Состав пневмококковой конъюгатной вакцины

Изобретение относится к составу пневмококковой конъюгатной вакцины для индукции иммунного ответа против Streptococcus pneumoniae. Состав содержит 15-валентную пневмококковую конъюгатную композицию, состоящую по существу из полисахарида S. pneumoniae серотипов 1, 3, 4, 5, 6А, 6В, 7F, 9V, 14, 18С, 19А, 19F, 22F, 23F и 33F, причем каждый серотип конъюгирован с CRM₁₉₇, 20 мМ гистидина, рН 5,8, 150 мМ NaCl, 250 мкг/мл фосфат-алюминиевого адъюванта (APA) и 0,2% мас./об. полисорбата-20 (PS-20). Состав содержит 4 мкг/мл каждого серотипа, за исключением 6B, количество которого составляет 8 мкг/мл, и 64 мкг/мл CRM₁₉₇. Конъюгаты, содержащие серотипы 6A, 6B, 7F, 18C, 19A, 19F и 23F, получены в условиях ДМСО, а конъюгаты, содержащие серотипы 1, 3, 4, 5, 9V, 14, 22F и 33F, получены в водных условиях. Изобретение обеспечивает раствор состава, устойчивый к физической нестабильности или агрегации, возникающей во время обычного процесса производства, транспортировки и обработки. 16 ил., 9 табл., 14 пр.

 

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ, К КОТОРОЙ ОТНОСИТСЯ ИЗОБРЕТЕНИЕ

Настоящее изобретение относится к составам пневмококковой конъюгатной вакцины, содержащим поверхностно-активные системы, включающие полисорбат 20 или комбинацию полоксамера и полиола.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Streptococcus pneumoniae, один из примеров инкапсулированной бактерии, является важной причиной серьезных заболеваний во всем мире. Согласно оценке Центров по контролю и профилактике заболеваний (CDC) в США 1997 года, ежегодно регистрируются 3000 случаев пневмококкового менингита, 50000 случаев пневмококковой бактериемии, 7000000 случаев пневмококкового среднего отита и 500000 случаев пневмококковой пневмонии. См. Centers for Disease Control and Prevention, MMWR Morb Mortal Wkly Rep 1997, 46(RR-8):1-13. К тому же эти заболевания могут приводить осложнения этих заболеваний могут сопровождаться серьезными осложнениями: так в некоторых исследованиях сообщалось о 8% смертности и 25% неврологических осложнений при пневмококковом менингите. См. Arditi et al., 1998, Pediatrics 102: 1087-97.

Лицензированные мультивалентные пневмококковые полисахаридные вакцины в течение многих лет оказывают неоценимый вклад в профилактику пневмококковых заболеваний у взрослых, особенно пожилых людей и лиц с высоким риском. Однако младенцы и маленькие дети плохо реагируют на неконъюгированные пневмококковые полисахариды. Бактериальные полисахариды являются Т-клеточно-независимыми иммуногенами, вызывающими слабый ответ или вовсе не вызывающими ответной реакции у детей. Химическая конъюгация бактериального полисахаридного иммуногена с белком-носителем превращает иммунный ответ у детей в Т-клеточно-зависимый ответ. Дифтерийный анатоксин (DTx, химически детоксифицированная версия DT) и CRM197 были описаны как белки-носители для бактериальных полисахаридных иммуногенов благодаря наличию в их аминокислотных последовательностях эпитопов, стимулирующих Т-клетки.

Пневмококковая конъюгатная вакцина Prevnar®, содержащая 7 наиболее часто выделяемых серотипов (4, 6B, 9V, 14, 18C, 19F и 23F), вызывающих инвазивное пневмококковое заболевание у детей младшего возраста и младенцев, была впервые лицензирована в США в феврале 2000 г. После широкого применения препарата Prevnar® на территории США частота возникновения пневмококкового заболевания у детей значимо снизилась благодаря серотипам, присутствующим в Prevnar®. См. Centers for Disease Control and Prevention, MMWR Morb Mortal Wkly Rep 2005, 54(36):893-7. Тем не менее, в некоторых регионах мира охват серотипов препаратом Prevnar® ограничен, и имеются некоторые свидетельства появления в США нескольких новых серотипов (например, 19A и другие). См. O'Brien et al., 2004, Am J Epidemiol 159:634-44; Whitney et al., 2003, N Engl J Med 348:1737-46; Kyaw et al., 2006, N Engl J Med 354:1455-63; Hicks et al., 2007, J Infect Dis 196:1346-54; Traore et al., 2009, Clin Infect Dis 48:S181-S189.

Prevnar 13® представляет собой 13-валентную пневмококковую полисахарид-белковую конъюгатную вакцину, включающую серотипы 1, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19A, 19F и 23F. См., например, публикацию заявки на патент США № US 2006/0228380 A1, Prymula et al., 2006, Lancet 367:740-48 и Kieninger et al., Safety and Immunologic Non-inferiority of 13-valent Pneumococcal Conjugate Vaccine Compared to 7-valent Pneumococcal Conjugate Vaccine Given as a 4-Dose Series in Healthy Infants and Toddlers, presented at the 48th Annual ICAAC/ISDA 46th Annual Meeting, Washington DC, October 25-28, 2008. См. также Dagan et al., 1998, Infect Immun. 66:2093-2098 и Fattom, 1999, Vaccine 17:126.

В публикации заявки на патент Китая № CN 101590224 A описана 14-валентная пневмококковая полисахарид-белковая конъюгатная вакцина, включающая серотипы 1, 2, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 9N, 9V, 14, 18C, 19A, 19F и 23F.

В патенте США № US 8192746 описана 15-валентная пневмококковая полисахарид-белковая конъюгатная вакцина, имеющая серотипы 1, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19A, 19F, 22F, 23F и 33F, все независимо конъюгированные с полипептидами CRM₁₉₇.

Также описаны многочисленные белковые системы-носители. См., например, публикации заявок на патент США № 20100209450, 20100074922, 20090017059, 20090010959 и 20090017072.

Раскрыты составы, содержащие S. pneumoniae полисахарид-белковые конъюгаты и поверхностно-активные вещества, включая полисорбат 80 (PS-80) и полоксамер 188 (P188). См. патент США № 8562999 и публикацию заявки на патент США № US20130273098, соответственно.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение относится к составу, содержащему (i) один или более полисахарид-белковых конъюгатов; (ii) рН-забуференный солевой раствор, имеющий рН в диапазоне от 5,0 до 7,5; (iii) соль алюминия; и (iv) поверхностно-активную систему, выбранную из а) полисорбата 20 и (b) полоксамера, имеющего молекулярную массу в диапазоне от 1100 Да до 17400 Да, и полиола, выбранного из пропиленгликоля (ПГ) и полиэтиленгликоля (ПЭГ) 400.

В некоторых вариантах осуществления один или более полисахарид-белковых конъюгатов получают в апротонном растворителе, например диметилсульфоксиде (ДМСО). В некоторых аспектах этого варианта осуществления 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 60%, 70%, 80% или 90% или более конъюгатов (на основе общего белка) получают в апротонном растворителе, таком как ДМСО. Альтернативно, 10-100%, 24-100% или 24-80% конъюгатов (на основе общего белка) получают в апротонном растворителе, например ДМСО. В некоторых аспектах этих вариантов осуществления поверхностно-активная система представляет собой полисорбат 20 или комбинацию полоксамер/полиол, как описано выше.

В некоторых вариантах осуществления поверхностно-активная система включает полоксамер, который имеет молекулярную массу в диапазоне от 1100 Да до 17400 Да, от 7500 Да до 15000 Да или от 7500 Да до 10000 Да. Полоксамер может представлять собой полоксамер 188 или полоксамер 407. В некоторых аспектах конечная концентрация полоксамера находится в пределах от 0,001% до 5% мас./об., от 0,025% до 1% мас./об. В конкретном аспекте полиол представляет собой пропиленгликоль с конечной концентрацией от 1 до 20% мас./об. В другом конкретном аспекте полиол представляет собой полиэтиленгликоль 400 с конечной концентрацией от 1% до 20% мас./об. В некоторых вариантах осуществления поверхностно-активная система содержит полисорбат 20. В некоторых аспектах конечная концентрация полисорбата 20 находится в диапазоне от 0,001% до 10% мас./об. или от 0,025% до 2,5% мас./об., или от 0,025% до 0,1% мас./об. В некоторых аспектах, в которых поверхностно-активная система включает PS-20, композиция дополнительно содержит полиол, выбранный из пропиленгликоля и полиэтиленгликоля. Полиэтиленгликоль или пропиленгликоль могут иметь конечную концентрацию от 6 до 20% мас./об. В некоторых вариантах осуществления полиэтиленгликоль представляет собой полиэтиленгликоль 400.

В некоторых вариантах осуществления рН забуференного солевого раствора может находиться в диапазоне от 5,0 до 7,0. Буфер может быть выбран из группы, состоящей из фосфата, сукцината, L-гистидина, MES, MOPS, HEPES, ацетата или цитрата. В одном из аспектов буфер представляет собой L-гистидиновый буфер с конечной концентрацией от 5 мМ до 50 мМ или сукцинатный с конечной концентрацией от 1 мМ до 10 мМ. В конкретном аспекте L-гистидин находится в конечной концентрации 20 мМ ± 2 мМ. Соль в рН-забуференном солевом растворе может представлять собой хлорид магния, хлорид калия, хлорид натрия или их комбинацию. В одном из аспектов рН-забуференный солевой раствор представляет собой хлорид натрия. Солевой раствор может присутствовать в концентрации от 20 мМ до 170 мМ.

В некоторых вариантах осуществления полисахарид-белковые конъюгаты содержат один или более пневмококковых полисахаридов, конъюгированных с белком-носителем. В определенных аспектах белок-носитель выбирают из CRM₁₉₇, фрагмента B дифтерийного токсина (DTFB), DTFB C8, дифтерийного анатоксина (DT), столбнячного анатоксина (TT), фрагмента C TT, коклюшного анатоксина, холерного анатоксина, LT (термолабильного энтеротоксина) E.coli, ST (термостабильного энтеротоксина) E.coli, экзотоксина А Pseudomonas aeruginosa и их комбинации. В одном из конкретных аспектов один или более полисахарид-белковых конъюгатов конъюгированы с CRM₁₉₇. В некоторых аспектах один или более полисахарид-белковых конъюгатов получают по реакции восстановительного аминирования в неводном растворителе ДМСО. В этом аспекте полисахарид-белковые конъюгаты серотипов 6A, 6B, 7F, 18C, 19A, 19F и 23F могут быть получены по реакции восстановительного аминирования в ДМСО, а полисахарид-белковые конъюгаты серотипов 1, 3, 4, 5, 9V, 14, 22F и 33F могут быть получены по реакции восстановительного аминирования в водном растворе. В некоторых аспектах каждая доза составлена таким образом, чтобы она содержала 4 мкг/мл или 8 мкг/мл каждого сахарида, за исключением 6B, количество которого составляет 8 мкг/мл или 16 мкг/мл; и примерно 64 мкг/мл или 128 мкг/мл белка-носителя CRM₁₉₇.

Настоящее изобретение также относится к 15-валентному пневмококковому конъюгатному составу, содержащему полисахариды S. pneumoniae серотипов 1, 3, 4, 5, 6А, 6В, 7F, 9V, 14, 18С, 19А, 19F, 22F, 23F и 33F, конъюгированные с полипептидом CRM₁₉₇, 20 мМ L-гистидина, 150 мМ NaCl, 0,2% (мас./об.) PS-20 и 250 мкг/мл APA. В некоторых аспектах состав готовят в виде дозированной формы, содержащей 4 мкг/мл или 8 мкг/мл каждого сахарида, за исключением 6B, количество которого составляет 8 мкг/мл или 16 мкг/мл; и примерно 64 мкг/мл или 128 мкг/мл белка-носителя CRM₁₉₇. В некоторых аспектах полисахарид-белковые конъюгаты серотипов 6А, 6В, 7F, 18С, 19А, 19F и 23F получают в условиях ДМСО, а полисахарид-белковые конъюгаты серотипов 1, 3, 4, 5, 9V, 14, 22F и 33F получают в водных условиях.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

Фиг. 1A-D: SDS-PAGE анализ промежуточных продуктов процесса DTFB в нередуцирующих условиях. A: Представленные образцы представляют собой: стандарты молекулярной массы (дорожка 1 слева); продукт элюции из трех повторных циклов анионообменной мультимодальной хроматографии (MM AEX1, MM AEX2, MM AEX3, дорожки 2-4); объединенный продукт элюции из циклов анионообменной мультимодальной хроматографии (пул MM AEX, дорожка 5); диафильтрованный ретентат (UF-DR, дорожка 6); и конечное объемное промежуточное соединение после фильтрации через 0,2-микронный фильтр (FBI, дорожка 7). SDS PAGE: NuPAGE 4-12% бис-трис-гель; 5 мкг/дорожка; окрашивание геля красителем SYPRO Ruby для белков. B: SDS-PAGE анализ (NuPAGE 4-12% бис-трис-гель; дорожки 2, 4, 8, 10: 5 мкг/дорожка; дорожка 6: 2 мкг/дорожка; окрашивание геля красителем SYPRO Ruby для белков) промежуточных соединений процесса DTFB в редуцирующих условиях. Показаны следующие образцы: стандарты Mark-12 (дорожки 1 и 12); очищенный CRM₁₉₇, используемый для генерации DTFB (CRM₁₉₇, дорожки 2 и 10); протеолитически расщепленный CRM₁₉₇ после стадии расщепления трипсином, загруженный в смолу для катионообменной мультимодальной хроматографии (загрузка MM CEX, дорожка 4); продукт катионообменной мультимодальной хроматографии (продукт MM CEX, дорожка 6); и конечное объемное промежуточное соединение после фильтрации через 0,2-микронный фильтр (DTFB-FBI, дорожка 8). C: Показаны следующие образцы: маркеры молекулярной массы (дорожка 1 слева); исходный концентрированный ретентат после катионообменной мультимодальной хроматографии (ICR, дорожка 2); диафильтрованный ретентат (UF-DR, дорожка 3); концентрированный ретентат после диафильтрации (UF-OCR, дорожка 4); промывка мембраны для извлечения продукта (UF-W, дорожка 5); конечный объединенный ретентат плюс промывка (UF-FR, дорожка 6); и конечное объемное промежуточное соединение после фильтрации через 0,2-микронный фильтр (FBI, дорожка 6). SDS-PAGE: 14% трис-глициновый гель; 8,3-8,4 мкг/дорожка; окраска геля красителем GelCode Blue для белков. D: SDS-PAGE анализ (NuPAGE 4-12% бис-трис-гель; окраска геля красителем SYPRO Ruby для белков) промежуточных продуктов после процесса DTFB в редуцирующих условиях. Показаны следующие образцы: стандарты Mark-12 (дорожки 1 и 12); протеолитически расщепленный CRM₁₉₇ после стадии расщепления трипсином, загруженный в смолу для катионообменной мультимодальной хроматографии (загрузка MM CEX, дорожка 2); очищенный CRM₁₉₇, используемый для генерации DTFB (CRM₁₉₇, дорожка 3); фильтрат, полученный при загрузке колонны (MM CEX фильтрат, дорожка 4); промывка колонки после загрузки (MM CEX промывка, дорожка 5); продукт, собранный после стадии элюирования из катионообменной мультимодальной хроматографии (продукт MM CEX, дорожка 7; 10-кратно разбавленный продукт MM CEX, дорожка 9); и продукт позднего элюирования, собранный после стадии элюирования катионообменной из мультимодальной хроматографии (продукт MM CEX позднего элюирования, дорожка 11).

Фиг. 2: Концентрация белка DTFB в 100 мМ фосфате калия (KPi) в зависимости от значения рН и концентрации хлорида натрия (NaCl). Растворы выдерживали в течение ночи при комнатной температуре и затем центрифугировали. Супернатанты анализировали с помощью гель-проникающей (эксклюзионной) хроматографии с определением оптической плотности при UV280.

Фиг. 3: Концентрация белка DTFB в растворах фосфата калия (KPi) в зависимости от концентрации полисорбата 20 (PS-20). Растворы встряхивали в течение 5 минут при комнатной температуре и затем центрифугировали. Супернатанты анализировали с помощью гель-проникающей хроматографии с определением оптической плотности при UV280.

Фиг. 4: ИФА титры антител мышей, иммунизированных полисахаридом S. pneumoniae серотипа 3, конъюгированным с белком-носителем CRM₁₉₇ или DTFB в составе с фосфат-алюминиевым адъювантом (APA). Мышей иммунизировали одной из двух независимых партий конъюгата серотип 3-CRM₁₉₇ (партии 1 и 2).

Фиг. 5: Кривые выживания мышей, иммунизированных капсульным полисахаридом S. pneumoniae серотипа 3, конъюгированным с белком-носителем CRM₁₉₇ или DTFB в составе с фосфат-алюминиевым адъювантом (APA). Мышей иммунизировали одной из двух независимых партий конъюгата серотип 3-CRM₁₉₇ (партии 1 и 2). Составы, содержащие только АРА или солевой раствор, также были включены в исследование в качестве контроля. После иммунизации мышей внутрибрюшинно заражали бактериями серотипа 3.

Фиг. 6: Исследование перемешивания в лаборатории для оценки влияния времени и перемешивания на гранулометрический состав 15-валентного пневмококкового полисахаридного (PnPs) конъюгатного состава, измеренный методом статического рассеяния света (SLS). Все 15 серотипов пневмококкового полисахарида конъюгировали с CRM₁₉₇ по реакции восстановительного аминирования в водном растворе. Для исследования перемешивания конъюгаты готовили в 20 мМ L-гистидине, pH 5,8, 150 мМ NaCl и 0,25 мг/мл (мас./об. Al⁺³) APA.

Фиг. 7: Исследование перемешивания в лаборатории для оценки влияние времени и перемешивания на гранулометрический состав 15-валентного пневмококкового полисахаридного (PnPs) конъюгатного состава, измеренный методом статического рассеяния света (SLS). Все 15 серотипов пневмококковых полисахаридов конъюгировали с CRM₁₉₇ по реакции восстановительного аминирования в водном растворе. Для исследования перемешивания конъюгаты готовили в 20 мМ L-гистидине, pH 5,8, 150 мМ NaCl и 0,25 мг/мл (мас./об. Al⁺³) APA с 0,08% мас./об. или 0,24% мас./об. полоксамера 188 (P188).

Фигура 8А-В: Исследование транспортировки и обработки в масштабе лаборатории 15-валентных пневмококковых полисахаридных конъюгатных составов в шприцах. Все 15 серотипов пневмококковых полисахаридов конъюгировали с CRM₁₉₇ по реакции восстановительного аминирования в водном растворе. Конъюгаты готовили в 20 мМ L-гистидине, pH 5,8, 150 мМ NaCl и 0,25 мг/мл (мас./об. Al⁺³) APA без P188 или с 0,2% мас./об. P188. Показан гранулометрический состав, измеренный методом SLS до и после 24 часов горизонтального вращения (A) и визуальная оценка шприцев через 24 часов после горизонтального вращения (B).

Фиг. 9: Гранулометрический состав (выраженный в виде взвешенного по объему распределения или D[4,3], измеренного методом SLS) двух 15-валентных пневмококковых полисахаридных конъюгатых составов с 20 мМ L-гистидином, pH 5,8, 150 мМ NaCl, 0,25 мг/мл (мас./об. Al⁺³) APA и 0,2% мас./об. P188. Состав PCV15_Aq состоял из конъюгатов пневмококковый полисахарид-CRM₁₉₇, полученных по реакции восстановительного аминирования в водном растворе. В составе PCV15_{Aq/Non-Aq/ST3-DTFB} использовали комбинацию 15 пневмококковых полисахаридных конъюгатов, некоторые из которых получали по реакции восстановительного аминирования в водном растворе, а другие - по реакции восстановительного аминирования в неводном растворе; все серотипы пневмококкового полисахарида в PCV15_{Aq/Non-Aq/ST3-DTFB} были конъюгированы с CRM₁₉₇, за исключением серотипа 3 (ST3), который был конъюгирован с DTFB. Составы заливали в шприцы и перед проведением оценки методом SLS горизонтально перемешивали в течение до 24 часов при 4°C.

Фиг. 10A-B: измеренные методом SLS значения D[4,3] составов PCV_{15Aq/Non-Aq/ST3-DTFB}, содержащих P188 (A), PS-80 (B) и PS-20 (A, B), после перемешивания и перед 24-часовым горизонтальным вращением в 1,5 мл шприцах HyPak.

Фиг. 11: Концентрации IgG, специфичных к пневмококковому серотипу 3, у новорожденных макак-резус (IRM), иммунизированных 15-валентными пневмококковыми полисахаридными конъюгатными составами с фосфат-алюминиевым адъювантом (APA). Все составы содержали капсульный полисахарид S. pneumoniae серотипа 3 (ST3), конъюгированный с CRM₁₉₇ или DTFB. В составе PCV15_Aq/Non-Aq использовали комбинацию из 15 конъюгатов пневмококковый полисахарид-CRM₁₉₇, некоторые из которых получали по реакции восстановительного аминирования в водном растворе, а другие - по реакции восстановительного аминирования в неводном растворе. Составы PCV15 содержали 0,2% мас./об. P188 или 0,1% мас./об. PS-20, как указано на фиг.

Фиг. 12: OPA (OPK) титры серотипа 3 младенцев макак-резусов, иммунизированных двумя 15-валентными пневмококковыми полисахаридными конъюгатными вакцинами в составе с фосфат-алюминиевым адъювантом (APA) и 0,2% мас./об. P188. Составы содержали капсульный полисахарид S. pneumoniae серотипа 3 (ST3), конъюгированный либо с CRM₁₉₇ (PCV15_Aq), либо с DTFB (PCV15_{Aq/Non-Aq/ST3-DTFB}).

Фиг. 13A-C: Измеренный методом SLS гранулометрический состав составов PCV15_{Aq/Non-Aq/ST3-DTFB} через 1 час после перемешивания и перед 24 часовым горизонтальным вращением. Составы содержали 0,2% мас./об. полоксамера 188 и различные концентрации пропиленгликоля (ПГ) или полиэтиленгликоля 400 (ПЭГ400), как указано на чертежах.

Фиг. 14A-B: сравнительное исследование иммуногенности у младенцев макак-резус составов PCV15_{Aq/Non-AQ/ST3-DTFB}, содержащих либо 0,2% мас./об. P188 с 15% мас./об. ПГ, либо 0,1% мас./об. PS-20, как описано в пример 12. Восемь животных в группе получали внутримышечную инъекцию любого из двух составов в возрасте T=0 (доза 1), 1 месяц (доза 2) и 2 месяца (доза 3). Сыворотку собирали перед введением дозы 1 и через 2 недели после введения доз 1, 2 и 3. Концентрации специфического для серотипа IgG (GMC IgG) в образцах сыворотки до иммунизации, после введения дозы 1, после введения дозы 2 и после введения дозы 3 измеряли, как описано в примере 10. На панели A показаны результаты иммуногенности в отношении серотипов 1, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F и 9V. На панели B показаны результаты иммуногенности в отношении серотипов 14, 18C, 19A, 19F, 22F, 23F и 33F.

15A-E: измеренные методом SLS значения D[4,3] составов PCV_Aq/Non-Aq, как описано в примере 13, с различным процентным содержанием серотипов, полученных в ДМСО (панель A: 24%; панель B: 50%; панель С: 62%, панель D: 79% и панель E: 100%), содержащих 0,05% мас./об. PS-80, 0,05% мас./об. PS-20 и 0,2% мас./об. PS-20, после перемешивания и перед 24 часовым горизонтальным вращением в 1,5 мл шприцах HyPak.

Фиг. 16: Результаты иммуногенности у новозеландских белых кроликов 15-валентного пневмококкового конъюгатного состава с 20 мМ гистидином, pH 5,8, 150 мМ NaCl, 250 мкг/мл APA, 0,2% мас./об. PS-20, содержащего полисахариды S. pneumoniae серотипов 6A, 6B, 7F, 18C, 19A, 19F и 23F, конъюгированных с CRM₁₉₇ по реакции восстановительного аминирования в DMSO, и полисахариды S. pneumoniae серотипов 1, 3, 4, 5, 9V, 14, 22F и 33F, конъюгированных с CRM₁₉₇ по реакции восстановительного аминирования в водном растворе, приготовленного в виде лекарственной формы, содержащей по 4 мкг/мл каждого сахарида, за исключением 6B, количество которого составляло 8 мкг/мл; и примерно 64 мкг/мл белка-носителя CRM₁₉₇.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение отчасти основано на открытии того факта, что конкретное поверхностно-активное вещество в составах поливалентных конъюгатных вакцин может влиять на стабильность конъюгатов и их тенденцию к агрегации, особенно когда один или более конъюгатов получают в апротонном растворителе, таком как ДМСО. Кроме того, для достижения требуемой стабильности к некоторым поверхностно-активным веществам требуется добавление полиола.

Используемый в настоящем описании термин «протонный растворитель» представляет собой растворитель, у которого атом водорода связан с кислородом (как в гидроксильной группе) или азотом (как в аминогруппе). В общих чертах, любой растворитель, который содержит лабильный Н⁺, называется протонным растворителем.

Используемый в настоящем описании термин «апротонный растворитель» относится к полярному апротонному растворителю. Такие растворители не имеют кислого водорода и не могут отдавать водород. Примеры полярных апротонных растворителей включают, без ограничения, диметилсульфоксид (ДМСО), диметилформамид (ДМФА) и гексаметилфосфорамид (ГМФА). Неводный раствор или растворитель используются взаимозаменяемо с апротонным растворителем. Апротонный растворитель может содержать небольшое количество воды, например, до 1%, 2%, 5%, 10% или 20%.

Используемый в настоящем описании термин «полисахарид» (Ps) включает любой антигенный сахаридный элемент (или антигенную единицу), обычно используемый в области создания иммунологических и бактериальных вакцин, включая, без ограничения, «сахарид», «олигосахарид», «полисахарид», «липосахарид», «липо-олигосахарид (LOS)», «липополисахарид (LPS)», «гликозилат», «гликоконъюгат» и т.п.

Используемый в настоящем описании термин «содержит», в контексте иммуногенной композиции по изобретению, относится к включению любых других компонентов (при условии соблюдения ограничений, налагаемых фразой «состоящий из», для смеси антигенов), таких как адъюванты и наполнители. Термин «состоящий из», используемый в контексте смеси мультивалентного полисахарид-белкового конъюгата, относится к смеси, содержащей такие конкретные конъюгаты полисахарида S. pneumoniae с белком без каких-либо других конъюгатов полисахарида S. pneumoniae другого серотипа с белком.

Используемые в настоящем описании термины «осаждение», «осадок», «образование частиц», «помутнение» и «агрегация» могут использоваться взаимозаменяемо и предназначены для обозначения любого физического взаимодействия или химической реакции, которая приводит к агломерации полисахарид-белкового конъюгата. Процесс агрегации (например, агрегации белка) может быть вызван многочисленными физико-химическими стрессами, включая нагревание, давление, pH, перемешивание, силы сдвига, оттаивание, замораживание, дегидратацию, воздействие тяжелых металлов, фенольных соединений, силиконового масла, денатурирующих веществ и т.п.

Используемое в настоящем описании «поверхностно-активное вещество» представляет собой любую молекулу или соединение, которое уменьшает поверхностное натяжение состава иммуногенной композиции. «Поверхностно-активная система» включает поверхностно-активное вещество, но допускает включение дополнительных наполнителей, таких как полиолы, которые усиливают действие поверхностно-активного вещества.

Иммуногенная композиция по изобретению может представлять собой поливалентную композицию, содержащую один или более антигенов, конъюгированных с одним или более белками-носителями. В определенных вариантах осуществления изобретения антиген представляет собой сахарид инкапсулированных бактерий. В таких вакцинах сахариды состоят из длинных цепочек молекул сахара, которые имеют сходство с молекулами сахаров, присутствующих на поверхности определенных типов бактерий. Инкапсулированные бактерии включают, без ограничения, Streptococcus pneumoniae, Neisseria meningitides и Haemophilus influenzae типа b. Антигены могут быть из одного и того же организма или могут быть из разных организмов. В других вариантах осуществления изобретения антигенами являются капсульные полисахариды Streptococcus pneumoniae.

В вариантах осуществления, в которых используются два белка-носителя, каждый капсульный полисахарид, не конъюгированный с первым белком-носителем, конъюгирован с одним и тем же вторым белком-носителем (например, каждая молекула капсульного полисахарида конъюгирована с одним белком-носителем). В другом варианте осуществления капсульные полисахариды, не конъюгированные с первым белком-носителем, конъюгированы с двумя или более белками-носителями (каждая молекула капсульного полисахарида конъюгирована с одним белком-носителем). В таких вариантах осуществления каждый капсульный полисахарид одного и того же серотипа обычно конъюгирован с одним и тем же белком-носителем.

Дифтерийный токсин, экзотоксин, секретируемый Corynebacterium diphtheriae, представляет собой классический токсин A-B, состоящий из двух субъединиц (фрагментов), связанных дисульфидными мостиками, и содержит три домена. Фрагмент A (DTFA) содержит ответственный за ADP-рибозилирование каталитический C-домен, в то время как фрагмент B (DTFB) содержит T-домен, ответственный за центральную транслокацию, и R-домен, связывающий карбоксиконцевой рецептор. DTFB представляет собой нетоксичный фрагмент, составляющий примерно 60% общей аминокислотной последовательности DT. См., например, Gill, D. M. and Dinius, L. L., J. Biol. Chem., 246, 1485-1491 (1971), Gill, D. M. and Pappenheimer, Jr., A. M., J. Biol. Chem., 246, 1492-1495 (1971), Collier, R. J. and Kandel, J., J. Biol. Chem., 246, 1496-1503 (1971); и Drazin, R., Kandel, J., and Collier, R. J., J. Biol. Chem., 246, 1504-1510 (1971).

Опубликована полная аминокислотная последовательность дифтерийного токсина. См. Greenfield, L., Bjorn, M.J., Horn, G., Fong, D., Buck, G.A., Collier, R.J. and Kaplan, D.A., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80, 6853-6857 (1983). В частности, DTFB содержит аминокислотные остатки с 194 по 535 DT.

Белок-носитель CRM₁₉₇ представляет собой мутантную форму DT, которая становится нетоксичной в результате одной аминокислотной замены остатка 52 фрагмента A. Во фрагменте B CRM₁₉₇ и DT имеют полную гомологию последовательности. Основные эпитопы Т-клеток были обнаружены преимущественно в B фрагменте аминокислотной последовательности DT. См. Bixler et al., Adv Exp Med Biol. (1989) 251:175-80; Raju et al., Eur. J. Immunol. (1995) 25: 3207-3214; Diethelm-Okita et al., J Infect Dis (2000) 181:1001-9; и McCool et al., Infect. and Immun. 67 (Sept. 1999), p. 4862-4869.

Использование DTFB, как описано в настоящем документе, включает делеции в области дифтерийного токсина, ответственной за ADP-рибозилировани. Использование DTFB также включает варианты, имеющие по меньшей мере 90%, 95% или 99% идентичности последовательности, включая делеции, замены и добавления. Примером варианта является делеция или мутация цистеина 201. DTFB (C8) означает дифтерийный токсин, из которого удален домен, ответственный за ADP-рибозилирование, и цистеин 201 удален или мутирован. Использование DTFB также включает фрагменты, которые охватывают последовательность 265-450 DT, включающую опубликованные Т-клеточные эпитопы (см. Bixler et al., Adv Exp Med Biol. (1989) 251:175-80; Raju et al., Eur. J. Immunol. (1995) 25:3207-3214). DTFB также включает состояния мономера, димера или олигомеров. Использование DTFB также включает любой белковый комплекс (исключая полноразмерный DT или CRM₁₉₇), гибридные белки или конъюгированные белки, которые содержат DTFB или фрагменты. Использование DTFB также включает химически модифицированный DTFB или его фрагменты (т.е. пегилирование, неприродную модификацию аминокислот).

В некоторых вариантах осуществления DTFB получают путем ферментативного расщепления и восстановления нативного DT или мутанта CRM₁₉₇ с последующей очисткой с помощью адсорбционной хроматографии. Таким образом, предполагается, что очищенный DTFB с мутацией в остатке C201 DT или без нее может быть получен аналогичным образом из полноразмерного нативного или C201-мутированного DT или CRM₁₉₇ или из его вариантов, в которых A-фрагмент укорочен. В частности, известно, что мультимодальные смолы, продаваемые под торговыми марками Capto^ТМ Adhere и Capto^ТМ MMC, и концентрации Трис, выше 50 мМ в цикле хроматографии, обеспечивают исключительные способы очистки расщепленного нативного DTFB.

В некоторых вариантах осуществления препарат DTFB включает до 10 мМ DTT. DTT предотвращает димеризацию, вызванную образованием дисульфидной связи между мономерами DTFB, обусловленное присутствием свободного цистеина в положении остатка 201. В таких случаях в реакционную смесь не добавляют никель для обеспечения конъюгации. Однако, при прочих равных условиях, реакция конъюгации протекает по тому же методу. Если DTT не используется, димеризованный DTFB может быть конъюгирован с Ps в присутствии никеля для повышения степени конъюгации путем секвестрации остаточного ингибирующего цианида.

Ожидается, что удаление свободного цистеина (мутация C201 DT) в DTFB приведет к аналогичному поведению в мультимодальных смолах. Ожидается, что удаление свободного цистеина устранит необходимость в DTT, поскольку димеризация путем образования дисульфидной связи между свободным цистеином окажется невозможной. Было показано, что увеличение концентрации трис-буфера и концентрации элюирующего буфера с хлоридом натрия улучшает извлечение белка DTFB из хроматографической смолы Capto MMC. Очистку DTFB можно выполнять, используя других мультимодальных смол.

В некоторых вариантах осуществления выполняется рекомбинантная экспрессия DTFB с мутацией остатка C201 DT или без нее, который затем очищают различными методами, известными специалистам в данной области.

В конкретном варианте осуществления настоящего изобретения CRM₁₉₇ используется в качестве белка-носителя. CRM₁₉₇ представляет собой нетоксичный вариант (т.е., анатоксин) дифтерийного токсина. В одном из вариантов осуществления его выделяют из культур штамма Corynebacterium diphtheria C7 (β197), выращенных в казаминовых кислотах и среде на основе дрожжевого экстракта. В другом варианте осуществления CRM₁₉₇ получают рекомбинантно в соответствии со способами, описанными в патенте США № 5614382. Как правило, CRM₁₉₇ очищают с помощью комбинации ультрафильтрации, осаждения сульфатом аммония и ионообменной хроматографии. В некоторых вариантах осуществления CRM₁₉₇ получают в Pseudomonas fluorescens по технологии Pfenex Expression Technology™ (Pfenex Inc., Сан-Диего, Калифорния).

В качестве белка-носителя для антигенов могут быть использованы DTFB и его варианты, включая белок (пептиды) и сахариды. Другие подходящие белки-носители включают дополнительные инактивированные бактериальные токсины, такие как DT (дифтерийный анатоксин), TT (столбнячный анатоксин) или C-фрагмент TT, коклюшный анатоксин, холерный анатоксин (например, описанные в публикации международной заявки на патент № WO 2004/083251), LT E.coli, ST E.coli и экзотоксин A Pseudomonas aeruginosa. Также могут быть использованы белки наружной мембраны бактерий, такие как внешний мембранный комплекс c (OMPC), порины, трансферрин-связывающие белки, пневмококковый поверхностный белок A (PspA; см. публикацию международной заявки на патент № WO 02/091998), пневмококковый белок адгезин (PsaA), C5a пептидаза стрептококка группы A или группы B, или белок D Haemophilus influenzae, пневмококковый пневмолизин (Kuo et al., 1995, Infect Immun 63; 2706-13), включая некоторые ply, детоксифицированный любым образом, например dPLY-GMBS (см. публикацию международной заявки на патент № WO 04/081515) или dPLY-formol, PhtX, включая PhtA, PhtB, PhtD, PhtE и слитые белки Pht, например слитые белки PhtDE, слитые белки PhtBE (см. публикации международных заявок на патент №№ WO 01/98334 и WO 03/54007). Также могут быть использованы другие белки, такие как овальбумин, гемоцианин лимфы улитки (KLH), бычий сывороточный альбумин (BSA) или производное очищенного белка туберкулина (PPD), PorB (из N. meningitidis), PD (белок D Haemophilus influenzae; см., например, Европейский Патент № EP 0 594 610 B) или его иммунологически функциональные эквиваленты, синтетические пептиды (см. Европейские патенты № EP0378881 и EP0427347), белки теплового шока (см. публикации международных заявок на патент №№ WO 93/17712 и WO 94/03208), белки коклюша (см. публикацию международной заявки на патент № WO 98/58668 и европейский патент № EP0471177), цитокины, лимфокины, факторы роста или гормоны (см. публикацию международной заявки на патент № WO 91/01146), искусственные белки, содержащие несколько человеческих CD4+ Т-клеточных эпитопов из различных антигенов, полученных из патогенов (см. Falugi et al., 2001, Eur J Immunol 31:3816-3824), такие как белок N19 (см. Baraldoi et al., 2004, Infect Immun 72:4884-7), белки метаболизма железа (см. публикацию международной заявки на патент № WO 01/72337), токсин A или B C.difficile (см. публикацию международной заявки на патент № WO 00/61761) и флагеллин (см. Ben-Yedidia et al., 1998, Immunol Lett 64: 9).

В качестве второго белка-носителя можно использовать другие мутанты DT, такие как CRM₁₇₆, CRM₂₂₈, CRM₄₅ (Uchida et al., 1973, J Biol Chem 218:3838-3844); CRM₉, CRM₄₅, CRM₁₀₂, CRM₁₀₃ и CRM₁₀₇ и другие мутации, описанные Nicholls и Youle в Genetically Engineered Toxins, Ed: Frankel, Maecel Dekker Inc, 1992; делецию или мутацию Glu-148 в Asp, Gln или Ser и/или Ala 158 в Gly и другие мутации, раскрытые в патенте США № 4709017 или патенте США. № 4950740; мутации по меньшей мере одного или более остатков Lys 516, Lys 526, Phe 530 и/или Lys 534 и другие мутации, раскрытые в патенте США № 5917017 или патенте США 6455673; или фрагмент, раскрытый в патенте США № 5843711. Такие мутанты DT также можно использовать для создания вариантов DTFB, где варианты содержат фрагмент B, содержащий области эпитопов.

В одном из вариантов осуществления настоящее изобретение относится к иммуногенной композиции, содержащей полисахарид-белковые конъюгаты, включающие капсульные полисахариды из по меньшей мере одного серотипа 1, 2, 3, 4, 5, 6А, 6В, 6С, 6D, 7B, 7C, 7F, 8., 9N, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 15A, 15B, 15C, 16F, 17F, 18C, 19A, 19F, 20, 21, 22A, 22F, 23A, 23B, 23F, 24F, 27, 28A, 31 33F, 34, 35A, 35B, 35F и 38 Streptococcus pneumoniae, конъюгированные с одним или более белками-носителями, и фармацевтически приемлемый носитель. В некоторых вариантах осуществления изобретения иммуногенная композиция содержит, по существу состоит или состоит из капсульных полисахаридов серотипа 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43 или 44, независимо конъюгированных с CRM₁₉₇. В некоторых аспектах изобретения CRM₁₉₇ является единственным используемым белком-носителем.

В некоторых вариантах осуществления описанные выше иммуногенные композиции необязательно дополнительно содержат капсульные полисахариды одного дополнительного серотипа S. pneumoniae, выбранного из по меньшей мере одного из 1, 2, 3, 4, 5, 6A, 6B, 6C, 6D, 7B, 7C, 7F, 8, 9N, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 15A, 15B, 15C, 16F, 17F, 18C, 19A, 19F, 20, 21, 22A, 22F, 23A, 23B, 23F, 24F, 27, 28A 31, 33F, 34, 35A, 35B, 35F и 38, конъюгированные со вторым белком-носителем (который отличается по меньшей мере одной аминокислотой от первого белка-носителя). Предпочтительно, сахариды определенного серотипа не конъюгированы с более чем одним белком-носителем.

В некоторых вариантах осуществления изобретения иммуногенная композиция по изобретению дополнительно содержит капсульные полисахариды из по меньшей мере одного дополнительного серотипа, конъюгированного со вторым белком-носителем. В этих вариантах осуществления иммуногенная композиция содержит, по существу состоит или состоит из капсульных полисахаридов серотипа 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43 или 44, независимо конъюгированных со вторым белком-носителем, который не является CRM₁₉₇.

В некоторых вариантах осуществления изобретения иммуногенная композиция содержит, по существу состоит или состоит из капсульных полисахаридов из N серотипов, где N равно 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43 или 44; и капсульные полисахариды каждого из N серотипов конъюгированы с первым белковым носителем, который является CRM₁₉₇. В других вариантах осуществления изобретения капсульные полисахариды из 1, 2, 3… или N-1 серотипов конъюгированы с первым белком-носителем, а капсульные полисахариды из N-1, N-2, N-3 … 1 серотипа конъюгированы со вторым белком-носителем, который отличается от CRM₁₉₇.

В одном конкретном варианте осуществления настоящего изобретения предоставляется 15-валентная иммуногенная композиция, содержащую, по существу состоящая или состоящая из капсульных полисахаридов серотипов 1, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 9V, 14, 18C 19A, 19F, 22F, 23F и 33F, конъюгированных с CRM₁₉₇.

Капсульные полисахариды Steptococcus pneumoniae могут быть получены стандартными способами, известными специалистам в данной области. Например, полисахариды могут быть выделены из бактерий и могут быть измерены, до некоторой степени, известными способами (см., например, европейские патенты №№ EP497524 и EP497525); предпочтительно методом микрофлюидизации, осуществляемым с помощью гомогенизатора, или химическим гидролизом. В одном из вариантов осуществления штаммы S. pneumoniae, соответствующие каждому полисахаридному серотипу, выращивают в среде на основе сои. Затем отдельные полисахариды очищают с помощью стандартных этапов очистки, включая центрифугирование, осаждение и ультрафильтрацию. См., например, публикацию заявки на патент США № 2008/0286838 и патент США № 5847112. Размеры полисахаридов могут быть уменьшены с целью уменьшения вязкости и/или улучшения фильтруемости последующих конъюгированных продуктов. В настоящем изобретении капсульные полисахариды получают из одного или более серотипов 1, 2, 3, 4, 5, 6А, 6В, 6С, 6D, 7В, 7С, 7F, 8, 9N, 9В, 10А, 11А, 12F, 14, 15A, 15B, 15C, 16F, 17F, 18C, 19A, 19F, 20, 21, 22A, 22F, 23A, 23B, 23F, 24F, 27, 28A, 31, 33F, 34, 35A, 35B, 35F и 38.

Очищенные полисахариды подвергают химической активации для введения функциональной группы, способной реагировать с белком-носителем. После активации каждый капсульный полисахарид отдельно конъюгируют с белком-носителем с образованием гликоконъюгата. Полисахаридные конъюгаты могут быть получены известными методами связывания.

В одном из вариантов осуществления химическую активацию полисахаридов и последующую конъюгацию с белком-носителем выполняют с помощью средств, описанных в патентах США №№ 4365170, 4673574 и 4902506. Вкратце, пневмококковый полисахарид реагирует с окислителем на основе периодата, таким как периодат натрия, периодат калия или иодная кислота, что приводит к случайному окислительному расщеплению вицинальных гидроксильных групп с образованием реакционноспособных альдегидных групп.

Связывание окисленного полисахарида с первичными аминогруппами на белке-носителе (главным образом, остатки лизина) путем прямого аминирования можно получить по реакции восстановительного аминирования. Например, конъюгацию проводят путем взаимодействия смеси активированного полисахарида и белка-носителя с восстановителем, таким как цианоборогидрид натрия, в присутствии никеля. Реакция конъюгации может быть проведена в водном растворе или в органическом растворителе, таком как ДМСО. См., например, US2015/0231270 A1, EP 0471177 B1 и US2011/0195086 A1. По завершении реакции конъюгации непрореагировавшие альдегиды кэппируют (блокируют) путем добавления сильного восстановителя, такого как боргидрид натрия.

В одном из вариантов осуществления перед приготовлением состава, каждый пневмококковый капсульный полисахариднный антиген индивидуально очищают от S. pneumoniae, активируют с образованием реакционноспособных альдегидов и затем ковалентно конъюгируют по реакции восстановительного аминирования с участием цианоборогидрида натрия в присутствии никеля с первым или вторым белком-носителем. Никель образует комплекс с остаточным ингибирующим цианидом из восстанавливающего агента цианоборогидрида натрия, используемого в реакции восстановительного аминирования.

В некоторых вариантах осуществления реакцию конъюгации проводят по реакции восстановительного аминирования, в которой никель используют для увеличения эффективности реакции конъюгации и для удаления свободного цианида. Известно, что переходные металлы образуют стабильные комплексы с цианидом и, как известно, улучшают восстановительное метилирование аминогрупп белка и формальдегида цианоборогидридом натрия (Gidley et al., 1982, Biochem J. 203:331-334; Jentoft et al., 1980, Anal Biochem. 106:186-190). Благодаря образованию комплекса с остаточным ингибирующим цианидом добавление никеля увеличивает расход белка во время конъюгации и приводит к образованию более крупных, потенциально более иммуногенных конъюгатов.

Непостоянство уровней свободного цианида в коммерческих партиях цианоборогидридных натриевых реагентов может привести к неустойчивой конъюгации, что приведет к изменяющимся характеристикам конъюгата, включая молекулярную массу и соотношение полисахарида к белку. Добавление никеля в реакцию конъюгации снижает уровень свободного цианида и, таким образом, улучшает степень консистенции конъюгата от партии к партии.

В другом варианте осуществления в способе конъюгации можно использовать активацию полисахарида тетрафторборатом 1-циано-4-диметиламинопиридиния (CDAP) с образованием эфира цианата. Активированный сахарид может быть связан непосредственно с аминогруппой белка-носителя.

В другом варианте осуществления в активированный полисахарид может быть введена реакционноспособная гомобифункциональная или гетеробифункциональная группа через взаимодействие сложного эфира цианата любым доступным способом. Например, можно использовать цистамин или цистеамин для получения тиолированного полисахарида, который может быть связан с носителем через тиоэфирную связь, полученную после реакции с белком-носителем, активированным малеимидом (например, с использованием GMBS), или галоацетилированным белком-носителем (например, с использованием йодацетимида [например, этилйодацетимид HCl] или N-сукцинимидилбромацетата или SIAB, или SIA, или SBAP). В другом варианте осуществления сложный эфир цианата взаимодействует с гександиамином или дигидразидом адипиновой кислоты (ADH), и полученный дериватизированный амином сахарид конъюгируют со свободной карбоксильной группой на белке-носителе с использованием карбодиимида (например, EDAC или EDC). Такие конъюгаты описаны в публикациях международной заявки на патент №№ WO 93/15760, WO 95/08348 и WO 96/29094; и Chu et al., 1983, Infect. Immunity 40: 245-256.

В других подходящих методах конъюгации используются карбодиимиды, гидразиды, активные эфиры, норборан, п-нитробензойная кислота, N-гидроксисукцинимид, S-NHS, EDC и TSTU. Многие из них описаны в публикации международной заявки на патент № WO 98/42721. Конъюгация может включать карбонильный линкер, который может быть образован в результате реакции свободной гидроксильной группы сахарида с CDI (см. Bethell et al., 1979, J. Biol. Chem. 254:2572-4; Hearn et al., 1981, J. Chromatogr. 218:509-18), с последующей реакцией с белком-носителем с образованием карбаматной связи. Эта химия состоит в восстановлении аномерного конца углевода с образованием первичной гидроксильной группы с последующей реакцией первичного гидроксила с CDI с образованием карбаматного промежуточного соединения и последующим взаимодействием с аминогруппами белка-носителя. Реакция может потребовать необязательного введения/снятия защиты с других первичных гидроксильных групп на сахариде.

После конъюгации полисахарид-белковые конъюгаты очищают для удаления избыточных реагентов конъюгации, а также остаточного свободного белка и свободного полисахарида, одним или более способами, хорошо известными специалисту в данной области, включая концентрацию/диафильтрацию, ультрафильтрацию, осаждение/элюирование, колоночную хроматографию и глубинную фильтрацию. См., например, патент США. 6146902.

После очистки отдельных гликоконъюгатов их смешивают для приготовления иммуногенной композиции по настоящему изобретению. Эти пневмококковые конъюгаты получают в отдельных процессах и объединяют для получения единичных дозированных составов.

Фармацевтические/вакцинные композиции

Помимо этого в настоящем изобретении предоставляются композиции, включая фармацевтические, иммуногенные и вакцинные композиции, содержащие, по существу состоящие или, альтернативно, состоящие из любой из описанных выше комбинаций серотипов полисахаридов вместе с фармацевтически приемлемым носителем и адъювантом. В одном из вариантов осуществления композиции содержат, по существу состоят или состоят из 2-13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43 или 44 различных полисахарид-белковых конъюгатов, где каждый из конъюгатов содержит разные капсульные полисахариды, конъюгированные с первым белком-носителем или вторым белком-носителем и где капсульные полисахариды по меньшей мере одного из серотипов 1, 2, 3, 4, 5, 6А, 6В, 6С, 6D, 7В, 7С, 7F, 8, 9N, 9V, 10А, 11А, 12F, 14, 15А, 15В, 15С, 16F, 17F, 18С, 19А, 19Ф, 20, 21, 22А, 22Ф, 23А, 23В, 23Ф, 24Ф, 27, 28А, 31, 33Ф, 34 35A, 35B, 35F и 38 Streptococcus pneumoniae конъюгированы с первым белком-носителем, выбранным из CRM₁₉₇, и необязательно содержат дополнительные серотипы S.pneumoniae, выбранные из серотипов 1, 2, 3, 4, 5, 6A, 6B, 6C, 6D, 7B, 7C, 7F, 8, 9N, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 15A, 15B, 15C, 16F, 17F, 18C, 19A, 19F, 20, 21, 22A, 22F, 23A, 23B, 2 3F, 24F, 27, 28A, 31, 33F, 34, 35A, 35B, 35F и 38, которые конъюгированы со вторым белком-носителем (который отличается по меньшей мере одной аминокислотой от первого белка-носителя), вместе с фармацевтически приемлемым носителем и адъювантом.

Состав полисахарид-белковых конъюгатов по настоящему изобретению может быть реализован способами, известными в данной области техники. Например, 15 отдельных пневмококковых конъюгатов могут находиться в составе с физиологически приемлемым носителем для приготовления композиции. Примеры таких носителей включают, без ограничения, воду, забуференный солевой раствор, полиолы (например, глицерин, пропиленгликоль, жидкий полиэтиленгликоль) и растворы декстрозы.

В другом варианте осуществления вакцинную композицию готовят в L-гистидиновом буфере с хлоридом натрия.

Используемый в настоящем описании «адъювант» представляет собой вещество, которое служит для усиления иммуногенности иммуногенной композиции по изобретению. Иммунный адъювант может усиливать иммунный ответ на антиген, который является слабоиммуногенным, когда вводится сам по себе, например, не способным индуцировать выработку титров антител или индуцирующим слабые титры антител или клеточный иммунный ответ, увеличивает выработку титров антител к антигену и/или снижает дозу антигена, эффективного для достижения иммунного ответа у человека. Таким образом, адъюванты часто используются для усиления иммунного ответа и хорошо известны специалисту в данной области. Подходящие адъюванты для усиления эффективности композиции включают, без ограничения:

(1) соли алюминия (квасцы), такие как гидроксид алюминия, фосфат алюминия, сульфат алюминия и т.д.;

(2) составы эмульсий масло-в-воде (в комбинации или без других специфических иммуностимулирующих агентов, таких как мурамилпептиды (определенные ниже) или компоненты бактериальной клеточной стенки), такие как, например, (a) MF59 (публикация международной заявки на патент № WO 90/14837), содержащий 5% сквалена, 0,5% твина 80 и 0,5% Span 85 (необязательно содержащий различные количества MTP-PE), приготовленный в виде субмикронных частиц с помощью микрофлюидизатора, такого как микрофлюидизатор модели 110Y (Microfluidics, Newton, MA), (b) SAF, содержащий 10% сквалена, 0,4% твина 80, 5% полимера, блокированного плуроником L121, и thr-MDP, либо микрофлюидизированный в субмикронную эмульсию, либо перемешенный вихревым способом для образования эмульсии с большим размером частиц, (c) адъювантная система Ribi™ (RAS), (Corixa, Hamilton, MT), содержащая 2% сквалена, 0,2% Твин 80 и один или более компонентов бактериальной клеточной стенки из группы, состоящей из 3-O-деацилированного монофосфорилипида A (MPL™), описанного в патенте США № 4991094, димиколята трегалозы (TDM) и скелета клеточной стенки (CWS), предпочтительно MPL+CWS (Detox™); и (d) Montanide ISA;

(3) сапониновые адъюванты, такие как Quil A или STIMULON™ QS-21 (Antigenics, Framingham, MA) (см., например, патент США № 5057540), или частицы, генерируемые из них, такие как ISCOM (иммуностимулирующие комплексы, образованные путем комбинирования холестерина, сапонина, фосфолипида и амфипатических белков) и Iscomatrix® (по существу с такой же структурой, что и у ISCOM, но без белка);

(4) бактериальные липополисахариды, синтетические аналоги липида A, такие как аминоалкилглюкозаминфосфатные соединения (AGP), или их производные или аналоги, которые доступны от Corixa и которые описаны в патенте США № 6113918; одним из таких AGP является 2-[(R)-3-тетрадеканоилокситетрадеканоиламино]этил 2-дезокси-4-O-фосфоно-3-O-[(R)-3-тетрадеканоилокситетрадеканоил]-2-[(R)-3- тетрадеканоилокситетрадеканоиламино]-b-D-глюкопиранозид, который также известен как 529 (ранее известный как RC529), приготовленный в виде водной формы или в виде стабильной эмульсии;

(5) синтетические полинуклеотиды, такие как олигонуклеотиды, содержащие мотив(ы) CpG (патент США № 6207646);

(6) цитокины, такие как интерлейкины (например, IL-1, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-12, IL-15, IL-18 и т.д.), интерфероны (например, гамма-интерферон), колониестимулирующий фактор гранулоцитов и макрофагов (GM-CSF), колониестимулирующий фактор макрофагов (M-CSF), фактор некроза опухолей (TNF), костимулирующие молекулы B7-1 и B7-2 и т.д.; и

(7) комплемент, такой как тример компонента комплемента C3d.

В другом варианте осуществления адъювант представляет собой смесь 2, 3 или более вышеуказанных адъювантов, например, SBAS2 (эмульсия масло-в-воде, также содержащая 3-деацилированный монофосфориллипид А и QS21).

Мурамильные пептиды включают, без ограничения, N-ацетилмурамил-L-треонил-D-изоглутамин (thr-MDP) и N-ацетилнормурамил-L-аланин-2-(1'-2'дипальмитоил-sn-глицеро-3-гидроксифосфорилокси)этиламин (MTP-PE) и др.

В некоторых вариантах осуществления адъювант представляет собой соль алюминия. Адъюванты, соли алюминия, могут представлять собой осажденную квасцами вакцину или адсорбированную квасцами вакцину. Адъюванты, соли алюминия, хорошо известны в данной области техники и описаны, например, у Harlow E. и D. Lane (1988; Antibodies: A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratory) и Nicklas, W. (1992; Aluminum salts. Research in Immunology 143:489-493). Соль алюминия включает, без ограничения, гидратированный оксид алюминия, гидрат оксида алюминия, тригидрат оксида алюминия (ATH), гидрат алюминия, тригидрат алюминия, Alhydrogel®, Superfos, Amphogel®, гидроксид алюминия (III), гидроксифосфат-сульфат алюминия (фосфат-алюминиевый адъювант) (APA)), аморфный оксид алюминия, тригидратированный оксид алюминия или тригидроксид алюминия.

APA представляет собой водную суспензию гидроксифосфата алюминия. APA получают смешиванием хлорида алюминия и фосфата натрия в объемном соотношении 1:1 для осаждения гидроксифосфата алюминия. После процесса смешивания материал уменьшают по размеру с помощью смесителя с высоким сдвиговым усилием для достижения однородного (монодисперсного) гранулометрического состава. Затем продукт подвергают диафильтрации против солевого раствора и стерилизуют паром.

В некоторых вариантах осуществления коммерчески доступный Al(OH)₃ (например, Alhydrogel® или Суперфос компании Denmark/Accurate Chemical and Scientific Co., Westbury, NY) используется для адсорбции белков при соотношении 50-200 г белка/мг гидроксида алюминия. Адсорбция белка зависит, в другом варианте осуществления, от pI (изоэлектрического pH) белка и pH среды. Белок с более низким pI адсорбируется на положительно заряженном ионе алюминия сильнее, чем белок с более высоким pI. Соли алюминия могут образовывать депо Ag, медленно высвобождаемого в течение 2-3 недель, участвовать в неспецифической активации макрофагов и активации комплемента и/или стимулировать механизм врожденного иммунитета (возможно, посредством стимуляции мочевой кислоты). См., например, Lambrecht et al., 2009, Curr Opin Immunol 21:23.

Одновалентные объемные водные конъюгаты обычно смешивают вместе и разбавляют. После разбавления партию подвергают стерильной фильтрации. Фосфат-алюминиевый адъювант добавляют в асептических условиях до конечной концентрации 4 мкг/мл для всех серотипов, кроме серотипа 6В, который разбавляют до целевого значения 8 мкг/мл, и конечной концентрации алюминия 250 мкг/мл. Приготовленную партию состава с адъювантом заливают во флаконы или шприцы.

В некоторых вариантах осуществления адъювант представляет собой CpG-содержащую нуклеотидную последовательность, например, CpG-содержащий олигонуклеотид, в частности, CpG-содержащий олигодезоксинуклеотид (CpG ODN). В другом варианте осуществления адъювант представляет собой ODN 1826, который можно приобрести у компании Coley Pharmaceutical Group.

«CpG-содержащий нуклеотид», «CpG-содержащий олигонуклеотид», «CpG-олигонуклеотид» и подобные термины относятся к нуклеотидной молекуле длиной 6-50 нуклеотидов, которая содержит неметилированный фрагмент CpG. См., например, Wang et al., 2003, Vaccine 21:4297. В другом варианте осуществления подразумевается любое другое принятое в области техники определение этих терминов. CpG-содержащие олигонуклеотиды включают модифицированные олигонуклеотиды с любыми синтетическими межнуклеозидными связями, модифицированными основаниями и/или модифицированным сахаром.

Способы применения CpG-олигонуклеотидов хорошо известны в данной области и описаны, например, у Sur et al., 1999, J. Immunol. 162:6284-93; Verthelyi, 2006, Methods Mol. Med. 127:139-58; и Yasuda et al., 2006, Crit Rev Ther Drug Carrier Syst. 23:89-110.

Введение/дозирование

Композиции и составы по настоящему изобретению можно использовать для профилактики или лечения человека, восприимчивого к инфекции, например, пневмококковой инфекции, путем системного или мукозального введения вакцины. В одном из вариантов осуществления настоящее изобретение относится к способу индукции иммунного ответа на конъюгат капсульного полисахарида S.pneumoniae, включающему введение человеку иммунологически эффективного количества иммуногенной композиции по настоящему изобретению. В другом варианте осуществления настоящее изобретение относится к способу вакцинации человека против пневмококковой инфекции, включающему этап введения человеку иммуногенно эффективного количества иммуногенной композиции по настоящему изобретению.

Оптимальные количества компонентов для конкретной вакцины могут быть установлены с помощью стандартных исследований, включающих наблюдение соответствующих иммунных ответов у субъектов. Например, в другом варианте осуществления дозировка для вакцинации человека определяется путем экстраполяции результатов исследований, полученных на животных, на данные человека. В другом варианте осуществления дозировку определяют опытным путем. Данные по младенцам макак-резус, приведенные в примерах, показывают, что вакцина является иммуногенной.

«Эффективное количество» композиции по изобретению относится к дозе, необходимой для индуцирования выработки антител, которые существенно снижают вероятность или степень инфективности микроба, например S. pneumoniae, во время последующего заражения.

Способы по изобретению можно использовать для профилактики и/или уменьшения первичных клинических синдромов, вызванных микробами, например S. pneumoniae, включая как инвазивные инфекции (менингит, пневмония и бактериемия), так и неинвазивные инфекции (острый средний отит, и синусит).

Введение композиций по изобретению может включать одно или более из следующего: внутримышечную, внутрибрюшинную, внутрикожную или подкожную инъекцию; или мукозальное введение в ротовую полость/пищеварительную систему, дыхательные пути или мочеполовые пути. В одном из вариантов осуществления интраназальное введение используется для лечения пневмонии или среднего отита (поскольку оно обеспечивает более эффективную профилактику носоглоточного носительства пневмококков, таким образом ослабляя инфекцию на самой ранней стадии).

Количество конъюгата в каждой дозе вакцины выбирают в виде количества, которое вызывает иммунопротективный ответ без существенных побочных эффектов. Такое количество может варьировать в зависимости от пневмококкового серотипа. Как правило, для конъюгатов на основе полисахаридов каждая доза будет составлять от 0,1 до 100 мкг каждого полисахарида, в частности от 0,1 до 10 мкг и более конкретно от 1 до 5 мкг. Например, каждая доза может содержать 100, 150, 200, 250, 300, 400, 500 или 750 нг или 1, 1,5, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 7,5, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 18, 20, 22, 25, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 или 100 мкг.

Оптимальное количество компонентов для конкретной вакцины может быть установлено с помощью стандартных исследований, включающих наблюдение соответствующих иммунных ответов у субъектов. Например, в другом варианте осуществления дозировку для вакцинации человека определяют путем экстраполяции результатов исследований, полученных на животных, на данные человека. В другом варианте осуществления дозировку определяют опытным путем.

В одном из вариантов осуществления доза соли алюминия составляет 10, 15, 20, 25, 30, 50, 70, 100, 125, 150, 200, 300, 500 или 700 мкг или 1, 1,2, 1,5, 2, 3,5 мг или более. В другом варианте осуществления дозу описанной выше соли алюминия определяют на мкг рекомбинантного белка.

В конкретном варианте осуществления настоящего изобретения вакцина PCV15 представляет собой стерильную жидкую композицию пневмококковых капсульных полисахаридов серотипов 1, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19A, 19F, 22F, 23F и 33F, независмо конъюгированных с CRM₁₉₇. В одном из аспектов каждая доза приготовлена таким образом, чтобы она содержала: 4 мкг/мл или 8 мкг/мл каждого сахарида, за исключением 6B, количество которого составляет 8 мкг/мл или 16 мкг/мл; и примерно 64 мкг/мл или 128 мкг/мл белка-носителя CRM₁₉₇. В одном из аспектов каждую 0,5 мл дозу готовят таким образом, чтобы она содержала: 2 мкг каждого сахарида, за исключением 6B, количество которого составляет 4 мкг; примерно 32 мкг белка-носителя CRM₁₉₇ (например, 32 мкг ± 5 мкг, ±3 мкг, ±2 мкг или ±1 мкг), 0,125 мг металлического алюминия (0,5 мг фосфата алюминия) в качестве адъюванта; и хлорид натрия и L-гистидиновый буфер. Концентрация хлорида натрия составляет примерно 150 мМ (например, 150 мМ ± 25 мМ, ±20 мМ, ±15 мМ, ±10 мМ или ±5 мМ) и примерно 20 мМ (например, 20 мМ ±5 мМ, ±2,5 мМ, ±2 мМ, ±1 мМ или ±0,5 мМ) L-гистидинового буфера.

Согласно любому из способов по настоящему изобретению и в одном из вариантов осуществления субъект является человеком. В некоторых вариантах осуществления субъектом-человеком является младенец (в возрасте до 1 года), малыш (в возрасте примерно от 12 до 24 месяцев) или маленький ребенок (в возрасте примерно от 2 до 5 лет). В других вариантах осуществления субъектом-человеком является пациент пожилого возраста (> 65 лет). Композиции по настоящему изобретению также подходят для введения детям старшего возраста, подросткам и взрослым (например, в возрасте от 18 до 45 лет или от 18 до 65 лет).

В одном из вариантов осуществления способов по настоящему изобретению композицию по настоящему изобретению вводят в виде единичной инокуляции. В другом варианте осуществления вакцину вводят два раза, три раза или четыре раза или более, с достаточным разнесением по времени. Например, композицию можно вводить с интервалами 1, 2, 3, 4, 5 или 6 месяцев или в виде любой их комбинации. График иммунизации может соответствовать графику, предусмотренному для пневмококковых вакцин. Например, обычный график для младенцев и детей младшего возраста для лечения инвазивного заболевания, вызванного S. pneumoniae, составляет 2, 4, 6 и 12-15 месяцев. Таким образом, в другом варианте осуществления композицию вводят в виде серии из 4 доз детям в возрасте 2, 4, 6 и 12-15 месяцев.

Композиции по настоящему изобретению также могут включать один или более белков из S. pneumoniae. Примеры белков S. pneumoniae, подходящих для включения, включают белки, описанные в публикациях международных заявок на патент №№ WO 02/083855 и WO 02/053761.

Составы

Композиции по изобретению могут вводиться субъекту одним или более способами, известными специалисту в данной области, такими как парентеральное, трансмукозальное, трансдермальное, внутримышечное, внутривенное, внутрикожное, внутриназальное, подкожное, внутрибрюшинное введение и могут быть приготовлены в виде соответствующих лекарственных форм.

В одном из вариантов осуществления композиции по настоящему изобретению вводят посредством эпидермальной инъекции, внутримышечной инъекции, внутривенной, внутриартериальной, подкожной инъекции или инъекции в слизистую оболочку дыхательных путей жидкого препарата. Жидкие составы для инъекций включают растворы и т.п.

Композиция по изобретению может быть приготовлена в виде флаконов с единичной дозой, флаконов с множеством доз или в виде предварительно заполненных шприцев.

В другом варианте осуществления композиции по настоящему изобретению вводят перорально и, следовательно, готовят в форме, подходящей для перорального введения, т.е., в виде твердого или жидкого препарата. Твердые пероральные составы включают таблетки, капсулы, пилюли, гранулы, пеллеты и т.п. Жидкие пероральные составы включают растворы, суспензии, дисперсии, эмульсии, масла и т.п.

Фармацевтически приемлемые носители для жидких составов представляют собой водные или неводные растворы, суспензии, эмульсии или масла. Примерами неводных растворителей являются пропиленгликоль, полиэтиленгликоль и инъецируемые органические сложные эфиры, такие как этилолеат. Водные носители включают воду, спиртовые/водные растворы, эмульсии или суспензии, включая солевой раствор и забуференные среды. Примерами масел являются масла животного, растительного или синтетического происхождения, например, арахисовое масло, соевое масло, оливковое масло, подсолнечное масло, рыбий жир, другое масло морского происхождения или липид из молока или яиц.

Фармацевтическая композиция может быть изотонической, гипотонической или гипертонической. Однако часто предпочтительно, чтобы фармацевтическая композиция для инфузии или инъекции была по существу изотонической при введении. Следовательно, для хранения фармацевтическая композиция предпочтительно может быть изотонической или гипертонической. Если фармацевтическая композиция является гипертонической во время хранения, она может быть разбавлена до изотонического раствора перед введением.

Изотонический агент может представлять собой ионный изотонический агент, такой как соль, или неионный изотонический агент, такой как углевод. Примеры ионных изотонических агентов включают, без ограничения, NaCl, CaCl₂, KCl и MgCl₂. Примеры неионных изотонических агентов включают, без ограничения, маннит, сорбит и глицерин.

Также предпочтительно, чтобы по меньшей мере одна фармацевтически приемлемая добавка представляла собой буфер. Для некоторых целей, например, когда фармацевтическая композиция предназначена для инфузии или инъекции, часто желательно, чтобы композиция содержала буфер, который способен буферировать раствор до рН в диапазоне от 4 до 10, например 5 до 9, например от 6 до 8.

Буфер может быть выбран, например, из группы, состоящей из трис, ацетатного, глутаматного, лактатного, малеатного, тартратного, фосфатного, цитратного, карбонатного, глицинатного, L-гистидинового, глицинового, сукцинатного и триэтаноламинового буфера.

Кроме того, буфер может быть выбран, например, из совместимых с USP буферов для парентерального применения, в частности, когда фармацевтическая композиция предназначена для парентерального применения. Например, буфер может быть выбран из группы, состоящей из одноосновных кислот, таких как уксусная, бензойная, глюконовая, глицериновая и молочная; двухосновных кислот, таких как аконитовая, адипиновая, аскорбиновая, угольная, глутаминовая, яблочная, янтарная и винная; многоосновных кислот, таких как лимонная и фосфорная; и оснований, таких как аммиак, диэтаноламин, глицин, триэтаноламин и трис.

Парентеральные несущие среды (для подкожных, внутривенных, внутриартериальных или внутримышечных инъекций) включают раствор хлорида натрия, декстрозу Рингера, декстрозу и хлорид натрия, лактат Рингера и жирные масла. Внутривенные носители включают жидкие и питательные добавки, электролитные добавки, такие как основанные на декстрозе Рингера, и т.п. Примерами являются стерильные жидкости, такие как вода и масла, с добавлением или без добавления поверхностно-активного вещества и других фармацевтически приемлемых адъювантов. Как правило, предпочтительными жидкими носителями являются вода, солевой раствор, водные растворы декстрозы и родственных сахаров, гликоли, такие как пропиленгликоли или полиэтиленгликоль, полисорбат 80 (PS-80), полисорбат 20 (PS-20) и полоксамер 188 (P188), особенно для инъецируемых растворов. Примерами масел являются масла животного, растительного или синтетического происхождения, например, арахисовое масло, соевое масло, оливковое масло, подсолнечное масло, рыбий жир, другое масло морского происхождения или липид из молока или яиц.

Составы по изобретению также могут содержать поверхностно-активное вещество. Предпочтительные поверхностно-активные вещества включают, без ограничения: поверхностно-активные вещества на основе сложных эфиров полиоксиэтиленсорбитана (обычно называемые Твинами), особенно PS-20 и PS-80; сополимеры этиленоксида (EO), пропиленоксида (PO) и/или бутиленоксида (BO), продаваемые под торговой маркой DOWFAX™, такие как линейные EO/PO блок-сополимеры; октоксинолы, которые могут варьировать по количеству повторяющихся этокси(окси-1,2-этандиил) групп, причем октоксинол-9 (тритон Х-100 или трет-октилфеноксиполиэтоксиэтанол) представляет особый интерес; (октилфенокси)полиэтоксиэтанол (IGEPAL CA-630/NP-40); фосфолипиды, такие как фосфатидилхолин (лецитин); этоксилаты нонилфенола, такие как серия Tergitol™ NP; жирные эфиры полиоксиэтилена, полученные из лауриловых, цетиловых, стеариловых и олеиловых спиртов (известные как поверхностно-активные вещества Brij), такие как монолауриловый эфир триэтиленгликоля (Brij 30); и сложные эфиры сорбитана (обычно известные как SPAN), такие как сорбитантриолеат (Span 85) и сорбитанмонолаурат.

Могут быть использованы смеси поверхностно-активных веществ, например, смеси PS-80/Span 85. Также пригодной является комбинация сложного эфира полиоксиэтиленсорбитана, такого как моноолеат полиоксиэтиленсорбитана (PS-80), и октоксинола, такого как трет-октилфеноксиполиэтоксиэтанол (Тритон X-100). Другая полезная комбинация включает лаурет-9 плюс сложный эфир полиоксиэтиленсорбитана и/или октоксинол.

Предпочтительными количествами поверхностно-активного вещества являются: от 0,01 до 1% мас./об., в частности, примерно 0,1% мас./об. для сложных эфиров полиоксиэтиленсорбитана (таких как PS-80); от 0,001 до 0,1% мас./об., в частности от 0,005 до 0,02% мас./об. для октил- или нонилфеноксиполиоксиэтанолов (таких как Тритон X-100 или других детергентов в серии Тритон); от 0,1 до 20% мас./об., предпочтительно от 0,1 до 10% мас./об. и, в частности, от 0,1 до 1% мас./об. или примерно 0,5% мас./об. для полиоксиэтиленовых эфиров (таких как лаурет-9).

В некоторых вариантах осуществления композиция по существу состоит из L-гистидина (20 мМ), солевого раствора (150 мМ) и 0,2% мас./об. PS-20 при pH 5,8 с 250 мкг/мл APA (фосфат-алюминиевый адъювант). Количество PS-20 может варьировать от 0,005 до 0,3% мас./об. в случае его присутствия в составе для контроля агрегации во время имитации процессов изготовления и транспортировки с использованием первичной упаковки. Процесс состоит из объединения до 44 серотипов в L-гистидине, хлориде натрия и PS-20, последующего объединения этого смешанного материала с АРА и хлоридом натрия с антимикробными консервантами или без них.

Как показано в настоящей заявке, выбор поверхностно-активного вещества может быть оптимизирован для разных лекарственных продуктов и лекарственных веществ. Для поливалентных вакцин, содержащих 15 или более серотипов, предпочтительными являются PS-20 и P188. Предполагается, что выбор химического вещества, используемого для получения конъюгата, является важным фактором, влияющим на стабилизацию состава. В частности, как показано ниже, конъюгаты пневмококковый полисахарид-белок, полученные в водном растворителе или ДМСО и объединенные в поливалентную композицию, показывают существенную разницу в стабильности в зависимости от конкретных поверхностно-активных систем, используемых для их приготовления. Как описано, улучшенную стабильность наблюдали в случае присутствия одного полисорбата 20 или полоксамера 188 в комбинации с полиолом, особенно когда один или более полисахарид-белковых конъюгатов получали в апротонном растворителе, таком как ДМСО.

Настоящее изобретение отчасти основано на открытии того, что применение полисорбата 20 или комбинации полоксамера 188 с полиолом в составах, содержащих полисахарид-белковые конъюгаты, приготовленные по реакции восстановительного аминирования, некоторые из которых получают в водных условиях, а другие получают в условиях ДМСО, позволяют контролировать возникновение и развитие вызванной стрессом физико-химической нестабильности иммуногенных композиций и обеспечивают неожиданно превосходные свойства по сравнению с другими поверхностно-активными веществами и стабилизаторами. Точный механизм того, каким образом конкретный детергент защищает биотерапевтическое средство, плохо изучен и не может быть предсказан a priori. Возможные механизмы стабилизации включают предпочтительную гидратацию, преимущественное исключение, конкуренцию на границе раздела воздух/жидкость между биотерапевтическим средством и поверхностью, поверхностное натяжение и/или прямую связь детергента с биотерапевтическим средством для маскирования гидрофобных областей, которые служат затравками для агрегации. Настоящее изобретение направлено на решение существующей потребности в данной области техники в улучшении стабильности и подавления образования частиц (например, агрегации, осаждения) иммуногенных композиций, содержащих полисахарид-белковые конъюгаты. Композиции по изобретению обеспечивают значительные преимущества в контроле агрегации сложных биотерапевтических средств, возникающей в процессе производства, транспортировки и обработки, по сравнению с ранее использованными поверхностно-активными веществами, включая полоксомер 188 и полисорбат 80.

Предполагается, что белковый компонент в полисахарид-белковом конъюгате играет важную роль в агрегации. Это продемонстрировано в различных явлениях агрегации лекарственных препаратов с использованием конъюгатов одного и того же состава серотипов, но с разными растворителями, используемыми при конъюгации. Апротонный растворитель, используемый при получении полисахаридного конъюгата, изменяет структуру белка и может проявлять другую тенденцию к агрегации в присутствии адъюванта АРА. При использовании двух или более белков-носителей можно рассчитать весовой процент.

Таким образом, в некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение относится к составу, содержащему (i) один или более полисахарид-белковых конъюгатов; (ii) рН-забуференный солевой раствор, имеющий рН в диапазоне от 5,0 до 7,5; (iii) соль алюминия; и (iv) поверхностно-активную систему, выбранную из а) полисорбата 20 и (b) полоксамера, имеющего молекулярную массу в диапазоне от 1100 Да до 17400 Да, и полиола, выбранного из пропиленгликоля и полиэтиленгликоля 400. В некоторых аспектах этого варианта осуществления один или более полисахарид-белковых конъюгатов готовят в апротонном растворителе, таком как ДМСО. Примерно 10-100%, 24-100% или 24-80% от общей массы белка может быть приготовлено и конъюгировано в апротонном растворителе, таком как ДМСО.

В некоторых вариантах осуществления поверхностно-активная система содержит полисорбат 20 (название IUPAC: полиоксиэтилен (20) сорбитана монолаурат; PS-20), который является коммерчески доступным поверхностно-активным веществом, известным как Твин® 20. В некоторых аспектах конечная концентрация полисорбата 20 в составах по изобретению находится в диапазоне от 0,001% до 10% мас./об. или от 0,025% до 2,5% мас./об., или от 0,025% до 0,3% мас./об. Поверхностно-активная система, содержащая полисорбат 20 и может дополнительно содержать полиол. Полиол может быть выбран из пропиленгликоля и полиэтиленгликоля. В некоторых аспектах полиэтиленгликоль или пропиленгликоль имеет конечную концентрацию от 6 до 20% мас./об. В некоторых аспектах полиэтиленгликоль представляет собой полиэтиленгликоль 400.

В некоторых вариантах осуществления поверхностно-активная система включает полоксамер с молекулярной массой в диапазоне от 1100 Да до 17 400 Да, и полиол, выбранный из пропиленгликоля и полиэтиленгликоля 400.

Полоксамер представляет собой неионный триблок-сополимер, состоящий из центральной гидрофобной цепи полиоксипропилена (поли(полипропиленоксида)), фланкированного двумя гидрофильными цепями полиоксиэтилена (поли(этиленоксида)). Полоксамеры также известны под торговй маркой Pluronic®. Поскольку длины полимерных блоков можно регулировать, существует много разных полоксамеров, которые немного различаются по своим свойствам. Обозначенные общим термином «полоксамер» эти сополимеры обычно обозначают буквой «П» (полоксамер), за которой следуют три цифры, первые две цифры х100 дают примерную величину молекулярной массы полиоксипропиленового ядра, а последняя цифра х10 означает процентное содержание полиоксиэтилена (например, P407=полоксамер с молекулярной массой полиоксипропилена 4000 г/моль с 70% содержанием полиоксиэтилена). Для торговой марки Pluronic® кодирование этих сополимеров начинается с буквы, определяющей его физическую форму при комнатной температуре (L=жидкость, P=паста, F=хлопья (твердое вещество)), за которой следуют две или три цифры. Первая цифра (две цифры в трехзначном исчислении) в числовом обозначении, умноженная на 300, указывает примерную молекулярную массу гидрофоба; и последняя цифра x10 показывает процентное содержание полиоксиэтилена (например, L61=Pluronic® с молекулярной массой полиоксипропилена 1800 г/моль и 10% содержанием полиоксиэтилена). См., например, патент США. 3740421.

Примеры полоксамеров имеют общую формулу:

HO(C₂H₄O)_a(C₃H₆O)_b(C₂H₄O)_aH,

где блоки а и b имеют следующие значения:

Pluronic®	Полоксамер	а	b	Молекулярная масса
L31		2	16	1100 (средняя)
L35				1900 (средняя)
L44NF	124	12	20	2090-2360
L64				2900 (средняя)
L81				2800 (средняя)
L121				4400 (средняя)
P123		20	70	5750 (средняя)
F68NF	188	80	27	7680-9510
F87NF	237	64	37	6840-8830
F108NF	338	141	44	12700-17400
F127NF	407	101	56	9840-14600

Используемые в настоящем описании единицы измерения молекулярной массы даны в Дальтонах (Да) или г/моль.

В составах полоксамер обычно имеет молекулярную массу в диапазоне от 1100 Да до 17400 Да, от 7500 Да до 15000 Да или от 7500 Да до 10000 Да. Полоксамер может быть выбран из полоксамера 188 или полоксамера 407. Конечная концентрация полоксамера в составах по изобретению находится в диапазоне от 0,001 до 5% мас./об. или от 0,025 до 1% мас./об. Поверхностно-активная система, содержащая полоксамер, должна дополнительно содержать полиол. В некоторых аспектах полиол представляет собой пропиленгликоль и имеет конечную концентрацию от 1 до 20% мас./об. В некоторых аспектах полиол представляет собой полиэтиленгликоль 400 и имеет конечную концентрацию от 1 до 20% мас./об.

Подходящими полиолами для составов являются полимерные полиолы, в частности простые полиэфирдиолы, включая, без ограничения, пропиленгликоль и полиэтиленгликоль, монометиловые эфиры полиэтиленгликоля. Пропиленгликоль доступен в диапазоне молекулярных масс мономера от ~425 до ~2700. Полиэтиленгликоль и монометиловый эфир полиэтиленгликоля также доступны в диапазоне молекулярных масс от ~200 до ~35000, включая, без ограничения, ПЭГ200, ПЭГ300, ПЭГ400, ПЭГ1000 ПЭГ MME 550, ПЭГ MME 600, ПЭГ MME 2000, ПЭГ MME 3350 и ПЭГ MME 4000. Другим полиэтиленгликолем является полиэтиленгликоль 400. Конечная концентрация полиола в составах по изобретению может находиться в диапазоне от 1 до 20% мас./об. или от 6 до 20% мас./об.

Состав также содержит рН-забуференный солевой раствор. Буфер может быть выбран, например, из группы, состоящей из трис, ацетатного, глутаматного, лактатного, малеатного, тартратного, фосфатного, цитратного, карбонатного, глицинатного, L-гистидинового, глицинового, сукцинатного, HEPES (4-(2-гидроксиэтил)-1-пиперазинэтансульфоновой кислоты), MOPS (3-(N-морфолино)пропансульфоновой кислоты), MES (2-(N-морфолино)этансульфоновой кислоты) и триэтаноламинного буфера. Буфер способен буферировать раствор до pH в диапазоне от 4 до 10, от 5,2 до 7,5 или от 5,8 до 7,0. В определенном аспекте изобретения буфер выбирают из группы, состоящей из фосфата, сукцината, L-гистидина, MES, MOPS, HEPES, ацетата или цитрата. Кроме того, буфер может быть выбран, например, из совместимых с USP буферов для парентерального введения, в частности, когда фармацевтическая композиция предназначена для парентерального применения. Концентрации буфера могут варьировать от 1 до 50 мМ или от 5 до 50 мМ. В некоторых аспектах буфер представляет собой L-гистидин с конечной концентрацией от 5 мМ до 50 мМ или сукцинат с конечной концентрацией от 1 мМ до 10 мМ. В некоторых аспектах L-гистидин находится в конечной концентрации 20 мМ ± 2 мМ.

Хотя солевой раствор (т.е. раствор, содержащий NaCl) является предпочтительным, другие соли, подходящие для приготовления составов, включают, без ограничения, CaCl₂, KCl и MgCl₂ и их комбинации. Вместо соли могут быть использованы неионные изотонические агенты, включая, без ограничения, сахарозу, трегалозу, маннит, сорбит и глицерин. Подходящие диапазоны солей включают, без ограничения, от 25 до 500 мМ или от 40 до 170 мМ. В одном из аспектов солевой раствор представляет собой NaCl, необязательно присутствующий в концентрации от 20 мМ до 170 мМ.

В предпочтительном варианте осуществления составы включают L-гистидиновый буфер с хлоридом натрия.

В некоторых вариантах осуществления составов, описанных в настоящей заявке, полисахарид-белковые конъюгаты содержат один или более пневмококковых полисахаридов, конъюгированных с белком-носителем. Белок-носитель может быть выбран из CRM₁₉₇, фрагмента B дифтерийного токсина (DTFB), DTFBC8, дифтерийного анатоксина (DT), столбнячного анатоксина (TT), C-фрагмента TT, коклюшного анатоксина, холерного анатоксина, LT E.coli, ST E. coli, экзотоксина А Pseudomonas aeruginosa и их комбинации. В некоторых аспектах один или более полисахарид-белковых конъюгатов конъюгированы с DTFB. В одном из аспектов все полисахарид-белковые конъюгаты получают с использованием водных растворов веществ. Например, состав полисахарид-белкового конъюгата может представлять собой 15-валентный пневмококковый конъюгатный (15vPnC) состав, по существу состоящий из полисахарида S. pneumoniae серотипов 1, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 9V, 14, 18C 19А, 19F, 22F, 23F и 33F, конъюгированных с полипептидом CRM₁₉₇. В другом аспекте один или более полисахарид-белковых конъюгатов получают в растворе ДМСО. В качестве примера, состав полисахарид-белкового конъюгата может представлять собой 15-валентный пневмококковый конъюгатный состав (15vPnC), в котором полисахарид-белковые конъюгаты серотипов 6A, 6B, 7F, 18C, 19A, 19F и 23F получены в ДМСО, а полисахарид-белковые конъюгаты серотипов 1, 3, 4, 5, 9V, 14, 22F и 33F получены в водном растворе.

В другом варианте осуществления фармацевтическая композиция доставляется в системе с контролируемым высвобождением. Например, агент можно вводить с помощью внутривенной инфузии, трансдермального пластыря, липосом или другими способами введения. В другом варианте используются полимерные материалы; например микросферы или имплант.

Композиции по настоящему изобретению могут также включать один или более белков S. pneumoniae. Примеры белков S. pneumoniae, подходящих для включения, включают белки, описанные в публикациях международных заявок на патент №№ WO 02/083855 и WO 02/053761.

Не смотря на приведенное описание различных вариантов осуществления изобретения со ссылкой на сопровождающее описание и чертежи, следует понимать, что изобретение не ограничено этими точными вариантами осуществления и что специалист в данной области техники может выполнить различные изменения и модификации без отступления от объема или сущности изобретения, определенных в прилагаемой формуле изобретения.

Приведенные ниже примеры иллюстрируют, но не ограничивают изобретение.

ПРИМЕРЫ

Пример 1. Получение белка-носителя DTFB.

Использование анионообменной мультимодальной хроматографии для получения DTFB

Очищенный CRM₁₉₇, полученный путем экспрессии в Pseudomonas fluorescens, как описано ранее (см. публикацию международной заявки на патент № WO 2012/173876 A1), расщепляли рекомбинантным трипсином в молярного соотношении трипсина к CRM₁₉₇ 1:500 в течение примерно 1 часа при примерно 22°С в 50 мМ Трис, рН 8,0. Затем добавляли дитиотреитол (DTT) в 50 мМ Трис, рН 8, до конечной концентрации 5 мМ в течение 30 минут при примерно 22°С для уменьшения количества дисульфидных связей между фрагментами А и В протеолитически расщепленного CRM₁₉₇.

Затем продукты реакции расщепления загружали в колонку анионообменной мультимодальной хроматографии (Capto™ Adhere, GE Healthcare), уравновешенную 50 мМ Трис, рН 8. Колонку промывали 50 мМ Трис, рН 8, и продукт DTFB элюировали градиентом от 0,45 М до 0,65 М хлорида натрия в 50 мМ Трис, рН 8. Продукт концентрировали и подвергали диафильтрации против 10 мМ фосфата калия, рН 8, с использованием мембраны для ультрафильтрации в тангенциальном (поперечном) потоке с порогом отсечения по молекулярной массе (NMWCO) 5 кДа. Продукт DTFB, содержащий ретентат, фильтровали через 0,2 мкм мембрану и хранили при 2-8°C. Концентрацию продукта определяли по величине поглощения при 280 нм, а чистоту оценивали с помощью SDS-PAGE в нередуцирующих условиях.

Результаты показывают, что элюент анионообменной мультимодальный хроматографии содержал относительно чистый DTFB, присутствующий в основном в виде мономера с небольшой долей димера. См. фиг. 1А. Образование димера связано с образованием дисульфидных связей между мономерами DTFB. Как показано в следующих разделах, DTT использовали на этапах хроматографии и ультрафильтрации для минимизации потенциальной возможности образования димера.

Использование катионообменной мультимодальной хроматографии для получения DTFB

Из-за присутствия димеров DTFB был исследован альтернативный метод очистки. Очищенный CRM₁₉₇, полученный путем экспрессии в Pseudomonas fluorescens, как описано выше, разбавляли до концентрации белка примерно 1 мг/мл с помощью 300 мМ Трис, рН 7,5. В раствор белка добавляли трипсин в молярном отношении трипсина к CRM₁₉₇, составляющем примерно 1:3250. Раствор инкубировали в течение примерно 20 часов при комнатной температуре. Затем добавляли DTT в 300 мМ Трис, рН 7,5, до конечной концентрации 10 мМ DTT для чтобы уменьшения количества дисульфидных связей между протеолитически расщепленным CRM₁₉₇ путем разделения фрагментов A и B.

Примерно через 75 минут раствор восстановленного белка загружали в колонку для катионообменной мультимодальной хроматографии (Capto™ MMC, GE Healthcare). Перед загрузкой раствора белка колонку уравновешивали при 2-8°С 300 мМ Трис, 10 мМ ДТТ, рН 7,5. После загрузки колонку промывали при 2-8°С 300 мМ Трис, рН 7,5, содержащим 200 мМ хлорида натрия и 10 мМ DTT, и затем продукт элюировали при 2-8°С 1 М хлорида натрия в 300 мМ Трис, рН 8,5. В партию добавляли примерно 0,002% мас./об. PS-20 до этапа концентрирования при 2-8°C, используя мембрану для ультрафильтрации в тангенциальном потоке с NMWCO 5 кДа. После концентрирования в партию добавляли дополнительное количество PS-20 до достижения 0,02% мас./об. концентрации PS-20, и партию подвергали диафильтрации против 100 мМ фосфата калия, 10 мМ DTT, pH 8. Далее партию концентрировали путем фильтрации в тангенциальном потоке, используя 5 кДа мембрану. Конечный ретентат фильтровали через 0,2 мкм фильтр и хранили в замороженном виде или при 2-8°С до конъюгации.

Образцы DTFB анализировали методом SDS-PAGE в редуцирующих условиях (фиг. 1B и 1C). Денситометрический анализ геля показал, что конечный объемный промежуточный продукт, полученный после фильтрации через 0,2-микронную мембрану (FBI) имеет чистоту >98%.

Конечный объемный промежуточный продукт (FBI), показанный на фиг. 1С, анализировали с помощью жидкостной хроматографии с масс-спектрометрией (ЖХ-МС) для измерения массы интактного белка. ЖХ-МС анализ выполняли на образцах после восстановления с помощью DTT. Деконволюция необработанных данных из основного пика дала в результате измеренную массу 37194,2 Да. Это измерение массы согласуется с теоретической массой 37194,4 Да для DTFB, что подтверждает получение целевой аминокислотной последовательности.

Пептидную карту получали путем расщепления комбинацией трипсина, эндопротеиназы Asp-N и эндопротеиназы Glu-C. Образец подвергали восстановительному алкилированию йодацетамидом в присутствии 6 М гуанидин-HCl и расщепляли в течение примерно 16-17 часов при 37°С с каждым ферментом в отдельности. Расщепления останавливали добавлением муравьиной кислоты. Пептиды отделяли и анализировали методом ЖХ-МС. Используя комбинацию пептидов, идентифицированных путем отдельных расщеплений, покрытие аминокислотной последовательности составило примерно 98%. Найденные пептиды соответствовали предсказанной последовательности DTFB.

Альтернативный процесс катионообменной мультимодальной хроматографии для очистки DTFB

Очищенный CRM₁₉₇, полученный путем экспрессии в Pseudomonas fluorescens, как описано выше, разбавляли с помощью 300 мМ Трис, рН 7,5, до концентрации белка примерно 5 мг/мл. Трипсин добавляли к раствору белка до молярного соотношения трипсина к CRM₁₉₇, составляющего примерно 1:3000. Раствор инкубировали в течение примерно 15-20 часов при примерно 22°С. Затем добавляли DTT в 300 мМ Трис, рН 7,5 до конечной концентрации ≥10 мМ DTT для уменьшения количества дисульфидных связей между протеолитически расщепленными CRM₁₉₇ путем разделения фрагментов A и B.

Раствор восстановленного белка загружали в колонку для катионообменной мультимодальной хроматографии (Capto™ MMC, GE Healthcare) в количестве примерно 25 г белка на литр смолы. Перед загрузкой раствора белка колонку уравновешивали при примерно 22°С с помощью 300 мМ Трис, 10 мМ DTT, рН 7,5. После загрузки колонку промывали при примерно 22°С 300 мМ Трис, рН 7,5, содержащим 200 мМ хлорида натрия и 10 мМ DTT, и затем продукт элюировали при 22°С 1 М хлорида натрия в 300 мМ Трис, рН 8,5. Продукт DTFB из катионообменной мультимодальной хроматографии может быть подвергнут диафильтрации и концентрированию с использованием мембраны для ультрафильтрации в тангенциальном потоке с NMWCO 5 кДа и фильтрации через 0,2-микронную мембрану, как описано выше.

Образцы DTFB из катионнообменного мультимодального процесса анализировали методом SDS-PAGE в редуцирующих условиях (фиг. 1D). Денситометрический анализ геля показал, что белковый продукт DTFB, элюированный из катионообменной мультимодальной колонки, является высокоочищенным.

Влияние pH буфера, ионной силы и концентрации сурфактанта PS-20 на стабильность DTFB во время ультрафильтрации

Исследования pH буфера, ионной силы и поверхностно-активного вещества PS-20 выполняли для решения проблемы образования белковых частиц, наблюдаемых в ходе стадии ультрафильтрации DTFB. Концентрацию DTFB доводили до 100 мМ с помощью фосфата калия с рН 7, 7,5 или 8, содержащим хлорид натрия в количестве 0, 200 или 500 мМ. Дифференциальную сканирующую калориметрию использовали для оценки стабильности (температуры плавления, Tm) растворов DTFB в виде зависимости рН от концентрации хлорида натрия. Как показано в таблице 1, увеличение рН с 7 до 8 приводило к увеличению Tm DTFB примерно на 3°C. Хлорид натрия в диапазоне от 0 до 500 мМ не оказывал значительного влияния на Tm при исследованных значениях рН.

Таблица 1: Стабильность растворов DTFB в зависимости от pH буфера и концентрации хлорида натрия согласно результатам дифференциальной сканирующей калориметрии.

Значение pH калий фосфатного буфера	Концентрация хлорида натрия (мМ)	Температура плавления, Tm (°C)
7	0	50,6
	200	50,4
500	50,6
7.5	0	51,5
	200	51,3
500	51,2
8	0	52,8
	200	53,2
500	53,3

В отдельном исследовании значение рН раствора очищенного DTFB доводили до рН 6,0, рН 7,0 и рН 8,5 помощью 100 мМ фосфата калия, содержащего хлорид натрия в количестве 0, 150, 500 и 1000 мМ. Растворы выдерживали в течение ночи при комнатной температуре и затем центрифугировали для удаления осажденного белка. Надосадочные жидкости анализировали на концентрацию белка методом гель-фильтрационной хроматографии с определением оптической плотности при UV280 (фиг. 2). Концентрация белка в супернатанте в этом исследовании не зависела от рН раствора в присутствии 0 и 150 мМ хлорида натрия. Однако при более высоких концентрациях хлорида натрия (500 и 1000 мМ) результаты показали выраженное уменьшение концентрации белка в супернатанте, свидетельствующее о снижении стабильности DTFB уменьшением рН буфера с рН 7,0 или 8,5 до 6,0.

Влияние концентрации PS-20 на стабильность DTFB изучали путем добавления увеличивающихся количеств PS-20 в растворы DTFB в 50 и 100 мМ растворах фосфата калия с pH 8 и в 50 мМ фосфате калия с 150 мМ хлоридом натрия, pH 8. Растворы перемешивали вихревым способом в течение 5 минут и затем центрифугировали. Супернатнатны анализировали в отношении концентрации белка методом гель-фильтрационной хроматографии с определением оптической плотности при UV280 (фиг. 3). Значительную потерю белка в результате перемешивания вихревым способом наблюдали в образцах, не содержащих PS-20. Извлечение DTFB было заметно улучшено в образцах, содержащих ≥0,01% мас./об. PS-20.

ПРИМЕР 2: Получение капсульных полисахаридов S. pneumoniae.

Способы культивирования пневмококков хорошо известны в данной области. См., например, Chase, 1967, Methods of Immunology and Immunochemistry 1:52. Способы получения пневмококковых капсульных полисахаридов также хорошо известны в данной области. См., например, европейский патент № EP0497524. Изоляты пневмококковых подтипов доступны из Американской коллекции типовых культур (Manassas, VA). Бактерии идентифицированы как инкапсулированные, неподвижные, грамположительные, ланцетные диплококки, которые при росте на кровяном агаре являются альфа-гемолитическими. Подтипы можно дифференцировать по результатам реакции подавления (Quelling) с использованием специфических антисывороток. См., например, патент США. 5,847,112.

Банки клеток, представляющие каждый из представляющих интерес серотипов S. pneumoniae, получали из коллекции культур Merck (Rahway, NJ) в замороженном флаконе. Оттаявшую посевную культуру переносили в семенной ферментер, содержащий предварительно стерилизованную питательную среду, подходящую для S. pneumoniae. Культуру выращивали в семенном ферментере с контролируемой температурой и pH. Весь объем семенного ферментера переносили в ферментер для продуцирования, содержащий предварительно стерилизованную питательную среду. Ферментация продуктов была конечной стадией процесса клеточного роста. Контролировали температуру, pH и скорость перемешивания.

Процесс ферментации прекращали путем добавления инактивирующего агента. После инактивации партию переносили в резервуар для инактивации, где ее выдерживали при перемешивании при контролируемой температуре. Клеточный дебрис удаляли с помощью комбинации центрифугирования и фильтрации. Партию подвергали ультрафильтрации и диафильтрации. Затем партию подвергли фракционированию растворителем для удаления примеси и извлечения полисахарида.

ПРИМЕР 3: Конъюгация полисахаридов с белком-носителем DTFB по реакции восстановительного аминирования в водном растворе

Получение конъюгата серотип 3-DTFB (ST3-DTFB) для изучения иммуногенности у мышей

Очищенный полисахарид серотипа 3, полученный, как описано в Примере 2, растворяли в воде. Размер Ps уменьшали до средней молекулярной массы примерно 200 кДа с помощью зондового ультразвукового устройства, используя образец, охлажденный во льду. Обработанный ультразвуком образец фильтровали через 0,2 микронный фильтр и хранили при 2-8°С. Раствор полисахарида концентрировали диафильтрацией с использованием мембраны для фильтрации в тангенциальном потоке с NMWCO 30 кДа.

Полисахарид готовили для конъюгации путем окисления метапериодатом натрия (см. Anderson et al., 1986, J. Immunol. 137:1181-1186; и публикация заявки на патент США № US20110195086). К раствору полисахарида в 50 мМ ацетате натрия добавляли 100 мМ раствор метапериодата натрия. Образец перемешивали в течение 14-18 часов при 19-25°С в защищенном от света месте. Добавляли этиленгликоль (с молярным избытком 100:1 относительно повторяющихся звеньев полисахарида) и перемешивали еще в течение 16-18 часов при 19-25°С, чтобы блокировать остаточный метапериодат натрия и остановить реакцию окисления. Полученный раствор подвергали диафильтрации против 10 объемов воды. Раствор окисленного полисахарида хранили в аликвотах при -70°С.

Окисленный периодатом полисахарид смешивали с DTFB, полученным, как описано в Примере 1 (используя анионообменную мультимодальную хроматографию), при массовом соотношении полисахарида к белку 0,6:1. Фосфат калия, рН 6,4, и хлорид никеля добавляли до конечных концентраций 145 мМ и 2,2 мМ, соответственно. Затем добавляли цианоборогидрид натрия до примерно 1-2 молярных эквивалентов. Реакцию защищали от света и проводили в течение 120 часов при 2-8°С.

Затем смесь подвергали диализу против 2 замен 25 мМ калий-фосфатного буфера, рН 6,4, с 0,3 М хлоридом натрия при 2-8°С в течение 14-18 часов. Нерастворимые материалы удаляли непродолжительным центрифугированием, а конъюгат дополнительно обессоливали гель-фильтрационной хроматографией (SEC) для выделения свободного полисахарида и белка. SEC-обессоленный конъюгат концентрировали с помощью центрифужного концентратора с NMWCO 30 кДа.

Приготовление конъюгата серотипа 3-DTFB для изучения иммуногенности у младенцев макак-резус

Очищенный порошок пневмококкового капсульного полисахарида серотипа 3 растворяли в воде и фильтровали через 0,45 мкм фильтр. Партию гомогенизировали для уменьшения молекулярной массы Ps и фильтровали через 0,22 микронный фильтр. Уменьшение размера полисахарида Streptococcus pneumoniae до проведения конъюгации было описано ранее как средство получения полисахарида с более специфическими, воспроизводимыми и управляемыми физическими свойствами (Marburg et al., 1997, патент США 5623057). Как описано у Marburg et al., известно, что уменьшение размера полисахарида увеличивает растворимость и фильтруемость и уменьшает полидисперсность и вязкость, тем самым улучшая консистенцию и упрощая процесс конъюгации. Уменьшение размера полисахарида серотипа 19F S. pneumoniae путем гомогенизации было описано ранее (Lander et al., 2000, Biotechnol. Prog. 2000, 16, 80-85). Затем уменьшенный в размере полисахарид концентрировали и подвергали диафильтрации против воды, используя мембрану для ультрафильтрации в тангенциальном потоке с NMWCO 10 кДа.

Затем добавляли 50 мМ ацетата натрия и инициировали активацию полисахарида путем добавления 100 мМ раствора метапериодата натрия для образования в полисахариде реакционноспособных альдегидов. Партию инкубировали при примерно 22°С в течение примерно 12 часов. Партию подвергали диафильтрации против 10 мМ фосфата калия, рН 6,4, используя мембрану для ультрафильтрации в тангенциальном потоке с NMWCO 10 кДа при ≤8°С, и богатый продуктом ретентат концентрировали.

Раствор активированного полисахарида смешивали с водой и 1,5 М фосфатом калия, рН 7,0. Очищенный DTFB фильтровали через 0,2 микронную мембрану и затем объединяли с отрегулированным буфером раствором полисахарида при массовом соотношении полисахарида к белку 1,3:1. Затем раствор фильтровали через 0,2 микронную мембрану. В партию добавляли хлорид никеля до конечной концентрации примерно 2 мМ, используя 100 мМ маточный раствор хлорида никеля. Затем добавляли цианоборогидрид натрия (2 моля на моль повторяющегося звена полисахарида). Партию оставляли для осуществления реакции на примерно 120 часа при примерно 10°С для максимального потребления полисахарида и белка.

После реакции конъюгации партию разбавляли до концентрации полисахарида примерно 3,5 г/л, охлаждали до 2-8°С, фильтровали через 1,2 мкм фильтр и подвергали диафильтрации против 100 мМ фосфата калия, рН 7,0, при 2-8°С, используя мембрану для ультрафильтрации в тангенциальном потоке с NMWCO 100 кДа. Затем извлеченную из ретентата партию разбавляли до примерно 2,0 г полисахарида/л и корректировали рН добавлением 1,2 М бикарбоната натрия, рН 9,4. Добавляли боргидрид натрия (1 моль на моль повторяющегося звена полисахарида). Затем добавляли 1,5 М фосфат калия, рН 6,0.

Затем партию концентрировали и выполняли диафильтрацию против 10 мМ L-гистидина в 150 мМ хлориде натрия, pH 7,0, при 2-8°C, используя мембрану для ультрафильтрации в тангенциальном потоке с NMWCO 300 кДа. Ретентат фильтровали через 0,2 микронный фильтр, и концентрацию полисахарида доводили до 1,0 г/л путем добавления дополнительного 10 мМ L-гистидина в 150 мМ хлориде натрия, рН 7,0. Партию аликвотировали и замораживали при -60°С.

ПРИМЕР 4: Конъюгация серотипов 1, 3, 4, 5, 6А, 6В, 7F, 9V, 14, 18С, 19А, 19F, 22F, 23F и 33F с CRM₁₉₇ по реакции восстановительного аминирования в водном растворе

Конъюгацию полисахаридов разных серотипов с очищенным белком-носителем CRM₁₉₇ выполняли независимо, используя общий технологический процесс. Полисахарид растворяли, уменьшали его размер, химически активировали и заменяли буфер с помощью ультрафильтрации. Затем выполняли конъюгацию очищенного CRM₁₉₇ с активированным полисахаридом, используя NiCl₂ (2 мМ) в реакционной смеси, и полученный конъюгат очищали ультрафильтрацией перед конечной фильтрацией через 0,2 микронный фильтр. Значения некоторых параметров процесса на каждой стадии, таких как pH, температура, концентрация и время, регулировали до значений, специфичных для серотипа, как указано в разделе ниже.

Уменьшение размера полисахаридов и окисление

Порошок очищенного пневмококкового капсульного полисахарида растворяли в воде, и все серотипы, кроме серотипа 19А, фильтровали через 0,45 мкм фильтр. Серотипы 1, 3, 4, 5, 6А, 6В, 7F, 9V, 14, 19А, 19F, 22F, 23F и 33F гомогенизировали для уменьшения молекулярной массы полисахарида. Серотип 18C уменьшали в размере путем гомогенизации или кислотного гидролиза при ≥90°C. Размер серотипа 19А не уменьшали в силу его изначально относительно низкого размера. Для каждого серотипа выставляли соответствующее для него давление гомогенизации и использовали соответствующее количество проходов через гомогенизатор (150-1000 бар; 4-7 проходов) для достижения молекулярной массы, специфической для серотипа. Полисахарид уменьшенного размера фильтровали через 0,2 микронный фильтр, а затем концентрировали и подвергали диафильтрации против воды, используя мембрану для ультрафильтрации в тангенциальном потоке с NMWCO 10 кДа. Для гидролизованного кислотой серотипа 18С использовали мембрану с NMWCO 5 кДа.

Затем температуру раствора полисахарида доводили до значения, специфического для серотипа (4-22°C), и регулировали pH (4-5), используя ацетатно-натриевый буфер, чтобы минимизировать уменьшение размера полисахарида из-за активации. Для всех серотипов (кроме серотипа 4) активацию полисахарида инициировали путем добавления 100 мМ раствора метапериодата натрия. Количество добавляемого метапериодата натрия зависело от серотипа и составляло примерно от 0,1 до 0,5 моль метапериодата натрия на моль повторяющегося звена полисахарида. Специфическая для серотипа загрузка метапериодата натрия заключалась в достижении целевого уровня активации полисахарида (молей альдегида на моль повторяющегося звена полисахарида). Для серотипа 4, перед добавлением метапериодата натрия партию инкубировали при примерно 50°С и рН 4,1, чтобы частично декетализировать полисахарид.

Для всех серотипов, за исключением серотипов 5 и 7F, активированный продукт подвергали диафильтрации против 10 мМ фосфата калия, рН 6,4, используя мембрану для ультрафильтрации в тангенциальном потоке с NMWCO 10 кДа. Для гидролизованного кислотой серотипа 18С использовали мембрану с NMWCO 5 кДа. Серотипы 5 и 7F подвергали диафильтрации против 10 мМ ацетата натрия. Ультрафильтрацию для всех серотипов проводили при 2-8°С.

Конъюгация полисахарида с CRM₁₉₇

Раствор окисленного полисахарида смешивали с водой и 1,5 М фосфатом калия, рН 6,0 или 7,0, в зависимости от серотипа. Значение рН буфера подбирали для улучшения стабильности активированного полисахарида во время реакции конъюгации. Очищенный CRM₁₉₇, полученный экспрессией в Pseudomonas fluorescens, как описано ранее (см. публикацию международной заявки на патент № WO 2012/173876 A1), фильтровали через 0,2 микронный фильтр и объединяли с забуференным раствором полисахарида при массовом соотношении полисахарида к CRM₁₉₇ в диапазоне от 0,4 до 1,0 мас./мас. в зависимости от серотипа. Массовое соотношение выбирали для контроля соотношения полисахарида к CRM₁₉₇ в полученном конъюгате. Концентрации полисахарида и фосфата были специфическими для серотипа и варьировали от 3,6 до 10,0 г/л и от 100 до 150 мМ, соответственно, в зависимости от серотипа. Концентрацию полисахарида, специфическую для серотипа, выбирали для контроля размера получаемого конъюгата. Затем раствор фильтровали через 0,2 мкм фильтр. Хлорид никеля в виде 100 мМ раствора хлорида никеля добавляли до достижения концентрации примерно 2 мМ. Добавляли цианоборогидрид натрия (2 моля на моль повторяющегося звена полисахарида). Конъюгация длилась в течение специфического для серотипа времени (от 72 до 120 часов) для достижения максимального потребления полисахарида и белка.

Кислотно-гидролизованный серотип 18С конъюгировали при 37°С в 100 мМ фосфате калия при рН, равном примерно 8, с цианоборогидридом натрия, используя концентрации полисахарида и белка примерно 12,0 г/л и 6,0 г/л, соответственно.

Восстановление боргидридом натрия

После реакции конъюгации партию разбавляли до концентрации полисахарида примерно 3,5 г/л, охлаждали до 2-8°C и фильтровали через 1,2 микронный фильтр. Все серотипы (кроме серотипа 5) подвергали диафильтрации против 100 мМ фосфата калия, рН 7,0 при 2-8°С, используя мембрану для ультрафильтрации в тангенциальном потоке с NMWCO 100 кДа. Затем извлеченную из ретентата партию разбавляли до примерно 2,0 г полисахарида/л, и значение рН доводили добавлением 1,2 М бикарбоната натрия, рН 9,4. Добавляли боргидрид натрия (1 моль на моль повторяющегося звена полисахарида). Затем добавляли 1,5 М фосфат калия, рН 6,0. Серотип 5 подвергали диафильтрации против 300 мМ фосфата калия, используя мембрану для ультрафильтрации в тангенциальном потоке с NMWCO 100 кДа.

Окончательная фильтрация и хранение продукта

Затем партию концентрировали и подвергали диафильтрации против 10 мМ L-гистидина в 150 мМ хлориде натрия, рН 7,0 при 4°С, используя мембрану для ультрафильтрации в тангенциальном потоке с NMWCO 300 кДа. Партию ретентата фильтровали через 0,2 микронный фильтр.

Серотип 19F инкубировали в течение примерно 7 дней при 22°С, подвергали диафильтрации против 10 мМ L-гистидина в 150 мМ хлориде натрия, рН 7,0 при 4°С, используя мембрану для ультрафильтрации в тангенциальном потоке с NMWCO 100 кДа, и фильтровали через 0,2 микронный фильтр.

Концентрацию полисахарида в партии доводили до 1,0 г/л путем добавления 10 мМ L-гистидина в 150 мМ хлориде натрия, рН 7,0. Партию аликвотировали и замораживали при -60°С.

ПРИМЕР 5: Способы конъюгации серотипов 6А, 6В, 7F, 18С, 19А, 19F и 23F с CRM197 по реакции восстановительного аминирования в диметилсульфоксиде.

Конъюгацию полисахаридов разных серотипов с очищенным белком-носителем CRM₁₉₇ выполняли независимо, используя общий технологический процесс. Полисахарид растворяли, доводили размер до целевой молекулярной массы, химически активировали и заменяли буфер с помощью ультрафильтрации. Активированный полисахарид и очищенный CRM₁₉₇ лиофилизировали по отдельности и повторно растворяли в диметилсульфоксиде (ДМСО). Затем растворенные растворы полисахарида и CRM₁₉₇ объединяли и конъюгировали, как описано ниже. Полученный конъюгат очищали ультрафильтрацией перед конечным фильтрованием через 0,2-микронный фильтр. Значения некоторых параметров процесса на каждой стадии, таких как pH, температура, концентрация и время, регулировали до значений, специфических для серотипа, как указано в разделе ниже.

Уменьшение размера полисахаридов и окисление

Порошок очищенного пневмококкового капсульного полисахарида растворяли в воде, и все серотипы, кроме серотипа 19А, фильтровали через 0,45 мкм фильтр. Все серотипы, кроме серотипов 18C и 19A, гомогенизировали для уменьшения молекулярной массы полисахарида. Для каждого серотипа выставляли соответствующее для него давление гомогенизации и использовали соответствующее количество проходов через гомогенизатор (150-1000 бар; 4-7 проходов). Размер серотипа 18C уменьшали кислотным гидролизом при ≥90°C. Размер серотипа 19А не уменьшали.

Уменьшенный в размере полисахарид фильтровали через 0,2 микронный фильтр, а затем концентрировали и подвергали диафильтрации против воды, используя мембрану для ультрафильтрации в тангенциальном потоке с NMWCO 10 кДа. Мембрану с NMWCO 5 кДа использовали для серотипа 18C.

Затем температуру раствора полисахарида доводили до специфического для серотипа значения (4-22°C), а pH (4-5) регулировали, используя натрий-ацетатный буфер. Активацию полисахарида инициировали добавлением раствора метапериодата натрия. Количество добавляемого метапериодата натрия зависело от серотипа и составляло примерно от 0,1 до 0,5 моль метапериодата натрия на моль повторяющегося звена полисахарида.

Для всех серотипов активированный продукт подвергали диафильтрации против 10 мМ фосфата калия, рН 6,4, используя мембрану для ультрафильтрации в тангенциальном потоке с NMWCO 10 кДа. Мембрану с NMWCO 5 кДа использовали для серотипа 18C. Ультрафильтрацию для всех серотипов проводили при 2-8°С.

Конъюгация полисахарида с CRM₁₉₇

Очищенный CRM₁₉₇, полученный путем экспрессии в Pseudomonas fluorescens, как описано ранее (см. публикацию международной заявки на патент № WO 2012/173876 A1), подвергали диафильтрации против 2 мМ фосфатного буфера с pH 7, используя мембрану для ультрафильтрации в тангенциальном потоке с NMWCO 5 кДа, и фильтрации через 0,2 микронный фильтр.

Для подготовки к лиофилизации готовили раствор окисленного полисахарида с водой и сахарозой. Для подготовки к лиофилизации готовили раствор белка с водой, фосфатным буфером и сахарозой. Концентрацию сахарозы меняли в пределах от 1 до 5% для достижения оптимального повторного растворения в ДМСО после лиофилизации.

Составленные растворы полисахарида и CRM₁₉₇ лиофилизировали по отдельности. Лиофилизированный полисахарид и CRM₁₉₇ повторно растворяли в ДМСО и объединяли, используя Т-образный миксер. Добавляли цианоборогидрид натрия (1 моль на моль повторяющегося звена полисахарида), и конъюгацию продолжали в течение специфического для серотипа времени (от 1 до 48 часов) для достижения целевого размера конъюгата.

Восстановление боргидридом натрия

После реакции конъюгации добавляли боргидрид натрия (2 моль на моль повторяющегося звена полисахарида). Партию разводили в 150 мМ хлориде натрия при примерно 4°С. Затем для нейтрализации рН добавляли калий-фосфатный буфер. Партию концентрировали и подвергали диафильтрации при примерно 4°С против 150 мМ хлорида натрия, используя мембрану для ультрафильтрации в тангенциальном потоке с NMWCO 10 кДа.

Окончательная фильтрация и хранение продукта

Затем каждую партию концентрировали и подвергали диафильтрации против 10 мМ L-гистидина в 150 мМ хлориде натрия, рН 7,0, при 4°С, используя мембрану для ультрафильтрации в тангенциальном потоке с NMWCO 300 кДа. Порцию ретентата фильтровали через 0,2 мкм фильтр.

Серотип 19F инкубировали в течение примерно 5 дней, подвергали диафильтрации против 10 мМ L-гистидина в 150 мМ хлориде натрия, рН 7,0, при примерно 4°С, используя мембрану для ультрафильтрации в тангенциальном потоке с NMWCO 300 кДа, и фильтровали через 0,2 микронный фильтр.

Партию разбавляли дополнительным количеством 10 мМ L-гистидина в 150 мМ хлориде натрия, рН 7,0, аликвотировали и замораживали при ≤-60°С.

ПРИМЕР 6: Изучение иммуногенности состава одновалентного конъюгата ST3-DTFB у мышей

Выполняли сравнительную оценку иммуногенности ST3-DTFB и ST3-CRM₁₉₇ на мышиной модели. Адъювантные составы для введения мышам готовили путем смешивания 24 мкл стерильно отфильтрованного конъюгата (1:10 в солевом растворе - 0,1258 мг DTFB или CRM₁₉₇, конъюгированного с полисахаридом, на мл) с 62 мкл APA и 3,664 мл стерильного солевого раствора для дозы полисахарида в количестве 0,08 мкг и 5 мкг алюминия на 100 мкл. Составленные вакцины хранили в отдельных пробирках с боросиликатным покрытием при 2-8°C для сохранения отдельных иммунизаций.

ST3-DTFB оценивали у самок мышей Balb/C 6-8 недель (n=10 на группу). Мышей иммунизировали ST3-DTFB/APA и двумя партиями ST3-CRM₁₉₇/APA, изготовленными с использованием уникальных препаратов конъюгата ST3-DTFB и ST3-CRM₁₉₇, приготовленных, как описано в примерах 3 и 4. Концентрация PnPs ST3 составляла 0,08 мкг на 0,1 мл дозу с 5 мкг APA, вводимого внутрибрюшинно в дни 0, 14 и 28. Сыворотки собирали до начала исследования (до) и в день 39 после введения дозы 3 (PD3) и тестировали методом ИФА согласно протоколам ВОЗ для ST3 [стандартизированные протоколы Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ)], а также методом ИФА на белковом носителе (CRM₁₉₇ и DTFB). В день 49 мышей внутрибрюшинно заражали S. pneumoniae серотипа 3 (207 КОЕ/0,5 мл).

Результаты стандартизированного (ВОЗ) ИФА (фиг.4) показали, что мыши, иммунизированные как ST3-DTFB/APA, так и ST3-CRM₁₉₇/APA, имели сходные 3 титра PnPs после PD3. Мыши, иммунизированные ST3-DTFB/APA и ST3-CRM₁₉₇/APA, показали ≥90% защиту от заражения серотипом 3, что было значительно выше по сравнению с мышами, иммунизированными солевым раствором и APA (фиг. 5).

ПРИМЕР 7: Получение 15-валентной пневмококковой конъюгатной вакцины с различными поверхностно-активными веществами и стабилизаторами

Пневмококковые полисахарид-белковые конъюгаты, полученные как описано выше, использовали для приготовления 15-валентной пневмококковой конъюгатной вакцины (PCV15), содержащей серотипы 1, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19A, 19F 22F, 23F и 33F. Составы получали с использованием конъюгатов пневмококковый полисахарид-CRM₁₉₇, полученных по реакции восстановительного аминирования в водных растворах (пример 4) или в ДМСО (пример 5). Конъюгаты ST3-DTFB получали в соответствии с примером 3. Необходимые объемы объемных конъюгатов, необходимые для получения целевой конечной концентрации отдельного серотипа, рассчитывали на основе объема партии и объемных концентраций полисахарида. 15 конъюгатов объединяли с наполнителями, выбранными из хлорида натрия, L-гистидинового буфера, pH 5,8, с PS-20, PS-80 или P188.

Стерильно приготовленную массу осторожно смешивали во время и после перемешивания с объемным фосфат-алюминиевым адъювантом (APA) с пропиленгликолем (ПГ) или без него и с полиэтиленгликолем 400 (ПЭГ400) или без него. В различных составах изучали по две концентрации конъюгатов и APA. Один состав содержал 8 мкг/мл полисахарида серотипа 6B, 4 мкг/мл полисахарида всех других серотипов и 250 мкг/мл APA. Другой состав содержал 16 мкг/мл полисахарида серотипа 6B, 8 мкг/мл полисахарида всех других серотипов и 500 мкг/мл APA. Приготовленные лекарственные формы вакцины хранили при 2-8°С.

ПРИМЕР 8: Влияние наполнителей на стабильность состава пневмококковой конъюгатной вакцины, содержащей конъюгаты, полученные по реакции восстановительного аминирования в водном растворе

Стабильность 15-валентной пневмококковой конъюгатной вакцины (PCV15), полученной, как описано в Примере 7, оценивали в различных условиях наполнителя после исследования влияния перемешивания, рециркуляции и перемешивания в ротационном смесителе с целью имитации стрессов, возникающих в процессе производства и транспортировки. PCV15 готовили в 20 мМ L-гистидине, рН 5,8, 150 мМ хлориде натрия, используя одну из двух концентраций конъюгатов и АРА, перечисленных в примере 7. Поскольку результаты, полученные для двух составов с разными концентрациями конъюгатов и APA, были очень похожими, в этом примере показаны результаты только для состава PCV15, содержащего более низкие концентрации конъюгатов и APA. Для исследования влияния перемешивания составы PCV15 смешивали в стеклянном сосуде, используя магнитную мешалку. Для исследования влияния рециркуляции и сдвиговых усилий рециркуляцию составов PCV15 выполняли в петле трубы. Для ротационных исследований готовили базовую композицию PCV15 (L-гистидин, рН 5,8 и хлорид натрия), в которую добавляли поверхностно-активные вещества или стабилизаторы, как описано в Примере 7 и показано в Таблице 2. Исследования влияния перемешивания выполняли путем перемешивания с помощью лопастной боковой мешалки в течение 24 часов при 4°С. Для оценки составов использовали визуальную оценку. Путь луча света, проходящего через сосуд, позволял обнаруживать частицы. Кроме того, влияние стрессов, возникающих во время производства и транспортировки, на гранулометрический состав оценивали методом статического рассеяния света (SLS). Статическое рассеяние света, наблюдаемое для лекарственного продукта на основе суспензии, является более чувствительным в отношении детектирования агрегации, о чем свидетельствует гранулометрический состав. Однородный (мономодальный) гранулометрический состав лекарственного продукта PCV15 указывает на неагрегированный лекарственный продукт. Однако неоднородный (полидисперсный), полимодальный гранулометрический состав указывает на агрегацию.

Стабильность PCV15 в исследовании влияния перемешивания

Составы PCV15, содержащие лекарственные вещества на основе пневмококкового полисахарида, конъюгированного с CRM₁₉₇ (обозначенные как PCV15_Aq) по реакции восстановительного аминирования в водных условиях, как описано в примере 4, подвергали скринингу, используя лабораторную экспериментальную установку для смешивания, как указано выше (стакан и магнитная мешалка). PCV15_Aq содержит полисахарид S. pneumoniae серотипов 1, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19A, 19F, 22F, 23F и 33F, конъюгированный с CRM₁₉₇ по реакции восстановительного аминирования в водных условиях. PCV15 в 20 мМ L-гистидине, 150 мМ NaCl с APA готовили в лаборатории в виде партии препарата в количестве 100 мл, используя стакан и магнитную мешалку. В отсутствие поверхностно-активного вещества составы PCV15_Aq имели тенденцию к повреждению в процессе приготовления (перемешивания), что приводило к агрегациии вакцинного лекарственного продукта во время перемешивания с целью обеспечения гомогенности вакцинного лекарственного продукта.

Во время скрининговых исследований различных наполнителей было обнаружено, что класс неионных триблок-сополимеров обеспечивает устойчивую стабильность. Полоксамер 188 (P188) выбирали для контроля агрегации и обеспечения надежного и стабильного состава лекарственного препарата. Составы PCV15_Aq готовили с 20 мМ L-гистидином, рН 5,8, 150 мМ NaCl, APA и либо без P188, либо с P188 с концентрацией 0,08% мас./об. или с 0,24% мас./об. Влияние времени постоянного перемешивания на магнитной мешалке оценивали етодом статического рассеяния света (фиг.6-7). Гранулометрический состав оценивали с помощью устройства Malvern Mastesizer 2000. Калибровку осуществляли, используя 5 NIST стандарт с размером частиц 5 мкм, и получали ожидаемый гранулометрический состав. Для всех составов (с полоксамером 188 и без него) после добавления конъюгатов к APA наблюдали монодисперсный профиль гистограммы (T=0 ч перемешивания). Всего лишь 7 часов (T=7 ч перемешивания) непрерывного перемешивания состава без P188 привело к увеличении в гранулометрическом составе и агрегации (фиг.6). Однако составы, содержащие P188 в любой концентрации, не показали увеличения размера частиц или агрегации при непрерывном перемешивании до 24 часов (перемешивание=24 часа) (фиг.7).

Стабильность PCV15 в исследовании влияния горизонтального перемешивания

Дополнительные составы PCV15_Aq в 20 мМ L-гистидине, pH 5,8, 150 мМ NaCl и APA и с или без 0,2% мас./об. P188 готовили в лаборатории в виде партии препарата в количестве 100 мл, как описано в Примере 7. Имитацию транспортировки и обработки для оценки их влияния на стабильность вакцинного лекарственного препарата исследовали, используя горизонтальное перемешивание. Исследование представляет собой непосредственное перемешивание состава PCV15_Aq, при котором происходит взаимодействие с поверхностями в системе закрытого контейнера (шприц или флакон) и происходит воздействие конечных компонентов контейнера и границы раздела с воздухом на состав. 0,64 мл заливали в шприцы и закупоривали. Эти шприцы горизонтально вращали при 2-8°C в течение 24 часов, и оценивали гранулометрический состав методом SLS (фиг. 8A). Также проводили визуальную оценку (рис. 8В). Композиция PCV15_Aq в отсутствие P188, подвергнутая моделируемым стрессам, возникающим при транспортировке и обработке, показала увеличение в гранулометрическом составе лекарственного продукта и видимые признаки агломерации и агрегации в системе закрытого контейнера, такой как шприц. Композиция PCV15 с P188 не показала увеличения в гранулометрическом составе или видимых признаков агломерации и агрегации.

ПРИМЕР 9: Влияние наполнителей на стабилизацию лекарственного продукта - пневмококковой конъюгатной вакцины, приготовленного из смеси конъюгатов, полученных по реакции восстановительного аминирования в водных растворах и растворах ДМСО.

Многосичленные 15-валентные (PCV15) составы с APA в 20 мМ L-гистидине, pH 5,8, 150 мМ NaCl оценивали в лабораторных исследованиях, в которых имитировали транспортировку, чтобы обеспечить устойчивый при производстве и коммерчески жизнеспособный состав вакцинного лекарственного препарата. Состав PCV15_Aq содержал конъюгаты пневмококковый полисахарид-CRM₁₉₇, полученные по реакции восстановительного аминирования в водном растворе. Состав PCV_15Aq/Non-Aq содержал конъюгаты серотипов 6A, 6B, 7F, 19A, 19F и 23F, полученные по реакции восстановительного аминирования в ДМСО, и конъюгаты серотипов 1, 3, 4, 5, 9V, 14, 18C, 22F и 33F, полученные по реакции восстановительного аминирования в водном растворе, при этом все полисахариды были конъюгированы с CRM₁₉₇. Состав PCV_{15Aq/Non-Aq/ST3-DTFB} был аналогичен составу PCV_15Aq/Non-Aq, за исключением того, что серотип 3 был конъюгирован с белком DTFB, а не с CRM₁₉₇. Поскольку результаты, полученные для двух составов с разными концентрациями конъюгатов и APA, перечисленными в Примере 7, были очень похожими, в этом примере показаны результаты только для состава PCV15, содержащего более низкие концентрации конъюгатов и APA, если не указано иное. Prevnar 13® использовали в качестве другого примера поливалентного состава для проверки пригодности PS-80 в другом продукте пневмококковой конъюгатной вакцины. Он содержит полисахариды Streptococcus pneumoniae серотипов 1, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19A, 19F, 23F, конъюгированные с белком-носителем CRM₁₉₇, полисорбат 80, сукцинатный буфер и фосфат-алюминиевый адъювант. Конъюгаты получают по реакции восстановительного аминирования с использованием ДМСО или в водных условиях.

Для оценки влияния на стабильность вакцинных составов использовали исследование с горизонтальным перемешиванием. Исследование представляет собой непосредственное перемешивание составов, при котором происходит взаимодействие с поверхностями в системе закрытого контейнера (шприц или флакон) и происходит воздействие конечных компонентов контейнера и границы раздела с воздухом на состав. 0,64 мл заливали в шприцы и закупоривали. Эти шприцы горизонтально вращали при 2-8°С в течение 8 часов. Влияние времени при горизонтальном перемешивании на гранулометрический состав оценивали методом статического рассеяния света (SLS). Размер частиц и распределение оценивали с помощью устройства Malvern Mastesizer 2000. Калибровку осуществляли, используя 5 NIST стандарт с размером частиц 5 мкм, и получали ожидаемый гранулометрический состав. Как показано на фиг. 9, P188 не был эффективным стабилизатором, предотвращающим агрегацию состава PCV15_{Aq/Non-Aq/ST3-DTFB}, несмотря на то, что он оказался надежным стабилизатором для состава PCV15_Aq. В составе PCV15_{Aq/Non-Aq/ST3-DTFB} с P188 были отмечены увеличение в гранулометрическом составе и видимые признаки агломерации и агрегации.

В связи с неожиданным открытием того факта, что P188 не обеспечивает устойчивую стабильность состава PCV15, содержащего конъюгаты, образованные по реакции восстановительного аминирования в ДМСО, был проведен скрининг дополнительных стабилизаторов и наполнителей. Композиции PCV15_{Aq/Non-Aq/ST3-DTFB} (с APA в 20 мМ L-гистидине, pH 5,8, 150 мМ NaCl и различными стабилизаторами) заливали в шприцы и подвергали скринингу, используя горизонтальное перемешивание. Влияние времени при постоянном горизонтальном вращении оценивали методом визуальной оценки (таблица 2).

Таблица 2: Визуальное наблюдение составов PCV15_{Aq/Non-Aq/ST3-DTFB}, содержащих 64 мкг PnPs/мл и 250 мкг/мл APA без поверхностно-активного вещества, с P188, PS-80 или PS-20 после 1 часа перемешивания и до 24 часов горизонтального вращения в шприцах. Рассеяние света относится к отложению состава лекарственного продукта на поверхности системы замкнутого контейнера (например, шприца или флакона) и указывает осаждении композиции на поверхности.

Состав PCV15	Без вращения	1 ч вращение	3 ч вращение	6 ч вращение	8,5 ч вращение	24 ч вращение
Без ПАВ	Агрегации нет	Слабое рассеяние	Рассеяние	Рассеяние	Рассеяние	Образование частиц
0,05% мас./об. P188	Агрегации нет	Рассеяние	Рассеяние	Рассеяние	Не тестировали из-за рассеяния в более ранние моменты времени
0,1% мас./об. P188	Агрегации нет	Небольшое рассеяние	Небольшое рассеяние	Небольшое рассеяние
0,5% мас./об. P188	Агрегации нет	Агрегации нет	Агрегации нет	Агрегации нет	Агрегации нет	Агрегации нет
0,7% мас./об. P188	Агрегации нет	Агрегации нет	Агрегации нет	Агрегации нет	Агрегации нет	Агрегации нет
1,0% мас./об. P188	Агрегации нет	Агрегации нет	Агрегации нет	Агрегации нет	Агрегации нет	Агрегации нет
0,005% мас./об. PS-80	Агрегации нет	Рассеяние	Рассеяние	Рассеяние	Не тестировали из-за рассеяния или образования частиц в более ранние моменты времени
0,01% мас./об. PS-80	Агрегации нет	Рассеяние	Рассеяние	Рассеяние
0,05% мас./об. PS-80	Агрегации нет	Рассеяние	Рассеяние	Рассеяние
0,005% мас./об. PS-20	Агрегации нет	Рассеяние	Рассеяние и небольшое количество частиц	Рассеяние и большое количество частиц
0,01% мас./об. PS-20	Агрегации нет	Рассеяние	Рассеяние	Рассеяние и большое количество частиц
0,05% мас./об. PS-20	Агрегации нет	Агрегации нет	Агрегации нет	Небольшое рассеяние	Небольшое рассеяние	Образование частиц
0,07% мас./об. PS-20	Агрегации нет	Агрегации нет	Агрегации нет	Агрегации нет	Агрегации нет	Агрегации нет
0,1% мас./об. PS-20	Агрегации нет	Агрегации нет	Агрегации нет	Агрегации нет	Агрегации нет	Агрегации нет

Визуальная оценка составов PCV15_{Aq/Non-Aq/ST3-DTFB} показала отсутствие признаков агрегации при более высоких концентрациях P188 и PS-20 (таблица 2). Тем не менее, для оценки невидимого гранулометрического состава композиций PCV15_{Aq/Non-Aq/ST3-DTFB}, содержащих P188 (от 0,05 до 1,0% мас./об.) или PS-20 (от 0,005% мас./об. до 0,1% мас./об.) проводили исследование с более высоким разрешением методом SLS. Эти составы горизонтально вращали до 24 часов в 1,5 мл шприцах HyPak (Becton-Dickinson). Значения D[4,3], измеренные методом SLS, показаны на фиг. 10A-B. Результаты D[4,3] показывают, что более высокие концентрации PS-20 значительно улучшали физико-химическую стабильность состава, в то время как P188 при всех концентрациях не был эффективным. Как показано на фиг. 10B, горизонтальное перемешивание Prevnar 13® в течение до 24 часов показало увеличение значений D[4,3] и наличие частиц, указывающих на то, что препарат недостаточно защищен от агрегации, вызванной имитационной транспортировкой, и ведет себя аналогично составам, содержащим PS-80, приготовленным авторами изобретения.

Основываясь на данные, полученные авторами изобретения в присутствии PS-20 и PS-80, можно ожидать улучшения стабильности с другими конъюгатами пневмококковый полисахарид-белок, где один или более конъюгатов получены в апротонном растворителе.

ПРИМЕР 10: Исследование иммуногенности конъюгата ST3-DTFB в составе PCV15 у младенцев макак-резус (IRM)

DTFB, полученный, как описано в Примере 1 (катионообменная мультимодальная хроматография), использовали для приготовления конъюгата ST3-DTFB, как описано в Примере 3. Композиции PCV15 готовили, как описано в Примере 7. IRM (младенцев макак-резус, n=8/группа) иммунизировали внутримышечно (группы 1-4) путем введения 100 мкл вакцины, как показано в таблице 3 ниже, в дни 0, 28 и 56. Сыворотки собирали до начала исследования (до) и в дни 14, 28, 42, 56 и 70. Специалисты по уходу за животными два раза в сутки оценивали IRM на наличие признаков заболевания или дистресса. Составы вакцин считались безопасными для IRM и хорошо переносимыми, поскольку не было отмечено побочных эффектов, связанных с вакцинами.

Таблица 3. Изучение составов на младенцах макак-резус

Груп-па	Состав	Доза PnPs (мкг)	Процесс конъюгации	Белок-носитель для серотипа 3
1	PCV15Aq в 20 мМ L-гистидина, 150 мМ NaCl, 0,2% мас./об. P188, 250 мкг/мл APA	0,8 мкг для 6B, 0,4 мкг для всех других серотипов	Все серотипы PnPs конъюгировали с белком-носителем в водном растворе	CRM197
2	PCV15Aq/Non-Aq в 20 мМ L-гистидина, 150 мМ NaCl, 0,2% мас./об. P188, 250 мкг /мл APA		Серотипы 6A, 6B, 7F, 19A, 19F, 23F конъюгировали с белком-носителем в ДМСО; другие серотипы конъюгировали с белком-носителем в водном растворе
3	PCV15Aq/Non-Aq/ST3-DTFB в 20 мМ L-гистидина, 150 мМ NaCl, 0,2% мас./об. P188, 250 мкг /мл APA			DTFB
4	PCV15Aq/Non-Aq/ST3-DTFB мМ L-гистидина, 150 мМ NaCl, 0,1% мас./об. PS-20, 250 мкг /мл APA

Исследования на мышах, описанные в Примере 6, завершали методом ИФА по протоколу ВОЗ для моновалентных конъюгатов с одним PnPs серотипа 3 для оценки ответов IgG. Для оценки ответов серотип-специфических IgG на 15-валентную вакцину разрабатывали мультиплексный электрохемилюминесцентный анализ (ECL) для использования сыворотки макаки-резуса, взяв за основу анализ человеческих сывороток, описанный Marchese et al., в котором использована технология MSD (MSD является товарным знаком MesoScale Discovery, подразделения MesoScale Diagnostics, LLC., Gaithersburg, MD, USA) с меткой SULFO-TAG™, испускающей свет при электрохимической стимуляции. При тестировании образцов младенцев макак использовали реагенты и стандарты для человеческих антител. Результаты, полученные для младенцев макак-резус, выражали в виде средних геометрических концентраций, рассчитанных по стандартной кривой, построенной с использованием концентраций серотип-специфического IgG, являющегося эталонным человеческим стандартом (007sp).

Ответы IgG на серотип 3 после введения дозы 3 (PD3) не показали статистически значимых различий между иммунизированными группами (фиг. 11). Функциональное антитело, оцененное в анализах ОРА с использованием серотипа 3 S. pneumoniae (фиг. 12), не показало статистически значимых различий между иммунизированными группами.

ПРИМЕР 11: Оптимизация состава PCV15

Поскольку результаты, полученные для двух составов с разными концентрациями конъюгатов и APA, перечисленными в Примере 7, были очень похожими, в этом Примере показаны только результаты для состава PCV15, содержащего более низкие концентрации конъюгатов и APA, если не указано иное.

Линию рециркуляции использовали в процессе приготовления PCV15 для подачи вакцинного лекарственного препарата в шприц и машину для заполнения флаконов. Рециркуляция во время обычного заполнения создает дополнительную сдвиговую нагрузку и подвергает стрессу биотерапевтические лекарственные препараты и, следовательно, является важным этапом обработки для выполнения оценки. Исследования проводили для оценки влияния рециркуляции на PCV15_{Aq/Non-Aq/ST3-DTFB} и составы (в 20 мМ L-гистидине, pH 5,8, 150 мМ NaCl, 64 мкг/мл общего полисахарида и 250 мкг/мл APA), содержащие 0,2% мас./об. P188 и 0,1% мас./об. PS-20. Составы подвергали рециркуляции в течение 24 часов из контейнера подачи через трубку со скоростью потока 180 мл/мин с использованием перистальтического насоса. Контейнер для подачи непрерывно перемешивали с помощью магнитной мешалки, и образцы периодически отбирали для визуальной оценки. В составах, содержащих P188, отмечали появление комков или визуально наблюдаемую агрегацию (таблица 4), тогда как в составах, содержащих PS-20, признаки видимой агрегации отсутствовали.

Таблица 4. Визуальная оценка составов PCV15, содержащих 0,2% мас./об. P188 или 0,1% мас./об. PS-20, в течение 24 часов непрерывного перемешивания и рециркуляции

Состав PCV15	Время рециркуляции
0 ч	0,5 ч	1 ч	3 ч	6 ч	8 ч	12 ч	24 ч
PCV15Aq/Non-Aq/ST3-DTFB с 0,2% мас./об. P188	нет	нет	нет	нет	нет	нет	нет	есть
PCV15Aq/Non-Aq/ST3-DTFB с 0,1% мас./об. PS-20	нет	нет	нет	нет	нет	нет	нет	нет

Дополнительные исследования рециркуляции проводили для составов PCV15_Aq/Non-Aq и PCV15_{Aq/Non-Aq/ST3-DTFB} с APA в количестве до 500 мкг/мл (мас./об. Al⁺³) и P188 или PS-20. После 24 часов рециркуляции при постоянном перемешивании составы разливали в шприцы и горизонтально перемешивали до 24 часов. Составы тщательно осматривали; результат визуальной оценки шприцев приведен в таблице 5. Эти результаты показывают, что PS-20 обеспечивает состав, устойчивый к физической нестабильности или агрегации, возникающим во время обычного процесса производства, транспортировки и обработки. P188 не обеспечивает адекватный профиль стабильности состава PCV15_{Aq/Non-Aq/ST3-DTFB}, несмотря на его успех в стабилизации составов PCV15_Aq (Фиг. 7-9).

Таблица 5. Визуальная оценка составов PCV15 с 0,1% мас./об. PS-20 или 0,2% мас./об. P188 после 24 часов перемешивания и рециркуляции и горизонтального вращения в 1,5 мл шприцах HyPak продолжительностью до 24 часов

Состав PCV15	Время горизонтального вращения после 24 часовой рециркуляции
0 ч	1 ч	3 ч	6 ч	10 ч	24 ч
PCV15Aq/Non-Aq/ST3-DTFB с 0,2% мас./об. P188	Небольшие агрегаты	Небольшие агрегаты	Небольшие агрегаты	Большие агрегаты	Очень большие агрегаты	Очень большие агрегаты полностью осажденные
PCV15Aq/Non-Aq/ST3-DTFB с 0,1% мас./об. PS-20	Агрегации нет	Агрегации нет	Агрегации нет	Агрегации нет	Агрегации нет	Агрегации нет
PCV15Aq/Non-Aq с 0,1% мас./об. PS-20	Агрегации нет	Агрегации нет	Агрегации нет	Агрегации нет	Агрегации нет	Агрегации нет
PCV15 Aq/Non-Aq с 0,2% мас./об. PS-20	Агрегации нет	Агрегации нет	Агрегации нет	Агрегации нет	Агрегации нет	Агрегации нет

Дополнительное исследование проводили для состава PCV15_{Aq/Non-Aq/ST3-DTFB}, в котором ST18C получали по реакции восстановительного аминирования в ДМСО (PCV15_{Aq/Non-Aq/ST3-DTFB/ST18C-Non-Aq}). Композицию PCV15_{Aq/Non-Aq/ST3-DTFB/ST18C-Non-Aq} готовили в 20 мМ L-гистидине, pH 5,8, 150 мМ NaCl, 64 мкг/мл общего полисахарида, 250 мкг/мл APA и 0,2% мас./об. PS-20. После того, как состав PCV15_{Aq/Non-Aq/ST3-DTFB/ST18C-Non-Aq} подвергли рециркуляции продолжительностью до 6 часов при постоянном перемешивании, состав заливали в шприцы и горизонтально перемешивали в течение до 24 часов. Состав тщательно осматривали; результат визуальной оценки шприцов приведен в таблице 6. Эти результаты показывают, что PS-20 обеспечивает устойчивый к физической нестабильности или агрегации, возникающим во время обычного процесса производства, транспортировки и обработки, раствор состава, включающего композицию PCV15, приготовленную в 20 мМ L-гистидине, рН 5,8, 150 мМ NaCl, с 250 мкг/мл APA и 0,2% мас./об. PS-20 и содержащую конъюгаты пневмококкового полисахарида серотипов 6A, 6B, 7F, 18C, 19A, 19F и 23F, полученные по реакции восстановительного аминирования в ДМСО, и конъюгаты серотипа 1, 3, 4, 5, 9V, 14, 22F и 33F, полученные по реакции восстановительного аминирования в водном растворе, где все полисахариды конъюгированы с CRM₁₉₇.

Таблица 6. Визуальная оценка составов PCV15 с 0,2% мас./об. PS-20 после 24 часового перемешивания и рециркуляции и до горизонтального вращения в 1,5 мл шприцах HyPak продолжительностью до 24 часов

Состав PCV15	Время горизонтального вращения после 24 часов рециркуляции
0 ч	8 ч	16 ч	24 ч
PCV15Aq/Non-Aq/ST3-DTFB/ST18C Non-Aq с 0,2% PS20	Агрегации нет	Агрегации нет	Агрегации нет	Агрегации нет

Как показано на фиг.10 и в таблицах 4-5, использование только P188 давало минимальное преимущество в предотвращении агрегации композиций PCV15 в виде суспензии, состоящих из конъюгатов, полученных по реакции восстановительного аминирования в ДМСО, и/или ST3-DTFB. Дополнительные исследования смешивания и горизонтального вращения выполняли с составами, содержащими 0,2% мас./об. P188 и ПЭГ400 (ПЭГ) или пропиленгликоль (ПГ), используемых в качестве стабилизаторов. Составы PCV15_{Aq/Non-Aq/ST3-DTFB} готовили в объеме 500 мл, как описано в Примере 7. ПЭГ400 или ПГ добавляли к APA и затем добавляли конъюгаты. Конечная концентрация ПЭГ400 или ПГ составляла от 0 до 15% (мас./об.) в композиции, содержащей 64 мкг PnPs/мл, 250 мкг/мл APA и 0,2% мас./об. P188. Составы непрерывно перемешивали в течение 1 часа с помощью магнитной мешалки и заливали в шприцы. Шприцы перемешивали до 24 часов. Составы периодически отбирали для визуальной оценки и измерения гранулометрического состава методом SLS. Результаты визуальной оценки шприцов показаны в таблицах 7-8. Результаты оценки гранулометрического состава показаны на фиг. 13А-С. Добавление только P188 не блокировало агрегацию в композиции. Удивительно, но ПЭГ400 или ПГ обеспечивали адекватную стабильность в сочетании с P188.

Таблица 7. Визуальная оценка составов PCV15 с 0,2% мас./об. P188 и различными концентрациями ПЭГ400 после 1 часа перемешивания и горизонтального вращения в 1,5 мл шприцах HyPak продолжительностью до 24 часов

PCV15Aq/Non-Aq/ST3-DTFB с 0,2% мас./об. P188	Время горизонтального вращения после 1 часа перемешивания
0 ч	3 ч	6 ч	18 ч	24 ч
с 0% ПЭГ400	Агрегации нет	Агрегации нет	Небольшие агрегаты	Большие агрегаты; рассеяние света	Большие агрегаты; сильное рассеяние
с 6% ПЭГ400	Агрегации нет	Агрегации нет	Агрегации нет	Слабое кольцо рассеяния	Небольшие агрегаты; слабое рассеяние
с 8% ПЭГ400	Агрегации нет	Агрегации нет	Агрегации нет	Агрегации нет	Слабое кольцо рассеяния
с 10% ПЭГ400	Агрегации нет	Агрегации нет	Агрегации нет	Агрегации нет	Агрегации нет
с 12% ПЭГ400	Агрегации нет	Агрегации нет	Агрегации нет	Агрегации нет	Агрегации нет
с 15% ПЭГ400	Агрегации нет	Агрегации нет	Агрегации нет	Агрегации нет	Агрегации нет

Таблица 8. Визуальная оценка составов PCV15 с 0,2% мас./об. P188 и различными концентрациями ПЭГ после 1 часа перемешивания и горизонтального вращения в 1,5 мл шприцах HyPak продолжительностью до 24 часов

PCV15Aq/Non-Aq/ST3-DTFB с 0,2% мас./об. P188	Время горизонтального вращения после 1 часа перемешивания
0 ч	0 ч	0 ч	0 ч	0 ч
с 0% ПЭГ400	Агрегации нет	Агрегации нет	Небольшие агрегаты	Большие агрегаты; рассеяние света	Большие агрегаты; сильное рассеяние
с 6% ПЭГ400	Агрегации нет	Агрегации нет	Агрегации нет	Слабое кольцо рассеяния	Небольшие агрегаты; слабое рассеяние
с 8% ПЭГ400	Агрегации нет	Агрегации нет	Агрегации нет	Агрегации нет	Слабое кольцо рассеяния
с 10% ПЭГ400	Агрегации нет	Агрегации нет	Агрегации нет	Агрегации нет	Агрегации нет
с 12% ПЭГ400	Агрегации нет	Агрегации нет	Агрегации нет	Агрегации нет	Агрегации нет
с 15% ПЭГ400	Агрегации нет	Агрегации нет	Агрегации нет	Агрегации нет	Агрегации нет

ПРИМЕР 12: Иммуногенность стабилизирующих составов пневмококковой конъюгатной вакцины

Оценивали влияние PCV15 составов, оптимизированных для предотвращения нестабильности, возникающей в процессе производства и транспортировки, на иммуногенность у младенцев макак-резусов. Восемь животных в группе получали внутримышечную инъекцию 0,1 мл препарата PCV15_{Aq/Non-Aq/ST3-DTFB}, содержащего 64 мкг PnPs/мл, 20 мМ L-гистидин, pH 5,8, 150 мМ хлорид натрия, 250 мкг/мл APA и либо 0,2% мас./об. P188, 15% мас./об. ПГ, либо 0,1% мас./об. PS-20, как описано в примере 11. Инъекции вводили в возрасте T=0 (доза 1), 1 месяц (доза 2) и 2 месяца (доза 3). Сыворотку собирали до введения дозы 1 и через 2 недели после введения дозы 1, 2 и 3. Уровни IgG в образцах сыворотки до иммунизации, после введения дозы 1, после введения дозы 2 и после введения дозы 3 определяли, как описано выше в примере 10. Результаты, приведенные на фиг. 14, показывают, что составы PCV15 с PS-20 или комбинацией P188 и ПГ были иммуногенными.

ПРИМЕР 13: Влияние полисорбата 20 и полисорбата 80 на стабилизацию лекарственного препарата пневмококковой конъюгатной вакцины, приготовленного из разных смесей конъюгатов, полученных по реакции восстановительного аминирования, в протонных (водных) и апротонных (ДМСО) растворах

Обнадеживающие результаты, наблюдаемые для составов PCV15 в вышеприведенных примерах, мотивируют на изучение нижних и верхних пределов соотношения уровней белка в гликоконъюгатах, полученных в ДМСО по сравнению с полученными водных условиях. Многочисленные поливалентные составы PCV, имеющие различные соотношения гликоконъюгатов, содержали конъюгаты пневмококковый полисахарид-CRM₁₉₇, полученные по реакции восстановительного аминирования в водном растворе или в ДМСО. Каждый состав был нормализован по количеству белка и содержал полисахарида (Ps) в общей концентрации 64 мкг/мл (мас./об. PS) с 250 мкг/мл APA в 20 мМ L-гистидине, pH 5,8, 150 мМ NaCl. Для достижения конечной концентрации PS-80 (0,05% мас./об.) или PS-20 (0,05% мас./об.), или PS-20 (0,2% мас./мас.) в каждый состав добавляли либо PS-80, либо PS-20. Составы разливали в BD HyPAK Prefilled шприцы и оценивали в лаборатори, используя тесты, имитирующие транспортировку, для обеспечения стабильно производимой и коммерчески жизнеспособной композиции вакцинного лекарственного препарата.

Для достижения целевого диапазона процентного содержания гликоконъюгатов, полученных в ДМСО, приготовили следующие составы, в которых все полисахариды были конъюгированы с CRM₁₉₇ по реакции восстановительного аминирования:

Состав PCV_24% содержал конъюгаты серотипов 6A, 6B и 23F, полученные в ДМСО, и конъюгаты серотипов 1, 3, 4, 5, 7F, 9V, 14, 18C, 19A, 19F, 22F и 33F, приготовленные в водном растворе. Содержание общего белка в этой композиции находилось в диапазоне от 56 мкг/мл до 13 мкг/мл или ~24% от общего белка, состоящего из CRM₁₉₇, конъюгированного с полисахаридом по реакции восстановительного аминирования в ДМСО.

Состав PCV_50% содержал конъюгаты серотипов 6A, 6B, 7F, 19A, 19F и 23F, приготовленные в ДМСО, и конъюгаты серотипов 1, 3, 4, 5, 9V, 14, 18C, 22F и 33F, приготовленные в водном растворе. Содержание общего белка в этой композиции находилось в диапазоне от 62 мкг/мл до 31 мкг/мл или 50% от общего белка, состоящего из CRM₁₉₇, конъюгированного с полисахаридом по реакции восстановительного аминирования в ДМСО.

Состав PCV_62% содержал конъюгаты серотипов 6A, 6B, 7F, 19A, 19F и 23F, полученные в ДМСО, и конъюгаты серотипов 1, 5, 9V, 14, 18C, 22F и 33F, полученные в водном растворе. Содержание общего белка в этой композиции находилось в диапазоне от 61 мкг/мл до 38 мкг/мл или ~62% от общего белка, состоящего из CRM₁₉₇, конъюгированного с полисахаридом по реакции восстановительного аминирования в ДМСО.

Композиция PCV_79% содержала конъюгаты серотипов 6А, 6В, 7F, 19А, 19F и 23F, полученные в ДМСО, и конъюгаты серотипов 1, 5, 18С и 33F, полученные в водном растворе. Содержание общего белка в этой композиции находилось в диапазоне от 63 мкг/мл до 50 мкг/мл или ~79% от общего белка, состоящего из CRM₁₉₇, конъюгированного с полисахаридом по реакции восстановительного аминирования в ДМСО.

Состав PCV_100% содержал конъюгаты серотипов 6А, 6В, 7F, 19А, 19F и 23F, приготовленные с использованием восстановительного аминирования в ДМСО. Содержание общего белка в этой композиции находилось в диапазоне от 65 мкг/мл до 65 мкг/мл или 100% от общего белка, состоящего из CRM₁₉₇, конъюгированного с полисахаридом в ДМСО.

Исследование с горизонтальным перемешиванием использовали для оценки влияния на стабильность соотношения белка, конъюгированного с полисахаридом в ДМСО, к общему белку. Исследование представляет собой непосредственное перемешивание составов, при котором происходит взаимодействие с поверхностями в системе закрытого контейнера (шприц или флакон) и происходит воздействие конечных компонентов контейнера и границы раздела с воздухом на состав. Составы в количестве 0,64 мл заливали в шприцы и закупоривали. Эти шприцы горизонтально вращали при 2-8°С в течение до 24 часов. Влияние времени при горизонтальном перемешивании на гранулометрический состав оценивали методом статического рассеяния света (SLS). Размер и распределение частиц оценивали с помощью устройства Malvern Mastesizer 2000. Калибровку осуществляли, используя 5 NIST стандарт с размером частиц 5 мкм, и получали ожидаемый гранулометрический состав. Как показано на фиг. 15A-E, PS-80 не был эффективным стабилизатором, предотвращающим агрегацию, для всех лекарственных препаратов, содержащих PCV (от PCV_24% до PCV_100%). Во всех составах с PS-80 было отмечено увеличение в гранулометрическом составе и видимые признаки агломерации (появления частиц) и агрегации.

Удивительным оказалось то, что PS-20 в концентрации, сопоставимой с концентрацией, используемой для PS-80, обеспечивал улучшенный профиль стабильности во всем диапазоне протестированного процентного содержания конъюгатов в ДМСО. Добавление PS-20 до концентрации 0,2% PS-20 в буфере для состава обеспечивало очень хорошую стабильность состава сравнению с 0,05% PS-20 во всем диапазоне протестированного процентного содержания конъюгатов в ДМСО.

ПРИМЕР 14: Иммуногенность стабилизирующих составов пневмококковой конъюгатной вакцины у новозеландских белых кроликов.

Оценивали влияние PCV15 составов, оптимизированных для предотвращения нестабильности, вызванной процессом производства и транспортировки, на иммуногенность у новозеландского белого кролика. Восемь животных в группе получали внутримышечную инъекцию 0,1 мл препарата PCV15_Aq/Non-Aq, содержащего 64 мг PnPs/мл, 20 мМ L-гистидин, pH 5,8, 150 мМ хлорид натрия, 250 мкг/мл APA и 0,2% мас./об. PS-20, как описано в Примере 11. Инъекции вводили в 0 и 14 день. Сыворотку собирали до вакцинации и в дни 0 и 14, а также в день 28. Уровни IgG в образцах сыворотки, полученных до иммунизации, после введения первой дозы и после введения второй дозы, определяли с помощью анализа ECL.

Результаты, приведенные на фиг. 16, показывают, что 15-валентный состав пневмококкового конъюгата в 20 мМ гистидина pH 5,8, 150 мМ NaCl, 250 мкг/мл APA, 0,2% мас./об. PS-20, содержащий полисахариды S. pneumoniae серотипов 6A, 6B, 7F, 18C, 19A, 19F и 23F, конъюгированные с CRM₁₉₇ по реакции восстановительного аминирования в DMSO, и полисахариды S. pneumoniae серотипов 1, 3, 4, 5, 9V, 14, 22F и 33F, конъюгированные с CRM₁₉₇ по реакции восстановительного аминирования в водной среде, в виде лекарственной формы, содержащей 4 мкг/мл каждого сахарида, за исключением 6B, количество которого составляло 8 мкг/мл, и примерно 64 мкг/мл белка-носителя CRM197, является иммуногенным.

Состав для индукции иммунного ответа против Streptococcus pneumoniae, содержащий:

15-валентную пневмококковую конъюгатную композицию, состоящую по существу из полисахарида S. pneumoniae серотипов 1, 3, 4, 5, 6А, 6В, 7F, 9V, 14, 18С, 19А, 19F, 22F, 23F и 33F, причем каждый серотип конъюгирован с CRM₁₉₇;

20 мМ гистидина, рН 5,8;

150 мМ NaCl;

250 мкг/мл фосфат-алюминиевого адъюванта (APA); и

0,2% мас./об. полисорбата-20 (PS-20);

составленный в виде лекарственной формы, содержащей 4 мкг/мл каждого серотипа, за исключением 6B, количество которого составляет 8 мкг/мл; и 64 мкг/мл CRM₁₉₇;

где конъюгаты, содержащие серотипы 6A, 6B, 7F, 18C, 19A, 19F и 23F, получены в условиях ДМСО, а конъюгаты, содержащие серотипы 1, 3, 4, 5, 9V, 14, 22F и 33F, получены в водных условиях.