Способ получения гомологического иммуноглобулина против covid-19
Изобретение относится к области биотехнологии. Сущность изобретения состоит комбинировании метода спиртового осаждения этанолом при низких температурах с трехэтапной хроматографической очисткой с использованием сорбента ProteinA на первом этапе, сорбента, содержащего положительно заряженные S-лиганды (сульфоприл), с базовой матрицей из композита полисахаридов (агарозы) на втором этапе и сорбента из агарозы с гидрофобными лигандами на третьем этапе, что позволяет получить гомологичный иммунобиологический препарат с чистотой мономерной фракции не мене 98%. Технический результат изобретения выражается в том, что соблюдение указанных технологических стадий обеспечивает выделение высокоочищенного гомологичного иммуноглобулина против COVID-19 из плазмы крови реконвалесцентов с содержанием мономерной фракции IgG в конечном продукте не менее 98% и титром антител к вирусу SARS-CoV-2 в реакции нейтрализации не менее 1:512. Изобретение может быть использовано для пассивной антительной терапии против вируса SARS-CoV-2 на ранних стадиях заболевания. 1 табл., 1 пр.
Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к разработке технологий производства защитных иммунобиологических препаратов, в частности к разработке способа получения жидкой формы очищенного гомологичного иммуноглобулина против COVID-19.
Изобретение может быть использовано для пассивной антительной терапии против вируса SARS-CoV-2 на ранних стадиях заболевания.
Целью настоящего изобретения является разработка способа получения гомологичного иммуноглобулина против COVID-19 из плазмы крови реконвалесцентов с содержанием мономерной фракции IgG в конечном продукте не менее 98%.
Сущность настоящего изобретения состоит комбинировании метода спиртового осаждения этанолом при низких температурах с трехэтапной хроматографической очисткой с использованием сорбента ProteinA на первом этапе, сорбента, содержащего положительно заряженные S-лиганды (сульфоприл), с базовой матрицей из композита полисахаридов (агарозы) на втором этапе и сорбента из агарозы с гидрофобными лигандамина третьем этапе, что позволяет получить гомологичный иммунобиологический препарат с чистотой мономерной фракции не мене 98%.
Технический результат изобретения выражается в том, что соблюдение указанных технологических стадий обеспечивает выделение высокоочищенного гомологичного иммуноглобулина против COVID-19 из плазмы крови реконвалесцентов, с содержанием мономерной фракции IgG в конечном продукте не менее 98% и титром антител к вирусу SARS-CoV-2 в реакции нейтрализации не менее 1:512.
Указанный технический результат достигается за счет того, что выделение гомологичного иммуноглобулина против вируса SARS-CoV-2 из сыворотки крови реконвалесцентов проводят методом спиртового осаждения при низких температурах. Очистку иммуноглобулина проводят в три этапа. Для первого этапа очистки применяют аффинную хроматографию на колонке с сорбентом ProteinA, предварительно уравновешенную раствором 0,02 М натрия фосфатом рН=7,0 со скоростью потока 120 см/ч, в изократическом режиме элюирования раствором 0,1 М лимонной кислоты с рН=3,0. Перед загрузкой на второй этап хроматографической очистки раствор иммуноглобулина концентрируют и диафильтрируют на системе с тангенциальным потоком. Концентрирование проводят в 50 раз на мембране PESU, предел эксклюзии фильтрующего элемента 50 кДа. Диафильтрируют 10-кратным объемом раствора ацетата натрия, рН=4,5. Для второго этапа очистки применяют катионообменную хроматографию на колонке с сорбентом, содержащим с S-лиганд (сульфоприл), базовая матрица которого, представляет собой композит из поперечно-сшитых полисахаридов (агарозы), предварительно уравновешенной 0,05 М натрием ацетатом (NaO2C2H3) с рН=4,5. Очистку иммуноглобулина проводят в режиме «проскока». Связавшийся с S-лигандами не целевой белок элюируют 0,05 М натрием ацетатом с 1,5 М хлоридом натрия, рН=6,0 при значении линейной скорости потока 120 см/ч. Полученный от предыдущей стадии «проскок» концентрируют и диафильтрируют на системе с тангенциальным потоком. Концентрирование проводят в 50 раз на мембране PESU, предел эксклюзии фильтрующего элемента 50 кДа. Диафильтрируют 10-ти кратным объемом раствора 0,15 молярного натрия хлорида. Третий этап - мультимодальная хроматографическая очистка на сорбенте из бисерной агарозы с гидрофобными лигандами в режиме «проскока» при линейной скорости потока 20 см/ч, фракцию проскока собирают, как целевой продукт, а связавшийся материал элюируют 0,5 М гидроксидом натрия (NaOH). Стадию концентрирования проводят на системе тангенциальной фильтрации с пределом эксклюзии фильтрующего полиэтилсульфонового элемента 50 кДа, до содержания IgG в растворе 10%.
Предлагаемый способ является новым, поскольку в доступной научно-технической информации нет сведений об аналогичном способе очистки гомологичного иммуноглобулина против COVID-19.
Предлагаемое техническое решение имеет изобретательский уровень, поскольку из уровня техники явным образом не следует, что использование совокупности используемых методических приемов обеспечивает достижение заявленного технического результата.
Предлагаемое техническое решение промышленно применимо, поскольку для его реализации может быть использовано типовое оборудование, а также широко распространенные в вирусологических и молекулярно-генетических исследованиях реактивы и материалы.
Получение гомологичных иммуноглобулинов включает в себя несколько этапов: получение иммунной сыворотки, фракционирование, очистку, концентрирование и получение готовой формы препарата.
Наиболее близким к заявленному изобретению является способ получения иммуноглобулина для внутривенного введения [RU 2068695, Сапожникова B.C., Шарыгин С.Л.]. Способ предусматривает получение сырого осадка фракции III Кона с его последующей лиофилизацией и выстаиванием. Данный способ не включает хроматографическую очистку.
Известен способ получения иммуноглобулина для внутривенного введения, включающий растворение спиртовой фракции III Кона, ультрафильтрацию, диафильтрацию и последующую аффинную хроматографическую очистку. В данном способе не применяется катионообменная и мультимодальные очистки. [RU 2492176, Гальговская С.А., Анастасьев В.В., Короткова Т.В.] Также известны способы включающий фракционирование этиловым спиртом донорской плазмы и получение осадка III, который пропускают через сульфопропилкатионитный сорбент [RU 2372939, Курищук К.В., Скринник М.М., Диденко Н.Ю., Самойленко В.А., Куркина О.В.]. В данном способе только один этап хроматографии.
Существует способ получения иммуноглобулина из осадка I Кона. В данном способе осадок сначала пропускают через гидрофобный сорбент и ДЕАЕ-сорбент, затем предварительно очищенную фракцию пропускают через последовательно соединенные между собой три колонны: первую содержащую анионообменный сорбент, вторую с гидрофобным сорбентом и третью, заполненную сульфокатионитом [RU 2467783, Карасев В.С., Бочкова О.П., Староверов С.М., Красильников И.В., Николаева A.M., Петровских В.П., Перевозчиков А.Б.]
В заявленном способе иммунную сыворотку получали путем добавления к плазме крови 30% раствора хлористого кальция (3,5 мл раствора на 1 л плазмы) и последующего энергичного встряхивания в течение 10 минут. Дефибринированную плазму оставляли на срок от 18 до 24 часов при комнатной температуре. По истечении указанного срока фибриновые нити и комочки собирались в верхнем слое, а сыворотка осаждалась в нижнем слое жидкости. Полученную сыворотку фильтровали через кассетный фильтр (стекловолокно + полиэтилсульфон) с размером пор 1,2 мкм.
Выделение иммуноглобулинов из сыворотки крови проводят методом спиртового осаждения при низких температурах. Схема выделения иммуноглобулинов построена на последовательных изменениях следующих факторов: диэлектрической постоянной раствора, ионной силы, величины рН, концентрации этилового спирта, концентрации белка. После данного этапа получают около 300-350 г осадка, содержащего иммуноглобулина G.
Рабочий раствор IgG после стадии осаждения готовят путем добавления 0,02 М раствора фосфата натрия рН=7,0 из расчета 0,2 л на грамм осадка. Далее раствор иммуноглобулина подвергают глубинной фильтрации при помощи целлюлозно-диатомитового фильтра с рейтингом отсечения 0,8-1,2 мкм и осветляющей фильтрации на стекловолоконном - полиэфирсульфоновом фильтре с размером пор 0,45 мкм.
Все буферные растворы для последующей хроматографии готовят непосредственно перед применением, перед этим их следует профильтровать через PES мембрану с рейтингом 0,2 мкм.
Первый этап хроматографической очистки - аффинная хроматография на сорбенте ProteinA. В качестве буфера нанесения используют 0,02 М натрия фосфат рН=7,0. Буфер элюирования - 0,1 М лимонная кислота рН=3,0. Колонку уравновешивают 5 объемами буфера нанесения до тех пор, пока сигналы проводимости не станут стабильными. Образец на колонку наносится со скоростью 120 см/ч. Из расчета на 1 мл сорбента 10 мг белка. Для поддержания физиологического рН в приемную емкость элюата добавляют 1 М Трис рН=9,0 из расчета 100 мкл Трис на 1 мл элюата. Аффинная хроматография обладает высокой избирательностью и позволяет получить препарат свободный от остатков α - и β - глобулинов и альбуминов.
Перед загрузкой на второй этап хроматографической очистки раствор иммуноглобулина концентрируют и диафильтрируют на системе с тангенциальным потоком. Концентрирование проводят в 50 раз на мембране PESU, предел эксклюзии фильтрующего элемента 50 кДа. Диафильтрируют 10-ти кратным объемом раствора ацетата натрия, рН=4,5.
Второй этап - катионообменная хроматографическая очистка. Его проводят с использованием сорбента, содержащего с S-лиганды (сульфоприл), базовая матрица которого, представляет собой композит из поперечно-сшитых полисахаридов (агарозы). Для придания ионной силы лигандам сорбента пропускают 4 объема буфера элюирования - 0,05 М натрия ацетата с 1,5 М хлоридом натрия, рН=6,0. Затем колонку с сорбентом уравновешивают буфером нанесения - 0,05 М натрия ацетатом рН=4,5 до изолинии сигналов проводимости. Очистку иммуноглобулина проводят в режиме «проскока». Связавшийся с S-лигандами не целевой белок элюируют 0,05 М натрием ацетатом с 1,5 М хлоридом натрия, рН=6,0 при значении линейной скорости потока 120 см/ч. Ионообменная хроматография позволяет эффективно удалить агрегаты и остаточное содержание высокомолекулярных белков.
Полученный от предыдущей стадии «проскок» концентрируют и диафильтрируют на системе с тангенциальным потоком. Концентрирование проводят в 50 раз на мембране PESU, предел эксклюзии фильтрующего элемента 50 кДа. Диафильтрируют 10-ти кратным объемом раствора 0,15 М натрия хлорида.
Мультимодальную хроматографическую очистку проводят на сорбенте из бисерной агарозы с гидрофобными лигандами в режиме «проскока», при линейной скорости потока 20 см/ч. Фракцию проскока собирают как целевой белок, а связавшийся материал элюируют 0,5 М гидроксидом натрия. При этом примесные низкомолекулярные компоненты задерживаются на сорбенте.
Стадию концентрирования проводят на системе тангенциальной фильтрации с пределом эксклюзии фильтрующего полиэтилсульфонового элемента 50 кДа, до содержания IgG в растворе 9-11%.
Пример выполнения
10,5 литров гипериммунной свежезамороженной плазмы от реципиентов с титрами ИФА к вирусу SARS-CoV-2 от 1:1600 до 1:25600 размораживают при комнатной температуре. Добавляют 36,7 мл 30% хлорида кальция. Интенсивно перемешивают в течение 10 минут. Плазму оставляют на сутки при комнатной температуре. Через 24 часа образовавшийся фибрин, отфильтровывают через кассетный фильтр (стекловолокно + полиэтилсульфон) с размером пор 1,2 мкм. Полученную сыворотку в объеме около 10 литров загружают в реактор для фракционирования по Кону. В результате трехстадийного процесса получают от 300 до 350 г осадка, содержащего иммуноглобулины.
Весь осадок фракции III, полученный при фракционировании, растворяют в 0,02 М фосфате натрия рН=7,0 до 10% концентрации по общему белку. Раствор подвергают глубинной фильтрации при помощи целлюлозно-диатомитового фильтра с ионной смолой, с рейтингом отсечения 0,8-1,2 мкм.
Далее раствор осветляют фильтрацией через стекловолоконный - полиэфирсульфоновый фильтр с размером пор 0,45 мкм.
Аффинную хроматографическую очистку проводят на сорбенте ProteinA в изократическом режиме элюирования. Раствор иммуноглобулина, предварительно разведенный из расчета 25 мг белка на 1 мл сорбента, наносят на хроматографическую колонку объемом 5 л, заполненную сорбентом на основе сефарозы с нативным белком А (штамм золотистого стафилококка), элюируют 0,1 М лимонной кислотой. В емкости коллектора фракций хроматографа вносят 1 М Трис рН=9,0 из расчета 100 мл на 1 л получаемого продукта. После нанесения 50 л раствора иммуноглобулина получают около 5 л элюата, который концентрируют на системе с тангенциальным потоком в 50 раз на мембране PESU, предел эксклюзии фильтрующего элемента 50 кДа, до объема 100 мл. Диафильтрируют 1 л раствора ацетата натрия, рН=4,0. Доводят объем концентрата до исходного (5 л) 0,05 М ацетатом натрия.
Далее раствор иммуноглобулина наносят на колонку объемом 2 л с катионообменным сорбентом на основе агарозы и содержащим с S-лиганды (сульфоприл). Линейная скорость потока 120 см/ч. Очистку проводят в режиме «проскока». Для промывки колонки используют 0,05 М ацетат натрия с 1,5 М хлоридом натрия, рН=6,0. На данном этапе получают 5 л раствора иммуноглобулина.
Полученный на предыдущей стадии раствор иммуноглобулина в объеме 5 л концентрируют на системе с тангенциальным потоком в 50 раз на мембране PESU, предел эксклюзии фильтрующего элемента 50 кДа, до объема 100 мл. Диафильтрируют 1 л раствора 0,15 М натрия хлорида. Доводят объем концентрата до исходного (5 л) 0,15 М хлоридом натрия.
Раствор наносят на мультимодальную хроматографическую колонку с сорбентом из бисерной агарозы с гидрофобными лигандами. Очистку проводят в режиме «проскока», при линейной скорости потока 20 см/ч. Фракцию проскока собирают как целевой белок, а связавшийся материал элюируют 0,5 М гидроксидом натрия.
Стадию концентрирования проводят на системе тангенциальной фильтрации с пределом эксклюзии фильтрующего полиэтилсульфонового элемента 50 кДа, до содержания IgG в растворе от 9 до 11%.
В результате осуществления способа получают 850 мл раствора иммуноглобулина против коронавирусной инфекции COVID-19 с концентрацией общего белка порядка 100 г/л. Содержание мономерной фракции иммуноглобулина G не менее 98% (методом ВЭЖХ). Титр антител к вирусу SARS-CoV-2 в реакции нейтрализации не менее 1:512.
Способ получения гомологичного иммуноглобулина против COVID-19, включающий отбор плазмы крови реконвалесцентов, содержащей специфические антитела, с последующим выделением иммуноглобулина G методом спиртового осаждения при низких температурах, очистку и концентрирование методом хроматографии, отличающийся тем, что очистка иммуноглобулина происходит в три этапа, для первого этапа очистки применяют аффинную хроматографию на колонке с сорбентом ProteinA, предварительно уравновешенную раствором 0,02 М натрия фосфата рН=7,0 со скоростью потока 120 см⋅ч-1, в изократическом режиме элюирования раствором 0,1 М лимонной кислоты с рН=3,0, для второго этапа - катионообменную хроматографию на колонке с сорбентом, содержащим S-лиганды, базовая матрица которого представляет собой композит из поперечно-сшитых полисахаридов, предварительно уравновешенный 0,05 М натрием ацетатом с 1,5 М натрий хлором, рН=6,0, при значении линейной скорости потока 120 см⋅ч-1, на третьем этапе проводят мультимодальную хроматографическую очистку на сорбенте из бисерной агарозы с гидрофобными лигандами в режиме проскока при линейной скорости потока 20 см⋅ч-1.
