Иммуностимулирующие олигонуклеотиды

Группа изобретений относится к композициям и способам стимуляции толл-подобного рецептора 9 (toll-like receptor 9, TLR9). Более конкретно, к иммуностимулирующим олигонуклеотидам, способам усиления иммуностимулирующих свойств олигонуклеотидов и способам вызывания иммунных ответов. Иммуностимулирующие композиции содержат олигонуклеотиды, содержащие по меньшей мере один CpG мотив и 3'-холестериновый компонент. Способ получения иммуностимулирующего олигонуклеотида включает присоединение холестеринового компонента к 3'- концу TLR9- лиганда с помощью линкера, где TLR9- лиганд представляет собой олигонуклеотид, имеющий CpG-мотив. Способ вызывания TLR9-опосредованного иммунного ответа у субъекта включает введение субъекту иммуностимулирующего олигонуклеотида или иммуностимулирующей композиции. Осуществление группы изобретений обеспечивает увеличение иммуногенности иммуностимулирующего олигонуклеотида. 4 н. и 33 з.п. ф-лы, 33 ил., 25 табл., 4 пр.

 

ССЫЛКА НА РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ

В настоящей заявке испрашивается приоритет и преимущества Европейских патентных заявок №№ ЕР 17207740.6, ЕР 17207746.3, и ЕР 17207750.5, каждая была подана 15 декабря 2017 г., раскрытие которых полностью включено в настоящую заявку в качестве ссылки.

ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

Настоящая заявка содержит перечень последовательностей, который был подан электронно в ASCII формате и, таким образом, полностью включен в качестве ссылки. Указанная ASCII копия, созданная 27 ноября 2018 г., называется 103976.000119 SEQ LISTING_ST25.txt и имеет размер 2233 байт.

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ, К КОТОРОЙ ОТНОСИТСЯ ИЗОБРЕТЕНИЕ

Обеспечиваются композиции и способы стимуляции толл-подобного рецептора 9 (toll-like receptor 9, TLR9). Более конкретно, в настоящей заявке описаны иммуностимулирующие олигонуклеотиды, способы усиления иммуностимулирующих свойств олигонуклеотидов и способы вызывания иммунных ответов.

ПРЕДПОСЫЛКИ СОЗДАНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Резистентность к антибиотикам является глобальной проблемой, оказывающей отрицательное влияние на различные отрасли промышленности. Резистентный к метициллину Staphylococcus aureus (MRSA) и другие "бактерии, питающиеся нефтью", наносят огромные потери в больницах и кабинетах врачей, делая визит в медицинские центры потенциально летальными. В сельскохозяйственной промышленности существуют аналогичные проблемы. Целые стада имеют риск развития патогенных инфекций вследствие ограниченного пространства и нестерильной окружающей среды. Например, одна больная корова, находящаяся в непосредственной близости к ее стаду, может экспоненциально повысить показатели заболеваемости и смертности. Несмотря на риск инфекций, лечение с применением антибиотиков становится все более неприемлемым вследствие возрастающей стоимости и требований потребителей к производству мясных и молочных продуктов без воздействия антибиотиков. И даже те производители, которые все еще используют терапии с применением антибиотиков, понимают, что, даже применяя расширенный спектр антибиотиков, не удается обеспечить полную эффективность по отношению к каждому патогену, который может контактировать со стадом.

Таким образом, существует потребность в терапиях без использования антибиотиков для лечения или предотвращения инфекций у животных. Раскрытые композиции и способы направлены на эти и другие чрезвычайно важные потребности.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

В настоящий заявке описаны иммуностимулирующие олигонуклеотиды, содержащие по меньшей мере один CpG мотив и 3'-холестерильный компонент.

Также в настоящей заявке описаны иммуностимулирующие композиции, содержащие иммуностимулирующие олигонуклеотиды.

Также обеспечиваются способы усиления иммуногенности TLR9 лиганда, содержащего присоединенный холестерильный компонент к 3' концу TLR9 лиганда с помощью линкера, где TLR9 лиганд представляет собой олигонуклеотид, имеющий по меньшей мере один CpG мотив.

Также обеспечиваются способы вызывания TLR9-onocpeflOBaHHoro иммунного ответа у субъекта, включающий введение субъекту любого (любой) одного (одной) из иммуностимулирующих олигонуклеотидов или иммуностимулирующих композиций, раскрытых в настоящей заявке

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ФИГУР

Сущность изобретения, а также последующее подробное описание, становится более понятным в системной связи с приложенными фигурами. Для целей иллюстрации раскрытых композиций и способов, на фигурах представлены иллюстративные варианты осуществления композиций и способов; тем не менее, композиции и способы не ограничиваются специфическими раскрытыми вариантами осуществления изобретения. На фигурах: На Фиг. 1 представлена химическая структура холестерильного компонента, присоединенного к гександиольному линкеру.

На Фиг. 2А и 2В сравнивается TLR9 стимулирующая активность олигонуклеотида РТО-2006, олигонуклеотида PDE-2006, имеющего 3' TTTTGGGGGTTTT (SEQ ID NO: 9) последовательность ("2006-3dT4G5T4"), и олигонуклеотида 2006-3dT4G5T4, имеющего 3'-холестерильный компонент, присоединенный с помощью гександиольного линкера, представленного на Фиг. 1 ("2006-3dT4G5T43C") в HEKBlue-hTLR9 клетках.

На Фиг. 3 представлена способность вызывать TLR9-опосредованный иммунный ответ в HEKBlue-hTLR9 клетках для олигонуклеотида PDE-2006, имеющего 3' ТТТТ последовательность ("2006-T4-PDE"), и олигонуклеотида 2006-T4-PDE с холестерильным компонентом, присоединенным с помощью гександиольного линкера согласно Фиг. 1 к 3'-концу олигонуклеотида ("3Chol-2006-T4-PDE").

На Фиг. 4А и 4В сравниваются TLR9 стимулирующие характеристики олигонуклеотида 2006-3dT4G5T4 и олигонуклеотида 2006-3dT4G5T4C.

На Фиг. 5 сравниваются TLR9 стимулирующие характеристики олигонуклеотида 2006-3dT4G5T4 и олигонуклеотида 2006-3dT4G5T4C.

На Фиг. 6 представлена химическая структура холестерильного компонента, присоединенного к гексаэтиленгликольному линкеру.

На Фиг. 7 сравнивается TLR9 стимулирующая способность олигонуклеотида 2006-T4G5T4 и олигонуклеотида 2006-T4G5T4 с холестерил-линкерным компонентом согласно Фиг. 6, присоединенным к его 3'-концу ("2006-T4G5T4-3Chol" или "2006-T4G5T4-3C").

На Фиг. 8А и 8В сравнивается иммуногенность олигонуклеотидов с 3'-холестерильной модификацией и без нее. На Фиг. 8А сравнивается способность олигонуклеотида 2007-РОЕ-Т4олигонуклеотид вызывать TLR9-опосредованный иммунный ответ в HEKBlue-hTLR9 клетках относительно такой способности олигонуклеотида 2007-PDE-T4 олигонуклеотид с холестерильным компонентом, присоединенным с помощью гександиольного линкера согласно Фиг. 1 ("2007-PDE-T4-3Ch"), и на Фиг. 8В сравнивается способность олигонуклеотида 2007-PDE-T4, имеющего 3' GGGGGTTTT последовательность ("2007-T4G5T4"), и олигонуклеотида 2007-T4G5T4 с холестерильным компонентом, присоединенным с помощью гександиольного линкера, представленного на Фиг. 1 ("2007-T4G5T4-3Ch") в HEKBlue-hTLR9 клетках.

На Фиг. 9А и 9В сравнивается иммуногенность олигонуклеотидов с 3'-холестерильной модификацией и без нее. Более специфически, Фиг. 9А иллюстрирует иммуногенность 2006-РТО, 2006-3dT4G5T4 и 2006-3dT4G5T4C олигонуклеотидов посредством TLR9-опосредованного иммунного ответа в Ramos-Blue клетках, и Фиг. 9В иллюстрирует результаты, представленные на Фиг. 9А для более узкого диапазона концентраций.

На Фиг. 10А и 10В сравнивается способность олигонуклеотидов с 3'-холестерильным компонентом, присоединенным с помощью гександиольного линкера, или без него вызывать TLR9-опосредованный иммунный ответ в Ramos-Blue клетках. Более специфически, Фиг. 10А иллюстрирует относительную способность олигонуклеотидов 2006-3dT4G5T4 и 2006-3dT4G5T4C вызывать TLR9-опосредованный иммунный ответ.Фиг. 10В иллюстрирует результаты согласно Фиг. 10А для более узкого диапазона концентраций.

На Фиг. 11 сравнивается иммуногенность олигонуклеотида 2006-T4-PDE и олигонуклеотида 2006-T4-PDE, имеющий 3'-холестерильный компонент, присоединенный с помощью гександиольного линкера, представленного на Фиг. 1 ("3Chol-2006-T4-PD") в Ramos-Blue.

На Фиг. 12 сравнивается способность олигонуклеотида 2006-3dT4G5T4 и олигонуклеотида 2006-3dT4G5T4-3Chol вызывать TLR9-onocpeflOBaHHbm иммунный ответ в Ramos-Blue клетках.

На Фиг. 13А, 13В и 13С сравниваются способности 2007-PDE-T4, 2007-T4G5T4, и TCG8-T4 олигонуклеотидов, с холестерильным компонентом, присоединенным к 3' концу олигонуклеотида, или без него, стимулировать TLR9 в Ramos-Blue клетках. Фиг. 13А иллюстрирует различные иммуногенности олигонуклеотидов 2007-PDE-T4 и 2007-PDE-T4-Ch3. Фиг. 13 В иллюстрирует различные иммуногенности олигонуклеотидов 2007-T4G5T4 и 2007-T4G5T4-3Ch. Фиг. 13С иллюстрирует различные иммуногенности олигонуклеотидов TCG8-T4 и TCG8-T4-Ch3.

На Фиг. 14А, 14В, 14С и 14D сравнивается стимулирующая активность нескольких олигонуклеотидов и холестерил-модифицированных олигонуклеотидов на мышином TLR9 ("mTLR9") в HEKBlue-mTLR9 клетках. На Фиг. 14А сравнивается способность вызывать TLR9-опосредованный ответ в HEKBlue-mTLR9 клетках немодифицированного 2007-PDE-T4 олигонуклеотида и олигонуклеотида 2007-PDE-T4-3Ch. На Фиг. 14В сравнивается способность немодифицированного 2007-T4G5T4 олигонуклеотида и олигонуклеотида 2007-T4G5T4-3Ch вызывать TLR9-опосредованный ответ в HEKBlue-mTLR9 клетках. На Фиг. 14С сравнивается способность олигонуклеотида TCG8-T4 и олигонуклеотида TCG8-T4-3Ch вызывать TLR9-опосредованный ответ в HEKBlue-mTLR9 клетках; и на Фиг. 14D сравнивается способность TCG8-T4G5T4 олигонуклеотида и олигонуклеотида TCG8-T4G5T4, имеющего 3'-холестерильный компонент, присоединенный с помощью гександиольного линкера, представленного на Фиг. 1 ("TCG8-T4G5T4-3Ch") вызывать TLR9-опосредованный ответ в HEKBlue-mTLR9 клетках.

На Фиг. 15 представлена химическая структура холестерильного компонента, присоединенного к гексаэтиленгликольному линкеру.

На Фиг. 16А, 16В, 16С и 16D представлен эффект от модификации либо 3'-или 5'- концов олигонуклеотидов с применением холестерильного компонента на способность олигонуклеотида вызывать TLR9-опосредованный иммунный ответ. На Фиг. 16А графически представлена способность стимулировать TLR9 в HEKBlue-hTLR9 клетках для олигонуклеотидов 2006-PDE-T4, 2006-PDE-T4-Chol, и олигонуклеотида 2006-PDE-T4, имеющего 5'-холестерильный компонент, присоединенный с помощью гексаэтиленгликольного линкера, представленного на Фиг. 15 ("2006-PDE-T4-5Chol"). На Фиг. 16В графически представлена способность стимулировать TLR9 в HEKBlue-hTLR9 клетках олигонуклеотида 2006-РТО, олигонуклеотида 2006-PDE, имеющего GGGGG 3'-концевую последовательность ("2006-G5"), олигонуклеотида 2006-G5, имеющего 3'-холестерильный компонент, присоединенный с помощью гексаэтиленгликольного линкера, представленного на Фиг. 6 ("2006-G5-3Chol"), и олигонуклеотида 2006-G5, имеющего 5'-холестерильный компонент, присоединенный с помощью гексаэтиленгликольного линкера, представленного на Фиг. 15 ("2006-G5-5Chol"). На Фиг. 16С графически представлена способность стимулировать TLR9-опосредованный иммунные ответы в HEKBlue-hTLR9 клетках для олигонуклеотидов 2006-РТО, 2006-T4G5T4, 2006-T4G5T4-3Chol, и олигонуклеотида 2006-T4G5T4, имеющего 5'-холестерильный компонент, присоединенный с помощью гексаэтиленгликольного линкера, представленного на Фиг. 15 ("2006-T4G5T4-5Chol"). На Фиг. 16D графически представлена способность стимулировать TLR9-опосредованные иммунные ответы в HEKBlue-hTLR9 клетках олигонуклеотида TCG8-T4G5T4, олигонуклеотида TCG8-T4G5T4, имеющего 3'-холестерильный компонент, присоединенный с помощью гексаэтиленгликольного линкера, представленного на Фиг. 6 ("TCG8-T4G5T4-3Chol"), и олигонуклеотида TCG8-T4G5T4, имеющего 5'-холестерильный компонент, присоединенный с помощью гексаэтиленгликольного линкера, представленного на Фиг. 15 ("TCG8-T4G5T4-5Chol").

На Фиг. 17А, 17В, 17С и 17D представлен эффект от модификации 3'- или 5'- концов олигонуклеотидов с применением холестерильного компонента. На Фиг. 17А графически представлена способность стимулировать TLR9 в Ramos-Blue клетках для олигонуклеотидов 2006-PDE-T4, 2006-PDE-T4-Chol, и 2006-PDE-T4-5Chol. На Фиг. 17В графически представлена способность стимулировать TLR9 в Ramos-Blue клетках олигонуклеотида 2006-РТО, 2006-G5, 2006-G5-3Chol, и 2006-G5-5Chol. На Фиг. 17С графически представлена способность стимулировать TLR9-опосредованный иммунные ответы в Ramos-Blue клетках для олигонуклеотидов 2006-РТО, 2006-T4G5T4, 2006-T4G5T4-3Chol, и олигонуклеотида 2006-T4G5T4-5Chol. На Фиг. 17D графически представлена способность стимулировать TLR9-опосредованный иммунные ответы в Ramos-Blue клетках для олигонуклеотидов TCG8-T4G5T4, TCG8-T4G5T4-3Chol, и TCG8-T4G5T4-5Chol.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЛЛЮСТРАТИВНЫХ ВАРИАНТОВ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ

Раскрытые композиции и способы могут пониматься более легко со ссылкой на последующее подробное описание, принимая во внимание приложенные фигуры, которые составляют часть описания. Подразумевается, что раскрытые композиции и способы не ограничиваются специфическими композициями и способами, описанными и/или представленными в настоящей заявке, и что терминология, используемая в настоящей заявке, предназначена для описания предпочтительных вариантов осуществления только в качестве примеров и не предназначена для ограничения заявленных композиций и способов.

Если специально не указано иначе, то любое описание как возможный механизм или способ действия или причина для улучшения рассматривается только как иллюстративное, и описанные композиции и способы не ограничиваются точностью или неточностью любого такого предложенного механизма или способа действия или причины для улучшения.

Для всей настоящей заявки, описания относятся к композициям и способам применения указанных композиций. Если раскрытие описывает или заявляет характерный признак или вариант осуществления, связанный с композицией, то такой характерный признак или вариант осуществления аналогичным образом применим к способам применения указанных композиций. Подобно этому, если раскрытие описывает или заявляет характерный признак или вариант осуществления, связанный со способом применения композиции, то такой характерный признак или вариант осуществления аналогичным образом применим к композиции.

Если задан диапазон значений, то другой вариант осуществления включает от одного предпочтительного значения и/или до другого предпочтительного значения. Дополнительно, ссылки на значения, указанные в диапазонах, включают все и каждое значение в пределах указанного диапазона. Все диапазоны являются включительными и комбинируемыми. Если значения выражены как приблизительные, путем применения предшествующего "приблизительно", то это подразумевает, что конкретное значения составляет другой вариант осуществления. Ссылка на конкретное числовое значение включает по меньшей мере это конкретное значение, если из контекста очевидно не следует иное.

Следует принять во внимание, что определенные характерные признаки описанных композиций и способов, которые, для лучшего понимания, описаны в настоящей заявке в контексте отдельных вариантов осуществления, также могут обеспечиваться в комбинации в одном варианте осуществления. И наоборот, различные характерные признаки описанных композиций и способов, которые, для краткости, описаны в контексте одного варианта осуществления, также могут быть обеспечены раздельно или в любой подкомбинации.

Как используется в настоящей заявке, формы единственного числа включают множественное число.

Как используется в настоящей заявке, "CpG мотив" относится к динуклеотидной последовательности цитозин-гуанин. Иммуностимулирующие нуклеиновые кислоты, описанные в настоящей заявке, содержат один или несколько CpG мотивов, которые, когда неметилированы, могут взаимодействовать с толл-подобными рецепторными белками (TLR) и вызывать иммунный ответ.

Термин "субъект", как используется в настоящей заявке, обозначает любое животное, в особенности, млекопитающие и любой тип птиц, млекопитающих или водных видов может подвергаться лечению с применением описанных способов.

Различные термины, относящиеся к аспектам описания, применяются во всем описании и пунктах приложенной формулы изобретения. Такие термины имеют их общепринятые значения в данной области техники, если не указано иное. Другие специфически определенные термины истолковываются образом, согласующимся с определениями, представленными в настоящей заявке.

В настоящей заявке раскрыты иммуностимулирующие олигонуклеотиды, содержащие по меньшей мере один CpG мотив и 3'-концевой холестерильный компонент.Ранее было показано, что CpG мотивы в олигодезоксинуклеотидах (ОДН) могут вызывать иммунный ответ у млекопитающих. В некоторых случаях, CpG мотив распознается толл-подобным рецептором (TLR). Примеры CpG-распознараспознающий TLR включают, но не ограничиваясь только ими, гомологи TLR9 млекопитающих. Таким образом, в некоторых аспектах настоящего раскрытия, CpG-распознающий TLR представляет собой TLR9 гомолог мыши, человека, коровы, свиньи, лошади или овцы. Иммуногенности ОДН может быть недостаточно для вызывания иммунных ответов, способных предотвращать развитие инфекционного заболевания у чувствительных популяциях или инфицированных индивидуумов. Как продемонстировано в настоящей заявке, иммуностимулирующие свойства ОДН могут быть усилены с помощью модифицирующих олигонуклеотидов, в особенности, путем добавления тиминового прогона, гуанинового прогона и/или холестерильного компонента на 3'-конце ОДН.

Иммуностимулирующие олигонуклеотиды согласно настоящему раскрытию включают по меньшей мере один CpG мотив. В некоторых вариантах осуществления, иммуностимулирующие олигонуклеотиды включают от одного до десяти CpG мотивов. В других вариантах осуществления иммуностимулирующие олигонуклеотиды могут включать даже двадцать CpG мотивов. Таким образом, в некоторых вариантах осуществления, иммуностимулирующие олигонуклеотиды согласно настоящему раскрытию включают один, два, три, четыре, пять, шесть, семь, восемь, девять или десять CpG мотивов. В других вариантах осуществления, иммуностимулирующие олигонуклеотиды включают от одиннадцати до пятнадцати CpG мотивов или даже от пятнадцати до двадцати CpG мотивов.

В настоящем изобретении охватываются олигонуклеотиды, содержащие фосфодиэфирные и/или фосфоротиоатные связи между нуклеотидами. В некоторых аспектах, олигонуклеотиды согласно настоящему раскрытию включают фосфодиэфирные связи между нуклеотидами олигонуклеотидов. В других аспектах, олигонуклеотиды включают фосфоротиоатные связи между нуклеотидами олигонуклеотидов. Также в настоящем изобретении охватываются другие связи. Например, олигонуклеотид согласно настоящему раскрытию может включать другие связи, включая, но не ограничиваясь только ими, фосфоацетатные, метилфосфонатные и фосфонокарбоксилатные связи. Некоторые связи могут обеспечивать желательные преимущества по сравнению с другими связями, такие как стоимость получения, легкое и/или качественное получение, и усиление иммуностимулирующего воздействия.

В некоторых аспектах согласно настоящему раскрытию, иммуногенность олигонуклеотидов благодаря CpG мотивам может быть дополнительно усилена с помощью не-CpG последовательностей. Как представлено в примерах, добавление тиминового прогона к 3' концу олигонуклеотида может улучшать способность олигонуклеотида вызывать TLR9-опосредованный иммунный ответ. В связи с этим, в некоторых вариантах осуществления настоящего раскрытия 3'-концевая последовательность иммуностимулирующего олигонуклеотида включает множество тиминовых нуклеотидов в виде 3'-концевой последовательности. В некоторых аспектах, это множество тиминовых нуклеотидов включает последовательные тиминовые нуклеотиды. В некоторых аспектах, множество тиминовых нуклеотидов включает от четырех до шести последовательных тиминовых нуклеотидов. Например, в некоторых вариантах осуществления согласно настоящему раскрытию, 3'-концевая последовательность включает SEQ ID NO: 9. В некоторых вариантах осуществления, олигонуклеотид включает SEQ ID NO: 2, 3, 4, 5, 6 или 8. И в некоторых аспектах, 3'-концевая последовательность олигонуклеотидной последовательности представляет собой ТТТТ.

Другие модификации последовательности на 3'-конце иммуностимулирующего олигонуклеотида также могут способствовать усилению иммуногенности. Например, в некоторых вариантах осуществления настоящего раскрытия, иммуностимулирующий олигонуклеотид включает множество гуаниновых нуклеотидов на или возле 3'-концевой последовательности. В некоторых аспектах, 3'-концевая последовательность иммуностимулирующего олигонуклеотида включает множество гуаниновых нуклеотидов. В некоторых аспектах, множество гуаниновых нуклеотидов включает последовательные гуаниновые нуклеотиды, такие как олигонуклеотид в соответствии с настоящим раскрытием, имеющий 3'-концевую последовательность GGGGG. В некоторых аспектах, олигонуклеотид включает SEQ ID NO: 7.

Увеличение иммуногенности иммуностимулирующего олигонуклеотида не ограничивается модификациями 3'-конца олигонуклеотида. Также могут быть модифицированы внутренние последовательности, например, для повышения числа CpG мотивов. В некоторых аспектах, могут быть синтезированы олигонуклеотиды, содержащие дополнительные CpG мотивы между 5'- и 3'-концами олигонуклеотида. В некоторых аспектах, иммуностимулирующий олигонуклеотид включает последовательность (TCG)_n, где n находится в диапазоне от трех до десяти. Таким образом, в некоторых аспектах согласно настоящему раскрытию, олигонуклеотид включает последовательность (TCG)_n, где n равно 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10.

В некоторых вариантах осуществления согласно настоящему раскрытию, иммуностимулирующий олигонуклеотид может включать липидный компонент на 3'- конце для усиления иммуногенных свойств олигонуклеотида. Таким образом, в некоторых вариантах осуществления, холестерильный компонент ковалентно присоединен к 3'-концевому нуклеотиду иммуностимулирующего олигонуклеотида с помощью линкера. Холестерильный компонент, вероятно, повышает иммуногенность олигонуклеотидов путем предотвращения разложения, увеличения растворимости, создания мультивалентности лиганда путем образования структур высшего порядка (например, мицелл), увеличения стабильности олигонуклеотида в фармацевтической композиции или любой их комбинации. Линкер, имеющий по меньшей мере два компонента, способных образовывать ковалентные связи, может быть связан с холестерильным компонентом и с олигонуклеотидом. Например, в некоторых вариантах осуществления линкер взаимодействует с гидроксильной группой холестерильного компонента с образованием ковалентной связи и с 3'-концевым нуклеотидом олигонуклеотида. В некоторых аспектах, холестерильный компонент ковалентно связан с линкером с образованием холестерил-линкерного компонента. В некоторых аспектах, линкер сначала присоединяют к холестерильному компоненту и полученный холестерил-линкер затем присоединяют к олигонуклеотиду. В других аспектах, линкер сначала присоединяют к олигонуклеотиду и затем к холестерильному компоненту. В некоторых аспектах, холестерил-линкер коммерчески доступен.

Дополнительно к наличию компонентов, которые могут связываться олигонуклеотидом и холестерильным компонентом, некоторые варианты осуществления линкера включают углеродную цепь, и, в некоторых аспектах, углеродная цепь включает от 3 до 12 атомов углерода. Можно использовать, например, диолы в качестве линкера между холестерильным компонентом и олигонуклеотидом, поскольку концевые гидроксильные группы могут ковалентно связываться с гидроксильными группами олигонуклеотида и холестерильного компонента. В некоторых аспектах, линкер включает гександиол. В некоторых аспектах, холестерил-линкерный компонент имеет химическую структуру, представленную на Фиг. 1. Другие варианты осуществления обеспечивают линкер, содержащий повторяющуюся химическую единицу. Химическая единица, в некоторых аспектах, повторяется от двух до двенадцати раз. В некоторых аспектах повторяющаяся химическая единица включает этиленгликоль, и когда этиленгликольная химическая единица повторяется шесть раз, то линкер включает гексаэтиленгликоль. Линкер, содержащий гексаэтиленгликоль, может иметь химическую структуру, представленную на Фиг. 6.

В некоторых случаях является желательным доставлять олигонуклеотид, как описано в настоящей заявке, субъекту, который в этом нуждается. Олигонуклеотид может доставляться в виде иммуностимулирующей композиции. Обеспечиваются иммуностимулирующие композиции, содержащие любые из олигонуклеотидов, раскрытие в настоящей заявке. Эти иммуностимулирующие композиции, в некоторых аспектах, включают олигонуклеотид, а также другие компоненты, которые оказывают влияние на иммуногенность, действенность и эффективность композиции. В некоторых вариантах осуществления согласно настоящему раскрытию иммуностимулирующая композиция может включать, дополнительно к иммуностимулирующему олигонуклеотиду, вакцину для предотвращения или лечения инфекционного заболевания, вектор для доставки олигонуклеотида субъекту, фармацевтический носитель или любую их комбинацию. Например, в некоторых аспектах олигонуклеотид упакован в вирусный вектор, который предоставляет возможность нацеленной доставки олигонуклеотида. Олигонуклеотид, в некоторых аспектах, может быть добавлен к катионному липосомному средству доставки для усиления способности олигонуклеотида проникать через липидные клеточные мембраны и/или мембраны клеточных органелл, содержащих TLR9.

Инфекционные заболевания, которые можно лечить или предотвращать путем введения иммуностимулирующих олигонуклеотидов или иммуностимулирующих композиций, описанных в настоящей заявке, включают, но не ограничиваясь только ими, вирусные, бактериальные, грибковые, гельминтные или другие паразитарные инфекцией. Следует иметь в виду, что введение иммуностимулирующих олигонуклеотидов или композиций согласно настоящему раскрытию приводит к иммунному ответу, который создает окружающую среду, неблагоприятную для инвазивного агента. Следовательно, инвазивные агенты могут быть неспособны вызывать инфицирование, достаточное для получения отрицательного изменения состояния здоровья в организме-хозяине. Введение иммуностимулирующих олигонуклеотидов и/или композиций может обеспечивать неспецифический к антигену иммунный ответ, который усиливает или работает параллельно с антигенспецифическим иммунным ответом против инвазивного агента.

В некоторых аспектах, иммуностимулирующая композиция, содержащая олигонуклеотид, может дополнительно включать вакцину для предотвращения или лечения инфекционного заболевания. Комбинация олигонуклеотида и вакцины может обеспечиваться по соображениям эффективности, так как доставка множественных фармацевтических компонентов отдельно увеличивает стоимость лечения. Олигонуклеотид и вакцина также могут доставлять в виде отдельной иммуностимулирующей композиции для вызывания неспецифического к антигену иммунного ответа на любые конкурентные инфекции, а также для инициации развития антигенспецифического иммунного ответа.

Также в настоящей заявке охватываются иммуностимулирующие композиции, которые включают олигонуклеотид, как описано в настоящей заявке, и фармацевтически приемлемый носитель. В некоторых аспектах, фармацевтически приемлемый носитель представляет собой любой фармацевтически приемлемый носитель. Фармацевтически приемлемый носитель приспосабливает композицию для введения путем, выбранным из внутривенного, внутримышечного, интрамаммарного, внутрикожного, внутрибрюшинного, подкожного, путем распыления, с помощью аэрозоля, «в яйцо», слизистого, чрескожного, путем погружения, перорального, внутриглазного, интратрахеального, интраназального, легочного, ректального или других путей, известных квалифицированному специалисту в данной области техники. Фармацевтически приемлемый (е) носитель (и) может (гут) представлять собой разбавитель, адъювант, наполнитель или вспомогательное вещество, с которым вводится иммуностимулирующая композиция. Такие наполнители могут являться жидкостями, такими как вода и масла, включая нефтепродукты, вещества животного, растительного или синтетического происхождения, такие как арахисовое масло, соевое масло, минеральное масло, кунжутное масло и другие. Например, можно использовать 0,4% физиологический раствор и 0,3% глицин. Эти растворы являются стерильными и практически не содержат твердых примесей. Их можно стерилизовать с помощью общепринятых, хорошо известных методик стерилизации (например, фильтрации). Композиции могут содержать фармацевтически приемлемые вспомогательные вещества, что необходимо для приближения к физиологическим условиям, такие как вещества, корригирующие значение рН, и буферные агенты, стабилизаторы, загустители, смазывающие вещества и красители и др. Концентрация молекул согласно изобретению в таком фармацевтическом препарате может изменяться в широких пределах, то есть от менее чем приблизительно 0,5%, обычно до по меньшей мере приблизительно 1% вплоть до 15 или 20% по весу и будет выбираться главным образом на основании требуемой дозы, объема жидкостей, вязкостей и т.д., в соответствии с конкретным выбранным путем введения. Подходящие наполнители и препараты, в том числе и для других белков человека, например, сывороточного альбумина человека, описаны, например, в Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 21oe изд, под ред. Troy, D.B., Lipincott Williams and Wilkins, Philadelphia, PA 2006, часть 5, Pharmaceutical Manufacturing, cc. 691-1092 (см., в особенности, cc. 958-989).

В некоторых вариантах осуществления, олигонуклеотид и носитель связаны, например, химически связаны. Как используется для описания взаимосвязи между олигонуклеотидом и носителем, "связанный" относится к физической ассоциации олигонуклеотида и носителя. Если олигонуклеотид и носитель соединены друг с другом, взаимодействуют друг с другом, или комбинированы, или другим образом соединены, то они рассматриваются как связанные.

Иммуностимулирующие композиции, описанные в настоящей заявке, включают гаптен в некоторых вариантах осуществления. В некоторых аспектах, иммуностимулирующий олигонуклеотид связан с гаптеном. Гаптен может вызывать иммунологический ответ по отношению к специфическому микроорганизму, такому как Е. coli или Salmonella, в то время как иммуностимулирующий олигонуклеотид вызывает неспецифический иммунологический ответ, опосредованный взаимодействием TLR9 с олигонуклеотидом. Эти и другие инфицирующие микроорганизмы представляют собой значительный интерес для крупных производителей сельскохозяйственной продукции, таких как производители крупного рогатого скота, овец и свиней.

Также обеспечиваются способы усиления иммуногенности TLR9 лиганда, содержащего присоединенный холестерильный компонент к лиганду, где лиганд представляет собой иммуностимулирующий олигонуклеотид, имеющий по меньшей мере один CpG мотив и где холестерильный компонент присоединен, с помощью линкера, к 3'-концевому нуклеотиду олигонуклеотида.

В настоящей заявке описаны другие способы вызывания TLR9-опосредованного иммунного ответа у субъекта, который в этом нуждается, включающий введение субъекту олигонуклеотида, имеющего множество CpG мотивов и холестерил-линкерный компонент, присоединенный к 3'-концевому нуклеотиду олигонуклеотида. В некоторых аспектах способов вызывания TLR9-опосредованного иммунного ответа, олигонуклеотид вводится в виде иммуностимулирующей композиции.

Субъект, которому вводят иммуностимулирующий олигонуклеотид или иммуностимулирующую композицию, в некоторых вариантах осуществления настоящего раскрытия, представляет собой животное. В некоторых аспектах, животное имеет повышенный риск инфицирования патогеном, и, в особенности, патогеном, имеющий ассоциированную с патогеном характерную молекулярную структуру (РАМР) на основе CpG. Когда иммуностимулирующий олигонуклеотид и/или иммуностимулирующую композицию вводят такому животному, то TLR9-опосредованный иммунный ответ будет содействовать предотвращению инфицирования патогеном или облегчению симптомов, вызываемых патогеном. Для квалифицированных специалистов в данной области техники будет понятным, что иммуностимулирующие олигонуклеотиды согласно настоящему изобретению не обязательно должны быть специфическими к конкретному патогену, а скорее наоборот, стимулировать неспецифический к антигену иммунный ответ. Олигонуклеотиды также не обязательно должны быть специфичными для конкретного животного. Таким образом, в некоторых аспектах согласно настоящему раскрытию, субъект представляет собой млекопитающее. В некоторых аспектах субъект представляет собой стадное животное или животное, выращиваемое на ферме, такое как свинья, корова, конь или овца. Введение стадным животным может помогать предотвращать распространение инфекции в больших популяциях животных в условиях скученности, таких как загоны и/или совместно используемые общепринятые источники кормов или воды. Олигонуклеотиды согласно настоящему раскрытию обеспечивают существенное преимущество по сравнению с традиционными формами профилактического лечения инфекции, в том отношении, что применение антибиотиков все более становится неблагоприятным, в особенности, в связи со значительным распространением бактериальной резистентности к антибиотикотерапии.

В некоторых вариантах осуществления, субъектом может быть человек. Как и для стадных животных, резистентность к антибиотикам, применяемым для людей, становится распространенной для бактерий, и возможности лечения для резистентных инфекций ограничены. Олигонуклеотиды и способы согласно настоящему раскрытию обеспечивают такое столь необходимое решение для так называемых "бактерий, питающихся нефтью", таких как резистентный к метициллину Staphylococcus aureus.

Также в контексте настоящей заявки следует принять во внимание, что субъект, которому вводят иммуностимулирующий олигонуклеотид или композицию, может представлять собой мышь, крысу, хомячка, песчанку или другого грызуна. Субъект также может представлять собой субъект, отличающийся от млекопитающего. Например, субъект, в некоторых аспектах, представляет собой водные виды.

Примеры

Следующие примеры представлены для дальнейшего описания некоторых их вариантов осуществления, раскрытых в настоящей заявке. Примеры предназначены для иллюстрации, но не для ограничения описанных вариантов осуществления.

Пример 1: 3'-холестерильная модификация ОДН приводит к сильно повышенной стимулирующей активности TLR9 TLR9 человека, рекомбинантная сверхэкпрессия в HEKBlue

3'- холестерильная модификация PDE-ОДН (I)

3'-холестерильную модификацию (см. Фиг. 1 для химической структуры холестерил-линкерного компонента) применяли к PDE-ОДН (Таблица 1, 2006-3dT4G5T4), который имеет удовлетворительную активность на TLR9 человека. Модифицированные и немодифицированные формы тестировали in vitro в HEKBlue-hTLR9 клетках (Invivogen), клеточной линией, экспрессирующей TLR9 человека.

Полученные результаты свидетельствуют о том, что TLR9-стимулирующая активность 2006-3dT4G5T4 улучшается значительно при 3'-холестерильной модификации по отношению к ЕС₅₀, что почти в 30 раз ниже, чем для 2006-3dT4G5T43C (Таблица 2, Фиг. 2А, 2В).

3'- холестерильная модификация PDE-ОДН (II)

Холестерильный компонент (см. Фиг. 1 для химической структуры холестерил-линкерного компонента) присоединяли к 3'-концевому нуклеотиду 2006-T4-PDE (SEQ ID NO: 3, Таблица 3), который, как известно, является плохим активирующим лигандом TLR9 человека. Немодифицированные и модифицированные 2006-T4-PDE олигонуклеотиды вводили in vitro в HEKBlue-hTLR9 клетки для определения иммуностимулирующего воздействия 3'-холестерильной модификации.

Полученные результаты свидетельствуют о том, что стимулирующая активность TLR9 человека для 2006-T4-PDE улучшается значительно при 3'-холестерильной модификации (Таблица 2, Фиг. 3).

3'- холестерильная модификация PDE-ОДН (III)

3'-холестерильную модификацию (см. Фиг. 1 для химической структуры холестерил-линкерного компонента) применяли к PDE-ОДН, который имеет удовлетворительную активность на TLR9 человека, 2006-3dT4G5T4 (Таблица 4). Немодифицированные и модифицированные формы тестировали in vitro в HEKBlue-hTLR9 клетках.

Полученные результаты свидетельствуют о том, что TLR9-стимулирующая активность 2006-3dT4G5T4 улучшается значительно при 3'-холестерильной модификации по отношению к ЕС₅₀, которая более чем в 3 раза ниже, чем для 2006-3dT4G5T43C (Таблица 5, Фиг. 4А, 4В).

3'- холестерильная модификация PDE-ОДН (IV)

3'-холестерильную модификацию (см. Фиг. 1 для химической структуры холестерил-линкерного компонента) применяли к PDE-ОДН, который имеет удовлетворительную активность на TLR9 человека, 2006-3dT4G5T4 (Таблица 8). Немодифицированные и модифицированные формы тестировали in vitro в HEKBlue-hTLR9 клетках.

Полученные результаты свидетельствуют о том, что TLR9-стимулирующая активность 2006-3dT4G5T4 улучшается значительно при 3'-холестерильной модификации по отношению к ЕС₅₀, которая более чем в 36 раз ниже, чем для 2006-3dT4G5T43C (Таблица 9, Фиг. 5).

3'- холестерильная модификация PDE-ОДН (V)

3'-холестерильную модификацию (см. Фиг. 6 для химической структуры холестерил-линкерного компонента) применяли к PDE-ОДН, имеющему очень плохую активность на TLR9 человека, 2006-3dT4G5T4 (Таблица 10). Немодифицированные и модифицированные формы тестировали in vitro в HEKBlue-hTLR9 клетках.

Полученные результаты свидетельствуют о том, что TLR9-стимулирующая активность 2006-3dT4G5T4 чрезвычайно улучшается при 3'-холестерильной модификации, от практически нуля для ЕС₅₀ до 68 нМ (Таблица 11, Фиг. 7).

3'- холестерильная модификация PDE-ОДН (VI)

3'-холестерильную модификацию (см. Фиг. 1 для химической структуры холестерил-линкерного компонента) применяли к PDE-ОДН, которые имеют очень плохую активность или не имеют активности на TLR9 человека, 2007-PDE-T4 или 2007-PDE-T4G5T4 (Таблица 12). Немодифицированные и модифицированные формы тестировали in vitro в HEKBlue-hTLR9 клетках.

Полученные результаты свидетельствуют о том, что TLR9-стимулирующая активность обоих 2007-PDE-T4 и 2007-PDE-T4G5T4 чрезвычайно улучшается при 3'-холестерильной модификации (Фиг. 8А и 8В), в случае 2007-T4G5T4-3Ch до ЕС₅₀ 24,9 нМ (Таблица 13).

Пример 2: TLR9 человека, природная экспрессия в Ramos-Blue клетках

3'- холестерильная модификация (I)

3'-холестерильную модификацию (см. Фиг. 1 для химической структуры холестерил-линкерного компонента) применяли к PDE-ОДН, который имеет удовлетворительную активность на TLR9 человека, 2006-3dT4G5T4 (Таблица 14). Немодифицированные и модифицированные формы тестировали in vitro в Ramos-Blue клетках. Клеточная линия В-лимфоцитов Ramos-Blue (Invivogen, San Diego, CA) стабильно экспрессирует NF-κB/AP-1-индуцибельный репортерный ген, который предоставляет возможность обнаружения TLR9 передачи сигналов.

Полученные результаты свидетельствуют о том, что TLR9-стимулирующая активность 2006-3dT4G5T4 улучшается значительно при 3'-холестерильной модификации по отношению к ЕС₅₀, которая более чем в 8-раз ниже, чем для 2006-3dT4G5T43C (Таблица 15, Фиг. 9А, 9В). Также, модифицированный ОДН 2006-3dT4G5T43C превосходит активность "промышленного стандарта" ОДН 2006-РТО.

3'- холестерильная модификация (II)

3'-холестерильную модификацию (см. Фиг. 1 для химической структуры холестерил-линкерной группы) применяли к PDE-ОДН, который имеет удовлетворительную активность на TLR9 человека, 2006-3dT4G5T4 (Таблица 16). Немодифицированные и модифицированные формы тестировали in vitro в Ramos-Blue клетках.

Полученные результаты свидетельствуют о том, что TLR9-стимулирующая активность 2006-3dT4G5T4 улучшается значительно при 3'-холестерильной модификации по отношению к ЕС₅₀, которая более чем в 7-раз ниже, чем для 2006-3dT4G5T43C (Таблица 17, Фиг. 10А, 10В).

3'- холестерильная модификация PDE-ОДН (III)

3'-холестерильную модификацию (см. Фиг. 1 для химической структуры холестерил-линкерного компонента) применяли к PDE-ОДН, который только плохо активный на TLR9 человека, 2006-T4-PDE (Таблица 18). Немодифицированные и модифицированные формы тестировали in vitro в Ramos-Blue клетках.

Полученные результаты свидетельствуют о том, что стимулирующая активность TLR9 человека для 2006-T4-PDE улучшается значительно при 3'-холестерильной модификации (Таблица 18, Фиг. 11).

3'- холестерильная модификация PDE-ОДН (IV)

3'-холестерильная модификация (см. Фиг. 6 для химической структуры холестерил-линкерного компонента) применяли к PDE-ОДН, который имеет очень плохую активность на TLR9 человека, 2006-3dT4G5T4 (Таблица 19). Немодифицированные и модифицированные формы тестировали in vitro в Ramos-Blue клетках.

Полученные результаты свидетельствуют о том, что стимулирующая активность TLR9 человека для 2006-3dT4G5T4 на Ramos-Blue клетках улучшается значительно при 3'-холестерильной модификации (Таблица 20, Фиг. 12) в 13 раз применительно к ЕС₅₀.

3'- холестерильная модификация PDE-ОДН (V)

3'-холестерильную модификацию (см. Фиг. 1 для химической структуры холестерил-линкерного компонента) применяли к PDE-ОДН, которые имеют очень плохую активность или не имеют активности на TLR9 человека, 2007-PDE-T4 или 2007-PDE-T4G5T4 (Таблица 21). Немодифицированные и модифицированные формы тестировали in vitro в Ramos-Blue клетках.

Полученные результаты свидетельствуют о том, что стимулирующая активность TLR9 человека для 2006-3dT4G5T4 в Ramos-Blue клетках улучшается значительно при 3'-холестерильной модификации всех ОДН, рассматриваемых в этом эксперименте (2007-PDE-T4, 2007-T4G5T4, TCG8-T4, Таблица 22, Фиг. 13А, 13В и 13С). В случае 2007-T4G5T4-Ch, отмечали улучшение активности практически в 14 раз применительно к ЕС₅₀ по сравнению с его немодифицированным аналогом.

Пример 3: Мышиный TLR9, рекомбинантная сверхэкпрессия в HEKBlue

3'- холестерильная модификация PDE-ОДН

3'-холестерильную модификацию (см. Фиг. 1 для химической структуры холестерил-линкерного компонента) применяли к 2007-PDE-T4, 2007-PDE-T4G5T4, и TCG8-T4, которые имеют очень плохую активность или не имеют активности на TLR9 человека (Таблица 23). Немодифицированные и модифицированные формы тестировали in vitro в HEKBlue-mTLR9 клетках (Invivogen).

Полученные результаты свидетельствуют о том, что стимулирующая активность всех ОДН для мышиного TLR9, рассматриваемых в этом эксперименте (2007-PDE-T4, 2007-T4G5T4, TCG8-T4, Таблица 23) в HEKBlue-mTLR9 улучшается значительно при 3'-холестерильной модификации в трех случаях (Фиг. 14А, 14В и 14С), и незначительно при низких концентрациях в четвертом примере (Фиг. 14D).

Пример 4: Систематическое исследование на немодифицированных, модифицированных 3'-холестерилом и модифицированных 5'-холестерилом ОДН на HEKBlue-hTLR9 и Ramos-Blue клетках: зависимость активности от структуры (SAR)

HEKBlue-hTLR9

3'-холестерильные или 5'-холестерильные модификации (см. Фиг. 6 и 15, соответственно для химических структур компонентов холестерил-линкер) применяли к 4 различным ОДН (Таблица 24). Немодифицированные и модифицированные формы тестировали in vitro в HEKBlue-hTLR9 клетках.

В этом эксперименте, нулевые ОДН значения вычитали из каждой экспериментальной точки для расчета ЕС50 и Vmax, вследствие относительно высоких фоновых данных.

Для каждого ОДН, исследуемого в этом эксперименте, 3'-холестерильная модификация была наиболее благоприятной для активности на TLR9 человека, экспрессируемых в HEKblue клетках (Таблица 24, Фиг. 16А, 16В, 16С, 16D). В тех случаях, где возможны расчеты EC₅₀/V_max (2006-G5, 2006-T4G5T4, Таблица 25), было обнаружено, что ЕС₅₀ немодифицированных ОДН была более низкой (в 2,5 и 48 раз, соответственно), в то время как 5'-холестерильная модификация приводила к потере активности. ЕС50 для 2006-G5-3Chol и 2006-T4G5T4-3Chol были более низкими по сравнению с такими значениями "промышленного стандарта" 2006-РТО, что делает их кандидатами для иммуномодулирующего вмешательства.

Ramos-Blue

3'-холестерильные или 5'-холестерильные модификации (см. Фиг. 6 и 15, соответственно для химических структур холестерил-линкерных компонентов) применяли к 4 различным ОДН (Таблица 26). Немодифицированные и модифицированные формы тестировали in vitro в Ramos-Blue клетках.

В этом эксперименте, нулевые ОДН значения вычитали из каждой экспериментальной точки для расчета ЕС50 и Vmax, для обеспечения согласованности с Таблицей 25).

Для каждого ОДН, исследуемого в этом эксперименте, 3'-холестерильная модификация была наиболее благоприятной для активности на TLR9 человека, эндогенно присутствующей в Ramos-Blue клетках (Таблица 26, Фиг. 17А-17D). В тех случаях, где возможны расчеты EC₅₀/V_max (2006-G5, 2006-T4G5T4, Таблица 25), было обнаружено, что ЕС₅₀ немодифицированных ОДН была более низкой (в 3 и 10 раз, соответственно), в то время как 5'-холестерильная модификация приводила к потере активности, за исключением такой для TCG8-T4G5T4, где обе дериватизации проводят к улучшенной активности, но больше для 3'-холестерила, чем для 5'-холестерила (Фиг. 17D, Таблица 26). ЕС₅₀ для 2006-G5-3Chol и 2006-T4G5T4-3Chol были более низкими по сравнению с такими значениями "промышленного стандарта" 2006-РТО, что делает их кандидатами для иммуномодулирующего вмешательства.

Для квалифицированных специалистов в данной области техники будет понятно, что в предпочтительные варианты осуществления изобретения могут быть внесены различные изменения и модификации и что такие изменения и модификации могут быть осуществлены без отклонения от сущности изобретения. Следовательно, предполагается, что пункты приложенной формулы изобретения охватывают все такие эквивалентные вариации как подпадающие под сущность и объем изобретения.

Раскрытие каждого патента, патентной заявки и публикации, процитированной или описанной в данной документе, таким образом полностью включено в настоящую заявку в качестве ссылки.

1. Иммуностимулирующий олигонуклеотид, содержащий CpG мотив и 3'-холестериновый компонент, где иммуностимулирующий олигонуклеотид включает SEQ ID NO: 2, 3, 4, 5, 6, или 8.

2. Иммуностимулирующий олигонуклеотид по п. 1, где иммуностимулирующий олигонуклеотид включает фосфодиэфирные связи между нуклеотидами иммуностимулирующего олигонуклеотида.

3. Иммуностимулирующий олигонуклеотид по п. 1, где иммуностимулирующий олигонуклеотид включает фосфоротиоатные связи между нуклеотидами иммуностимулирующего олигонуклеотида.

4. Иммуностимулирующий олигонуклеотид по одному из пп. 1-3, где холестериновый компонент ковалентно присоединен к 3'-концевому нуклеотиду иммуностимулирующего олигонуклеотида с помощью линкера.

5. Иммуностимулирующий олигонуклеотид по одному из пп. 1-4, содержащий 3'-концевую последовательность, содержащую множество тиминовых нуклеотидов.

6. Иммуностимулирующий олигонуклеотид по п. 5, где множество тиминовых нуклеотидов включает последовательные тиминовые нуклеотиды.

7. Иммуностимулирующий олигонуклеотид по п. 5 или 6, где множество тиминовых нуклеотидов включает от 4-х до 6-ти последовательных тиминовых нуклеотидов.

8. Иммуностимулирующий олигонуклеотид по одному из пп. 5-7, где 3'-концевая последовательность включает SEQ ID NO:9.

9. Иммуностимулирующий олигонуклеотид по одному из пп. 4-8, где линкер включает углеродную цепь.

10. Иммуностимулирующий олигонуклеотид по п. 9, где углеродная цепь включает от 3 до 12 атомов углерода.

11. Иммуностимулирующий олигонуклеотид по одному из пп. 4-10, где линкер включает гександиол.

12. Иммуностимулирующий олигонуклеотид по одному из пп. 9-11, содержащий холестерин-линкерный компонент, имеющий следующую структуру:

13. Иммуностимулирующий олигонуклеотид по одному из пп. 4-10, где линкер включает повторяющуюся химическую единицу.

14. Иммуностимулирующий олигонуклеотид по п. 13, где повторяющаяся химическая единица повторяется от 2 до 12 раз.

15. Иммуностимулирующий олигонуклеотид по п. 13, где повторяющаяся химическая единица представляет собой этиленгликоль.

16. Иммуностимулирующий олигонуклеотид по одному из пп. 13-15, где линкер включает гексаэтиленгликоль.

17. Иммуностимулирующий олигонуклеотид по одному из пп. 13-16, где холестериновый компонент ковалентно связан с линкером с образованием холестерин-линкерного компонента.

18. Иммуностимулирующий олигонуклеотид по п. 17, содержащий холестерин-линкерный компонент, имеющий следующую структуру:

19. Иммуностимулирующая композиция, содержащая иммуностимулирующий олигонуклеотид по одному из пп. 1-18.

20. Иммуностимулирующая композиция по п. 19, дополнительно содержащая вакцину для предотвращения или лечения инфекционного заболевания.

21. Иммуностимулирующая композиция по п. 19 или 20, дополнительно содержащая вектор.

22. Иммуностимулирующая композиция по п. 21, где вектор представляет собой вирусный вектор.

23. Иммуностимулирующая композиция по п. 22, где олигонуклеотид упакован внутри вирусного вектора.

24. Иммуностимулирующая композиция по одному из пп. 19-23, дополнительно содержащая фармацевтически приемлемый носитель.

25. Иммуностимулирующая композиция по п. 24, где олигонуклеотид и фармацевтически приемлемый носитель ковалентно связаны.

26. Иммуностимулирующая композиция по одному из пп. 19-25, дополнительно содержащая гаптен.

27. Иммуностимулирующая композиция по п. 26, где олигонуклеотид и гаптен ковалентно связаны.

28. Способ получения иммуностимулирующего олигонуклеотида по одному из пп. 1-18, включающий присоединение холестеринового компонента к 3'-концу TLR9-лиганда с помощью линкера, где TLR9-лиганд представляет собой олигонуклеотид, имеющий CpG-мотив.

29. Способ по п. 28, где холестериновый компонент ковалентно связан с линкером с образованием холестерин-линкерного компонента.

30. Способ по п. 29, где холестерин-линкерный компонент включает:

31. Способ по п. 29, где холестерин-линкерный компонент включает:

32. Способ вызывания TLR9-опосредованного иммунного ответа у субъекта, включающий введение субъекту иммуностимулирующего олигонуклеотида по одному из пп. 1-18 или иммуностимулирующей композиции по одному из пп. 19-27.

33. Способ по п. 32, где введение осуществляют внутривенно, внутримышечно, интрамаммарно, внутрикожно, внутрибрюшинно, подкожно, путем распыления, с помощью аэрозоля, «в яйцо», слизисто, чрескожно, путем погружения, перорально, внутрь глаза, интратрахеально или интраназально.

34. Способ по п. 32 или 33, где субъект представляет собой животное.

35. Способ по одному из пп. 32-34, где субъект представляет собой млекопитающее.

36. Способ по одному из пп. 32-35, где субъект представляет собой водные виды.

37. Способ по одному из пп. 32-35, где субъект представляет собой мышь, свинью, корову, лошадь, овцу или человека.