Способ культивирования и культуральная среда для пролиферации человеческих vγ9vδ2 t-клеток

Настоящее изобретение относится к области клеточной биологии, в частности к способу пролиферации человеческих Vγ9Vδ2 Т-клеток и культуральной среде для их пролиферации. Для осуществления указанного способа сначала культивируют композицию, содержащую T-клетки, используя культуральную среду, способную стимулировать T-клетки, которая содержит полную культуральную среду RPMI-1640 с 10% фетальной телячьей сывороткой, интерлейкин-2 и соединение фосфоновой кислоты, а именно золедроновую кислоту. Далее используют вторую культуральную среду для культивирования стимулированных T-клеток, которая содержит полную культуральную среду RPMI-1640 с 10% фетальной телячьей сывороткой, интерлейкин-2, интерлейкин-15 и витамин C. При этом концентрация интерлейкина-2 составляет 40-500 нг/мл, концентрация интерлейкина-15 составляет 3,48-700 нг/мл, концентрация витамина C составляет 70 мкМ - 300 мМ, концентрация соединений фосфоновой кислоты составляет 50-500 мкМ. Настоящее изобретение позволяет улучшать эффективность пролиферации и чистоту Vγ9Vδ2 Т-клеток. Человеческая Vγ9Vδ2 Т-клетка, полученная посредством культивирования в данном способе, обладает более сильной антиапоптотической способностью и более длительным периодом выживаемости клеток, и, кроме того, уровень экспрессии ее критических молекул-киллеров NKG2D выше, что позволяет ей иметь более сильную способность уничтожения опухолевых клеток. 2 н. и 3 з.п. ф-лы, 8 ил., 1 табл., 6 пр.

 

Перекрестная ссылка на родственные заявки

Данное раскрытие заявляет приоритет по китайской патентной заявке №201811580040.2, поданной Китайским патентным ведомством 24 декабря 2018 года, под названием «Способ и культуральная среда для пролиферации человеческих Vγ9Vδ2 Т-клеток», которая включена в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте.

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее раскрытие относится к технической области клеточной культуры, в частности, к способу и культуральной среде для пролиферации человеческих Vγ9Vδ2 Т-клеток.

Предшествующий уровень техники

Терапия на основе иммуноцитов стала новым важным медицинским способом лечения рефракторных заболеваний (таких как злокачественная опухоль) в области медицины во всем мире, например, CAR-T-клетка используется для лечения В-клеточной лимфомы. Для научных и медицинских сообществ очень важно получать иммуноцит со стабильным и надежным качеством и хорошими функциями для оказания хорошего клинического лечебного эффекта.

Человеческая Vγ9Vδ2 Т-клетка, которая существует только у приматов и человека, представляет собой субпопуляцию Т-клеток с противоопухолевыми и противоинфекционными функциями. Человеческая Vγ9Vδ2 Т-клетка может быть использована для терапии на основе иммуноцитов или восстановления иммунологической функции людей, которые страдают от опухоли, рефракторных инфекционных заболеваний или заболеваний, связанных с несбалансированной иммунной функцией.

В настоящее время существует главным образом два типа способов пролиферации человеческих Vγ9Vδ2 Т-клеток:

первый тип существующей технологии пролиферации заключается в добавлении моноклональных антител против IL-2 (от англ. interleukin - интерлейкин 12) и TCR (от англ. Т cell receptor - Т-клеточный рецептор) в культуральную среду мононуклеарных клеток периферической крови (РВМС - от англ. peripheral blood mononuclear cell). Основным недостатком данного способа является то, что данные два типа γδ Т-клеток (субпопуляция клеток Vδ1 и субпопуляция клеток Vδ2) в периферической крови оба являются пролиферированными, в то время как субпопуляция клеток Vδ1 имеет функцию иммунодепрессии, и, таким образом, не может применяться для терапии на основе иммуноцитов; и

второй тип существующей технологии пролиферации заключается в добавлении IL-2 и низкомолекулярного соединения фосфата, такого как золедроновая кислота, в культуральную среду РВМС. Способ может придавать γδ Т-клеткам субпопуляции клеток Vδ2 относительно высокую чистоту, и, таким образом, может быть использован в терапии на основе иммуноцитов, и это является общепринятым способом, используемым в настоящее время для пролиферации человеческих Vγ9Vδ2 Т-клеток в периферической крови человека внутри страны и заграницей. Однако, способ имеет следующие недостатки: период пролиферации клеточной культуры составляет примерно 14 суток, пролиферированные человеческие Vγ9Vδ2 Т-клетки имеют относительно короткий период выживаемости (которые могут длительное время выживать на протяжении примерно 7 суток), и, таким образом, антиапоптотическая способность не является сильной, и, таким образом, способность уничтожать опухолевые клетки также не является сильной.

Краткое изложение сущности изобретения

Цель настоящего раскрытия включает, например, предложение способа пролиферации человеческих Vγ9Vδ2 Т-клеток, который может улучшать эффективность пролиферации и чистоту человеческих Vγ9Vδ2 Т-клеток, и культивируемые человеческие Vγ9Vδ2 Т-клетки обладают относительно более сильной способностью уничтожения и способностью подавления в отношении опухоли, и обладают более сильной антиапоптотической способностью и более длительным периодом выживаемости клеток.

Цель настоящего раскрытия также включает, например, предложение культуральной среды для человеческих Vγ9Vδ2 Т-клеток, и данную культуральную среду используют для культивирования человеческих Vγ9Vδ2 Т-клеток, и она может улучшать эффективность пролиферации и чистоту человеческих Vγ9Vδ2 Т-клеток, и культивируемые человеческие Vγ9Vδ2 Т-клетки обладают относительно более сильной способностью уничтожения и способностью подавления опухоли, и обладают более сильной антиапоптической способностью и имеют более длительный период выживаемости клеток.

Цель настоящего раскрытия также включает, например, предложение культуральной среды для стимуляции и пролиферации человеческих Vγ9Vδ2 Т-клеток, которая может селективно осуществлять пролиферацию человеческих Vγ9Vδ2 Т-клеток из мононуклеарных клеток периферической крови, и пролиферированные человеческие Vγ9Vδ2 Т-клетки обладают высокой чистотой, более сильной способностью уничтожения и более сильной антиапоптотической способностью.

Согласно настоящему раскрытию предложен способ пролиферации Т-клеток, включающий:

стадию А, культивирование композиции, содержащей Т-клетки, посредством использования первой культуральной среды, которая способна стимулировать Т-клетки, со стимуляцией Т-клетки; и

стадию В, использование второй культуральной среды для культивирования стимулированных Т-клеток; где указанная вторая культуральная среда содержит интерлейкин-2, интерлейкин-15 и витамин С или производные витамина С.

В одном или множестве воплощений Т-клетки включают Vγ9Vδ2 Т-клетки.

В одном или множестве воплощений первая культуральная среда содержит интерлейкин-2 и соединения фосфоновой кислоты.

В одном или множестве воплощений первая культуральная среда содержит интерлейкин-2, соединения фосфоновой кислоты, интерлейкин-15 и витамин С или производные витамина С.

В одном или множестве воплощений производные витамина С выбраны из простого этилового эфира витамина С, пальмитата витамина С, глюкозида витамина С, фосфата магния витамина С и фосфата натрия витамина С.

В одном или множестве воплощений во второй культуральной среде концентрация интерлейкина-15 составляет 1-1000 нг/мл.

В одном или множестве воплощений во второй культуральной среде концентрация витамина С или производных витамина С составляет 10 мкМ-800 мМ.

В одном или множестве воплощений во второй культуральной среде концентрация интерлейкина-2 составляет 1-1000 нг/мл.

В одном или множестве воплощений композиция, содержащая Т-клетки, содержит мононуклеарные клетки периферической крови, выделенные из периферической крови человеческого организма.

В одном или множестве воплощений на стадии А продолжительность культивирования составляет 60-100 часов.

В одном или множестве воплощений соединения фосфоновой кислоты включают соединения бисфосфорной кислоты, предпочтительно выбранные из группы, состоящей из золедроновой кислоты, этидроновой кислоты, ибандроновой кислоты, памидроновой кислоты, алендроновой кислоты, ризедроновой кислоты, минодроновой кислоты и их комбинаций, например, золедроновой кислоты.

В одном или множестве воплощений вторая культуральная среда содержит базовую культуральную среду, интерлейкин-2, интерлейкин-15 и витамин С или производные витамина С.

В одном или множестве воплощений базовая культуральная среда выбрана из группы, состоящей из культуральной среды RPMI-1640, D-MEM, MEM, RPMI, Opti-МЕМ и их комбинаций, например, культуральной среды RPMI-1640.

Согласно настоящему раскрытию также предложена культуральная среда, содержащая базовую культуральную среду, интерлейкин-2, интерлейкин-15 и витамин С или производные витамина С.

В одном или множестве воплощений концентрация интерлейкина-2 в культуральной среде составляет 1-1000 нг/мл, концентрация интерлейкина-15 составляет 1-1000 нг/мл и концентрация витамина С или производных витамина С составляет 10 мкМ-800 мМ.

Согласно настоящему раскрытию также предложена фармацевтическая композиция, содержащая Т-клетки, полученные посредством использования способа пролиферации согласно настоящему тексту, и фармацевтически приемлемый носитель.

Согласно настоящему раскрытию также предложена фармацевтическая композиция, содержащая Vγ9Vδ2 Т-клетки, полученные посредством использования способа пролиферации согласно настоящему тексту, и фармацевтически приемлемый носитель.

В одном или множестве воплощений фармацевтическая композиция представляет собой клеточную суспензию.

Согласно настоящему раскрытию также предложено применение Т-клеток, полученных способом пролиферации согласно настоящему раскрытию, или фармацевтической композиции по настоящему раскрытию в получении лекарственных средств для подавления, предупреждения или лечения инфекционных заболеваний, аутоиммунных заболеваний или злокачественных заболеваний.

В одном или множестве воплощений злокачественное заболевание представляет собой рак.

В одном или множестве воплощений злокачественное заболевание представляет собой рак легкого.

Согласно настоящему раскрытию также предложен способ подавления, предупреждения или лечения инфекционных заболеваний, аутоиммунных заболеваний или злокачественных заболеваний, включающий:

(1) выделение мононуклеарных клеток периферической крови из периферической крови субъекта, нуждающегося в этом;

(2) осуществление пролиферации мононуклеарных клеток периферической крови посредством способа пролиферации по настоящему раскрытию; и

(3) введение пролиферированного продукта субъекту, нуждающемуся в этом.

Согласно настоящему изобретению также предложено применение Т-клеток, полученных способом пролиферации согласно настоящему тексту, или фармацевтической композиции по настоящему тексту в подавлении, предупреждении или лечении инфекционных заболеваний, аутоиммунных заболеваний или злокачественных заболеваний.

Согласно настоящему раскрытию также предложено применение культуральной среды по настоящему тексту, используемой для пролиферации Т-клеток.

В одном или множестве воплощений Т-клетки представляют собой Vγ9Vδ2 Т-клетки.

Согласно настоящему раскрытию предложен способ пролиферации человеческих Vγ9Vδ2 Т-клеток, включающий:

стадию 1, выделение мононуклеарных клеток периферической крови из периферической крови организма человека;

стадию 2, предоставление первой культуральной среды, ресуспендирование мононуклеарных клеток периферической крови посредством использования первой культуральной среды с получением клеточной суспензии,

где первая культуральная среда содержит вторую культуральную среду и соединения фосфоновой кислоты; и вторая культуральная среда содержит базовую культуральную среду и итерлейкин-2, итерлейкин-15 и витамин С или производные витамина С, добавляемые в базовую культуральную среду; и

порядок стадии 1 и стадии 2 можно регулировать;

стадию 3 (или стадию А), инокуляцию клеточной суспензии в контейнер для клеточной культуры с культивированием в течение 60-100 часов; и

стадию 4 (или стадию В), использование второй культуральной среды для замены среды, где вторую культуральную среду используют во всех последующих способах культивирования.

В одном или множестве воплощений базовая культуральная среда представляет собой культуральную среду RPMI-1640; и соединения фосфоновой кислоты включают одно или множество из следующих соединений: золедроновая кислота, этидроновая кислота, ибандроновая кислота, памидроновая кислота, алендроновая кислота, ризедроновая кислота, минодроновая кислота.

В одном или множестве воплощений на стадии 2 плотность клеток клеточной суспензии составляет 3~4×10⁶ клеток/мл.

В одном или множестве воплощений на стадии 2 в первой культуральной среде концентрация соединений фосфоновой кислоты составляет 1-1000 мкМ; и

В первой культуральной среде и второй культуральной среде концентрация интерлейкина-2 составляет 1-1000 нг/мл, концентрация интерлейкина-15 составляет 1-1000 нг/мл и концентрация витамина С или производных витамина С составляет 10 мкМ-800 мМ.

В одном или множестве воплощений контейнер для клеточной культуры представляет собой 24-луночный планшет, 48-луночный планшет или 96-луночный планшет; на стадии 3 клеточную суспензию инокулируют в контейнер для клеточной культуры для культивирования в течение 72 часов; и в последующем процессе культивирования на стадии 4 среду для клеток заменяют каждые 48-72 часа.

Согласно настоящему раскрытию также предложена культуральная среда, содержащая базовую культуральную среду и интерлейкин-2, интерлейкин-15 и витамин С, добавляемые в базовую культуральную среду.

В одном или множестве воплощений базовая культуральная среда представляет собой культуральную среду RPMI-1640.

В одном или множестве воплощений в культуральной среде концентрация интерлейкина-2 составляет 1-1000 нг/мл, концентрация интерлейкина-15 составляет 1-1000 нг/мл и концентрация витамина С составляет 10 мкМ-800 мМ.

Согласно настоящему раскрытию также предложена первая культуральная среда, которая содержит вторую культуральную среду и соединения фосфоновой кислоты.

В одном или множестве воплощений в первой культуральной среде концентрация соединений фосфоновой кислоты составляет 1-1000 мкМ.

Настоящее раскрытие имеет следующие преимущественные эффекты:

(1) в сравнении с общепринятым способом пролиферации (второй тип технологии пролиферации), человеческие Vγ9Vδ2 Т-клетки, полученные способом пролиферации по настоящему раскрытию, обладают более высокой эффективностью пролиферации и более высокой чистотой клеток; 90%-ная чистота клеток может быть достигнута при проведении культивирования в течение 10-12 суток (начиная со стадии 3), и индекс пролиферации клеток достигает более чем 1000 раз (а именно, могут пролиферировать от 100000 человеческих Vγ9Vδ2 Т-клеток до по меньшей мере 100 миллионов человеческих Vγ9Vδ2 Т-клеток), что очевидно сокращает период культивирования для пролиферации человеческих Vγ9Vδ2 Т-клеток;

(2) в сравнении с человеческими Vγ9Vδ2 Т-клетками, полученными общепринятым способом пролиферации (второй тип технологии пролиферации), человеческие Vγ9Vδ2 Т-клетки, полученные способом пролиферации по настоящему раскрытию, обладают более сильными способностями уничтожения и подавление опухоли; и

(3) человеческие Vγ9Vδ2 Т-клетки, полученные способом пролиферации по настоящему раскрытию, обладают более сильной антиапоптотической способностью и более длительным периодом выживаемости, и после окончания периода культивирования с пролиферацией клеток (10-12 суток, начиная со стадии 3), человеческие Vγ9Vδ2 Т-клетки, полученные способом пролиферации по настоящему раскрытию, могут продолжать выживать на протяжении примерно 20 суток.

Краткое описание графических материалов

Для более ясной иллюстрации технических решений воплощений настоящего раскрытия, прилагаемые графические материалы, которые нужно использовать в воплощениях, будут кратко введены ниже, и следует понимать, что данные прилагаемые ниже графические материалы лишь демонстрируют некоторые воплощения настоящего раскрытия, таким образом, их не следует рассматривать как ограничение объема.

Фиг. 1 представляет собой график сравнения эффективностей пролиферации, когда используют четыре разные культуральные среды для проведения пролиферации культуры человеческих Vγ9Vδ2 Т-клеток.

Фиг. 2 представляет собой график сравнения индексов апоптоза человеческих Vγ9Vδ2 Т-клеток, полученных посредством использования четырех разных культуральных сред для проведения пролиферации культуры человеческих Vγ9Vδ2 Т-клеток.

Фиг. 3 представляет собой график сравнения уровней экспрессии критической молекулы-киллера NKG2D человеческих Vγ9Vδ2 Т-клеток, полученных в результате использования четырех разных культуральных сред для проведения пролиферации культуры человеческих Vγ9Vδ2 Т-клеток.

Фиг. 4А представляет собой схематичное изображение размера опухоли после обработки клетками гуманизированной мыши с раком легкого, используя человеческие Vγ9Vδ2 Т-клетки, полученные общепринятым способом пролиферации (IL-2).

Фиг. 4В представляет собой схематичное изображение размера опухоли после обработки клетками гуманизированной мыши с раком легкого, используя человеческие Vγ9Vδ2 Т-клетки, полученные способом пролиферации (IL2+IL15+VC) по настоящему раскрытию.

Фиг. 4С представляет собой схематичное изображение размера опухоли гуманизированной мыши с раком легкого в случае отсутствия обработки.

Фиг. 5 представляет собой схематичное изображение вариаций объема опухоли гуманизированной мыши с раком легкого в разных условиях обработки; и

Фиг. 6 представляет собой схематичное изображение вариаций коэффициента выживаемости гуманизированной мыши с раком легкого в разных условиях обработки.

Подробное описание воплощений

Термины, используемые в настоящем раскрытии

Термин «базовая культуральная среда», используемый в настоящем тексте, относится к раствору, содержащему питательные элементы, которые подпитывают рост клеток млекопитающего. Базовая культуральная среда предоставляет стандартные неорганические соли, такие как соли цинка, железа, магния, кальция и калия, и витамины, глюкозу, буферную систему и незаменимые аминокислоты. Например, базовая культуральная среда представляет собой культуральную среду RPMI-1640, D-MEM, MEM, RPMI, Opti-MEM или их комбинации.

Термин «полученный посредством» имеет то же значение, как и термин «содержащий». Термин «включают», «содержат», «имеют» или любые другие варианты, используемые в данном документе, предназначены для охвата неисключающего содержания. Например, композиция, стадия, способ, изделие или устройство, содержащее перечисленные элементы, не обязательно ограничивается данными элементами, также могут содержаться другие элементы, явным образом не перечисленные, или элементы, присущие такой композиции, стадии, способу, изделию или устройству.

Соединительная фраза «состоят из» исключает какие-либо неустановленные элементы, стадии или компоненты. При использовании в пункте формулы изобретения, данная фраза будет делать данный пункт формулы изобретения закрытым, таким образом, что пункт формулы изобретения не содержит веществ, отличных от описанных веществ, за исключением традиционных примесей, ассоциированных с ними. Когда фраза «состоят из» появляется в субпредложении предмета пункта формулы изобретения, а не сразу после предмета, она только определяет элементы, описанные в субпредложении; и другие элементы не исключены из пункта формулы изобретения полностью.

Когда количество, концентрацию или другую величину или параметр выражают посредством интервала, предпочтительного интервала или интервала, определенного целым рядом предпочтительных верхних предельных значений и предпочтительных нижних предельных значений, его следует понимать, как раскрытие всех интервалов, образованных посредством какого-либо попарного соединения какого-либо верхнего предельного или предпочтительного значения какого-либо интервала и какого-либо нижнего предельного или предпочтительного значения какого-либо интервала, несмотря на то, раскрыт ли в отдельности данный интервал или нет. Например, когда раскрыт интервал «1~5», нужно объяснить, что описанный интервал содержит интервалы «1~4», «1~3», «1~2», «1~2 и 4~5», «1~3 и 5» и тому подобное. Когда в настоящем тексте описан интервал значений, если не описано иначе, подразумевается, что интервал содержит свои граничные значения и все целые числа и доли в пределах данного интервала.

Термин «массовые части» относится к основной единице измерения, которая представляет соотношение масс множества компонентов; 1 часть может представлять любую единичную массу, например, она может представлять 1 г или 2,689 г и тому подобное. Если массовые части компонента А представляют собой части а, и массовые части компонента В представляют собой части b, тогда это показывает, что массовое соотношение компонента А и компонента В составляет а:b. Или же, это показывает, что масса компонента А представляет собой aK, и масса компонента В представляет собой bK (K представляет собой случайное число, представляющее множественный фактор). Что не следует неправильно понимать, это то, что сумма данных массовых частей всех данных компонентов не ограничивается 100 частями, что отличается от массовой доли.

Термин «и/или» используют для ссылки на то, что одно или оба из описанных условий могут случаться, например, А и/или В содержит (А и В) и (А или В).

Кроме того, элемент или компонент по настоящему раскрытию в единственном числе не имеют ограничений по количеству (а именно, количеству раз наступления события) элемента или компонента. Таким образом, следует понимать, что элемент или компонент в единственном числе включает один или по меньшей мере один, и элемент или компонент в форме единственного числа также включает форму множественного числа, если описанное число явным образом не предназначено для ссылки на форму единственного числа.

Термин «производные витамина С» обычно представляет собой тип соединений с ендиольной структурой, которая стабилизирует восстановленный витамин С посредством введения других групп к атому углерода в положении 2 витамина С. Примеры производных витамина С включают фосфат витамина С, такой как фосфат магния витамина С и фосфат натрия витамина С; пальмитат витамина С и простой этиловый эфир витамина С; и углеводы витамина С, такие как глюкозид витамина С и тому подобное.

Термины «мононуклеарные клетки периферической крови», «РВМС» или «мононуклеарная клетка» относятся к мононуклеарным клеткам, выделенным из периферической крови, и обычно используются для противораковой иммунотерапии. Мононуклеарные клетки периферической крови могут быть получены из собранной крови человека с использованием, например, способа градиента плотности фиколл-гипак.

«Мононуклеарные клетки периферической крови» могут быть получены от нормальных людей, субъектов, которые находятся в группе риска заболеть, или пациентов. Мононуклеарные клетки периферической крови, используемые в данном документе, не обязательно должны происходить из аутологичных, и также можно использовать аллогенные мононуклеарные клетки периферической крови.

Термин «злокачественное заболевание» в настоящем тексте используют в его наиболее широком смысле, и он относится к заболеваниям, характеризующимся неконтролируемым ростом клеток. Он включает адренокортикальную карциному, рак анального канала, рак мочевого пузыря, эпендимому, медуллобластому, рак молочной железы, рак шейки матки, рак толстой кишки, рак эндометрия, рак пищевода, экстрагепатическую холангиокарциному, рак глаза, рак желчного пузыря, рак желудка, герминогенные опухоли, внегонадный рак, рак головы и шеи, гипофарингеальный рак, рак из островковых клеток поджелудочной железы, рак гортани, лейкоз, острый лимфобластный лейкоз, рак ротовой полости, рак печени, рак легкого и тому подобное, но не ограничивается ими.

Термин «аутоиммунное заболевание» относится к заболеваниям и расстройствам, обусловленным иммунным ответом организма на свои собственные ткани, что вызывает длительное воспаление и последующее разрушение ткани. Примеры аутоиммунных заболеваний включают очаговую алопецию, диабет 1 типа, синдром Гийена-Барре, множественный склероз, ревматоидный артрит, склеродерму, полимиозит, витилиго и системную красную волчанку, но не ограничиваются ими.

Термин «инфекционное заболевание» может представлять собой результат какого-либо патогена. Его примеры включают результат вирусных инфекций, таких как СПИД (синдром приобретенного иммунодефицита), гепатит В и С, клеточных инфекций, бактериальных инфекций, паразитов и грибковых инфекций, но не ограничиваются ими.

Во-первых, согласно настоящему раскрытию предложен способ пролиферации человеческих Vγ9Vδ2 Т-клеток, включающий:

стадию 1, выделение мононуклеарных клеток периферической крови (РВМС) из периферической крови организма человека;

стадию 2, предоставление первой культуральной среды, ресуспендирование мононуклеарных клеток периферической крови посредством использования первой культуральной среды с получением клеточной суспензии,

где первая культуральная среда содержит вторую культуральную среду и соединения фосфоновой кислоты; и вторая культуральная среда содержит базовую культуральную среду и итерлейкин-2 (IL-2), итерлейкин-15 (IL-15) и витамин С, добавляемые в базовую культуральную среду; и

порядок стадии 1 и стадии 2 можно регулировать;

стадию 3, инокуляцию клеточной суспензии в контейнер для клеточной культуры с культивированием в течение 60-100 часов; и

стадию 4, использование второй культуральной среды для замены среды и использование второй культуральной среды во всех последующих способах культивирования.

В частности, на стадии 1 базовая культуральная среда представляет собой культуральную среду RPMI-1640. RPMI расшифровывается как Мемориальный Институт Розуэлл-Парк (от англ. Roswell Park Memorial Institute), представляя Мемориальный Институт Розуэлл-Парк. RPMI представляет собой тип среды для клеточной культуры, разработанной данным институтом, и 1640 относится к кодовому названию культуральной среды. При использовании данной культуральной среды добавляют 10% фетальную телячью сыворотку.

Возможно, соединения фосфоновой кислоты включают одно из или множество следующих соединений: золедроновая кислота (золедронат, ZOL), этидроновая кислота, ибандроновая кислота, памидроновая кислота, алендроновая кислота, ризедроновая кислота, минодроновая кислота.

В одном воплощении настоящего раскрытия соединение фосфоновой кислоты представляет собой золедроновую кислоту.

В частности, на стадии 2 плотность клеток клеточной суспензии составляет 3-4×10⁶ клеток/мл.

В частности, цель стадий 2 и 3 заключается в культивировании мононуклеарных клеток периферической крови посредством использования первой культуральной среды, которая содержит соединения фосфоновой кислоты, селективной пролиферации человеческих Vγ9Vδ2 Т-клеток в мононуклеарных клетках периферической крови и подавлении роста других клеток, делая другие клетки апоптотическими.

Возможно, контейнер для клеточной культуры представляет собой 24-луночный планшет, 48-луночный планшет или 96-луночный планшет.

Целью стадии 4 является дополнительная пролиферация человеческих Vγ9Vδ2 Т-клеток с относительно высокой чистотой, полученных посредством селективной пролиферации на стадии 3, с дополнительным добавлением количества человеческих Vγ9Vδ2 Т-клеток.

В частности, на стадии 2 в первой культуральной среде концентрация соединения фосфоновой кислоты составляет 1-1000 мкМ; и

в первой культуральной среде и второй культуральной среде концентрация интерлейкина-2 составляет 1-1000 нг/мл, концентрация интерлейкина-15 составляет 1-1000 нг/мл, и концентрация витамина С составляет 10 мкМ-800 мМ.

Предпочтительно, на стадии 3 клеточную суспензию инокулируют в контейнер для клеточной культуры, культивируя в течение 72 часов.

В частности, в последующем способе культивирования на стадии 4 среду для клеток меняют каждые 48-72 часа.

В частности, общая продолжительность культивирования стадий 3 и 4 обычно составляет 10-12 суток, и клетки в данный момент достигают достаточного количества и обладают наиболее сильной способностью уничтожения, которые особенно подходят для клеточной терапии.

Согласно настоящему раскрытию предложен способ пролиферации Т-клеток, включающий:

стадию А, использование первой культуральной среды, которая содержит интерлейкин-2 и соединения фосфоновой кислоты и возможно также содержит интерлейкин-15 и витамин С или производные витамина С, для культивирования композиции, содержащей Т-клетки, для стимуляции Т-клеток; и

стадию В, использование второй культуральной среды, которая содержит интерлейкин-2, интерлейкин-15 и витамин С или производные витамина С, для культивирования стимулированных Т-клеток.

Согласно настоящему раскрытию предложен способ пролиферации человеческих Vγ9Vδ2 Т-клеток, включающий:

Стадию А, использование культуральной среды, которая содержит интерлейкин-2 и соединения фосфоновой кислоты и возможно также содержит интерлейкин-15 и витамин С или производные витамина С, для культивирования композиции, содержащей Т-клетки, для стимуляции Т-клеток;

стадию В, отбор и отделение человеческих Vγ9Vδ2 Т-клеток от стимулированных мононуклеарных клеток периферийной крови; и

стадию С, использование второй культуральной среды, которая содержит интерлейкин-2, интерлейкин-15 и витамин С или производные витамина С, для культивирования отобранных и отделенных человеческих Vγ9Vδ2 Т-клеток.

Согласно настоящему раскрытию предложен способ пролиферации человеческих Vγ9Vδ2 Т-клеток, включающий:

стадию А, выделение мононуклеарных клеток периферической крови (РВМС) из периферической крови;

стадию В, использование культуральной среды, которая может стимулировать Т-клетки, для культивации композиции, содержащей Т-клетки, для стимуляции Т-клеток;

стадию С, отбор и отделение человеческих Vγ9Vδ2 Т-клеток от стимулированных мононуклеарных клеток периферической крови; и

стадию D, использование второй культуральной среды, которая содержит интерлейкин-2, интерлейкин-15 и витамин С или производные витамина С, для культивирования отобранных и отделенных человеческих Vγ9Vδ2 Т-клеток.

Согласно настоящему раскрытию предложен способ подавления, предупреждения или лечения инфекционных заболеваний, аутоиммунных заболеваний или злокачественных заболеваний, включающий:

(1) выделение мононуклеарных клеток периферической крови из периферической крови первого субъекта;

(2) использование культуральной среды, которая содержит интерлейкин-2 и соединения фосфоновой кислоты и возможно также содержит интерлейкин-15 и витамин С или производные витамина С, для культивирования мононуклеарных клеток периферической крови для стимуляции человеческих Vγ9Vδ2 Т-клеток;

(3) использование второй культуральной среды, которая содержит интерлейкин-2, интерлейкин-15 и витамин С или производные витамина С, для культивирования стимулированных человеческих Vγ9Vδ2 Т-клеток;

(4) введение культивированных клеток второму субъекту, где

предпочтительно первый субъект и второй субъект могут быть одним и тем же субъектом. В качестве альтернативы, первый субъект и второй субъект представляют собой разные субъекты.

В вышеуказанном, мононуклеарные клетки периферической крови представляют собой композиции, содержащие Т-клетки, и предпочтительно злокачественное заболевание представляет собой рак, например, рак легкого.

В способе пролиферации человеческих Vγ9Vδ2 Т-клеток по настоящему раскрытию способы работы без конкретных условий проводят в соответствии со способами, описанными в общих условиях (например, Short Protocols in Molecular Biology, edited by F.M. Ausubel, R.E.Kingston, J.G. Seidman, et al, translated by Ma Xuejun, Shu Yuelong, Beijing: Science Press, 2004).

Крайне важный технический признак по настоящему раскрытию представляет собой применение интерлейкина-15 и витамина С в способе культивирования клеток, посредством добавления интерлейкина-15 и витамина С в способе пролиферации культуры человеческих Vγ9Vδ2 Т-клеток, в сравнении с общепринятым способом пролиферации (второй тип технологии пролиферации), эффективность пролиферации и чистота клеток человеческих Vγ9Vδ2 Т-клеток могут быть улучшены, и культивируемые человеческие Т-клетки Vγ9Vδ2 обладают более сильной антиапоптотической способностью и более длительным периодом выживаемости клеток; кроме того, уровень экспрессии своей критической молекулы-киллера NKG2D является более высоким, и в таком случае способность уничтожения опухолевых клеток является более сильной. По сравнению со вторым типом существующей технологии пролиферации (подробную информацию см. во введении в предшествующий уровень техники), настоящее раскрытие решает, например, технические проблемы низкой эффективности пролиферации и низкой чистоты, проблему, заключающуюся в том, что полученные клетки не обладают сильной способностью уничтожения, и технические проблемы, заключающиеся в том, что полученные клетки не имеют достаточного периода выживаемости и что полученные клетки склонны к старению и апоптозу и т.п.

Подводя итоги, способ пролиферации человеческих Vγ9Vδ2 Т-клеток по настоящему раскрытию имеет следующие преимущественные эффекты:

(1) по сравнению с общепринятым способом пролиферации (второй тип технологии пролиферации), человеческие Vγ9Vδ2 Т-клетки, полученные способом пролиферации по настоящему раскрытию, обладают лучшей эффективностью пролиферации и более высокой чистотой клеток; 90%-ная чистота клеток может быть достигнута, когда культивирование проводят в течение 10-12 суток (начиная со стадии 3), и индекс пролиферации клеток достигает более чем 1000 раз (а именно, может осуществляться пролиферация от 100000 человеческих Vγ9Vδ2 Т-клеток до по меньшей мере 100 миллионов человеческих Vγ9Vδ2 Т-клеток), что очевидно укорачивает период пролиферации культуры в случае человеческих Vγ9Vδ2 Т-клеток;

(2) по сравнению с человеческими Vγ9Vδ2 Т-клетками, полученными общепринятым способом пролиферации (второй тип технологии пролиферации), человеческие Vγ9Vδ2 Т-клетки, полученные способом пролиферации по настоящему раскрытию, обладают более сильными способностями уничтожения и подавления опухоли; и

(3) человеческие Vγ9Vδ2 Т-клетки, полученные способом пролиферации по настоящему раскрытию, обладают более сильной антиапоптической способностью и более длительным периодом выживаемости клеток, и после окончания периода культивирования с пролиферацией клеток (начиная со стадии 3, в течение 10-12 суток), человеческие Vγ9Vδ2 Т-клетки, полученные способом пролиферации по настоящему раскрытию, могут продолжать выживать на протяжении примерно 20 суток.

На основе упомянутого выше способа пролиферации человеческих Vγ9Vδ2 Т-клеток, согласно настоящему раскрытию также предложена культуральная среда для человеческих Vγ9Vδ2 Т-клеток (также называемая второй культуральной средой в настоящем тексте), которая содержит базовую культуральную среду и интерлейкин-2, интерлейкин-15 и витамин С, добавляемые в базовую культуральную среду.

В одном или множестве воплощений базовая культуральная среда представляет собой культуральную среду RPMI-1640.

В одном или множестве воплощений в первой культуральной среде и второй культуральной среде концентрация интерлейкина-2 составляет 1-1000 нг/мл, 1-500 нг/мл, 1-200 нг/мл или 70-130 нг/мл. В одном или множестве воплощений во второй культуральной среде концентрация интерлейкина-15 составляет 1-1000 нг/мл, 1-500 нг/мл, 1-200 нг/мл или 70-130 нг/мл. В одном или множестве воплощений во второй культуральной среде концентрация витамина С составляет 10 мкМ-800 мМ или 20 мкМ-400 мМ или 50 мкМ-100 мкМ.

Согласно настоящему раскрытию также предложена культуральная среда для стимуляции и пролиферации человеческих Vγ9Vδ2 Т-клеток (также называемая первой культуральной средой в настоящем тексте), которая содержит упомянутую выше вторую культуральную среду и соединения фосфоновой кислоты.

Возможно, в первой культуральной среде концентрация соединения фосфоновой кислоты составляет 1-1000 мкМ.

Примеры

Экспериментальные реагенты и материалы

Основные реагенты и материалы, используемые в экспериментах, предложены в следующей Таблице 1.

CFSE - от англ. carboxyfluorescein succinimidyl ester - сукцинимидиловый эфир карбоксифлуоресцеина

DMEM - от англ. Dulbecco modified Eagle's medium - среда Иглу, модифицированная по Дульбекко

PBS - от англ. phosphate buffered saline - фосфатно-солевой буферный раствор

РЕ - от англ. phycoerythrin - фикоэритрин

PerCP/Су5.5 - от англ. Peridinin chlorophyll protein-Cyanine5.5 - перидинин-хлорофилл-белковый комплекс -цианин5.5

Пример 1: Эффекты пролиферации Vγ9Vδ2 Т-клеток и характеристики Vγ9Vδ2 Т-клеток, полученных в результате пролиферации

Выделение мононуклеарных клеток периферической крови

1) Брали 4 мл раствора для разделения лимфоцитов человека и добавляли в 15 мл коническую центрифужную пробирку, буфер 1×PBS использовали для разведения периферической крови в равных долях и тщательно смешивали, и затем 10 мл разведенной периферической крови медленно распределяли по поверхности раствора для разделения лимфоцитов вдоль стенки аналитической пробирки, и центрифугирование при 600 g проводили в течение 25 мин при 25°С.

2) Стерильную пипетку Пастера использовали для перемещения среднего белого хлопьевидного слоя клеток в другую стерильную центрифужную пробирку, и равный объем PBS добавляли и тщательно перемешивали, и затем центрифугирование проводили при 1500 об./мин. в течение 10 мин.

3) После отбрасывания супернатанта, 5~10 мл буфера, лизирующего эритроциты, добавляли для ресуспендирования клеток для лизирования в течение 3~7 мин при комнатной температуре. 5-тикратный объем PBS добавляли для окончания лизиса. После фильтрования посредством 40 мкм экрана центрифугирование проводили при 1500 об./мин. в течение 10 мин.

4) После отбрасывания супернатанта 10 мл бессывороточной культуральной среды RPM11640 добавляли для ресуспендирования клеток, и центрифугирование проводили при 1500 об./мин. в течение 10 мин.

5) После отбрасывания супернатанта полную культуральную среду RPM11640 (содержащую 10% фетальную телячью сыворотку) использовали для разведения клеток, опускающихся на дно пробирки до уровня 2 мл, после тщательного и медленного перемешивания, 5 мкл клеточного разбавителя брали для разведения до соответствующей кратной величины, и для проведения подсчетов использовали гемоцитометр.

Пролиферация in vitro Vγ9Vδ2 Т-клеток

После выделения РВМС в свежей крови с использованием раствора для выделения на основе фиколла, полную культуральную среду RPMI-1640 с 10% FBS использовали для регулирования концентрации клеток до 3~4×10⁶ клеток/мл и инокулировали в 24-луночный планшет, и 40 нг/мл IL-2 и 50 мкМ золедроновой кислоты добавляли для стимулирования в течение 3 суток. Затем, золедроновую кислоту удаляли, среду меняли каждые 2~3 суток для пассирования, и использовали культуральную среду RPMI-1640, содержащую цитокины следующих концентраций: 100 ME (международная единица)/мл IL-15, 100 МЕ/мл IL-2 и 70 мкМ витамина С, для культивирования в инкубаторе для культивирования при 37°С, 5% CO₂, рН, равном 7,2-7,4, и влажности 95% в течение 10-14 суток.

Идентификация чистоты и фенотипа Vγ9Vδ2 Т-клеток

Vγ9Vδ2 Т-клетки, пролиферируемые in vitro на протяжении 10~14 суток, собирали и помещали внутрь 1,5 мл ЕР пробирки, и затем центрифугировали при 3500 об./мин. в течение 5 мин в миниатюрной центрифуге (Eppendorf 5424), и после отбрасывания супернатанта, промывку проводили два раза предварительно охлажденным PBS, 4°С; клетки переносили в соответствующие пробирки в соответствии с холостой контрольной пробиркой, изотипическим контролем и опытной группой, соответственно, и каждая пробирка содержала примерно 5×10⁵ клеток. Контрольная пробирка и пробирка для выявления соответственно были оборудованы следующим окрашивающим раствором флуоресцентного антитела в соответствии с подробным описанием антитела: антитело против человеческого CD3-V500, антитело против человеческого TCR-δ2-PE, антитело против человеческого CD45-PE-cy5, антитело против человеческого CD27-PB и NKG2D-PE-су7. Клетки ресуспендировали полученным окрашивающим раствором флуоресцентного антитела, затем помещали в холодильник на 4°С или на лед, проводили окрашивание в темном месте в течение 15-20 минут, дважды промывали PBS и центрифугировали при 3500 об./мин. в течение 5 минут, и супернатант отбрасывали, и затем клетки ресуспендировали 200-300 мкл PBS, и затем выявляли чистоту и фенотип Vγ9Vδ2 Т-клеток, используя проточный цитометр.

Анализ ki67 Vγ9Vδ2 Т-клеток

1) 7~10×10⁵ Vγ9Vδ2 Т-клеток, пролиферируемых in vitro на протяжении 10-14 суток, собирали, помещали внутрь 1,5 мл ЕР пробирки, центрифугировали при 3500 об./мин в течение 5 мин в миниатюрной центрифуге (Eppendorf 5424), и после отбрасывания супернананта два раза промывали с использованием PBS, предварительно охлажденного до 4°С.

2) Осадок клеток ресуспендировали 100 мкл PBS, добавляли поверхностно-окрашенное антитело против CD3-FITC и TCR-δ2-PE (разведение 1:200) для проточной цитометрии, в контрольную пробирку добавляли антитело изотипического контроля того же цвета и той же концентрации, и их инкубировали при 4°С в темноте в течение 15 минут.

3) После окрашивания полученный продукт промывали два раза в PBS и центрифугировали при 3500 об./мин. в течение 5 мин.

4) Набор окрашивающих буферов Foxp3 использовали для выявления уровня экспрессии внутриядерного ki67 следующим образом: приготовление фиксирующего и пермеабилизирующего буфера, равномерное перемешивание концентрации F & Р (от англ. fixation and permeabilization - фиксация и пермеабилизация) с разбавителем F & Р в объемном соотношении 1:3; и ресуспендирование клеток 500 мкл буфера F & Р, отстаивание в холодильнике при 4°С или на льду в темном месте в течение 0,5-18 часов, вследствие этого фиксация и пермеабилизация клеток.

5) 10×Пермеабилизирующий буфер разводили до 1×Пермеабилизирующего буфера ddH₂O (дважды дистиллированной водой). После фиксации добавляли 1 мл 1хпермеабилизирующего буфера, и полученный продукт центрифугировали при 5500 об./мин. при 4°С в течение 5 мин и два раза промывали.

6) Флуоресцентное антитело против APC-Ki67 разводили в буфере 1× Perm в объемном соотношении 1:200 и равномерно перемешивали; клеточный осадок ресуспендировали окрашивающим раствором, помещали в холодильник на 4°С или на лед и окрашивали в темном месте в течение 30 минут.

7) Добавляли буфер 1×Perm, полученный продукт центрифугировали при 5500 об./мин. при 4°С в течение 5 мин и ресуспендировали буферным раствором 1×Perm и еще раз центрифугировали для того, чтобы смыть несвязанное флуоресцентное антитело. Клетки ресуспендировали 200-300 мкл PBS, объем регулировали, и анализировали уровень экспрессии Ki67 посредством проточной цитометрии.

Фиг. 1 представляет собой график сравнения индексов пролиферации, показывающий, что сначала для стимуляции использовали культуральную среду, содержащую золедроновую кислоту, и затем использовали четыре разные среды для клеточных культур для проведения пролиферации культуры человеческих Vγ9Vδ2 Т-клеток.

На Фиг. 1, IL2 указывает на то, что то, что использовали во всем процессе культивации с пролиферацией, представляло собой культуральную среду, полученную в результате добавления IL2 на основе базовой культуральной среды;

IL2+VC указывает на то, что то, что использовали во всем процессе культивации с пролиферацией, представляло собой культуральную среду, полученную в результате добавления IL2+VC на основе базовой культуральной среды;

IL2+IL15 указывает на то, что то, что использовали во всем процессе культивации с пролиферацией, представляло собой культуральную среду, полученную в результате добавления IL2+IL15 на основе базовой культуральной среды; и

IL2+IL15+VC указывает на то, что то, что использовали во всем процессе культивации с пролиферацией, представляло собой культуральную среду, полученную в результате добавления IL2+IL15+VC на основе базовой культуральной среды.

На стадии стимуляции и пролиферации во всех растворах указанных выше культуральных сред использовалась базовая культуральная среда с добавлением ZOL (золедроновая кислота) и IL-2 для стимуляции клеток, и количество компонентов каждой культуральной среды на Фиг. 1 относится к концентрации, как описано в разделе «Пролиферация Vγ9Vδ2 Т-клеток in vitro» данного примера.

Как показано на Фиг. 1, после того, как указанные выше четыре культуральные среды соответственно использовали для проведения пролиферации культуры человеческих Vγ9Vδ2 Т-клеток, полученные данные показали, что эффективность пролиферации клеток культуральной среды (IL2 и IL2+VC), в которую не добавляли IL15, была относительно низкой, в то время как эффективность пролиферации клеток культуральной среды (IL2+IL15 и IL2+IL15+VC), в которую добавляли IL15, была относительно высокой, и, таким образом, можно видеть, что добавление IL-15 могло очевидно улучшать эффективность пролиферации (возрастание экспрессии белка Ki67) человеческих Vγ9Vδ2 Т-клеток.

Фиг. 2 представляет собой график сравнения индекса апоптоза человеческих Vγ9Vδ2 Т-клеток, полученных посредством использования четырех разных культуральных сред для проведения пролиферации культуры человеческих Vγ9Vδ2 Т-клеток, и IL2, IL2+VC, IL2+IL15, IL2+IL15+VC на Фиг. 2 представляли те же значения, как и на Фиг. 1.

По Фиг. 2 можно увидеть, что добавление VC в культуральную среду может очевидно уменьшать индекс апоптоза и степень апоптоза клеток, и, кроме того, комбинация IL-15 и VC может более значимо усиливать антиапоптотическую способность клеток.

Фиг. 3 представляет собой график сравнения уровней экспрессии критической молекулы-киллера NKG2D человеческих Vγ9Vδ2 Т-клеток, полученных посредством использования четырех разных культуральных сред для проведения пролиферации культуры человеческих Vγ9Vδ2 Т-клеток; и IL2, IL2+VC, IL2+IL15, IL2+IL15+VC на Фиг. 3 представляли те же значения, как и на Фиг. 1 и Фиг. 2.

По Фиг. 3 можно увидеть, что комбинация IL-15 и витамина С может приводить к поддержанию на протяжении длительного времени критической молекулой-киллером NKG2D человеческих Vγ9Vδ2 Т-клеток высокого уровня экспрессии, и данная критическая молекула киллер NKG2D может еще поддерживать высокий уровень экспрессии на 21^ые сутки культивирования и после 21 суток культивирования. Иными словами, формула комбинации IL-15 и VC (а именно, техническое решение настоящего раскрытия) может сохранять на протяжении более длительного времени высокую способность уничтожения у человеческих Vγ9Vδ2 Т-клеток.

Пример 2: противоопухолевый эффект пролиферированных Vγ9Vδ2 Т-клеток Конструирование модели гуманизированной мыши с раком легкого и экспериментальные способы

1. Экспериментальные животные

Самок Rag2^-/-γc^-/- мышей, в возрасте 3-4-х недель, приобретали у Taconic Company, которые относились к классу SPF (от англ. Specified Pathogen Free свободный от патогенной флоры). Для иммунодефицитных мышей использовались независимо вентилируемые IVC (от англ. individually ventilated cage - клетка с индивидуальной вентиляцией). В каждой клетке держали по 5 мышей. В каждом изоляторе имелись независимое воздуховпускное отверстие и воздуховыпускное отверстие НЕРА (от англ. high efficiency particulate air filter -высокоэффективный воздушный фильтр) и имелся 24-часовой контроль температуры и влажности, и поставку пищи и подстилки мышам подвергали вакуумной упаковке и стерилизации под действием γ-излучения, и стерилизованную воду использовали в качестве питьевой воды для животного, и животное, содержащееся в данной среде, также помещали в стерильную среду; и животных транспортировали в биологически безопасном транспортировочном ящике для обеспечения того, чтобы питание и транспортировка поддерживались в одном и том же микробном состоянии, таким образом, чтобы обеспечивать и поддерживать качество животных. Эксперимент с животными был одобрен этическим комитетом в области исследований на животных.

2. Способ конструирования животных моделей с опухолями

РВМС (huPBMC) выделяли посредством центрифугирования в градиенте плотности жидкости - фиколла для конструирования моделей гуманизированной мышини (huPBMC, гуманизированные мыши). Тип HLA конструирования РВМС, связанных с гуманизированной мышью, не соответствовал γδ Т-клеткам для реинфузии, и обычно представлял собой HLA-A2+/-. Было удобно проводить различие между γδ Т-клетками для реинфузии и собственно гуманизированными мышами во время последующего выявления.

Затем, отбирали нормальных Rag2^-/-γc^-/" мышей, в возрасте 4-6-х недель, после облучения сублетальной дозой 300 сГр, 30×10⁶ huPBMC инъецировали внутрибрюшинно. Спустя 4 недели, выживших гуманизированных мышей можно было использовать для конструирования моделей рака легкого на следующей стадии. После расщепления клеток А549, растущих слипшимися, получали клеточную суспензию, и концентрацию клеток А549 регулировали до 1×10⁷ клеток/мл фосфатно-солевым буферным раствором (PBS). Полученную клеточную суспензию инокулировали в гуманизированных мышей посредством подкожной инъекции в паховую область в дозе 100 мкл/мышь.

3. Применение пролиферированных Vγ9Vδ2 Т-клеток для обработки животных моделей

1) После 5-7 суток образования опухоли 5×10⁶ γδ Т-клеток, культивируемых посредством IL-2, IL-2+VC, IL-2+IL-15, IL-2+II-15+VC, инъецировали в гуманизированную мышиную модель с раком легкого через хвостовую вену мыши каждые 3 суток, и в каждой группе было по 5 мышей, и доза составляет 100 мкл/мышь. Группа инъекции PBS представляла собой контрольную группу обработки, γδ Т-клетки, культивируемые посредством IL-2, IL-2+VC, IL-2+IL-15 и IL-2+11-15+VC, получали способом и посредством стадий, описанных в разделе «пролиферация Vγ9Vδ2 Т-клеток in vitro» в воплощении 1, и IL2, IL2+VC, IL2+IL15 и IL2+IL15+VC представляли те же значения, как и на Фиг. 1 в воплощении 1.

2) После 3-4 раз обработки их наблюдали на протяжении более чем 60 суток. Размер опухоли мышей измеряли, используя штангельциркуль два раза в неделю, где размер по короткой оси (А) и размер по длинной оси (В) опухоли использовали для расчета объема опухоли в соответствии с формулой: V=1/2×A²×B.

3) После окончания курса реинфузии обработки периферическую кровь отбирали для выявления процентного содержания и клеточной активности γδ Т-клеток у мышей, и после окончания реинфузии периферическую кровь брали каждые две недели для выявления процентного содержания и клеточной активности γδ Т-клеток: NKG2D, PDI, CD107a, Fas и FasL.

4) Перед умерщвлением мышей выявляли ситуацию с колонизацией γδ Т-клеток у мышей. Сигнал GFP (от англ. green fluorescent protein - зеленый флуоресцентный белок) выявляли в то же время, и наблюдали за числом и процентным содержанием опухолевых клеток А549 в периферической крови.

4. Результат эксперимента

Результат эксперимента по обработки опухоли показан на Фиг. 4А, 4В, 4С, 5 и 6.

Фиг.4А представляет собой схематическое изображение размера опухоли после обработки клетками в отношении гуманизированной мыши с раком легкого с использованием человеческих Vγ9Vδ2 Т-клеток, полученных общепринятым способом пролиферации (IL-2).

Общепринятый способ пролиферации (второй тип технологии пролиферации) всегда заключался в добавлении IL2 в базовую культуральную среду для культивирования и в добавлении ZOL для стимуляции пролиферации на ранней стадии культивирования.

Фиг. 4В представляет собой схематическое изображение размера опухоли после обработки клетками гуманизированной мыши с раком легкого с использованием человеческих Vγ9Vδ2 Т-клеток, полученных способом пролиферации (IL2+IL15+VC) по настоящему раскрытию.

Фиг. 4С представляет собой схематическое изображение размера опухоли гуманизированной мыши с раком легкого в случае отсутствия обработки.

Гуманизированные мыши с раком легкого, используемые в экспериментах, как проиллюстрировано на Фиг. 4А, 4В и 4С, имели тот же тип опухоли и по существу тот же объем опухоли, и время роста опухоли, как проиллюстрировано на Фиг. 4А, 4В и 4С, было таким же.

Посредством сравнения Фиг. 4А, 4В и 4С могло быть видно, что после того, как человеческие Vγ9Vδ2 Т-клетки, полученные способом пролиферации по настоящему раскрытию, использовали для проведения обработки клетками на гуманизированных мышах с раком легкого, по сравнению с человеческими Vγ9Vδ2 Т-клетками, полученными общепринятым способом пролиферации, человеческие Vγ9Vδ2 Т-клетки, пролиферируемые посредством настоящего раскрытия, могли более эффективно подавлять рост клеток рака легкого (размер опухоли значимо уменьшался), и могли значимо улучшать коэффициент выживаемости гуманизированных мышей с раком легкого. На 42^ые сутки гуманизированые мыши с раком легкого, которых обрабатывали человеческими Vγ9Vδ2 Т-клетками, полученными традиционным способом пролиферации, и гуманизированные мыши с раком легкого, не подвергающиеся обработке, все умирали, однако, гуманизированные мыши с раком легкого, которых обрабатывали человеческими Vγ9Vδ2 Т-клетками, полученными способом пролиферации по настоящему раскрытию, все выживали с коэффициентом выживаемости 100%, и опухоль у одной мыши полностью исчезла (показано в блоке Фиг. 4В).

Фиг. 5 представляет собой схематическое изображение колебаний объема опухоли гуманизированных мышей с раком легкого в разных условиях обработки, и на Фиг. 5 соответственно проиллюстрированы изменения объема опухоли гуманизированных мышей с раком легкого, когда гуманизированных мышей с раком легкого обрабатывали человеческими Vγ9Vδ2 Т-клетками, полученными общепринятым способом пролиферации (IL2), и человеческими Vγ9Vδ2 Т-клетками, полученным способом пролиферации (IL2+IL15+VC) по настоящему раскрытию, и не обрабатывали.

Можно увидеть, что со временем объемы опухолей гуманизированных мышей с раком легкого, которых обрабатывали человеческими Vγ9Vδ2 Т-клетками, полученными общепринятым способом пролиферации (IL2), и которых не обрабатывали, непрерывно увеличивались, и объемы опухоли увеличивались очень быстро на более поздней стадии, однако, объем опухоли гуманизированных мышей с раком легкого, обработанных человеческими Vγ9Vδ2 Т-клетками, полученными способом пролиферации (IL2+IL15+VC) по настоящему раскрытию, увеличивался очень медленно, иными словами, по сравнению с человеческими Vγ9Vδ2 Т-клетками, полученными общепринятым способом пролиферации (IL2), человеческие Vγ9Vδ2 Т-клетки, полученные способом пролиферации (IL2+IL15+VC) по настоящему раскрытию, оказывали более сильное подавляющее действие на рост опухоли in vivo, и предоставляли меньшие объемы опухоли.

Фиг. 6 представляет собой схематическое изображение колебаний коэффициентов выживаемости гуманизированных мышей с раком легкого в разных условиях обработки, и на Фиг. 6 соответственно проиллюстрированы колебания коэффициентов выживаемости гуманизированных мышей с раком легкого, которых обрабатывали человеческими Vγ9Vδ2 Т-клетками, полученными общепринятым способом пролиферации (IL2), и человеческими Vγ9Vδ2 Т-клетками, полученными способом пролиферации (IL2+IL15+VC) по настоящему раскрытию, и которых не обрабатывали.

Можно увидеть, что со временем коэффициенты выживаемости гуманизированных мышей с раком легкого, которых обрабатывали человеческими Vγ9Vδ2 Т-клетками, полученными общепринятым способом пролиферации (IL2), и которых не обрабатывали, уменьшались очень быстро, однако, коэффициент выживаемости гуманизированных мышей с раком легкого, обработанных человеческими Vγ9Vδ2 Т-клетками, полученными способом пролиферации (IL2+IL15+VC) по настоящему раскрытию, составлял всегда 100%, иными словами, человеческие Vγ9Vδ2 Т-клетки, полученные способом пролиферации (IL2+IL15+VC) по настоящему раскрытию, могли значимо улучшать коэффициент выживаемости гуманизированной мыши с раком легкого.

Пример 3

Согласно примеру 1 была предложена вторая культуральная среда, которая содержала культуральную среду RPMI-1640 и интерлейкин-2, интерлейкин-15 и витамин С, добавляемые в культуральную среду RPMI-1640.

В вышеуказанном, во второй культуральной среде концентрация интерлейкина-2 составляла 300 нг/мл, концентрация интерлейкина-15 составляла 500 нг/мл и концентрация витамина С составляла 100 мМ.

Пример 4

Согласно примеру 2 была предложена вторая культуральная среда, которая содержала культуральную среду RPMI-1640 и интерлейкин-2, интерлейкин-15 и витамин С, добавляемые в культуральную среду RPMI-1640.

В вышеуказанном, во второй культуральной среде концентрация интерлейкина-2 составляла 500 нг/мл, концентрация интерлейкина-15 составляла 700 нг/мл и концентрация витамина С составляла 300 мМ.

Пример 5

Согласно примеру 3 была предложена первая культуральная среда, которая содержала вторую культуральную среду, как упомянуто в примере 1, и золедроновую кислоту.

В вышеуказанном, в первой культуральной среде концентрация золедроновой кислоты составляла 300 мкМ.

Пример 6

Согласно примеру 4 была предложена первая культуральная среда, которая содержала вторую культуральную среду, как упомянуто в примере 2, и золедроновую кислоту.

В вышеуказанном, в первой культуральной среде концентрация золедроновой кислоты составляла 500 мкМ.

Сложно описать все интервалы числовых значений технологических параметров, задействованных в настоящем раскрытии в упомянутых выше воплощениях, но специалисты в данной области могут в полной мере вообразить, что любое значение, попадающее в упомянутый выше интервал значений, может осуществлять настоящее раскрытие, и, безусловно, настоящее раскрытие содержит любую комбинацию конкретных значений нескольких интервалов числовых значений. При этом, для экономии места, воплощения, предоставляющие конкретные значения в пределах одного или более интервалов числовых значений, опущены, в то же время это не следует рассматривать как недостаточное раскрытие технических решений настоящего раскрытия.

Заявитель объявляет, что упомянутые выше воплощения в настоящем раскрытии используются для описания конкретного технологического оборудования и технологического потока по настоящему раскрытию, но настоящее раскрытие не ограничивается указанным выше технологическим оборудованием и технологическим потоком, то есть, это не означает, что настоящее раскрытие может только осуществляться в зависимости от указанного выше конкретного технологического оборудования и технологического потока. Специалист в данной области должен понимать, что любое улучшение настоящего раскрытия и эквивалентные замены каждого материала продукта по настоящему раскрытию и добавление, выбор конкретных способов вспомогательных компонентов и т.п.все попадают в объем настоящего раскрытия.

Промышленная применимость

По сравнению с общепринятым способом пролиферации (второй тип технологии пролиферации), человеческие Vγ9Vδ2 Т-клетки, полученные способом пролиферации по настоящему раскрытию, имеют более высокую эффективность пролиферации и более высокую чистоту клеток, и способ пролиферации по настоящему раскрытию, очевидно, укорачивает период культивирования с пролиферацией человеческих Vγ9Vδ2 Т-клеток. По сравнению с человеческим Vγ9Vδ2 Т-клетками, полученными общепринятым способом пролиферации (второй тип технологии пролиферации), человеческие Vγ9Vδ2 Т-клетки, полученные способом пролиферации по настоящему раскрытию, обладают более сильными способностями уничтожения и подавления опухоли. Человеческие Vγ9Vδ2 Т-клетки, полученные способом пролиферации по настоящему раскрытию, имеют более сильную антиапоптотическую способность и более длительный период выживаемости.

1. Способ пролиферации T-клеток, включающий:

стадию A, на которой культивируют композицию, содержащую T-клетки, используя первую культуральную среду, способную стимулировать T-клетки, таким образом, чтобы стимулировать T-клетки, где первая культуральная среда содержит полную культуральную среду RPMI-1640 с 10% фетальной телячьей сывороткой, интерлейкин-2 и соединение фосфоновой кислоты, где соединение фосфоновой кислоты представляет собой золедроновую кислоту;

и стадию B, на которой используют вторую культуральную среду для культивирования стимулированных T-клеток, при этом указанная вторая культуральная среда содержит полную культуральную среду RPMI-1640 с 10% фетальной телячьей сывороткой, интерлейкин-2, интерлейкин-15 и витамин C, где концентрация интерлейкина-2 составляет 40-500 нг/мл, концентрация интерлейкина-15 составляет 3,48-700 нг/мл, концентрация витамина C составляет 70 мкМ - 300 мМ, концентрация соединений фосфоновой кислоты составляет 50-500 мкМ, а Т-клетки представляют собой Vγ9Vδ2 Т-клетки.

2. Способ по п. 1, где первая культуральная среда также содержит интерлейкин-15 и витамин C.

3. Способ по любому из пп. 1, 2, в котором композиция, содержащая T-клетки, содержит мононуклеарные клетки периферической крови, выделенные из периферической крови человеческого организма.

4. Способ по любому из пп. 1-3, в котором на стадии A продолжительность культивации составляет от 60 до 100 часов.

5. Культуральная среда для пролиферации T-клеток, содержащая базовую культуральную среду, интерлейкин-2, интерлейкин-15 и витамин C, где базовая культуральная среда содержит полную культуральную среду RPMI-1640 с 10% фетальной телячьей сывороткой, концентрация интерлейкина-2 составляет 40-500 нг/мл, концентрация интерлейкина-15 составляет 3,48-700 нг/мл, концентрация витамина C составляет 70 мкМ - 300 мМ, а Т-клетки представляют собой Vγ9Vδ2 Т-клетки.