хрена вторичные антитела к иммуноглобулинам мыши («Jackson ImmunoResearch», США) или человека («HyTest», Россия) использовали в разведении 1/10000. Визуализировали с помощью ECL системы («GE Healthcare», США). Контрольный эксперимент - электрофоретический анализ (гель, окрашенный кумасси G-250) (А).

Фиг. 9 представляет собой анализ стабильности рекомбинантного модифицированного протективного антигена сибирской язвы (rPA83m) при температуре +4°С. 1.-2. - образцы rPA83m без инкубации (две независимые повторности). 3.-6. - образцы rPA83m после 264 дней инкубации при +4°C (пять независимых повторностей). М. - маркёры молекулярной массы PageRuler™ Plus Prestained Protein Ladder (10-250 кДа) («Thermo Fisher Scientific», США) (справа указаны молекулярные массы маркеров в кДа). Инкубация проводилась в 1-кратном PBS в объёме 10 мкл (концентрация rPA83m 0,1 мг/мл). Электрофоретический анализ в градиенте 8-20% ДСН-ПААГ. Гель окрашен Кумасси G-250.

Фиг. 10 представляет собой анализ стабильности рекомбинантного модифицированного протективного антигена сибирской язвы (rPA83m) при температуре +25°С. Инкубация проводилась в 1-кратном PBS в объёме 10 мкл в пяти аналитических повторностях (концентрация rPA83m 0,1 мг/мл). Относительное содержание полноразмерной формы rPA83m в проинкубированных образцах оценивалось с помощью электрофоретического анализа в 8-20% ДСН-ПААГ путём сравнения с контрольными образцами, приготовленными аналогичным образом, но не подвергавшимися инкубации, с помощью программы Image Lab системы гель-документирования ChemiDoc XRS+ («Bio-RAD», США). Планки погрешностей соответствуют стандартному отклонению значения относительного содержания rPA83m в образце (n=5) в каждой контрольной точке.

Осуществление изобретения

В соответствии с настоящим изобретением стабильный антиген для профилактической вакцины против сибирской язвы это рекомбинантный белок (rPA83m), представляющий собой модифицированный протективный антиген Bacillus anthracis, содержащий следующие мутации:

1) Замена ¹⁶⁴NSRKKR¹⁶⁷ на ¹⁶⁴QSSNKE¹⁶⁷ в сайте протеолиза фурином и делеция ³¹³FF³¹⁴ в сайте расщепления химотрипсином;

2) Замена подверженных спонтанному дезаминированию остатков Asn⁷¹³ и Asn⁷¹⁹ на остатаки глутамина. (Фиг. 2).

Разработана конструкция pQE-30-rPA83m обеспечивающая высокий уровень эксперессии rPA83m в клетках E. coli.

Согласно литературным данным, основными причинами быстрой деградации rPA являются спонтанное дезаминирование ряда аминокислотных остатков аспарагина и расщепление белка протеазами по соответствующим сайтам протеолиза (Ramirez D.M., Leppla S.H., Schneerson R., Shiloach J. Production, recovery and immunogenicity of the protective antigen from a recombinant strain of Bacillus anthracis // Journal of Industrial Microbiology and Biotechnology. 2002. V. 28. № 4. P. 232-238; Zomber G., Reuveny S., Garti N., Shafferman A., Elhanany E. Effects of spontaneous deamidation on the cytotoxic activity of the Bacillus anthracis protective antigen // Journal of Biological Chemistry. 2005. V. 280. № 48. P. 39897-39906; Powell B.S., Enama J.T., Ribot W.J., Wbster W., Little S., Hoover T., Adamovicz J.J., Andrews G.P. Multiple asparagine deamidation of Bacillus anthracis protective antigen causes charge isoforms whose complexity correlates with reduced biological activity // PROTEINS: Structure, Function, and Bioinformatics. 2007. V. 68. № 2. P. 458-479). В работе Zomber с соавторами была показана высокая вероятность спонтанного дезаминирования аминокислотных остатков Asn¹⁶², Asn⁷¹³ и Asn⁷¹⁹. Как было показано в данном исследовании, дезаминирование Asn⁷¹³ и Asn⁷¹⁹ приводит к существенному снижению цитотоксических свойств PA в присутствии фактора летальности сибирской язвы (LF). В то же время, дезаминирование по Asn¹⁶² приводит к уменьшению эффективности протеолиза белка фурином (Zomber G., Reuveny S., Garti N., Shafferman A., Elhanany E. Effects of spontaneous deamidation on the cytotoxic activity of the Bacillus anthracis protective antigen // Journal of Biological Chemistry. 2005. V. 280. № 48. P. 39897-39906). В более поздней работе других авторов также было продемонстрировано, что замена Asn⁷¹³ и Asn⁷¹⁹ на остатки глутамина обеспечивает более высокий уровень стабильности rPA83, не влияя на способность индуцировать выработку токсин-нейтрализующих антител и не оказывая влияния на общую структуру белка. Глутамин при этом не подвержен дезаминированию в течение времени, необходимого для хранения вакцинных препаратов (Verma A., Burns D.L. Improving the stability of recombinant anthrax protective antigen vaccine // Vaccine. 2018. V. 36. № 43. P. 6379-6382). Внесение изменений в сайты расщепления rPA83 протеазами также способствует повышению его стабильности. В работе Ramirez с соавторами исследовался rPA83 с заменами аминокислотных остатков ¹⁶⁴RKKR¹⁶⁷, которые является сайтом протеолиза фурином, на ¹⁶⁴SNKE¹⁶⁷, а также с делецией остатков ³¹³FF³¹⁴ в сайте протеолиза белка химотрипсином. Было показано, что содержащий подобные замены rPA83 сохраняет способность индуцировать образование токсин-нейтрализующих антител (Ramirez D.M., Leppla S.H., Schneerson R., Shiloach J. Production, recovery and immunogenicity of the protective antigen from a recombinant strain of Bacillus anthracis // Journal of Industrial Microbiology and Biotechnology. 2002. V. 28. № 4. P. 232-238). Таким образом, внесение в последовательность PA Bacillus anthracis вышеописанных замен одновременно и в сайты протеолиза, и сайты спонтанного дезаминирования является перспективным подходом для получения стабильного рекомбинантного протективного антигена сибирской язвы, способного индуцировать выработку токсиннейтрализующих антител.

Конкретные примеры осуществления изобретения приведены для предоставления специалистам полного описания его реализации и не ограничивают предполагаемый авторами разработки объем изобретения.

Изобретение осуществляется следующим способом.

Плазмида pQE-30-rPA83m, содержащая уникальную последовательность нуклеотидов, обеспечивающую высокий уровень экспрессии рекомбинантного антигена, создается на основе вектора pQE-30-rPA1+2, содержащего последовательность, кодирующую I и II домены РА с мутациями в сайтах протеолиза (замена ¹⁶⁴NSRKKR¹⁶⁷ на ¹⁶⁴QSSNKE¹⁶⁷ и делеция ³¹³FF³¹⁴), и вектора pQE-30-rPA3+4, содержащего последовательность, кодирующую III и IV домены РА с мутациями подверженных спонтанному дезаминированию остатков Asn⁷¹³ и Asn⁷¹⁹ на остатки глутамина. Синтез осуществляется путём получения методом ПЦР слитого фрагмента соответствующего 3'-концевому участку гена rPA1+2 и 5'-концевому участку гена rPA3+4 и последующего клонирования полученного ПЦР-продукта и 3'-концевого фрагмента гена rPA3+4 в вектор pQE-30-rPA1+2, из которого был удалён 3'-концевой участок гена rPA1+2. Белок rPA83m с молекулярной массой 84 кДа имеет последовательность аминокислот Seq ID 02 и синтезируется в бактериальной системе клеток E.coli штамма SG[pRep4], путём трансформации этих клеток плазмидой pQE-30-rPA83m, содержащей нуклеотидную последовательность Seq ID 01, кодирующую белок rPA83m. Экспрессированный белок выделяется из лизата бактериальных клеток методом металл-хелатной хроматографии и переводится методом диализа в водный раствор, который затем фильтруется через фильтр с диаметром пор 0,2 мкм. Анализ экспрессионной конструкции осуществляется с использованием следующих методик: рестрикция, электрофорез в 1% агарозном геле, секвенирование. Анализ полученного белка, его стабильности и специфических свойств осуществляют с использованием следующих методик: электрофорез в денатурирующих условиях в полиакриламидном геле и иммуноблот анализ.

Сущность изобретения поясняют следующие примеры, не ограничивая его.

Пример 1.

Получение генетической конструкции pQE-30-rPA83m для экспрессии рекомбинантного модифицированного протективного антигена сибирской язвы (rPA83m)

Аминокислотная последовательность rPA83m (Seq ID 02) была подвергнута "обратной трансляции" in silico, с учётом частоты встречаемости кодонов в E. coli. Также была проведена оптимизация полученной нуклеотидной последовательности с целью повышения вариабельности триплетов, кодирующих одни и те же аминокислотные остатки, в случае если их частота встречаемости сопоставима. Различные cis-элементы, негативно влияющие на эффективность экспрессии в бактериальных клетках (криптические промоторы, последовательности Шайна-Дальгарно, A/T-богатые регионы и прямые повторы), также как и нежелательные сайты рестрикции, возникающие при клонировании, были мутированы без изменения аминокислотной последовательности кодируемого белка. Проведенная оптимизация позволила получить уникальную нуклеотидную последовательность, обеспечивающую высокий уровень экспрессии rPA83m в клетках E. coli. В качестве вектора для клонирования синтетического гена rPA83m была выбрана плазмида pQE-30 («Qiagen», Германия). Таким образом, для экспрессии белка rPA83m был разработан дизайн гена, кодирующего rPA83m, который представлен на Фиг. 1 и соответствует нуклеотидной последовательности Seq ID 01.

Для получения конструкции pQE-30-rPA83m были использованы векторы pQE-30-rPA1+2 и pQE-30-rPA3+4. pQE-30-rPA1+2 представляет собой вектор pQE-30, содержащий ген rPA1+2, который кодирует рекомбинантный белок, состоящий из I и II доменов РА Bacillus anthracis с мутациями в сайтах протеолиза (замена ¹⁶⁴NSRKKR¹⁶⁷ на ¹⁶⁴QSSNKE¹⁶⁷ и делеция ³¹³FF³¹⁴). На Фиг. 1 нуклеотидная последовательность, входящая в состав pQE-30-rPA1+2 обособлена надстрочными символами ¹ и ². pQE-30-rPA3+4 представляет собой вектор pQE-30, содержащий ген rPA3+4, который кодирует рекомбинантный белок, состоящий из III и IV доменов РА Bacillus anthracis с мутациями подверженных спонтанному дезаминированию остатков (замена Asn⁷¹³ и Asn⁷¹⁹ на остатки глутамина). На Фиг. 1 нуклеотидная последовательность, входящая в состав pQE-30-rPA3+4 обособлена надстрочными символами ³ и ⁴. Дизайн плазмид pQE-30-rPA1+2 и pQE-30-rPA3+4 был разработан авторами изобретения. Затем эти плазмиды были синтезированы компанией Евроген (Россия) путём сборки генов rPA1+2 и rPA3+4 из перекрывающихся олигонуклеотидов и их последующего клонирования в вектор pQE-30 по сайтам рестрикции BamHI и HindIII.

Сайты рестрикции SphI и PstI, располагающиеся в составе генов rPA1+2 и rPA3+4 соответственно, были выбраны в качестве фланкирующих участков для создания фрагмента, содержащего 3'-концевую последовательность гена rPA1+2 и 5'-концевую последовательность гена rPA3+4. Выбор обусловлен тем, что SphI является ближайшим к 3'-концу гена rPA1+2, а PstI ближайшим к 5'-концу гена rPA3+4 сайтом рестрикции. Методом ПЦР на матрицах pQE-30-rPA1+2 и pQE-30-rPA3+4 были получены два ДНК-продукта длиной 530 п.н. (PCR1) и 188 п.н. (PCR2) соответственно, содержащие последовательности, соответствующие 3'-концевой части гена rPA1+2 и 5'-концевой части гена rPA3+4. Продукт PCR1, был получен в результате ПЦР с использованием прямого праймера к участку гена rPA1+2, содержащему сайт рестрикции SphI (SphIFwd: 5'-acgcggaagtgcatgcgtct-3'), и обратного праймера к 3'-концевому участку гена rPA1+2 (rPA1+2Rev: 5'-ggtttcctgaatctgcggca-3'). Продукт PCR2 был получен в результате ПЦР с использованием прямого праймера к 5'-концевому участку гена rPA3+4 (rPA3+4Fwd: 5'-tgccgcagattcaggaaaccaccgctcgtatcatcttcaac-3') и обратного праймера к участку гена rPA3+4, содержащему сайт рестрикции PstI (PstIRev: 5'-ctggtactgcaggttaccgt-3'). Прямой праймер к 5'-концевому участку гена rPA3+4 также содержал последовательность из 20 нуклеотидов, соответствующих 3'-концевому участку гена rPA1+2, что обеспечило перекрывание последовательностей PCR1 и PCR2. Каждая ПЦР проводилась в объеме 50 мкл, содержащем 180 нг соответствующей ДНК-матрицы, 1х буфер Encyclo («Евроген», Россия), смесь дНТФ в концентрации 0,2мМ каждого, 1х смесь полимераз Encyclo («Евроген», Россия) и по 20 пкмоль соответствующих прямого и обратного праймеров. Амплификацию проводили в термоциклере Терцик («ДНК-технология», Россия) по следующей схеме: 1) 94°С - 3 мин.; 2) 30 циклов: 94°С - 30 с., 50°С - 30 с., 72°С - 45 с.; 3) 72°С - 3 мин.

После этого было проведено электрофоретическое разделение ПЦР-смесей в 1% агарозном геле и амплифицированные продукты PCR1 и PCR2 были вырезаны из геля. Выделение ДНК из геля проводилось при помощи набора «Набор для экстракции ДНК из геля» «Thermo Fisher Scientific» (США) согласно протоколу. На Фиг. 3А представлено схематическое положение ДНК-фрагментов PCR1 и PCR2 в контексте соответствующих матричных векторов, а также результат электрофоретического анализа выделенных PCR1 и PCR2, используемых в дальнейшей работе.

На следующем этапе с помощью метода ПЦР с удлинением перекрывающихся фрагментов был получен ДНК-продукт PCR3, включающий фрагменты PCR1 и PCR2. ПЦР-смесь объёмом 50 мкл, содержала эквимолярные количества ДНК-продуктов ПЦР1 (195 нг, длина продукта 530 п.н.) и ПЦР2 (70 нг, длина продукта 188 п.н.), имеющих перекрывающийся участок длиной 20 п.н., а также 1х буфер Encyclo («Евроген», Россия), смесь дНТФ (0,2мМ каждого) и 1х смесь полимераз Encyclo («Евроген», Россия). Амплификация проводилась в термоциклере Терцик в две стадии. На первой стадии происходило достраивание комплементарных участков ДНК в сторону 3'-концов от перекрывающегося фрагмента. Схема первой стадии: 1) 94°С - 3 мин.; 2) 5 циклов: 94°С - 30 с., 50°С - 30 с., 72°С - 45 с. После завершения первой стадии ПЦР в реакционную смесь добавляли по 20 пкмоль праймеров SphIFwd и PstIRev и проводили вторую стадию. На второй стадии проводилась амплификация достроенного продукта с использованием концевых праймеров. Схема второй стадии: 1) 30 циклов: 94°С - 30 с., 50°С - 30 с., 72°С - 45 с.; 3) 72°С - 3 мин.

Полученный ДНК-продукт PCR3 длиной 688 п.н. представлял собой последовательность, фланкированную сайтами рестрикции SphI и PstI и кодирующую фрагмент рекомбинантного протективного антигена, соответствующий С-концевой части домена II и N-концевой части домена III. На Фиг. 3А представлена схема получения фрагмента PCR3, а также результат электрофоретического анализа ПЦР-смеси, содержащей накопленный PCR3. В данном случае, поскольку предполагалось проводить рестрикцию полученного ПЦР-продукта, перед разделением в 1% агарозном геле, была проведена фенольная депротеинизация ПЦР-смеси. Очищенный продукт PCR3, выделенный из геля, был использован для дальнейшего получения плазмидного вектора, кодирующего rPA83m.

На следующем этапе работы была проведена препаративная рестрикция векторов pQE-30-rPA1+2, pQE-30-rPA3+4 и фрагмента PCR3, в результате которой были получены 3 фрагмента будущего вектора pQE-30-rPA83m, имеющие комплементарные липкие концы. В качестве вектора для лигирования использовалась плазмида pQE-30-rPA1+2, из которой путём рестрикции по сайтам SphI и HindIII был удалён 3'-концевой фрагмент гена rPA1+2, содержащийся в последовательности PCR3. Рестрикция вектора pQE-30-rPA1+2 проводилась в 30 мкл рестрикционной смеси, содержащей 1-кратный White буфер («SibEnzyme», Россия), по 20 единиц эндонуклеаз рестрикции SphI и HindIII («SibEnzyme», Россия) и 920 нг ДНК pQE-30-rPA1+2. Рестрикция продукта PCR3 с целью получения соответствующих липких концов проводилась в 30 мкл рестрикционной смеси, содержащей 1-кратный Orange буфер («SibEnzyme», Россия), по 20 единиц эндонуклеаз рестрикции SphI и PstI («SibEnzyme», Россия) и 726 нг ДНК PCR3. Для получения третьего фрагмента из вектора pQE-30-rPA3+4 путём рестрикции по сайтам PstI и HindIII был вырезан 3'-концевой фрагмент гена rPA3+4 длиной 589 п.н. Рестрикция вектора pQE-30-rPA3+4 проводилась в 30 мкл рестрикционной смеси, содержащей 1-кратный Fast Digest буфер («Thermo Fisher Scientific», США), по 1 мкл эндонуклеаз рестрикции Fast Digest PstI и Fast Digest HindIII («Thermo Fisher Scientific», США) и 1050 нг ДНК pQE-30-rPA3+4. Во всех случаях рестрикция проводилась при 37°С в течение 16 часов. Продукты каждой из трёх реакций рестрикции были разделены методом электрофореза в 1% агарозном геле, необходимые для лигирования целевые фрагменты были выделены из геля по аналогии с ПЦР-продуктами.

Три полученных фрагмента были лигированы в одну стадию. Лигирование проводилось в объеме 50 мкл, содержащем 1-кратный буфер для Т4 ДНК-лигазы, 0,2мМ АТФ, 1 единицу Т4 ДНК-лигазы («Fermentas»), 150 нг вставки PCR3, 120 нг вставки, соответствующей 3'-концевому фрагменту гена rPA3+4 и 300 нг вектора. Для эффективного лигирования вставки были взяты в эквимолярном количестве, при этом количество молекул вектора было примерно в три раза меньше. Такое соотношение количества молекул вектора и вставок снижает вероятность лигирования вектора по некомплементарным концам без участия вставок. Также в целях снижения вероятности образования нецелевых продуктов лигирование проводилось сначала в течение часа при +14°С, так как такая температура является оптимальной для отжига образовавшихся в результате рестрикции коротких липких концов. Затем рестрикционная смесь инкубировалась ещё час при +25°С, так как более высокая температура обеспечивает большую эффективность работы фермента Т4-лигазы. Фиг. 3Б. представляет схему рестрикции и лигирования.

Далее компетентные клетки E. coli штамма XL-1 были трансформированны лигазной смесью. Для этого 200 мкл суспензии компетентных бактериальных клеток Escherichia coli (штамм XL1-Blue) было смешано с 10 мкл лигазной смеси и проинкубировано во льду в течение 20 минут. После этого клетки выдерживались 90 секунд при 42°С и снова во льду 5 минут. Затем к ним было добавлено 800 мкл среды 2xYT (1,6% триптон, 1% дрожжевой экстракта, 0,5% NaCl) и они были проинкубированы при 37°С в течение 50 минут. Затем суспензия клеток высевалась на чашку со средой YT с агаром, содержащей селективный антибиотик ампициллин в концентрации 100 мкг/мл, затем чашки инкубировались в течение 16 часов при 37°С.

После этого был проведён отбор клонов, содержащих вектор pQE-30-rPA1+2 с обеими целевыми вставками, т.е. вектор pQE-30-rPA83m. Для этого из клеток семи клонов, выросших после трансформации лигазной смесью, была выделена плазмидная ДНК. Выбранные колонии высевали в бакпечатки с 3 мл культуральной среды 2xYT, содержащей 100 мкг/мл ампициллина, и выращивали в течение ночи при 37°С. Затем из ночной культуры была выделена плазмидная ДНК. Для выделения плазмидной ДНК был использован «Набор для выделения плазмидной ДНК» фирмы «Евроген» (Россия) согласно протоколу. Выделенная ДНК была проанализирована с помощью рестрикции по сайтам разрезания BamHI и HindIII, что позволило оценить общую длину гена, клонированного в вектор pQE-30. Рестрикция проводилась в объеме 15 мкл, содержащем 1-кратный буфер Fast Digest Green Buffer («Thermo Fisher Scientific», США), по 0,5 мкл эндонуклеаз рестрикции Fast Digest BamHI и Fast Digest HindIII («Thermo Fisher Scientific», США) и примерно 150-200 нг каждого из разрезаемых фрагментов ДНК. Смесь была проинкубирована в течение 20 минут при температуре 37°С. Анализ продуктов рестрикции методом электрофореза в 1% агарозном геле (Фиг. 4) показал, что плазмидная ДНК, выделенная из клонов 1-5, содержала вставку длиной около 2200 п.н., что соответствует длине гена rPA83m. На геле визуализируются два основных продукта, соответствующие гену rPA83m (от BamHI до HindIII) и нативному вектору pQE-30 (от HindIII до BamHI), а также небольшое количество полноразмерного вектора pQE-30-rPA83, разрезанного, только по одному из сайтов. Плазмиды, выделенные из клонов 6 и 7, содержали вставку длиной около 1500 п.н., и, вероятно, представляли собой лигированный по некомплементарным липким концам вектор pQE-30-rPA1+2.

Таким образом, клоны 6 и 7 были исключены из дальнейшего анализа. Для ДНК клонов 1-5 нуклеотидный состав вставки, кодирующей rPA83m, был проанализирован путём секвенирования с праймеров SphIFwd и PstIRev, а также с праймеров к фланкирующим полилинкер участкам нативного вектора pQE-30 (pQE-30Fwd 5'-cggataacaatttcacacag-3' и pQE-30Rev 5'-gttctgaggtcattactgg-3'). Секвенирование было выполнено компанией Евроген. В результате анализа секвенированных последовательностей было установлено, что плазмиды, выделенные из всех пяти клонов, содержат ген rPA83m, однако в составе ДНК клонов 1, 2 и 5 имеются случайные мутации, приводящие к нецелевой замене аминокислотного остатка. Плазмиды, выделенные из клонов 3 и 4, кодируют rPA83m, последовательность которого полностью соответствует последовательности отображённой на Фиг. 1 и не содержит нежелательных случайных мутаций, то есть представляет собой последовательность Seq ID 01. Клон 4 был использован для продукции белка rPA83m.

Пример 2.

Продукция рекомбинантного модифицированного протективного антигена сибирской язвы (rPA83m) в бактериальных клетках E.coli

На Фиг. 2 представлена аминокислотная последовательность белка rPA83m (Seq ID 02), в составе которой отмечены мутированные сайты протеолиза и дезаминирования, а также располагающаяся на N-конце последовательность из шести остатков гистидина, необходимая для очистки белка с помощью аффинной металл-хелатной хроматографии. Для продукции белка rPA83m были использованы клетки E.coli штамма SG13009, содержащие плазмиду p[Rep4], которая обеспечивает высокий уровень экспрессии lac-репрессора. Бактериальные клетки были трансформированы плазмидой pQE-rPA83m, содержащей последовательность, кодирующую белок rPA83m. Для этого к 200 мкл суспензии бактериальных клеток было добавлено 100 нг выделенной и очищенной плазмиды, далее трансформация проводилась по аналогии с клетками XL1-Blue, за исключением того, что в качестве селективного антибиотика, помимо ампициллина (100 мкг/мл), был добавлен канамицин до конечной концентрации 50 мкг/мл. Колонии, выросшие после трансформации на селективной среде, были высеяны в небольшой объем (3 мл) культуральной среды 2xYT (1,6% триптон, 1% дрожжевого экстракт, 0,5% NaCl), содержащей селективные антибиотики - ампициллин и канамицин в концентрациях 100 мг/мл и 50 мг/мл соответственно, после чего ночная культура культивировалась в течение ночи при +37°С. Затем для экспрессии в большом объёме ночная культура была перенесена в 200 мл свежей 2xYT с соответствующими антибиотиками и клетки культивировались ещё в течение 3 часов при +37°С. После этого была проведена индукция экспрессии клонированных генов с помощью изопропил-β-D-1-тиогалактопиранозида (ИПТГ) с конечной концентрацией 2мМ. Был проведён подбор оптимальных условий экспрессии белка rPA83m. Было произведено сравнение эффективности накопления rPA83m в клетках-продуцентах при различных температурах культивирования после добавления индуктора ИПТГ. Для этого к клеткам культивируемым при +37°С был добавлен ИПТГ и затем они культивировались либо при +37°С, либо при +20°С в течение 4 часов. Затем эффективность накопления rPA83m при разных температурах была проанализирована методом иммуноблот анализа (Фиг. 5). Для приготовления проб 200 мкл культуры клеток после индукции при разных температурах, а также до добавления ИПТГ (неиндуцированный контроль), осаждались 1 мин при 14100g в микроцентрифужных пробирках, затем к осадку было добавлено 10 мкл деионизированной воды. После тщательного ресуспендирования на Vortex был добавлен буфер для нанесения на гель (15% глицерин, 2% додецилсульфатнатрия, 0,063М трис-HCl (pH 6,8), 0,04% бромфеноловый синий, 5% β-меркаптоэтанол) в объёме 50 мкл, затем пробы были снова ресуспендированы на Vortex и проинкубированы в течение 10 мин при 96°С, после чего нерастворённые фрагменты клеток осаждались с помощью центрифугирования в течение 10 мин при 14100g. 20 мкл супернатанта было нанесено на гель для анализа. После разделения методом электрофореза в градиентном 8-20% полиакриламидном геле с добавлением додецилсульфатнатрия (ДСН-ПААГ) белки были перенесены на мембрану Hybond-P из ПВДФ («Amersham», Великобритания), предварительно активированную этанолом, методом электро-переноса (прибор Pierce Power Blotter и буфер для переноса - фирмы «Thermo scientific», США), время переноса - 10 минут. После переноса мембрана была проинкубирована в 5% растворе сухого молока в буфере tTBS (1М трис-HCl pH=7,4; 3М NaCl; 0,05% твин-20) в течение часа. Далее проводилась инкубация с мышиной поликлональной антисывороткой к немодифицированному рекомбинантному rPA83 в разведении 1:5000 в 5% растворе сухого молока в буфере tTBS в течение 1 часа. Отмывка мембраны от первичных антител проводилась 3 раза по 10 минут в буфере tTBS. Затем мембрана была проинкубирована с вторичными антителами, конъюгированными с пероксидазой хрена («Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc.», США; разведение 1:10000) в 5% растворе сухого молока в буфере tTBS 1 час при комнатной температуре. Отмывка мембраны от вторичных антител проводилась 2 раза по 10 минут в буфере tTBS. Ещё одна отмывка была проведена в течение 10 минут в TBS (1М трис-HCl pH=7,4; 3М NaCl) без добавления детергента. Мембрана была проявлена с помощью ECL системы («Amersham», Великобритания). Хемилюминесцентный сигнал детектировался с помощью гельдокументирующей системы Chemi Doc XRS+ с программным обеспечением Image Lab Software («Bio-Rad Laboratories, Inc.», США). Фиг. 5А иллюстрирует результат вестерн-блот анализа, при этом на Фиг. 5Б изображена мембрана, окрашенная амидовым черным, который неспецифически связывается с белками на мембране.

Фиг. 5А демонстрирует более эффективное накопление полноразмерного rPA83m при культивировании клеток при +20°С после добавления индуктора (Фиг. 5, дорожка 3). Меньшее количество низкомолекулярных продуктов, узнаваемых антисывороткой к rPA83 в клетках, культивируемых при +20°С, позволяет предположить, что более низкая температура приводит к снижению скорости деградации rPA83m в клетках продуцентах, что, возможно, и является причиной более эффективного накопления полноразмерного продукта. Таким образом, было установлено, что культивирование клеток после индукции при пониженной температуре +20°С является оптимальным. Помимо прочего, результаты вестерн-блот анализа, проведённого с клетками-продуцентами, указывают на эффективное взаимодействие экспрессированного белка rPA83m с антисывороткой, полученной к немодифицированному rPA83 (Фиг. 5).

После накопления целевого белка клетки были отделены от культуральной среды с помощью низкоскоростного центрифугирования при 5000 об/мин (10 минут, ротор JA-14, центрифуга «Beckman Coulter» Avanti JXN-30) при +4°С. Биомасса хранилась при -20°С и затем была использована для выделения белка.

Пример 3.

Хроматографическая очистка рекомбинантного модифицированного протективного антигена сибирской язвы (rPA83m)

Хроматографическая очистка белка проводилась в денатурирующих условиях на Ni²⁺-нитрилотриацетатной агарозе (Ni²⁺-НТА) (Qiagen, Германия) с использованием буферов с последовательно понижающимся рН согласно протоколу производителя «The QIAexpressionist» с некоторыми модификациями. Биомасса, полученная после осаждения 400 мл культуры клеток, лизировалась в 10 мл буфера для нанесения (6M гуанидин-HCl, 0,1M NaH₂PO₄, 1M Трис-HCl; рН 8,0) с добавлением дезоксихолата натрия до конечной концентрации 0,2% в течение 1-2 часов на качалке Biosan PSU-10i (Латвия) (160-170 оборотов в минуту) до получения гомогенной суспензии. Далее для очистки от крупных компонентов бактериальных клеток лизат был центрифугирован при 9000 об/мин (15 минут, ротор JA-14, центрифуга «Beckman Coulter» Avanti JXN-30) при +4°С. Супернатант, получившийся после центрифугирования клеточного лизата, был нанесён на предварительно уравновешенную буфером для нанесения колонку с Ni²⁺-НТА агарозой (объем сорбента 1,6 мл). Сорбция белка проводилась в течение часа путём зацикливания потока через колонку. Далее колонка промывалась последовательно буфером для нанесения с добавлением дезоксихолата натрия (10 мл) и буфером для нанесения не содержащем дезоксихолат натрия (10 мл). Затем сорбированный на колонке белок был переведён в раствор мочевины, для этого колонка промывалась буфером аналогичного pH, но содержащем в качестве хаотропного агента 8M мочевину (8М мочевина; 0,1М NaH₂PO₄; 0,01М трис-HCl; pH 8,0) (15 мл), после чего для удаления оставшихся примесей и нецелевых белков колонка последовательно промывалась буферами аналогичного состава с pH 6,3 (30 мл) и pH 5,9 (2 мл). Затем колонка инкубировалась с элюирующим буфером (аналогичного состава, pH 4,5) (5 мл) в течения 30 минут. Наиболее прочно связанные с сорбентом молекулы белка были элюированы буфером с pH 3,5 (8М мочевина, 0,2М уксусная кислота; pH 3,5) (6 мл). Фракции, полученные после обработки колонки буферами с pH 5,9 и ниже, собирались и анализировались с помощью электрофореза в 8-20% ДСН-ПААГ. Для этого по 5 мкл раствора каждой из фракций было смешано с 15 мкл буфера для нанесения на гель и после инкубации в течение 5 минут при 96°С весь объём пробы был нанесён в слот. На Фиг. 6 представлена электрофореграмма содержания rPA83m в различных фракциях. Основная часть белка элюируется буфером рН=4,5 (Фиг. 6, дорожки 4-6), тем не менее, фракции, полученные после промывки колонки буферами с рН=5,9 (Фиг. 6, дорожки 1-2) и рН=3,5 (Фиг. 6, дорожки 8-10), а также переходные фракции (Фиг. 6, дорожки 3 и 7) тоже содержат целевой белок rPA83m.

Очищенный белок rPA83m был переведён в водный раствор с помощью диализа. Диализ проводился в диализных мешках с диаметром 6 мм (каталожный номер 44139, «Servapor», Германия) или 16 мм (каталожный номер 44145, «Servapor», Германия) в течение 4 часов, со сменой воды каждый час при соотношении раствор белка/вода 1:250. Для диализа использовалась вода качества Milli-Q, полученная с помощью системы Simplicity UV (Millipore, США). Затем водный раствор белка был профильтрован с помощью шприцевых фильтрующих насадок CHROMAFIL® CA-20/25(S, 729024). Концентрация белка в итоговом препарате после фильтрации была измерена спектрофотометрически с помощью бескюветного спектрофотометра Nanodrop 2000 («Thermo Scientific», США) и составляла от 0,3 мг/мл до 0,75 мг/мл для различных фракций. Суммарный выход белка в среднем составил 12 мг rPA83m в перерасчёте на 1 литр культуры E. coli.

rPA83m непосредственно после диализа, а так же после фильтрации был проанализирован с помощью электрофореза 8-20% ДСН-ПААГ. Для этого равный объем соответствующего препарата до и после фильтрации был смешан с 15 мкл буфера для нанесения на гель и после инкубации в течение 5 минут при 96°С весь объём пробы был нанесён в слот. Для проведения анализа были использованы маркеры молекулярной массы PageRuler™ Plus Prestained Protein Ladder (10-250 кДа) («Thermo Fisher Scientific», США) (Фиг. 7, дорожка М). На электофореграмме (Фиг.7) как для препарата белка после диализа (Фиг. 7, дорожка 1), так и для препарата после фильтрации (Фиг. 7, дорожка 2) отчётливо выявляется полоса, соответствующая белку rPA83m. Эта полоса располагается между полосами маркеров с подвижностью, соответствующей молекулярным массам 70 кДа и 100 кДа (Фиг. 7, дорожка М), что согласуется с расчётной молекулярной массой rPA83m, полученной c использованием программы ProtParam (http://www.expasy.org), которая составляет 84 кДа. Также представленная на Фиг. 7 электрофореграмма демонстрирует, что содержание белка в пробе не меняется после фильтрации.

Пример 4.

Анализ антигенных свойств рекомбинантного модифицированного протективного антигена сибирской язвы (rPA83m) методом иммуноблот анализа

При помощи метода вестерн-блот анализа была исследована способность очищенного препарата rPA83m взаимодействовать с поликлональной антисывороткой к рекомбинантному немодифицированному rPA83 (Фиг. 8Б), а также с химерными моноклинальными нейтрализующими антителами к РА (Панина А.А., Алиев Т.К., Топорова В.А., Шемчукова О.Б., Бикетов С.Ф., Долгих Д.А., Свешников П.Г. Нейтрализующие антитела против компонентов экзотоксина Bacillus anthracis // Тезисы докладов V Российского симпозиума «Белки и пептиды». 2011. С. 80) (Фиг. 8В). В качестве положительного контроля был использован немодифицированный рекомбинантный rPA63 (фрагмент РА массой 63 кДа, образующийся после протеолиза фурином и включающий 167-735 а.о.). В качестве отрицательного контроля были использованы препарат вируса табачной мозаики (ВТМ) и лизат клеток E. coli, не содержащих последовательности, кодирующие белки сибирской язвы. В качестве стандартов молекулярной массы был использован набор окрашенных маркерных белков Precision Plus Protein™ Dual Xtra («Bio-Rad», США). Белки фракционировали в градиентном 8-20% ПААГ. Электрофоретический анализ препаратов белков, анализируемых методом вестерн-блота, представлен на Фиг. 8А.

Вестерн-блот анализ был проведён, как описано в примере 2. Однако в качестве первичных антител кроме мышиной поликлональной антисыворотки к немодифицированному рекомбинантному rPA83 (разведение 1:5000 в 5% растворе сухого молока в буфере tTBS) (Фиг. 8Б) также были использованы химерные моноклональные антитела к РА, которые обладают нейтрализующей активностью (разведение 1:5000 в 5% растворе сухого молока в буфере tTBS) (Фиг. 8В). Для детекции связывания белков с первичными антителами использовались конъюгированные с пероксидазой хрена вторичные антитела к иммуноглобулинам мыши («Jackson Immunoresearch», разведение 1:10000 в 5% растворе сухого молока в буфере tTBS), или к иммуноглобулинам человека («HyTest», разведение 1:10000 в 5% растворе сухого молока в буфере tTBS).

Исходя из результатов, представленных на Фиг. 8 отчётливо видно, что rPA83m эффективно узнается как антисывороткой к немодифицированному белку rPA83 (Фиг. 8Б, дорожка 1), так и моноклональными антителами к РА (Фиг. 8В, дорожка 1). Взаимодействие с отрицательными контролями - ВТМ и лизатом E. coli - не наблюдается (Фиг. 8А, 8Б, 8В, дорожки 2 и 4), что подтверждает специфичность взаимодействия. Таким образом, мутации в сайтах протеолиза и дезаминирования, повышающие стабильность белка, не влияют на способность взаимодействия не только с поликлональной аснтисывороткой, но и с моноклональными антителами, способными к нейтрализации РА. Специфическое взаимодействие присутствующих в препарате rPA83m белков с большей электрофоретической подвижностью (Фиг. 8Б, 8В, дорожка 1) с обоими вариантами первичных антител свидетельствует о том, что эти белки являются антигенно-активными фрагментами rPA83m, а не чужеродными примесями белковой природы. Более того, в препарате положительного контроля rPA63 подобные деградированные формы белка превалируют (Фиг. 8А, 8Б, 8В, дорожка 3), в то время как в препарате rPA83m (Фиг. 8А, 8Б, 8В, дорожка 1) доминирует полноразмерный белок, что свидетельствует о его более высокой стабильности.

Пример 5.

Анализ стабильности рекомбинантного модифицированного протективного антигена сибирской язвы (rPA83m) при температурах +4°С и +25°С

Стабильность рекомбинантного модифицированного протективного антигена сибирской язвы (rPA83m) была исследована при температурах +4°С и +25°С. +4°С - стандартная температура для хранения вакцинных препаратов. Выбор комнатной температуры (+25°С) для анализа стабильности обусловлен тем, что подобные температурные значения могут достигаться при нарушении холодовой цепи при транспортировке и хранении вакцинных препаратов.

Для анализа стабильности проводилась инкубация в соответствующих температурных условиях образцов rPA83m с концентрацией 0,1 мг/мл, приготовленных в растворе 1-кратного фосфатно-солевого буфера (phosphate buffer saline, PBS). Каждый образец имел объем 10 мкл и, соответственно, содержал 1 мкг rPA83m. В эксперименте при +4°С оценка степени деградации белка производилась каждые 12 дней, а при +25°С - каждые 7 дней. Оба эксперимента были проведены в пяти аналитических повторностях. Стабильность белка оценивалась с помощью электрофоретического анализа в 8-20% ДСН-ПААГ путём сравнения с контрольными образцами, приготовленными аналогичным образом, но не подвергавшимися инкубации. Для электрофоретического анализа к каждому образцу было добавлено 10 мкл буфера для нанесения на гель, затем после инкубации при 95°С в течение 5 мин все содержимое пробы было внесено в слот. На каждом геле было проанализировано по два контрольных и по пять опытных (подверженных инкубации при +4°С или при +25°С в течение определённого числа дней) образцов. С помощью программы Image Lab системы гель-документирования ChemiDoc XRS+ («Bio-RAD», США) было рассчитано относительное содержание полноразмерной формы rPA83m в проинкубированных образцах по сравнению с контрольными образцами, содержание rPA83m в которых составляет 1 мкг, что было принято за 100%.

При инкубации при +4°С не было детектировано изменение количества полноразмерного rPA83m по сравнению с контрольными образцами. На Фиг. 9 представлен электрофоретический анализ образцов проинкубированных в течение 264 дней при +4°C, который демонстрирует, что в контрольных (Фиг. 9, дорожки 1-2) и опытных образцах (Фиг. 9, дорожки 3-7) полосы соответствующие полноразмерному rPA83m, сопоставимы. Таким образом, rPA83m остаётся стабильным после инкубации при +4°C как минимум в течение 264 дней (не было проведено анализа образцов проинкубированных в течение более длительного времени).

При +25°С наблюдалось снижение количества rPA83m в образцах при хранении. График, изображённый на Фиг. 10, отражает относительное содержание полноразмерного rPA83m в образцах в зависимости от времени инкубации при +25°С. Тем не менее, даже после 63 дней инкубации при +25°С около 50% rPA83m в составе образцов оставалось в не деградированной форме, что свидетельствует о достаточно высокой стабильности rPA83m по сравнению с немодифицированным rPA83 (Ryabchevskaya et al., 2021).

--->

ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110> Федеральное государственное бюджетное образовательное

учреждение высшего профессионального образования

"Московский государственный университет имени М.В.Ломоносова" (МГУ)

<120> СТАБИЛЬНЫЙ РЕКОМБИНАНТНЫЙ ПРОТЕКТИВНЫЙ АНТИГЕН ДЛЯ ВАКЦИНЫ

ПРОТИВ СИБИРСКОЙ ЯЗВЫ

<160> SEQ ID № 1

<210> 1

<211> 2247

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 1

1 ATGAGAGGAT CGCATCACCA TCACCATCAC GGATCCGAAG TGAAACAGGA

51 AAACCGTCTG CTGAACGAAA GCGAATCCAG CTCTCAGGGC CTGCTGGGCT

101 ATTACTTCAG CGATCTGAAC TTTCAGGCTC CGATGGTTGT GACCAGCTCT

151 ACCACCGGTG ATCTGAGCAT TCCGAGCTCT GAACTGGAAA ACATTCCGAG

201 CGAAAACCAG TACTTTCAGT CTGCGATTTG GTCTGGCTTC ATCAAAGTGA

251 AAAAATCTGA TGAATACACC TTTGCGACCT CTGCTGACAA CCATGTGACC

301 ATGTGGGTGG ACGATCAGGA AGTGATCAAC AAAGCGAGCA ACAGCAACAA

351 AATTCGTCTG GAAAAAGGTC GTCTGTATCA GATCAAAATT CAGTATCAGC

401 GTGAAAATCC GACCGAAAAA GGTCTGGACT TCAAACTGTA TTGGACCGAT

451 AGCCAGAACA AAAAAGAAGT GATTAGCAGC GACAACCTGC AGCTGCCGGA

501 ACTGAAACAG AAATCCAGCC AGTCTAGCAA CAAAGAATCT ACCAGCGCTG

551 GTCCGACCGT TCCGGATCGT GATAACGATG GCATTCCGGA TAGCCTGGAA

601 GTGGAAGGCT ACACCGTGGA TGTGAAAAAC AAACGCACCT TTCTGTCTCC

651 GTGGATCAGC AACATTCATG AAAAGAAAGG CCTGACCAAA TACAAAAGCT

701 CTCCGGAAAA ATGGAGCACT GCGTCTGATC CGTATAGCGA TTTTGAAAAA

751 GTGACCGGTC GCATTGACAA AAACGTGAGC CCGGAAGCAC GTCATCCGCT

801 GGTTGCAGCG TATCCGATTG TGCATGTGGA CATGGAAAAC ATCATTCTGA

851 GCAAAAACGA AGATCAGAGC ACCCAGAACA CCGATTCTCA GACCCGTACC

901 ATTAGCAAAA ACACCTCTAC CTCTCGCACC CACACCAGCG AAGTGCATGG

951 CAACGCGGAA GTGCATGCGT CTGACATTGG TGGCAGCGTG AGCGCAGGCT

1001 TTAGCAACAG CAACTCCAGC ACCGTGGCGA TTGATCATTC TCTGAGCCTG

1051 GCAGGTGAAC GCACCTGGGC TGAAACCATG GGTCTGAACA CAGCAGATAC

1101 AGCTCGTCTG AACGCTAACA TCCGCTATGT GAACACCGGC ACAGCACCGA

1151 TCTACAACGT TCTGCCGACC ACCAGCCTGG TGCTGGGCAA AAACCAGACC

1201 CTGGCGACCA TCAAAGCGAA AGAAAACCAG CTGTCTCAGA TTCTGGCACC

1251 GAACAACTAC TATCCGAGCA AAAACCTGGC TCCGATTGCG CTGAACGCAC

1301 AGGATGACTT CTCTAGCACC CCGATCACCA TGAACTACAA CCAGTTTCTG

1351 GAACTGGAAA AAACCAAACA GCTGCGTCTG GATACCGATC AGGTGTATGG

1401 CAACATTGCG ACCTACAACT TTGAAAACGG TCGCGTTCGT GTGGATACCG

1451 GCAGCAACTG GTCTGAAGTG CTGCCGCAGA TTCAGGAAAC CACCGCTCGT

1501 ATCATCTTCA ACGGTAAAGA CCTGAACCTG GTTGAACGTC GTATCGCTGC

1551 TGTTAACCCG AGTGACCCGC TGGAAACCAC CAAACCGGAC ATGACCCTGA

1601 AAGAAGCACT GAAAATCGCT TTCGGTTTCA ACGAACCGAA CGGTAACCTG

1651 CAGTACCAGG GTAAAGACAT CACCGAATTC GACTTCAACT TCGACCAGCA

1701 GACCTCTCAG AACATCAAAA ACCAGCTGGC TGAACTGAAC GCTACCAACA

1751 TCTACACCGT TCTGGACAAA ATCAAACTGA ACGCTAAAAT GAACATCCTG

1801 ATCCGTGACA AACGTTTCCA CTACGACCGT AACAACATCG CTGTTGGTGC

1851 TGACGAATCT GTTGTTAAAG AAGCTCACCG TGAAGTTATC AACTCTTCTA

1901 CCGAAGGTCT GCTGCTGAAC ATCGACAAAG ACATCCGTAA AATCCTGTCT

1951 GGTTACATTG TTGAAATCGA AGACACCGAA GGTCTGAAAG AAGTTATCAA

2001 CGACCGTTAC GACATGCTGA ACATCTCTTC TCTGCGTCAG GACGGTAAAA

2051 CCTTCATCGA CTTCAAAAAA TACAACGACA AACTGCCGCT GTACATCTCT

2101 AACCCGAACT ACAAAGTTAA CGTTTACGCT GTTACCAAAG AAAACACCAT

2151 CATCAATCCG TCTGAACAGG GTGACACCTC TACCCAGGGT ATCAAGAAAA

2201 TCCTGATCTT CTCCAAAAAA GGTTACGAAA TCGGTAAGCT TAATTAG

<160> SEQ ID № 2

<210> 2

<211> 748

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 2

1 MRGSHHHHHH GSEVKQENRL LNESESSSQG LLGYYFSDLN FQAPMVVTSS

51 TTGDLSIPSS ELENIPSENQ YFQSAIWSGF IKVKKSDEYT FATSADNHVT

101 MWVDDQEVIN KASNSNKIRL EKGRLYQIKI QYQRENPTEK GLDFKLYWTD

151 SQNKKEVISS DNLQLPELKQ KSSQSSNKES TSAGPTVPDR DNDGIPDSLE

201 VEGYTVDVKN KRTFLSPWIS NIHEKKGLTK YKSSPEKWST ASDPYSDFEK

251 VTGRIDKNVS PEARHPLVAA YPIVHVDMEN IILSKNEDQS TQNTDSQTRT

301 ISKNTSTSRT HTSEVHGNAE VHASDIGGSV SAGFSNSNSS TVAIDHSLSL

351 AGERTWAETM GLNTADTARL NANIRYVNTG TAPIYNVLPT TSLVLGKNQT

401 LATIKAKENQ LSQILAPNNY YPSKNLAPIA LNAQDDFSST PITMNYNQFL

451 ELEKTKQLRL DTDQVYGNIA TYNFENGRVR VDTGSNWSEV LPQIQETTAR

501 IIFNGKDLNL VERRIAAVNP SDPLETTKPD MTLKEALKIA FGFNEPNGNL

551 QYQGKDITEF DFNFDQQTSQ NIKNQLAELN ATNIYTVLDK IKLNAKMNIL

601 IRDKRFHYDR NNIAVGADES VVKEAHREVI NSSTEGLLLN IDKDIRKILS

651 GYIVEIEDTE GLKEVINDRY DMLNISSLRQ DGKTFIDFKK YNDKLPLYIS

701 NPNYKVNVYA VTKENTIINP SEQGDTSTQG IKKILIFSKK GYEIGKLN

<---

1. Модифицированный полноразмерный рекомбинантный протективный антиген rPA83m для профилактической вакцины против сибирской язвы, представляющий собой белок, кодируемый нуклеотидной последовательностью Seq ID № 1 и имеющий последовательность аминокислот Seq ID № 2, включающую аминокислотную последовательность протективного антигена Bacillus anthracis со следующими модификациями: 1) замена 164NSRKKR167 на 164QSSNKE167, 2) делеция 313FF314 и 3) замена Asn713 и Asn719 на Gln713 и Gln719, которые обеспечивают его повышенную стабильность при хранении.

2. Рекомбинантный вектор pQE-rPA83m, содержащий нуклеотидную последовательность Seq ID № 1 и обеспечивающий экспрессию рекомбинантного антигена rPA83m по п.1 в клетках Escherichia coli.