Схема лечения для лечения болезни фабри с использованием стабилизированной α-галактозидазы

Изобретение относится к области медицины, а именно к терапии, и предназначено для лечения болезни Фабри. Для лечения болезни Фабри применяют единичную лекарственную форму, содержущую растительную рекомбинантную α-галактозидазу человека, поперечно сшитую с помощью бис-NHS-PEG45. Мономеры указанной рекомбинантной α-галактозидазы человека ковалентно связаны друг с другом посредством поли(алкилен) гликолевого связующего фрагмента, содержащего по меньшей мере 20 алкиленовых групп. Указанная единичная лекарственная форма составлена в виде жидкости для внутривенного введения, и введение осуществляют в дозировке 2 мг/кг с интервалами, составляющими 4 недели. Использование изобретения является безопасным и обеспечивает значительное улучшение параметров заболевания пациента с точки зрения снижения накопления глоботриаозилцерамида, параметров боли и желудочно-кишечного тракта, стабилизации функции почек и сердца в клинических условиях. 16 з.п. ф-лы, 4 ил., 3 табл., 7 пр.

 

Область и уровень техники

Настоящее изобретение согласно некоторым его вариантам осуществления относится к гомодимерным белковым структурам α-галактозидазы и, в частности, но не исключительно, к эффективным схемам лечения для лечения болезни Фабри с помощью ферментозаместительной терапии с помощью стабилизированных ковалентно связанных гомодимерных белковых структур α-галактозидазы.

Лизосомальный фермент α-галактозидаза-А (α-GAL или α-Gal А; ЕС 3.2.1.22) катализирует удаление галактозы из олигосахаридов, гликопротеинов и гликолипидов во время катаболизма макромолекул. Дефицит лизосомальных ферментов приводит к накоплению их субстратов в различных тканях, состояниям, известным как лизосомные болезни накопления. У людей отсутствие функциональной α-галактозидазы-А приводит к накоплению в тканях гликолипидов, содержащих концевые остатки α-галактозы (прежде всего глоботриаозилцерамид, который также называют "церамидтригексозид", "СТН" или "Gb₃"), что приводит к болезни Фабри. Болезнь Фабри представляет собой сцепленное с X-хромосомой рецессивное заболевание, впервые описанное в 1898 году, для которого характерны хроническая боль, помутнение глаз, поражение печени и почек, поражения кожи, ухудшение состояния сосудов и/или сердечная недостаточность. Рекомбинантная α-галактозидаза-А человека обладает способностью обеспечивать и заменять пониженную ферментативную активность у пациентов, и ферментозаместительная терапия (ERT) с использованием α-GAL была одобрена в Соединенных Штатах и европейских странах в 2003 году для лечения болезни Фабри. α-GAL стал вторым рекомбинантным белком, одобренным для лечения лизосомной болезни накопления после β-глюкозидазы для лечения болезни Гоше.

Эндогенные и рекомбинантные ферменты α-GAL катализируют гидролиз концевых галактозилированных гликолипидов в лизосомах клеток таких органов, как кожа, почки, сердце и т.д. Эта среда естественного действия характеризуется кислотным рН, достигающим всего 4,5. Следовательно, лизосомальные ферменты, включая в себя α-GAL, предназначены для проявления своей максимальной активности при таких низких уровнях рН.

Современные способы лечения ERT болезни Фабри основаны на рекомбинантной α-GAL, происходящей из клеток млекопитающих, которая, как считается, характеризуется ограниченной клинической эффективностью и в настоящее время не предлагает удовлетворительного клинического решения для пациентов с болезнью Фабри.

Рентгеноструктурный анализ показывает, что α-GAL человека представляет собой гомодимерный гликопротеин, причем каждый мономер состоит из двух доменов: домена (β/α)₈, содержащего активный сайт, и С-концевого домена, содержащего восемь антипараллельных β-цепей на двух листах в β сэндвиче [Garman & Garboczi, J Mol Biol 2004, 337:319-335].

Как структурные (рентгеноструктурная кристаллография), так и биохимические (кинетические) данные свидетельствуют об кооперативности активных сайтов между мономерными звеньями гомодимерной структуры, подчеркивая важность димеризации для ферментативной активности и стабильности терапевтических композиций α-GAL.

В международной патентной публикации WO 2009/024977 настоящего патентообладателя, которая включена в настоящий документ посредством ссылки, как если бы она была полностью изложена в настоящем документе, описаны конъюгаты сахарида и биомолекулы, ковалентно связанные между собой посредством негидрофобного линкера, а также медицинские применения с использованием таких конъюгатов.

В международной патентной публикации WO 2011/061736 настоящего патентообладателя, которая включена в настоящий документ посредством ссылки, как если бы она была полностью изложена в настоящем документе, описаны методики, в которых использована α-галактозидаза, которая проявляет лизосомальную активность при уровнях рН выше, чем уровень рН лизосом.

В международной патентной публикации WO 2011/107990 настоящего патентообладателя, которая включена в настоящий документ посредством ссылки, как если бы она была полностью изложена в настоящем документе, описана ковалентно связанная мультимерная белковая структура, содержащая по меньшей мере два мономера α-галактозидазы, обладающая устойчивой каталитической активностью α-галактозидазы в физиологических условиях и улучшенной фармакодинамикой, и предложения для ее терапевтического использования.

В международной патентной публикации WO 2012/098537 настоящего патентообладателя, которая включена в настоящий документ посредством ссылки, как если бы она была полностью изложена в настоящем документе, описаны нуклеиновокислотные конструкты для рекомбинантной экспрессии каталитически активной α-галактозидазы в растениях и предложения по их терапевтическому применению.

Дополнительный предшествующий уровень техники включает в себя Bendele с соавт. [Toxicological Sciences 1998, 42:152-157], патенты США №№5256804, 5580757 и 5766897, международную патентную публикацию PCT/NL2007/050684 (опубликованную как WO 2008/075957), патентную публикацию США US 20160184409, Treco с соавт., и Seely & Richey [J Chromatography А 2001, 908:235-241].

Сущность изобретения

Согласно аспекту некоторых вариантов осуществления настоящего изобретения предусмотрен способ лечения болезни Фабри у нуждающегося в этом субъекта-человека, причем способ предусматривает введение субъекту терапевтически эффективного количества рекомбинантной α-галактозидазы человека, причем терапевтически эффективное количество рекомбинантной α-галактозидазы человека составляет 0,2-2,0 мг/кг, что позволяет лечить болезнь Фабри у субъекта, причем введение осуществляют с интервалами, составляющими больше чем две недели, и причем мономеры рекомбинантной α-галактозидазы человека ковалентно связаны друг с другом посредством связующего фрагмента, составляющего 20-600 атомов в длину.

Согласно аспекту некоторых вариантов осуществления настоящего изобретения предусмотрен способ лечения болезни Фабри у нуждающегося в этом субъекта-человека, причем способ предусматривает введение субъекту терапевтически эффективного количества рекомбинантной α-галактозидазы человека, причем терапевтически эффективное количество рекомбинантной α-галактозидазы человека составляет 0,2-2,0 мг/кг, что позволяет лечить болезнь Фабри у субъекта, причем введение осуществляют с интервалами, составляющими больше чем две недели - каждые 4 недели, и причем мономеры рекомбинантной α-галактозидазы человека ковалентно связаны друг с другом посредством связующего фрагмента, составляющего 20-600 атомов в длину.

Согласно аспекту некоторых вариантов осуществления настоящего изобретения рекомбинантная α-галактозидаза человека представляет собой растительную рекомбинантную α-галактозидазу человека.

Согласно аспекту некоторых вариантов осуществления настоящего изобретения растительная рекомбинантная α-галактозидаза человека поперечно сшита с помощью бис-NHS-PEG₄₅.

Согласно аспекту некоторых вариантов осуществления настоящего изобретения интервалы составляют три недели или четыре недели.

Согласно аспекту некоторых вариантов осуществления настоящего изобретения интервалы составляют 17 дней - 8 недель.

Согласно аспекту некоторых вариантов осуществления настоящего изобретения интервалы составляют 17 дней - 6 недель.

Согласно аспекту некоторых вариантов осуществления настоящего изобретения интервалы составляют 17 дней - 5 недель.

Согласно аспекту некоторых вариантов осуществления настоящего изобретения интервалы составляют 3 недели - 6 недель.

Согласно аспекту некоторых вариантов осуществления настоящего изобретения интервалы составляют 3 недели - 5 недель.

Согласно аспекту некоторых вариантов осуществления настоящего изобретения интервалы составляют 3 недели - 4 недели.

Согласно аспекту некоторых вариантов осуществления настоящего изобретения интервалы составляют 4 недели - 6 недель.

Согласно аспекту некоторых вариантов осуществления настоящего изобретения интервалы составляют 4 недели - 5 недель.

Согласно аспекту некоторых вариантов осуществления настоящего изобретения введение представляет собой внутривенное введение.

Согласно аспекту некоторых вариантов осуществления настоящего изобретения введение осуществляют в дозе, составляющей 1,0 мг/кг.

Согласно аспекту некоторых вариантов осуществления настоящего изобретения введение осуществляют в дозе, составляющей 2,0 мг/кг.

Согласно аспекту некоторых вариантов осуществления настоящего изобретения введение осуществляют один раз в три недели.

Согласно аспекту некоторых вариантов осуществления настоящего изобретения введение осуществляют один раз в четыре недели.

Согласно аспекту некоторых вариантов осуществления настоящего изобретения введение осуществляют один раз в пять недель.

Согласно аспекту некоторых вариантов осуществления настоящего изобретения введение осуществляют один раз в шесть недель.

Согласно аспекту некоторых вариантов осуществления настоящего изобретения терапевтически эффективное количество рекомбинантной α-галактозидазы человека снижает Gb3 и/или лизо-Gb3 у субъекта.

Согласно аспекту некоторых вариантов осуществления настоящего изобретения терапевтически эффективное количество рекомбинантной α-галактозидазы человека поддерживает стабильность или ослабляет ухудшение параметров сердца у субъекта.

Согласно аспекту некоторых вариантов осуществления настоящего изобретения параметры сердца представляют собой LVM (масса миокрада левого желудочка) или LVMI (индекс массы миокарда левого желудочка), измеренные с помощью МРТ, по сравнению со значениями до лечения.

Согласно аспекту некоторых вариантов осуществления настоящего изобретения терапевтически эффективное количество рекомбинантной α-галактозидазы человека поддерживает стабильность снижения концентраций Gb3 и/или лизо-Gb3 в плазме у субъекта.

Согласно аспекту некоторых вариантов осуществления настоящего изобретения терапевтически эффективное количество рекомбинантной α-галактозидазы человека поддерживает стабильность снижения концентраций Gb3 в моче у субъекта.

Согласно аспекту некоторых вариантов осуществления настоящего изобретения терапевтически эффективное количество рекомбинантной α-галактозидазы человека ослабляет связанное с болезнью Фабри ухудшение функции почек у субъекта.

Согласно аспекту некоторых вариантов осуществления настоящего изобретения терапевтически эффективное количество рекомбинантной α-галактозидазы человека поддерживает стабильность функции почек у субъекта.

Согласно аспекту некоторых вариантов осуществления настоящего изобретения терапевтически эффективное количество рекомбинантной α-галактозидазы человека поддерживает стабильность или ослабляет ухудшение по меньшей мере одного параметра желудочно-кишечного тракта у субъекта.

Согласно аспекту некоторых вариантов осуществления настоящего изобретения параметр желудочно-кишечный тракта представляет собой боль в животе и/или частоту боли в животе, измеренные через 6 месяцев лечения по сравнению со значениями до лечения.

Согласно аспекту некоторых вариантов осуществления настоящего изобретения терапевтически эффективное количество рекомбинантной α-галактозидазы человека поддерживает стабильность или ослабляет ухудшение индекса оценки степени тяжести Майнца (MSSI) у субъекта.

Согласно аспекту некоторых вариантов осуществления настоящего изобретения снижение в MSSI измеряют через 6 месяцев лечения по сравнению со значениями до лечения.

Согласно аспекту некоторых вариантов осуществления настоящего изобретения рекомбинантная α-галактозидаза человека характеризуется периодом полужизни в кровотоке (Т_1/2), составляющим по меньшей мере 5 часов после введения.

Согласно аспекту некоторых вариантов осуществления настоящего изобретения рекомбинантная α-галактозидаза человека характеризуется периодом полужизни в кровотоке (Т_1/2), составляющим по меньшей мере 20 часов после введения.

Согласно аспекту некоторых вариантов осуществления настоящего изобретения рекомбинантная α-галактозидаза человека характеризуется периодом полужизни в кровотоке (Т_1/2), составляющим по меньшей мере 50 часов после введения.

Согласно аспекту некоторых вариантов осуществления настоящего изобретения рекомбинантная α-галактозидаза человека характеризуется C_max, составляющей по меньшей мере 5000 нг/мл после введения 1 мг/кг рекомбинантной α-галактозидазы человека.

Согласно аспекту некоторых вариантов осуществления настоящего изобретения рекомбинантная α-галактозидаза человека характеризуется C_max, составляющей по меньшей мере 8000 нг/мл после введения 2 мг/кг.

Согласно аспекту некоторых вариантов осуществления настоящего изобретения рекомбинантная α-галактозидаза человека характеризуется биодоступностью (AUC_0-∞), составляющей по меньшей мере 100000 нг⋅ч/мл после введения 1,0 мг/кг рекомбинантной α-галактозидазы человека.

Согласно аспекту некоторых вариантов осуществления настоящего изобретения рекомбинантная α-галактозидаза человека характеризуется биодоступностью (AUC_0-∞), составляющей по меньшей мере 400000 нг⋅ч/мл после введения 2,0 мг/кг рекомбинантной α-галактозидазы человека.

Согласно аспекту некоторых вариантов осуществления настоящего изобретения предусмотрена единичная лекарственная форма, содержащая 2,0-500 мг рекомбинантной α-галактозидазы человека, составленная для введения человеку-субъекту.

Согласно аспекту некоторых вариантов осуществления настоящего изобретения единичная лекарственная форма содержит 10 мг рекомбинантной α-галактозидазы человека.

Согласно аспекту некоторых вариантов осуществления настоящего изобретения единичная лекарственная форма содержит 50 мг растительной рекомбинантной α-галактозидазы человека.

Согласно аспекту некоторых вариантов осуществления настоящего изобретения единичная лекарственная форма содержит 100-180 мг рекомбинантной α-галактозидазы человека.

Согласно аспекту некоторых вариантов осуществления настоящего изобретения единичная лекарственная форма содержит 150 мг рекомбинантной α-галактозидазы человека.

Согласно аспекту некоторых вариантов осуществления настоящего изобретения единичная лекарственная форма составлена в виде жидкости.

Согласно аспекту некоторых вариантов осуществления настоящего изобретения единичная лекарственная форма составлена для внутривенного введения.

Согласно аспекту некоторых вариантов осуществления настоящего изобретения мономеры рекомбинантной α-галактозидазы человека ковалентно связаны друг с другом посредством поли(алкилен)гликолевого связующего фрагмента.

Согласно аспекту некоторых вариантов осуществления настоящего изобретения поли(алкилен)гликолевый связующий фрагмент содержит по меньшей мере 20 алкиленовых групп.

Согласно аспекту некоторых вариантов осуществления настоящего изобретения рекомбинантная α-галактозидаза человека представляет собой растительную рекомбинантную α-галактозидазу человека.

Согласно аспекту некоторых вариантов осуществления настоящего изобретения растительная рекомбинантная α-галактозидаза человека представляет собой растительную рекомбинантную α-галактозидазу человека, поперечно сшитую с помощью бис-NHS-PEG₄₅.

Согласно аспекту некоторых вариантов осуществления настоящего изобретения рекомбинантная α-галактозидаза человека содержит белок α-галактозидазу человека с аминокислотной последовательностью, как представлено в любой из SEQ ID NO: 1-3.

Согласно аспекту некоторых вариантов осуществления настоящего изобретения белок α-галактозидаза человека является таким, как представлено в SEQ ID NO: 2 или 3.

Если не указано иное, все технические и/или научные термины, используемые в настоящем документе, имеют то же значение, которое обычно понимают специалисты в области техники, к которой относится настоящее изобретение. Хотя способы и материалы, подобные или эквивалентные тем, которые описаны в настоящем документе, можно использовать при практическом применении или тестировании вариантов осуществления настоящего изобретения, иллюстративные способы и/или материалы описаны ниже. В случае конфликта настоящее описание патента, включая в себя определения, будет иметь преимущественную силу. Кроме того, материалы, способы и примеры являются только иллюстративными, и не подразумевается, что они обязательно являются ограничивающими.

Краткое описание чертежей

Некоторые варианты осуществления настоящего изобретения описаны в настоящем документе только в качестве примера со ссылкой на прилагаемые графические материалы. С конкретной ссылкой на графические материалы в деталях ниже подчеркивается, что показанные подробности приведены в качестве примера и в целях иллюстративного обсуждения вариантов осуществления настоящего изобретения. В связи с этим описание, рассматриваемое с графическими материалами, делает очевидным для специалистов в настоящей области техники то, как могут быть реализованы варианты осуществления настоящего изобретения.

На графических материалах:

Фигура 1 представляет собой график, показывающий фармакокинетический профиль растительной рекомбинантной α-GAL человека, поперечно сшитой с помощью бис-NHS-PEG₄₅ (пегунигалсидазой альфа (pegunigalsidase alfa)), измеренный в плазме пациентов вплоть до 14 дней после введения, в начале лечения (день 1), что выражают в виде нг пегунигалсидазы альфа на мл плазмы. Концентрацию фермента измеряли в образцах крови, взятых через 0 часов (до введения/инфузии), через 1 час (через 1 час после начала введения), в конце введения (инфузии) (EOI) и через 1, 4, 8, 24, 48, 72, 96 часов после EOI и через 2 недели (14 дней) после введения ("С_2нед.") перед последующим введением пегунигалсидазы альфа. График представляет средние значения в плазме (нг/мл) для всех когорт в разные периоды отбора проб за 14-дневный период в логарифмическом масштабе. Треугольники (светло-серая линия) представляют дозу 1,0 мг/кг, а квадраты (черная линия) - 2,0 мг/кг пегунигалсидазы альфа;

Фигура 2 представляет собой график из общедоступных фармакокинетических (PK) данных, показывающий фармакокинетический профиль коммерчески доступной агалсидазы бета (r-αhGalA, рекомбинантная α-GAL А человека, Fabrazyme™, Genzyme Corp, Cambridge MA), в течение приблизительно 10 часов (600 мин) после начала введения (инфузии), в логарифмическом масштабе. Данные взяты из American Journal of Human Genetics, 68, 711-722, 2001. Следует обратить внимание на кратковременную (приблизительно 10 часов) биодоступность всех концентраций агалсидазы бета по сравнению с биодоступностью для пегунигалсидазы альфа для аналогичной дозы (что измерено в днях) (см. фиг. 1);

Фигуры 3А-3С представляют собой гистограммы, иллюстрирующие фармакокинетические параметры пегунигалсидазы альфа, выраженные в виде максимальной концентрации в плазме (C_max, в нг/мл) (фигура 3А), периода полужизни ( в часах) (фигура 3В) и рассчитанного общего доступного количества фермента (площадь под кривой, AUC_0-∞, в мкг⋅мин/мл) (фигура 3С), по сравнению с имеющимися опубликованными данными для агалсидазы бета (r-αhGalA, Fabrazyme™) и агалсидазы альфа (Replagal™, Shire Human Genetic Therapies (HGT), Inc., Cambridge, MA). Дозировки представленной пегунигалсидазы альфа составляют 1,0 и 2,0 мг/кг, дозировка агалсидазы бета составляет 1,0 мг/кг, и агалсидазы альфа составляет 0,2 мг/кг. Следует обратить внимание на более высокую фармакокинетику пегунигалсидазы альфа по всем параметрам (C_max; и AUC_0-∞) по сравнению с агалсидазой альфа или бета;

На фигурах 4А-4В представлены графические представления моделирования доступности фермента в течение 4-недельного периода, полученные в результате однократной инфузии пегунигалсидазы альфа по сравнению с моделированием доступности с расширенной схемой (2 мг/кг, раз в 4 недели) пегунигалсидазы альфа с моделированием стандартной схемы агалсидазы бета (фабразим) (1 мг/кг, раз в 2 недели). Фиг. 4А представляет собой схематическую иллюстрацию, показывающую экстраполированную доступность фермента в течение четырехнедельного периода после однократной инфузии;

Фиг. 4В представляет собой моделирование сравнений фармакокинетических параметров 2 мг/кг пегунигалсидазы альфа, вводимой один раз в течение 4-недельного интервала, и 1 мг/кг агалсидазы бета (фабразим), вводимой дважды в течение одного и того же 4-недельного интервала;

На фигуре 4В представлено сравнение доступности фермента в течение 4 недель (частичная AUC, рассчитанная на каждую последующую неделю) для 2 мг/кг пегунигалсидазы альфа, вводимой один раз в 4 недели, с частичной AUC 1 мг/кг агалсидазы бета (фабразим), вводимой один раз в 2 недели. Следует обратить внимание на фактическое отсутствие частичной AUC фермента агалсидазы бета в течение недели после введения (см. недели 2 и 4 для агалсидазы бета) по сравнению с прогнозируемой значительной доступностью фермента после однократного введения пегунигалсидазы альфа в течение всех 4 недель после введения.

Подробное описание изобретения

Настоящее изобретение в некоторых его вариантах осуществления относится к стабилизированному ковалентно связанному гомодимерному ферменту альфа-галактозидазе человека и, более конкретно, но не исключительно, к стабилизированному ковалентно связанному растительному рекомбинантному ферменту альфа-галактозидазе человека, эффективным схемам лечения для его применения при лечении болезни Фабри у субъектов-людей с помощью ферментозаместительной терапии.

Перед подробным объяснением по меньшей мере одного варианта осуществления изобретения следует понимать, что настоящее изобретение не обязательно ограничено в своем применении подробностями, изложенными в последующем описании или приведенными в качестве примеров в примерах. Настоящее изобретение допускает другие варианты осуществления или может быть применено на практике или осуществлено различными способами.

Дефициты лизосомального белка (например, дефекты в лизосомальном белке или отсутствие лизосомального белка) могут нанести значительный вред здоровью субъекта (лизосомная болезнь накопления). Ферментозаместительную терапию (ERT), при которой дефицитный белок вводят пациенту, использовали при попытках лечения лизосомных болезней накопления. Однако введение дефицитного белка не обязательно приводит к значительной и/или постоянной активности введенного белка in vivo.

Болезнь Фабри является примером связанной с Х-хромосомой рецессивной (наследственной) лизосомной болезни накопления, которая может вызывать широкий спектр симптомов. Дефицит лизосомального фермента α-галактозидазы А из-за мутаций вызывает накопление гликолипида, известного как глоботриаозилцерамид (также известного как Gb3 или церамидтригексозид), в кровеносных сосудах, других тканях и органах. Это накопление приводит к нарушению их правильного функционирования. Для функциональной компенсации дефицита α-галактозидазы доступны две ферментозаместительные терапии (ERT). Как агалсидаза альфа (Replagal®, Shire), так и агалсидаза бета (Fabrazyme®, Genzyme-Sanofi) являются рекомбинантными формами фермента α-галактозидазы А человека. Как агалсидаза альфа, так и агалсидаза бета характеризуются недостатком, заключающимся в коротком периоде полужизни, что приводит к ограниченной биодоступности, что приводит к неудовлетворительным клиническим результатам.

В связи с необходимостью решения проблемы нарушенной активности α-галактозидаз были разработаны стабилизированные формы α-галактозидазы (α-GAL), которые проявляли усиленную активность и/или более продолжительную активность как в условиях лизосом, так и в сыворотке, что указывает на потенциальную длительную усиленную активность белка in vivo в клинически значимых условиях. Кроме того, ковалентно связанная α-галактозидаза человека согласно настоящему изобретению проявляла усиленную активность и/или более продолжительную активность в сыворотке от пациентов с болезнью Фабри.

С использованием стабилизированной ковалентно связанной α-галактозидазы человека согласно настоящему изобретению авторы настоящего изобретения разработали эффективную новую терапевтическую дозу и схемы для ферментозаместительной терапии болезни Фабри у людей. Клинический опыт применения стабилизированной ковалентно связанной α-галактозидазы человека согласно настоящему изобретению показал, что ERT с помощью стабилизированной ковалентно связанной α-галактозидазой человека согласно настоящему изобретению, согласно новым схемам лечения, является безопасной и эффективной для лечения болезни Фабри у людей. Стабилизированная ковалентно связанная α-галактозидаза человека согласно настоящему изобретению проявляла значительно улучшенную фармакокинетику, поддерживая концентрации в плазме в течение более 10 дней после введения, C_max больше чем 5000 нг/мл при дозе 1,0 мг/кг (7900-23000 нг/мл) и больше чем 8000 нг/мл при дозе 2,0 мг/кг (13900-46500 нг/мл) и улучшенную биодоступность (AUC) по сравнению с доступными в настоящее время ERT.

Лечение с помощью стабилизированной ковалентно связанной α-галактозидазы человека согласно настоящему изобретению уменьшало количество включений церамидтригексозида в перитубулярных капиллярах почек, значительно ослабляло характерное ухудшение функции почек, улучшало функцию почек и симптомы со стороны желудочно-кишечного тракта, уменьшало показатели индекса боли пациента, улучшало или стабилизировало функции сердца пациента и улучшало физическую активность и общее качество жизни. Клиническое улучшение, такое как наблюдаемое в клинических исследованиях, при эффективной схеме введения доз 2 мг/кг с использованием более широких интервалов инфузии благодаря улучшенной фармакокинетике и биодоступности стабилизированной ковалентно связанной α-галактозидазы человека согласно настоящему изобретению может обеспечить охват ERT для конкретной популяции пациентов с болезнью Фабри, такой как как без ограничения пациенты с легкой и средней тяжестью, молодые, с ранней диагностикой и/или стабильные пациенты, что обеспечивает большее удобство терапии и соблюдение пациентом режима лечения при контроле симптомов пациента, что приводит к значительному улучшению качества жизни пациента и отсроченному риску осложнений заболевания.

Следовательно, согласно аспекту некоторых вариантов осуществления настоящего изобретения предусмотрен способ лечения болезни Фабри у нуждающегося в этом субъекта-человека, причем способ предусматривает введение субъекту терапевтически эффективного количества ковалентно связанной растительной рекомбинантной α-галактозидазы человека, причем указанное терапевтически эффективное количество указанной ковалентно связанной растительной рекомбинантной α-галактозидазы человека составляет 0,2-2,0 мг/кг, что позволяет лечить болезнь Фабри у субъекта, причем указанное введение осуществляют с интервалами, составляющими больше чем две недели - каждые 4 недели, и причем мономеры указанной ковалентно связанной растительной рекомбинантной α-галактозидазы человека ковалентно связаны друг с другом посредством поли(алкилен)гликолевого связующего фрагмента.

Согласно некоторым вариантам осуществления ковалентно связанная растительная рекомбинантная α-галактозидаза человека представляет собой ковалентно связанную гомодимерную растительную рекомбинантную α-галактозидазу человека.

Согласно некоторым вариантам осуществления ковалентно связанный гомодимерный растительный рекомбинантный белок альфа-галактозидаза человека обладает более высокой стабильностью, чем у нативной α-галактозидазы и/или более высокой начальной активностью, чем у нативной α-галактозидазы, как описано подробно ниже. Согласно некоторым вариантам осуществления стабилизированный ковалентно связанный белок α-галактозидаза человека представляет собой растительную рекомбинантную α-GAL человека, поперечно сшитую с помощью бис-NHS-PEG₄₅.

Следует отметить, что согласно некоторым вариантам осуществления способ можно осуществить с использованием стабилизированного ковалентно связанного белка α-галактозидазы человека, содержащего рекомбинантный белок α-галактозидазу человека, полученный не из растительных клеток (например, клеток млекопитающих), таких как коммерчески доступная агалсидаза альфа (Replagal®, Shire) и агалсидаза бета (Fabrazyme®, Genzyme), рекомбинантная альфа-галактозидаза, продуцируемая в клетках не млекопитающих (растение, бактерии, насекомые, грибы и т.д.) или подходящая альфа-галактозидаза любого другого происхождения.

Используемый в настоящем документе термин "болезнь Фабри" относится к любому дефициту альфа-галактозидазы А. "Дефицит альфа-галактозы А" относится к любому дефициту природной активности альфа-галактозидазы А у пациента, что приводит к аномальным накоплениям гликолипидов (например, глоботриаозилцерамида), главным образом, в клетках эндотелия капилляров, клетках почки и/или миоцитах сердца. Отложения этого материала могут приводить к сильной невропатической боли (например, акропарестезии и боли с рвотой), серьезным заболеваниям почек и сердечно-сосудистой системы и/или инсульту. Накопление гликолипидов может вызывать тяжелые симптомы, которые, как правило, наблюдаются у индивидуумов, страдающих болезнью Фабри. Как правило, более тяжелые симптомы наблюдаются у пациентов мужского пола, но также могут наблюдаться у гетерозиготных женщин-носителей дефектного гена. Эта болезнь, как известно, плохо диагностируется, особенно у пациентов-женщин. Пораженные заболеванием люди характеризуются значительно сокращенной продолжительностью жизни; смерть, как правило, наступает от почечных, сердечных и/или цереброваскулярных осложнений приблизительно в четвертом и пятом десятилетиях жизни.

В настоящем документе термин "мономер" в отношении α-галактозидазы относится к отдельной полипептидной субъединице" α-галактозидазы. Полипептид может включать в себя непептидные заместители (например, один или несколько сахаридных фрагментов).

В настоящем документе термин "нативный" в отношении α-галактозидазы охватывает белки, содержащие аминокислотную последовательность, по существу идентичную (т.е. по меньшей мере с 95% гомологии, необязательно по меньшей мере с 95% идентичности, необязательно по меньшей мере с 99% гомологии, необязательно по меньшей мере с 99% идентичности и необязательно с 100% идентичности) по отношению к аминокислотной последовательности встречающегося в природе белка α-галактозидазы. Нативная α-галактозидаза может представлять собой белок, выделенный из природного источника, или рекомбинантно продуцируемый белок (например, полученный из клеток человека, клеток млекопитающих, клеток растений, дрожжевых клеток, бактериальных клеток, клеток насекомых и т.п.).

Термин "нативный" при использовании в отношении четвертичной структуры α-галактозидазы (например, димера α-галактозидазы), кроме того, включает в себя четвертичную структуру, по существу идентичную структуре встречающегося в природе белка.

В настоящем документе фраза "встречающийся в природе белок" относится к белку в форме, которая встречается в природе (например, в организме), в отношении аминокислотной последовательности белка, а также четвертичной структуры белка, если белок находится в стабилизированной, гомодимерной форме.

Посттрансляционные модификации (например, гликозилирование) встречающихся в природе белков α-галактозидазы (например, в организме, который экспрессирует встречающийся в природе белок α-галактозидазу) могут присутствовать, отсутствовать или модифицироваться в нативной форме α-галактозидазы, упомянутой в настоящем документе. Нативная форма α-галактозидазы (например, рекомбинантно продуцируемая α-галактозидаза) может необязательно содержать посттрансляционные модификации, отличные от модификаций встречающейся в природе α-галактозидазы, при условии, что нативная форма α-галактозидазы сохраняет аминокислотную последовательность и структуру, по существу сходные со встречающейся в природе α-галактозидазой, как описано в настоящем документе выше.

В настоящем документе нативная форма белка может относиться к мономерной структуре (например, мономеру α-галактозидазы) и/или мультимерной структуре (например, димеру α-галактозидазы). Например, димерный белок можно описать как нативную форму α-галактозидазы, а мономерный полипептид в димерном белке можно описать как как нативную форму мономера α-галактозидазы.

Необязательно мультимерная белковая структура, описанная в настоящем документе, представляет собой димерную структуру, как и нативная форма α-галактозидазы.

Альтернативно, стабилизированная ковалентно связанная α-галактозидаза человека согласно настоящему изобретению содержит более двух мономеров α-галактозидазы. Например, мультимерная белковая структура может представлять собой тетрамер, гексамер или октамер, состоящий из мономеров α-галактозидазы.

Стабилизированная ковалентно связанная α-галактозидаза человека согласно настоящему изобретению, описанная в настоящем документе, содержит ковалентные связи, которые связывают мономеры α-галактозидазы в ней и которые отсутствуют в нативной форме α-галактозидазы.

Таким образом, например, связующий фрагмент необязательно представляет собой фрагмент, который ковалентно прикреплен к боковой цепи, N-концу, или С-концу, или фрагменту, связанному с посттрансляционными модификациями (например, сахаридному фрагменту) мономера α-галактозидазы, а также боковой цепи, N-концу, или С-концу, или фрагменту, связанному с посттрансляционными модификациями (например, сахаридному фрагменту) другого мономера α-галактозидазы. Такие иллюстративные связующие фрагменты подробно описаны в настоящем документе ниже.

Необязательно связующий фрагмент лишен дисульфидной связи. Однако связующий фрагмент, который включает в себя дисульфидную связь в положении, которое не образует связь между мономерами (например, расщепление дисульфидной связи не расщепляет связь между мономерами), входит в объем этого варианта осуществления настоящего изобретения. Потенциальное преимущество связующего фрагмента, лишенного дисульфидной связи, состоит в том, что он не подвержен расщеплению за счет мягко восстанавливающих условий, как дисульфидные связи.

Связующий фрагмент также называется в настоящем документе поперечно сшивающим фрагментом. Связывание мономеров α-галактозидазы связующим фрагментом в настоящем документе называется "поперечное сшивание".

Согласно некоторым вариантам осуществления относительно короткие связующие фрагменты могут быть менее эффективными, чем более длинные связующие фрагменты, при поперечном сшивании между различными мономерами α-галактозидазы.

Следовательно, согласно некоторым вариантам осуществления связующий фрагмент не является ковалентной связью, химическим атомом или группой, а скорее является мостиковым фрагментом.

Следовательно, согласно некоторым вариантам осуществления связующий фрагмент составляет по меньшей мере 10 атомов в длину, необязательно по меньшей мере 20 атомов в длину, необязательно по меньшей мере 30 атомов в длину, необязательно по меньшей мере 50 атомов в длину, необязательно по меньшей мере 100 атомов в длину, необязательно по меньшей мере 200 атомов в длину, необязательно по меньшей мере 300 атомов в длину, необязательно по меньшей мере 400 атомов в длину, необязательно по меньшей мере 500 атомов в длину, необязательно по меньшей мере 600 атомов в длину, необязательно по меньшей мере 700 атомов в длину, необязательно по меньшей мере 800 атомов в длину и необязательно по меньшей мере 1000 атомов в длину. Согласно некоторым вариантам осуществления длина связующего фрагмента (выраженная в количестве атомов) находится в диапазоне, составляющем 10-1000 атомов, 15-800 атомов, 20-600 атомов, 50-500 атомов, 65-400 атомов, 75-350 атомов и 80-200 атомов. Согласно конкретным вариантам осуществления длина связующего фрагмента (выраженная в количестве атомов) составляет 20-600 атомов. Согласно другому конкретному варианту осуществления длина связующего фрагмента (выраженная в количестве атомов) составляет 140 атомов.

В настоящем документе длина связующего фрагмента (если она выражена в виде числа атомов) относится к длине основной цепи связующего фрагмента, т.е. количества атомов, образующих линейную цепь между остатками каждого из двух мономеров, связанных посредством связующего фрагмента.

Согласно некоторым аспектам настоящего изобретения мономеры стабилизированной ковалентно связанной α-галактозидазы человека согласно настоящему изобретению ковалентно связаны друг с другом посредством поли(алкилен)гликолевого связующего фрагмента, например, согласно некоторым вариантам осуществления связующий фрагмент содержит поли(алкиленгликолевую) цепь.

Используемая в настоящем документе фраза "поли(алкиленгликоль)" включает в себя семейство полимеров простых полиэфиров, которые характеризуются следующей общей формулой: -O-[(СН₂)_m-O-]_n-, где m представляет собой число метиленовых групп, присутствующих в каждом алкиленгликолевом звене, и n представляет количество повторяющихся звеньев, и, следовательно, представляет размер или длину полимера. Например, когда m=2, полимер имеет название полиэтиленгликоль, а когда m=3, полимер имеет название полипропиленгликоль.

Согласно некоторым вариантам осуществления m представляет собой целое число, больше 1 (например, m=2, 3, 4 и т.д.).

Необязательно m варьируется среди звеньев поли(алкиленгликолевой) цепи. Например, поли(алкиленгликолевая) цепь может содержать как этиленгликолевые (m=2), так и пропиленгликолевые (m=3) звенья, связанные вместе.

Поли(алкиленгликоль) необязательно содержит по меньшей мере две функциональные группы (например, как описано в настоящем документе), причем каждая функциональная группа образует ковалентную связь с одним из мономеров α-галактозидазы. Функциональные группы представляют собой необязательно концевые группы поли(алкиленгликоля), так что вся длина поли(алкиленгликоля) находится между двумя функциональными группами.

Фраза "поли(алкиленгликоль)" также охватывает его аналоги, в которых атом кислорода замещен другим гетероатомом, таким как, например, S, -NH- и тому подобное. Этот термин дополнительно охватывает производные указанного выше, в которых одна или несколько метиленовых групп, составляющих полимер, являются замещенными. Иллюстративные заместители на метиленовых группах включают в себя без ограничения алкил, циклоалкил, алкенил, алкинил, алкокси, гидрокси, оксо, тиол и тиоалкокси и тому подобное.

Используемая в настоящем документе фраза "алкиленгликолевое звено" охватывает -(СН₂)_m-О- группу или ее аналог, как описано в настоящем документе выше, который образует основную цепь поли(алкиленгликоля), где (СН₂)_m (или его аналог) связан с гетероатомом, принадлежащим к другому алкиленгликолевому звену или с фрагментом мономера α-галактозидазы (в случае концевого звена), а О (или его аналог-гетероатом) связан с (СН₂)_m (или его аналогом) другого алкиленгликолевого звена или функциональной группой, которая образует связь с мономером α-галактозидазы.

Алкиленгликолевое звено может являться разветвленным, так что оно связано с 3 или больше соседними алкиленгликолевыми звеньями, где каждое из 3 или больше соседних алкиленгликолевых звеньев является частью цепи поли(алкиленгликоля). Такое разветвленное алкиленгликолевое звено связано через его гетероатом с одним соседним алкиленгликолевым звеном, и каждый из гетероатомов оставшихся соседних алкиленгликолевых звеньев связан с атомом углерода разветвленного алкиленгликолевого звена. Кроме того, гетероатом (например, азот) может связывать более одного атома углерода алкиленгликолевого звена, частью которого он является, образуя таким образом разветвленное алкиленгликолевое звено (например, [(-CH₂)_m]₂N- и тому подобное).

Согласно иллюстративным вариантам осуществления по меньшей мере 50% алкиленгликолевых звеньев являются идентичными, например, они содержат одинаковые гетероатомы и такие же значения m, что и у другого. Необязательно по меньшей мере 70%, необязательно по меньшей мере 90% и необязательно 100% алкиленгликолевых звеньев являются идентичными. Согласно иллюстративным вариантам осуществления гетероатомы, связанные с идентичными алкиленгликолевыми звеньями, представляют собой атомы кислорода. Согласно дополнительным иллюстративным вариантам осуществления m равно 2 для идентичных звеньев.

Согласно одному варианту осуществления линкер представляет собой одиночный линкер с неразветвленной цепью, например, полиэтиленгликоль (PEG).

Используемый в настоящем документе термин "поли(этиленгликоль)" описывает поли(алкиленгликоль), как определено в настоящем документе выше, в котором по меньшей мере 50%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 90% и предпочтительно 100% алкиленгликолевых звеньев представляют -СН₂СН₂-О-. Аналогично фраза "этиленгликолевые звенья" определена в настоящем документе как звенья -СН₂СН₂О-.

Согласно необязательным вариантам осуществления связующий фрагмент содержит поли(этиленгликоль) или его аналог, характеризующийся общей формулой:

-X₁-(CR₁R₂-CR₃R₄-Y)_n-X₂-

где каждый X₁ и Х₂ представляет собой функциональную группу (например, как описано в настоящем документе), которая образует ковалентную связь по меньшей мере с одним мономером α-галактозидазы;

Y представляет собой О, S или NR₅ (необязательно О);

n представляет собой целое число, необязательно от 1 до 200 (необязательно от 5 до 150 и необязательно от 40 до 70), хотя также предусмотрены более высокие значения n; и

каждый из R₁, R₂, R₃, R₄ и R₅ независимо выбран из группы, состоящей из следующего: водород, алкил, циклоалкил, алкенил, алкинил, алкокси, гидрокси, оксо, тиол и тиоалкокси.

Согласно некоторым вариантам осуществления n составляет по меньшей мере 5, необязательно по меньшей мере 8, необязательно по меньшей мере 15, необязательно по меньшей мере 25 и необязательно по меньшей мере 40.

Согласно некоторым вариантам осуществления n составляет не больше чем 200, необязательно не больше чем 150 и необязательно не больше чем 70.

Поли(этиленгликоль) или его аналог может необязательно содержать сополимер, например, в котором не все звенья CR₁R₂-CR₃R₄-Y в представленной выше формуле являются идентичными друг другу.

Согласно некоторым вариантам осуществления по меньшей мере 50% звеньев CR₁R₂-CR₃R₄-Y являются идентичными. Необязательно по меньшей мере 70%, необязательно по меньшей мере 90% и необязательно 100% звеньев CR₁R₂-CR₃R₄-Y являются идентичными.

Необязательно связующий фрагмент является разветвленным, например, таким образом, что для одного или нескольких звеньев CR₁R₂-CR₃R₄-Y в приведенной выше формуле по меньшей мере один из R₁, R₂, R₃, R₄, и R₅ представляет собой -(CR₁R₂-CR₃R₄-Y)_p-X₃-, где R₁-R₄ и Y имеют значения, определенные в настоящем документе выше, р представляет собой целое число, как определено в настоящем документе для n (например, от 1 до 200), и Х₃ является таким, как определено в настоящем документе для X₁ и Х₂.

Функциональные группы могут необязательно образовывать связь, такую как без ограничения амидная связь, аминная связь, сложноэфирная связь и/или эфирная связь.

Например, функциональная группа может необязательно содержать карбонильную группу, которая образует амидную связь с атомом азота в полипептиде (например, в остатке лизина или N-конце), или сложноэфирную связь с атомом кислорода в полипептиде (например, в остатке серина, треонина или тирозина).

Альтернативно или дополнительно, функциональная группа может необязательно содержать гетероатом (например, N, S, О), который образует амидную связь, сложноэфирную связь или тиоэфирную связь с карбонильной группой в полипептиде (например, в остатке глутамата или аспартата или на С-конце).

Альтернативно или дополнительно, функциональная группа может содержать алкильную или арильную группу, прикрепленную к полипептиду (например, к гетероатому в полипептиде).

Альтернативно или дополнительно, функциональная группа может необязательно содержать атом азота, который образует аминную связь с алкильной группой в мономере α-галактозидазы, или мономер α-галактозидазы может необязательно содержать атом азота, который образует аминную связь с алкильной группой в функциональной группе. Такая аминная связь может быть образована путем восстановительного аминирования (например, как описано в настоящем документе ниже).

Согласно некоторым вариантам осуществления по меньшей мере одна из функциональных групп образует амидную связь с полипептидом (например, с остатком лизина в нем).

Функциональные группы могут являть идентичными друг другу или различными.

Согласно некоторым вариантам осуществления по меньшей мере одна из функциональных групп прикреплена к одной функциональной группе полипептида (например, аминогруппе остатка лизина или N-конца), и по меньшей мере одна из функциональных групп прикреплена к другой функциональной группе полипептида (например, тиольной группе остатка цистеина).

Согласно некоторым вариантам осуществления стабилизированная ковалентно связанная α-галактозидаза человека может содержать дополнительные фрагменты PEG, связанные только с одной субъединицей, посредством связывания с остатком лизина в этой субъединице.

Согласно некоторым вариантам осуществления стабилизированная ковалентно связанная α-галактозидаза человека согласно настоящему изобретению поперечно сшита с помощью бис-NHS-PEG₄₅. Получение и характеристики такой растительной рекомбинантной человеческой α-галактозидазы человека, поперечно сшитой с помощью бис-NHS-PEG₄₅, подходящей для применения в настоящем изобретении, подробно описаны в международной патентной заявке согласно РСТ WO 2011/107990 настоящего патентообладателя. Описанная в настоящем документе стабилизированная ковалентно связанная растительная рекомбинантная α-галактозидаза человека, поперечно сшитая с помощью бис-NHS-PEG₄₅, также в настоящем документе имеет название «пегунигалсидаза альфа».

Стабилизированная ковалентно связанная растительная рекомбинантная α-галактозидаза человека, поперечно сшитая с помощью бис-NHS-PEG₄₅, описанная в настоящем документе, является биологически активной, характеризующейся активностью α-галактозидазы. Активность α-галактозидазы, описанная в настоящем документе, представляет собой биологическую активность, которая характерна для α-галактозидазы (например, каталитическая активность, характерная для α-галактозидазы, такая как гидролиз концевого α-галактозильного фрагмента субстрата).

Согласно некоторым вариантам осуществления каталитическая активность α-галактозидазы характеризуется скоростью катализа при насыщении (т.е. значением V_max).

Альтернативно, активность α-галактозидазы представляет собой терапевтическую активность (например, ферментативную активность, характеризующуюся терапевтическим эффектом), такую как терапевтическая активность в контексте болезни Фабри. Необязательно, терапевтическую активность определяют у экспериментальных животных (например, мышей с болезнью Фабри) и, необязательно, у пациентов-людей с болезнью Фабри.

Техники определения активности α-галактозидазы будут известны специалисту в настоящей области техники. Как правило, α-галактозидазу (т.е. описанную в настоящем документе нативную форму или мультимерную белковую структуру) приводят в контакт с соединением, признанным в настоящей области техники в качестве субстрата α-галактозидазы, и степень активности затем определяют количественно. Соединения, которые обеспечивают особенно удобное обнаружение активности α-галактозидазы, известны в настоящей области техники и являются коммерчески доступными.

Согласно некоторым вариантам осуществления активность α-галактозидазы определяют путем анализа гидролиза 4-метилумбеллиферил-α-D-галактопиранозида. Согласно другим вариантам осуществления активность α-галактозидазы определяют путем анализа гидролиза п-нитрофенил-α-D-галактопиранозида.

При сравнении активности стабилизированного ковалентно связанного белка α-галактозидазы человека, описанной в настоящем документе, с активностью нативной α-галактозидазы, согласно некоторым конкретным вариантам осуществления нативная α-галактозидаза предпочтительно содержит мономеры α-галактозидазы, по существу идентичные (например, в отношении аминокислотной последовательности и характера гликозилирования) мономерам α-галактозидазы стабилизированного ковалентно связанного рекомбинантного белка α-галактозидазы человека.

Согласно некоторым вариантам осуществления стабилизированная ковалентно связанная α-галактозидаза человека согласно настоящему изобретению характеризуется периодом полужизни в кровотоке в физиологической системе субъекта-человека, который выше (например, по меньшей мере на 20%, по меньшей мере на 50% выше, по меньшей мере на 100% выше, по меньшей мере на 400% выше, по меньшей мере на 900% выше, по меньшей мере на 1500% выше, по меньшей мере на 2000% выше, по меньшей мере на 2500% выше, по меньшей мере на 3000% выше, по меньшей мере на 3500% выше, по меньшей мере на 4000% выше, по меньшей мере на 5000% выше, по меньшей мере на 7500% выше, по меньшей мере на 8000% выше, вплоть до 10000% выше, вплоть до 20000% выше, вплоть до 50000% выше, на 100000% выше, на 200000% выше или больше), чем период полужизни в кровотоке не поперечно сшитой α-галактозидазы [например, агалсидазы альфа (Replagal®, Shire) и агалсидазы бета (Fabrazyme®, Genzyme)].

Как описано в настоящем документе, при испытании в клиническом контексте период полужизни в кровотоке стабилизированной ковалентно связанной α-галактозидазы человека согласно настоящему изобретению после внутривенной (в/в) инфузии был значительно увеличен. Таким образом, согласно некоторым аспектам настоящего изобретения стабилизированная ковалентно связанная α-галактозидаза человека согласно настоящему изобретению характеризуется периодом полужизни в кровотоке (Т 1/2), составляющим по меньшей мере 5 часов, по меньшей мере 10 часов, по меньшей мере 20 часов, по меньшей мере 50 по меньшей мере 60, по меньшей мере 70, по меньшей мере 80 или по меньшей мере 90 часов после в/в инфузии.

Согласно некоторым вариантам осуществления период полужизни в кровотоке стабилизированной ковалентно связанной α-галактозидазы человека согласно настоящему изобретению является таким, что концентрация стабилизированной ковалентно связанной α-галактозидазы человека согласно настоящему изобретению в плазме через 14 дней после внутривенного введения 2 мг/кг массы тела имеет тот же порядок величины, что и максимальная концентрация в плазме коммерчески доступной рекомбинантной α-галактозидазы человека (агалсидазы бета, Fabrazyme®) через 2 часа после инфузии в дозе 1 мг/кг массы тела).

Согласно некоторым вариантам осуществления период полужизни в кровотоке (Т_1/2) стабилизированной ковалентно связанной α-галактозидазы человека согласно настоящему изобретению, при введении внутривенно субъекту, составляет по меньшей мере 5, 10, 20, 30, 40, по меньшей мере 50, по меньшей мере 60, по меньшей мере 70, по меньшей мере 80 или по меньшей мере 90 часов после в/в инфузии. Согласно некоторым вариантам осуществления период полужизни в кровотоке (Т_1/2) после в/в инфузии стабилизированной ковалентно связанной α-галактозидазы человека согласно настоящему изобретению находится в диапазоне, составляющем 3-100 часов, в диапазоне, составляющем 5-70 часов, в диапазоне, составляющем 5-50, 10-45, 15-40, 20-35 40-69 60-80, 60-90 и 25-50 часов. Согласно конкретным вариантам осуществления период полужизни в кровотоке (Т_1/2) стабилизированной ковалентно связанной α-галактозидазы человека согласно настоящему изобретению составляет 5-10 часов, 10-20 часов, 20-50 часов или 50-80 или 50-90 часов.

Согласно некоторым вариантам осуществления биодоступность стабилизированной ковалентно связанной α-галактозидазы человека согласно настоящему изобретению может отражать общее количество доступного фермента после введения, выраженное как "площадь под кривой" (AUC_0-∞), в единицах мкг⋅мин/мл или нг⋅ч/мл. Таким образом, согласно некоторым вариантам осуществления биодоступность (площадь под кривой) стабилизированной ковалентно связанной α-галактозидазы человека согласно настоящему изобретению после внутривенного введения 1,0 мг/кг стабилизированной ковалентно связанной α-галактозидазы человека согласно настоящему изобретению субъекту находится в диапазоне, составляющем 10000-500000 нг⋅ч/мл, 50000-250000 нг⋅ч/мл, по меньшей мере 10000 нг⋅ч/мл, по меньшей мере 25000 нг⋅ч/мл, по меньшей мере 50000 нг⋅ч/мл, по меньшей мере 75000 нг⋅ч/мл, по меньшей мере 100000 нг⋅ч/мл или по меньшей мере 200000 нг⋅ч/мл. Согласно конкретным вариантам осуществления биодоступность (площадь под кривой) стабилизированной ковалентно связанной α-галактозидазы человека согласно настоящему изобретению составляет 100000 нг⋅ч/мл после введения 1,0 мг/кг указанной рекомбинантной α-галактозидазы человека.

Согласно другим вариантам осуществления биодоступность (площадь под кривой) стабилизированной ковалентно связанной α-галактозидазы человека согласно настоящему изобретению после внутривенного введения 2,0 мг/кг стабилизированной ковалентно связанной α-галактозидазы человека согласно настоящему изобретению субъекту находится в диапазоне, составляющем 50000-800000 нг⋅ч/мл, 100000-600000 нг⋅ч/мл, 150000-500000 нг⋅ч/мл, по меньшей мере 50000 нг⋅ч/мл, по меньшей мере 75000 нг⋅ч/мл, по меньшей мере 100000 нг⋅ч/мл, по меньшей мере 200000 нг⋅ч/мл, по меньшей мере 300000 нг⋅ч/мл, по меньшей мере 400000 нг⋅ч/мл или по меньшей мере 600000 нг⋅ч/мл. Согласно конкретным вариантам осуществления биодоступность (площадь под кривой) стабилизированной ковалентно связанной α-галактозидазы человека согласно настоящему изобретению составляет 400000 нг⋅ч/мл после введения 2,0 мг/кг указанной рекомбинантной α-галактозидазы человека.

Увеличенный период полужизни в кровотоке необязательно может быть связан с более высокой стабильностью in vivo (например, устойчивостью к метаболизму), более высоким поглощением и/или активностью в органах-мишенях.

Периоды полужизни в кровотоке можно определить путем отбора образцов (например, образцов крови) из физиологических систем (например, от людей, лабораторных животных) с различными интервалами и определения содержания α-галактозидазы в образце с использованием техник, известных в настоящей области техники.

Периоды полужизни в ткани можно определить путем отбора образцов (например, образцов ткани) из физиологических систем (например, от людей, лабораторных животных) с различными интервалами и определения содержания α-галактозидазы в образце с использованием техник, известных в настоящей области техники.

Необязательно период полужизни рассчитывают как конечный период полужизни (например, как описано в разделе «Примеры»), где период полужизни представляет собой время, необходимое для снижения концентрации (например, концентрации в крови) на 50% после достижения псевдоравновесия распределения. Конечный период полужизни можно рассчитать из конечной линейной части зависимости логарифма концентрации от времени путем линейной регрессии зависимости логарифма концентрации от времени (см., например, Toutain & Bousquet-Melou [J Vet Pharmacol Ther 2004, 27:427-39]). Таким образом, конечный период полужизни представляет собой меру снижения концентрации лекарственного средства в плазме из-за скорости выведения лекарственного средства, а не его снижения по другим причинам, и не обязательно является временем, необходимым для уменьшения количества вводимого лекарственного средства на половину.

Определение содержания α-галактозидазы (например, стабилизированной ковалентно связанной α-галактозидазы человека согласно настоящему изобретению или не поперечно сшитой α-галактозидазы) может включать в себя обнаружение физического присутствия α-галактозидазы (например, посредством антитела к α-галактозидазе) и/или обнаружение уровня активности α-галактозидазы (например, как описано в настоящем документе).

В настоящем документе "α-галактозидаза человека" относится к растительной рекомбинантной α-галактозидазе, содержащей аминокислотную последовательность, по существу идентичную (например, как описано в настоящем документе выше) аминокислотной последовательности белка α-галактозидазы, который естественным образом встречается у людей.

Примеры α-GAL, подходящие для применения в настоящем изобретении, включают без ограничения α-GAL с аминокислотной последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 и SEQ ID NO: 3. Необязательно согласно конкретным вариантам осуществления α-GAL характеризуется аминокислотной последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 2 и SEQ ID NO: 3. Согласно некоторым вариантам осуществления α-GAL может являться любой из SEQ ID NO: 2 или SEQ ID NO: 3. Согласно другим вариантам осуществления стабилизированная ковалентно связанная α-галактозидаза человека согласно настоящему изобретению содержит популяцию растительной рекомбинантной α-галактозидазы, содержащую комбинацию растительных рекомбинантных белков α-галактозидазы, содержащую как α-GAL согласно SEQ ID NO: 2, так и α-GAL согласно SEQ ID NO: 3.

Используемый в настоящем документе термин "α-галактозидаза" относится к любому белку, который проявляет ферментативную активность (например, гидролиз) в отношении галактозных фрагментов в Gb₃ (например, α-галактозидаза А). Необязательно, "α-галактозидаза" относится к Е.С. 3.2.1.22. Используемый в настоящем документе термин "кислая α-галактозидаза" относится к α-галактозидазе, характеризующейся способностью гидролизовать связанные на концах фрагменты α-галактозы из галактозосодержащих олигосахаридов в кислых условиях рН (например, приблизительно рН 4,2-5), таких как встречающиеся в лизосоме.

Необязательно, белок α-галактозидаза дополнительно содержит по меньшей мере один фрагмент манноза-6-фосфат (М6Р). Фрагмент М6Р (или фрагменты) может быть связан с одним или несколькими мономерами α-галактозидазы белка α-галактозидазы (например, через линкер).

Техники и реагенты для введения M6P-содержащих фрагментов в биомолекулу (например, полипептид) описаны в международной патентной публикации WO 2009/024977.

Как подробно описано в настоящем документе, внутривенное введение стабилизированной ковалентно связанной α-галактозидазы человека согласно настоящему изобретению приводило к улучшению/стабилизации клинических параметров у пациентов-людей, включая в себя оценки функции почек, сердца и испытываемых страданий (например, боли).

Накопление гликолипида Gb3 характерно для естественного течения болезни Фабри, а снижение его накопления представляет собой клинический параметр при ERT для пациентов с болезнью Фабри. Согласно одному варианту осуществления способ согласно настоящему изобретению можно использовать для снижения накопления гликолипидов. Таким образом, согласно некоторым вариантам осуществления в/в (внутривенное) введение терапевтически эффективного количества стабилизированной ковалентно связанной α-галактозидазы человека согласно настоящему изобретению снижает концентрации Gb3 и/или лизо-Gb3 в плазме. Согласно некоторым вариантам осуществления в/в введение терапевтически эффективного количества стабилизированной ковалентно связанной α-галактозидазы человека согласно настоящему изобретению снижает Gb3 (гликолипид) в перитубулярных капиллярах почек субъектов. Согласно конкретным вариантам осуществления снижение представляет собой снижение по меньшей мере на 20%, по меньшей мере на 30%, по меньшей мере на 40%, по меньшей мере на 50%, по меньшей мере на 60%, по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 90% или больше в соответствии с количественной оценкой по шкале BLISS. Согласно некоторым вариантам осуществления снижение измеряют в виде балла по шкале BLISS. Снижение ответа Gb3 и/или лизо-Gb3 на введение стабилизированной ковалентно связанной α-галактозидазы человека согласно настоящему изобретению измеряют через 1 месяц, 2 месяца, 3 месяца, 5 месяцев, 6 месяцев, один год лечения или более. Согласно некоторым вариантам осуществления снижение Gb3 составляет по меньшей мере 50% при измерении через 6 месяцев после начала лечения по сравнению с Gb3 до лечения.

Пациенты с болезнью Фабри также страдают от боли и, в частности, от невропатической боли, и способ и стабилизированную ковалентно связанную α-галактозидазу человека согласно настоящему изобретению можно использовать для облегчения боли, связанной с болезнью Фабри, у пациентов. Согласно некоторым вариантам осуществления введение терапевтически эффективного количества стабилизированной ковалентно связанной α-галактозидазы человека согласно настоящему изобретению уменьшает боль у субъектов. Для оценки уменьшения боли доступно множество опросников оценки боли, неограничивающий перечень включает в себя опросник оценки боли Мак-Гилла, опросник оценки боли при болезни Фабри и краткий опросник оценки боли. Согласно некоторым вариантам осуществления уменьшение боли измеряют согласно краткому опроснику оценки боли. Согласно некоторым вариантам осуществления уменьшение боли согласно опроснику составляет по меньшей мере 30%, по меньшей мере 40%, по меньшей мере 50% или больше. Согласно конкретным вариантам осуществления уменьшение боли представляет собой уменьшение по меньшей мере на 50%. Уменьшение боли в ответ на введение стабилизированной ковалентно связанной α-галактозидазы человека согласно настоящему изобретению измеряют через 1 месяц, 2 месяца, 3 месяца, 5 месяцев, 6 месяцев, один год лечения или более. Согласно другим вариантам осуществления уменьшение параметров боли измеряют через 6 месяцев после начала лечения и/или сравнивают с оценками до лечения.

Согласно некоторым вариантам осуществления уменьшение боли измеряют через 1 неделю, 2 недели и 3 недели в каждом цикле лечения. Согласно некоторым вариантам осуществления уменьшение боли выявляют на второй неделе после введения. Согласно некоторым вариантам осуществления уменьшение боли выявляют на третьей неделе после введения.

Согласно другим вариантам осуществления введение терапевтически эффективного количества стабилизированной ковалентно связанной α-галактозидазы человека согласно настоящему изобретению обеспечивает улучшение восприятия общего качества жизни у субъектов. Для оценки результатов лечения доступно множество опросников оценик качества жизни, неограничивающий список включает в себя опросник оценки качества жизни Мак-Гилла, шкалу оценки качества жизни (QOLS), опросник оценки качества жизни ВОЗ (WHOQOL) и опросник EQ-5D-5L. Согласно некоторым вариантам осуществления качество жизни измеряют в соответствии с опросником EQ-5D-5L, который содержит 5 аспектов здоровья: мобильность, способность к самообслуживанию, способность выполнять обычные действия, боль и дискомфорт, а также тревога и депрессия. Существуют 5 вариантных уровней под каждым доменом. Согласно некоторым вариантам осуществления улучшение согласно опроснику составляет по меньшей мере 30%, по меньшей мере 40%, по меньшей мере 50% или более. Согласно конкретным вариантам осуществления улучшение качества жизни представляет собой улучшение по меньшей мере на 50%. Улучшение качества жизни в ответ на введение стабилизированной ковалентно связанной α-галактозидазы человека согласно настоящему изобретению измеряют через 1 месяц, 2 месяца, 3 месяца, 5 месяцев, 6 месяцев, один год лечения или более. Согласно другим вариантам осуществления улучшение качества жизни измеряют через 6 месяцев после начала лечения и/или сравнивают с оценками до лечения.

Почечная недостаточность является еще одним распространенным клиническим осложнением болезни Фабри, в основном вызванным накоплением гликолипида в почечных канальцах и характеризующимся прогрессирующим ухудшением в течение заболевания, приводящим к терминальной стадии почечной недостаточности. Способ и стабилизированную ковалентно связанную α-галактозидазу человека согласно настоящему изобретению можно использовать для замедления прогрессирования нефропатии и достижения стабилизации функции почек или для поддержания стабильного уровня функции почек у пациента. Таким образом, согласно некоторым вариантам осуществления введение терапевтически эффективного количества стабилизированной ковалентно связанной α-галактозидазы человека согласно настоящему изобретению с использованием способов согласно настоящему изобретению ослабляет нефропатию Фабри у субъектов.

Таким образом, в соответствии с другими вариантами осуществления введение терапевтически эффективного количества стабилизированной ковалентно связанной α-галактозидазы человека согласно настоящему изобретению с использованием способов согласно настоящему изобретению поддерживает устойчивый уровень нефропатической функции почек у субъектов.

Способы оценки функции почек у пациентов с болезнью Фабри включают в себя без ограничения лабораторные маркеры (протеинурия, микроальбуминурия, оценка хронической болезни почек (ХБП) и т.д.), макроскопическую гематурию, биопсию, электронную микроскопию биопсии, нарушенную функцию почек и ультразвуковое исследование почек и выявленные в МРТ аномалии. Согласно некоторым вариантам осуществления функцию почек (и нарушенную функцию почек, или нефропатию) измеряют в соответствии со скоростью клубочковой фильтрации и/или показателем протеинурии. Скорость клубочковой фильтрации (СКФ) представляет собой объем жидкости, отфильтрованной из почечных клубочковых капилляров в капсулу Боумена за единицу времени. Существует несколько различных техник, используемых для расчета или оценки скорости клубочковой фильтрации (СКФ или рСКФ (расчетная скорость клубочковой фильтрации)). В клинической практике для оценки СКФ используют клиренс креатинина или оценки клиренса креатинина на основе содержания креатинина в сыворотке. Наиболее часто используемые способы для расчетной СКФ (рСКФ) с использованием формулы «Модификация рациона при почечной недостаточности» (MDRD) (с использованием четырех переменных: сывороточного креатинина, возраста, этнической принадлежности и пола) и формулы CKD-EPI (Сотрудничество в области эпидемиологии хронических заболеваний почек), разработанной с целью создания формулы, более точной, чем формула MDRD.

Согласно некоторым вариантам осуществления наблюдается ослабление ухудшения функции почек. Ослабление ухудшения функции почек в ответ на внутривенное введение стабилизированной ковалентно связанной α-галактозидазы человека согласно настоящему изобретению в соответствии с некоторыми аспектами настоящего изобретения измеряют через 3 месяца, 6 месяцев, 12 месяцев, 24 месяца лечения или более. Согласно другим вариантам осуществления ослабление связанного с болезнью Фабри ухудшения почек измеряют через 6 месяцев после начала лечения и/или сравнивают с оценками до лечения. Согласно конкретным вариантам осуществления функция почек поддерживается на постоянном уровне, таком же или сходном с уровнем, когда начинается лечение, как измерено с использованием расчетной скорости клубочковой фильтрации и/или показателя протеинурии после 6 месяцев, 12 месяцев, 24 месяцев лечения или более.

Согласно некоторым вариантам осуществления введение терапевтически эффективного количества стабилизированной ковалентно связанной α-галактозидазы человека согласно настоящему изобретению улучшает по меньшей мере один параметр желудочно-кишечного тракта у субъектов. Согласно некоторым вариантам осуществления параметр желудочно-кишечного тракта включает в себя без ограничения боль в животе и/или частоту боли в животе. Согласно некоторым вариантам осуществления наблюдается ослабление частоты признаков и симптомов, связанных с желудочно-кишечным трактом. Согласно другим вариантам осуществления снижение параметров желудочно-кишечного тракта измеряют через 6 месяцев после начала лечения и/или сравнивают с состоянием до лечения.

Согласно конкретным вариантам осуществления желудочно-кишечные параметры, ассоциированные с болезнью Фабри, остаются на том же постоянном уровне, который измеряют через 2, 4, 6, 12 месяцев лечения или более.

Согласно некоторым вариантам осуществления введение терапевтически эффективного количества стабилизированной ковалентно связанной α-галактозидазы человека согласно настоящему изобретению улучшает/стабилизирует по меньшей мере один параметр сердца у субъектов. Параметры сердца включают в себя без ограничения компоненты ЭКГ, функцию сердца (например, фракцию выброса левого желудочка), аритмии, нарушение функции клапанов и гипертрофию сердца. Согласно другим вариантам осуществления параметры сердца представляют собой LVM и LVMI, измеренные с помощью МРТ. Улучшение/стабилизацию параметров сердца в ответ на внутривенное введение стабилизированной ковалентно связанной α-галактозидазы человека согласно настоящему изобретению в соответствии с некоторыми аспектами изобретения измеряют через 6 месяцев, 12 месяцев, 24 месяца лечения или более. Согласно другим вариантам осуществления снижение LVM или LVMI, измеренное посредством МРТ, измеряют через 6 месяцев после начала лечения и/или сравнивают со значениями до лечения.

Согласно конкретным вариантам осуществления параметры сердца остаются на постоянном уровне, измеряемом в начале лечения, через 6 месяцев, 12 месяцев, 24 месяцев лечения или более.

Согласно другим вариантам осуществления состояние болезни Фабри у пациента можно оценить с помощью индекса оценки степени тяжести Майнца (MSSI), который представляет собой инструмент для количественной оценки бремени болезни Фабри, совокупных признаков и симптомов заболевания. Таким образом, MSSI можно использовать для оценки состояния заболевания у пациентов, которых лечат с помощью белка альфа-галактозидазы и способов согласно настоящему изобретению. Таким образом, согласно некоторым вариантам осуществления введение терапевтически эффективного количества стабилизированной ковалентно связанной α-галактозидазы согласно настоящему изобретению поддерживает стабильный или улучшенный показатель MSSI у субъектов. Показатель MSSI в ответ на введение стабилизированной ковалентно связанной α-галактозидазы человека согласно настоящему изобретению в соответствии с некоторыми аспектами изобретения можно измерять через 6 месяцев, 12 месяцев, 24 месяца лечения или более. Согласно другим вариантам осуществления снижение MSSI измеряют через 6 месяцев после начала лечения и/или сравнивают с оценками до лечения.

Согласно другим конкретным вариантам осуществления состояние болезни Фабри у пациента, измеряемое с помощью MSSI, остается на постоянном уровне, измеряемом в начале лечения, через 6, 12, 24 месяцев лечения или более.

Согласно другому аспекту вариантов осуществления настоящего изобретения предусмотрена фармацевтическая композиция, которая содержит стабилизированную ковалентно связанную α-галактозидазу человека согласно настоящему изобретению, как описано в настоящем документе, и фармацевтически приемлемый носитель. Согласно некоторым вариантам осуществления стабилизированная ковалентно связанная α-галактозидаза человека согласно настоящему изобретению содержит стабилизированный ковалентно связанный растительный рекомбинантный белок альфа-галактозидазу человека.

Используемый в настоящем документе "фармацевтическая композиция" относится к препарату одного или нескольких из стабилизированного ковалентно связанного белка α-галактозидазы человека согласно настоящему изобретению, описанного в настоящем документе, с другими химическими компонентами, такие как фармацевтически приемлемые и подходящие носители и вспомогательные вещества. Целью фармацевтической композиции является облегчение введения соединения в организм.

В настоящем документе далее термин "фармацевтически приемлемый носитель" относится к носителю или разбавителю, который не вызывает значительного раздражения организма и не отменяет биологическую активность и свойства вводимого соединения. Примерами носителей без ограничений являются: пропиленгликоль, физиологический раствор, эмульсии и смеси органических растворителей с водой, а также твердые (например, порошкообразные) и газообразные носители.

В настоящем документе термин "вспомогательное вещество" относится к инертному веществу, добавленному в фармацевтическую композицию для дополнительного облегчения введения соединения. Примеры без ограничения вспомогательных веществ включают в себя карбонат кальция, фосфат кальция, различные сахара и типы крахмала, производные целлюлозы, желатин, растительные масла и полиэтиленгликоли.

Фармацевтическая композиция необязательно содержит дополнительный ингредиент, который дополнительно стабилизирует α-галактозидазу стабилизированной ковалентно связанной α-галактозидазы человека согласно настоящему изобретению. Необязательно, дополнительный ингредиент представляет собой галактозу.

Альтернативно, производное галактозы (например, галактозосодержащий гликозид) можно использовать вместо галактозы. Необязательно, используют невосстанавливающее производное галактозы.

Техники получение составов и введения лекарственных средств можно найти в издании "Remington's Pharmaceutical Sciences", Mack Publishing Co., Easton, PA, последнее издание, которое включено в настоящий документ посредством ссылки.

Фармацевтические композиции согласно настоящему изобретению можно изготовить способами, хорошо известными в настоящей области техники, например, с помощью общепринятых способов смешивания, растворения, гранулирования, изготовления драже, растирания в порошок, эмульгирования, инкапсулирования, захвата или лиофилизации.

Таким образом, фармацевтические композиции для применения согласно настоящему изобретению можно составить общепринятым способом с использованием одного или нескольких фармацевтически приемлемых носителей, содержащих вспомогательные вещества и вспомогательные средства, которые облегчают обработку стабилизированной ковалентно связанной α-галактозидазы человека согласно настоящему изобретению в препараты, которые можно использовать фармацевтически. Правильный состав зависит от выбранного пути введения.

Для инъекции или инфузии стабилизированную ковалентно связанную α-галактозидазу человека согласно настоящему изобретению можно составить в водных растворах, предпочтительно в физиологически совместимых буферах, таких как раствор Хенкса, раствор Рингера или физиологический солевой буфер с или без органических растворителей, таких как пропиленгликоль, полиэтиленгликоль.

Стабилизированную ковалентно связанную α-галактозидазу человека согласно настоящему изобретению можно составить как часть водной жидкой суспензии или раствора для внутривенного введения.

Описанную в настоящем документе стабилизированную ковалентно связанную α-галактозидазу человека согласно настоящему изобретению можно составить для парентерального введения, например, путем болюсной инъекции или непрерывной инфузии. Составы для инъекции или инфузии могут быть представлены в единичной лекарственной форме, например, в ампулах или в многодозовых контейнерах с необязательно добавленным консервантом. Композиции могут представлять собой суспензии, растворы или эмульсии в масляных или водных носителях и могут содержать вспомогательные средства, такие как суспендирующие, стабилизирующие и/или диспергирующие средства.

Фармацевтические композиции для парентерального введения включают в себя водные растворы стабилизированной ковалентно связанной α-галактозидазы человека согласно настоящему изобретению в водорастворимой форме. Кроме того, суспензии стабилизированной ковалентно связанной α-галактозидазы человека согласно настоящему изобретению можно приготовить в виде подходящих масляных инъекционных суспензий и эмульсий (например, эмульсий вода-в-масле, масло-в-воде или вода-в-масле в масле). Подходящие липофильные растворители или носители включают в себя жирные масла, такие как кунжутное масло, или синтетические сложные эфиры жирных кислот, такие как этилолеат, триглицериды или липосомы. Водные инъекционные суспензии могут содержать вещества, которые увеличивают вязкость суспензии, такие как натрийкарбоксиметилцеллюлоза, сорбит или декстран. Необязательно, суспензия также может содержать подходящие стабилизаторы или средства, которые увеличивают растворимость стабилизированной ковалентно связанной α-галактозидазы человека согласно настоящему изобретению, что позволяет получать высококонцентрированные растворы.

Составы согласно настоящему изобретению можно использовать со способами, описанными в настоящем документе, или с другими способами лечения болезни Фабри. Составы стабилизированной ковалентно связанной α-галактозидазы человека согласно настоящему изобретению можно дополнительно разбавить перед введением субъекту. Согласно некоторым вариантам осуществления составы разбавляют физиологическим раствором и хранят в пакетах для внутривенного введения или шприцах перед введением субъекту.

Согласно типичным вариантам осуществления стабилизированную ковалентно связанную α-галактозидазу человека согласно настоящему изобретению составляют в соответствии с обычными процедурами в виде фармацевтической композиции, адаптированной для внутривенного введения людям. Как правило, композиции для внутривенного введения представляют собой растворы в стерильном изотоническом водном буфере. Там, где это необходимо, фармацевтическое средство может также включать в себя солюбилизирующее средство и местный анестетик, такой как лигнокаин, для облегчения боли в месте инъекции. Как правило, ингредиенты поставляют либо по отдельности, либо в смешанном виде в единичной лекарственной форме, например, в виде сухого лиофилизированного порошка или безводного концентрата в герметически закрытом контейнере, таком как ампула или саше, с указанием количества активного средства. Если фармацевтическое средство подлежит введению путем инфузии, его можно отпускать, например, в инфузионном флаконе, содержащем стерильную воду или физиологический раствор фармацевтического качества. Если фармацевтическое средство вводят с помощью инъекции, может быть предусмотрена, например, ампула со стерильной водой для инъекций или физиологическим раствором, так чтобы ингредиенты можно было смешать перед введением.

Альтернативно, стабилизированная ковалентно связанная α-галактозидаза человека согласно настоящему изобретению может находиться в форме порошка для разведения с помощью подходящей несущей среды, например, стерильной, апирогенной воды, перед применением.

Описанные в настоящем документе фармацевтические композиции также могут содержать подходящие носители или вспомогательные вещества в твердой фазе или гель-фазе. Примеры таких носителей или вспомогательных веществ включают в себя без ограничения карбонат кальция, фосфат кальция, различные сахара, крахмалы, производные целлюлозы, желатин и полимеры, такие как полиэтиленгликоли.

Фармацевтические композиции, подходящие для применения в контексте настоящего изобретения, включают в себя композиции, в которых активные ингредиенты содержатся в количестве, эффективном для достижения предусмотренной цели. Более конкретно, терапевтически эффективное количество означает количество стабилизированной ковалентно связанной α-галактозидазы человека согласно настоящему изобретению, эффективное для предотвращения, облегчения или ослабления симптомов заболевания, улучшения качества жизни или продления выживаемости субъекта, которого лечат.

Для любой стабилизированной ковалентно связанной α-галактозидазы человека, используемой в способах согласно настоящему изобретению, терапевтически эффективное количество или дозу можно первоначально оценить из анализов активности на животных. Например, дозу можно составить на моделях с использованием животных для достижения диапазона циркулирующих концентраций, который включает в себя IC₅₀, что определяют с помощью анализов активности (например, концентрация исследуемого стабилизированного ковалентно связанного белка α-галактозидазы человека, которая достигает полумаксимального увеличения в биологической активности стабилизированного ковалентно связанного белка α-галактозидазы человека). Такую информацию можно использовать для более точного определения применимых доз для людей.

Как показано в следующем разделе «Примеры», терапевтически эффективное количество стабилизированной ковалентно связанной α-галактозидазы человека согласно вариантам осуществления настоящего изобретения может находиться в диапазоне от 0,1 мг/кг массы тела до приблизительно 5,0 мг/кг массы тела. Согласно некоторым вариантам осуществления терапевтически эффективное количество для стабилизированной ковалентно связанной α-галактозидазы человека согласно настоящему изобретению может являться любым из 0,1, 0,2, 0,5, 0,75, 1,0, 1,25, 1,50, 1,75, 2,0, 2,25, 2,5, 2,75, 3,0 3,25, 3,50, 3,75, 4,0, 4,25, 4,50, 4,75 или 5,00 мг/кг массы тела. Согласно конкретным вариантам осуществления терапевтически эффективное количество стабилизированной ковалентно связанной α-галактозидазы человека согласно настоящему изобретению составляет 1,0 мг/кг массы тела. Согласно другим конкретным вариантам осуществления терапевтически эффективное количество для стабилизированной ковалентно связанной α-галактозидазы человека согласно настоящему изобретению составляет 2,0 мг/кг массы тела. Согласно другим конкретным вариантам осуществления терапевтически эффективное количество для стабилизированной ковалентно связанной α-галактозидазы человека согласно настоящему изобретению составляет 5,0 мг/кг массы тела. В целом, токсичность и терапевтическую эффективность стабилизированной ковалентно связанной α-галактозидазы человека согласно настоящему изобретению, описанной в настоящем документе, можно определить с помощью стандартных фармацевтических процедур на экспериментальных животных, например, путем определения ЕС₅₀, IC₅₀ и LD₅₀ (летальная доза, вызывающая смерть в 50% испытуемых животных) для исследуемой белковой структуры. Данные, полученные из этих анализов активности и исследований на животных, можно использовать при составлении диапазона доз для применения на людях.

Дозировка может варьироваться в зависимости от используемой лекарственной формы и используемого пути введения. Точный состав, путь введения и дозировка могут быть выбраны лечащим врачом с учетом состояния пациента. (См., например, Fingl et al., 1975, в "The Pharmacological Basis of Therapeutics", гл. 1, стр. 1).

Количество дозировки и интервал между введениями доз можно регулировать индивидуально для обеспечения содержаний активного компонента в плазме, которые являются достаточными для поддержания требуемых эффектов. Согласно некоторым вариантам осуществления стабилизированную ковалентно связанную α-галактозидазу человека согласно настоящему изобретению вводят путем внутривенной инфузии со скоростью, составляющей 20-200 мл/час. Согласно конкретным вариантам осуществления, например, стабилизированную ковалентно связанную α-галактозидазу человека согласно настоящему изобретению доставляют в общем объеме, составляющем 150 мл, и для дозировок, составляющих меньше чем 2,0 мг/мл, скорость инфузии может составлять 37,5 или 75 мл/час для пациентов с массой тела меньше чем 75 кг и 25,2 мл/час для пациентов с массой тела больше чем 75 кг. Согласно другим вариантам осуществления стабилизированную ковалентно связанную α-галактозидазу человека согласно настоящему изобретению доставляют в общем объеме, составляющем 350 мл, и для дозировок, составляющих 2,0 мг/кг массы тела, скорость инфузии может составлять 58,2 мл/час для пациентов с массой тела меньше чем 90 кг, с индивидуально определенными скоростями инфузии для пациентов с массой тела больше чем 90 кг. Согласно другим вариантам осуществления стабилизированную ковалентно связанную α-галактозидазу человека согласно настоящему изобретению доставляют в объеме 150 мл, например, пациентам с массой тела вплоть до 70 кг, в общем объеме 250 мл, например, пациентам с массой тела от 70 до 100 кг и общим объемом 500 мл на одну инфузию, например, для пациентов с массой тела больше чем 100 кг, со скоростью 0,83 мл/мин (50 мл/час) для 150 мл инфузии, 1,38 мл/мин (82,2 мл/час) для 250 мл инфузии и 2,78 мл/мин (167 мл/час) для 500 мл инфузии.

Время инфузии можно изменить после наблюдения в отношении толерантности пациентов к лечению. Согласно некоторым вариантам осуществления время инфузии можно постепенно уменьшить до 1,5 часов на основании оценки врача, осуществляющего введение.

Согласно некоторым вариантам осуществления время инфузии может составлять вплоть до 8 часов от начала до завершения требуемой дозировки стабилизированной ковалентно связанной α-галактозидазы человека согласно настоящему изобретению. Согласно некоторым вариантам осуществления время инфузии составляет 1, 2, 3, 4,5, 5, 6, 7 или 8 часов. В некоторых случаях время инфузии может превышать 8 часов в соответствии с индивидуальными обстоятельствами и потребностями отдельных субъектов.

Согласно некоторым вариантам осуществления (например, когда дозировка стабилизированной ковалентно связанной α-галактозидазы человека согласно настоящему изобретению составляет 2,0 мг/кг) внутривенные инфузии можно вводить вместе с протоколом премедикации, включая в себя без ограничения блокатор H1 (дифенгидрамин, гидроксизин, цетризин, лоратадин, дезлоратидин) и блокатор Н2 (ранитидин, циметидин, фамотидин) в стандартных дозах за 12 часов и/или за 2 часа до начала инфузии.

Удивительно, что при введении пациентам с болезнью Фабри стабилизированная ковалентно связанная α-галактозидаза человека согласно настоящему изобретению проявляла превосходную расширенную биодоступность (см. примеры III-V в настоящем документе ниже) по сравнению с общепринятыми доступными препаратами альфа-галактозидазы, используемыми в ERT болезни Фабри. Таким образом, стабилизированная ковалентно связанная α-галактозидаза человека согласно настоящему изобретению будет обладать пролонгированной биодоступностью не только в течение продемонстрированного 2-недельного периода после введения, но вплоть до 3-й и 4-й недель после внутривенного введения.

Таким образом, согласно конкретным вариантам осуществления стабилизированную ковалентно связанную α-галактозидазу человека согласно настоящему изобретению вводят внутривенно в виде инфузии с интервалами между введением доз, составляющими больше чем две недели (14 дней ± 3 дня). Согласно некоторым вариантам осуществления стабилизированную ковалентно связанную α-галактозидазу человека согласно настоящему изобретению вводят внутривенно в виде инфузии с интервалами между введением доз, составляющими больше чем две недели (14 дней ± 3 дня) - вплоть до четырех недель (28 дней ± 3 дня). Согласно некоторым вариантам осуществления интервал может представлять собой любой из следующего: 15 дней, 16 дней, 17 дней, 18 дней, 19 дней, 20 дней, 21 день (3 недели), 22 дня, 23 дня, 24 дня, 25 дней, 26 дней, 27 дней или 28 дней (4 недели), 29 дней, 30 дней, 31 день (месяц), 32 дня, 33 дня, 34 дня, 35 дней (5 недель), 36 дней, 37 дней, 38 дней, 39 дней, 41 день, 42 дня (6 недель), 43 дня, 44 дня, 45 дней, 46 дней, 47 дней, 48 дней, 49 дней (7 недель), 50 дней, 51 день, 52 дня, 53 дня, 54 дня, 55 дней или 56 дней (8 недель). Согласно некоторым вариантам осуществления стабилизированную ковалентно связанную α-галактозидазу человека согласно настоящему изобретению вводят внутривенно в виде инфузии с интервалами между введением доз, составляющими больше чем две недели (14 дней ± 3 дня) - вплоть до восьми недель (56 дней ± 3 дня). Согласно некоторым вариантам осуществления стабилизированную ковалентно связанную α-галактозидазу человека согласно настоящему изобретению вводят внутривенно в виде инфузии с интервалами между введением доз, составляющими 17 дней - 8 недель, 17 дней - 6 недель, 17 дней - 5 недель, 3 недели - 6 недель, 3 недели - 5 недель, 3 недели - 4 недели, 4 недели - 6 недель или 4 недели - 5 недель. Согласно конкретным вариантам осуществления стабилизированную ковалентно связанную α-галактозидазу человека согласно настоящему изобретению вводят внутривенно с интервалами в диапазоне, составляющем один раз в 6 недель ±3 дня. Согласно другим вариантам осуществления интервал составляет один раз в 6 недель. Согласно конкретным вариантам осуществления стабилизированную ковалентно связанную α-галактозидазу человека согласно настоящему изобретению вводят внутривенно с интервалами в диапазоне, составляющем один раз в 5 недель ±3 дня. Согласно другим вариантам осуществления интервал составляет один раз в 5 недель. Согласно конкретным вариантам осуществления стабилизированную ковалентно связанную α-галактозидазу человека согласно настоящему изобретению вводят внутривенно с интервалами в диапазоне, составляющем один раз в 4 недели ±3 дня (например, каждый месяц). Согласно другим вариантам осуществления интервал составляет один раз в 4 недели. Согласно одному варианту осуществления стабилизированную ковалентно связанную α-галактозидазу человека согласно настоящему изобретению вводят с интервалами, составляющими три недели ±3 дня между введениями.

Согласно другому варианту осуществления стабилизированную ковалентно связанную α-галактозидазу человека согласно настоящему изобретению вводят с интервалами, составляющими три недели между введениями. Согласно другим вариантам осуществления стабилизированную ковалентно связанную α-галактозидазу человека согласно настоящему изобретению вводят в дозировке, составляющей 1,0 мг/кг массы тела, с интервалами, составляющими три недели между введениями. Согласно другим вариантам осуществления стабилизированную ковалентно связанную α-галактозидазу человека согласно настоящему изобретению вводят в дозировке, составляющей 2,0 мг/кг массы тела, с интервалами, составляющими три недели между введениями. Согласно другим вариантам осуществления стабилизированную ковалентно связанную α-галактозидазу человека согласно настоящему изобретению вводят в дозировке, составляющей 1,0 мг/кг массы тела, с интервалами, составляющими 4 недели между введениями. Согласно другим вариантам осуществления стабилизированную ковалентно связанную α-галактозидазу человека согласно настоящему изобретению вводят в дозировке, составляющей 2,0 мг/кг массы тела, с интервалами, составляющими 4 недели между введениями.

Для облегчения введения стабилизированной ковалентно связанной α-галактозидазы человека согласно настоящему изобретению в соответствии со способом (например, схемой) согласно настоящему изобретению, стабилизированная ковалентно связанная α-галактозидаза человека согласно настоящему изобретению может быть предоставлена в виде единичной лекарственной формы, составленной для внутривенного введения или в виде фармацевтической композиции, составленной для внутривенного введения (инфузии).

Таким образом, согласно аспекту настоящего изобретения предусмотрена единичная лекарственная форма, содержащая 2,0-500 мг стабилизированной ковалентно связанной α-галактозидазы человека согласно настоящему изобретению, составленная для введения человеку-субъекту. Следует понимать, что этот диапазон предназначен для минимальной дозы, вводимой с интервалами, составляющими больше чем 2 недели - вплоть до 4 недель, до максимальной дозы, вводимой с интервалами, составляющими больше чем 2 недели - вплоть до 4 недель, у пациентов с массой тела от 10 до 250 кг.

Согласно варианту осуществления единичная лекарственная форма содержит 2,0-500 мг стабилизированной ковалентно связанной α-галактозидазы человека согласно настоящему изобретению, составленной для введения человеку-субъекту.

Согласно варианту осуществления единичная лекарственная форма содержит 5,0-470 мг стабилизированной ковалентно связанной α-галактозидазы человека согласно настоящему изобретению, составленной для введения человеку-субъекту.

Согласно варианту осуществления единичная лекарственная форма содержит 10,0-450 мг стабилизированной ковалентно связанной α-галактозидазы человека согласно настоящему изобретению, составленной для введения человеку-субъекту.

Согласно варианту осуществления единичная лекарственная форма содержит 17,0-425 мг стабилизированной ковалентно связанной α-галактозидазы человека согласно настоящему изобретению, составленной для введения человеку-субъекту.

Согласно варианту осуществления единичная лекарственная форма содержит 21,0-400 мг стабилизированной ковалентно связанной α-галактозидазы человека согласно настоящему изобретению, составленной для введения человеку-субъекту.

Согласно варианту осуществления единичная лекарственная форма содержит 35,0-370 мг стабилизированной ковалентно связанной α-галактозидазы человека согласно настоящему изобретению, составленной для введения человеку-субъекту.

Согласно варианту осуществления единичная лекарственная форма содержит 55,0-340 мг стабилизированной ковалентно связанной α-галактозидазы человека согласно настоящему изобретению, составленной для введения человеку-субъекту.

Согласно варианту осуществления единичная лекарственная форма содержит 75,0-300 мг стабилизированной ковалентно связанной α-галактозидазы человека согласно настоящему изобретению, составленной для введения человеку-субъекту.

Согласно варианту осуществления единичная лекарственная форма содержит 90,0-270 мг стабилизированной ковалентно связанной α-галактозидазы человека согласно настоящему изобретению, составленной для введения человеку-субъекту.

Согласно варианту осуществления единичная лекарственная форма содержит 100,0-225 мг стабилизированной ковалентно связанной α-галактозидазы человека согласно настоящему изобретению, составленной для введения человеку-субъекту.

Согласно варианту осуществления единичная лекарственная форма содержит 100,0-200 мг стабилизированной ковалентно связанной α-галактозидазы человека согласно настоящему изобретению, составленной для введения человеку-субъекту.

Согласно варианту осуществления единичная лекарственная форма содержит 110,0-190 мг стабилизированной ковалентно связанной α-галактозидазы человека согласно настоящему изобретению, составленной для введения человеку-субъекту.

Согласно варианту осуществления единичная лекарственная форма содержит 120,0-175 мг стабилизированной ковалентно связанной α-галактозидазы человека согласно настоящему изобретению, составленной для введения человеку-субъекту.

Согласно варианту осуществления единичная лекарственная форма содержит 130,0-150 мг стабилизированной ковалентно связанной α-галактозидазы человека согласно настоящему изобретению, составленной для введения человеку-субъекту.

Согласно варианту осуществления единичная лекарственная форма содержит 10,0 мг стабилизированной ковалентно связанной α-галактозидазы человека согласно настоящему изобретению, составленной для введения человеку-субъекту.

Согласно варианту осуществления единичная лекарственная форма содержит 30,0 мг стабилизированной ковалентно связанной α-галактозидазы человека согласно настоящему изобретению, составленной для введения человеку-субъекту.

Согласно варианту осуществления единичная лекарственная форма содержит 50,0 мг стабилизированной ковалентно связанной α-галактозидазы человека согласно настоящему изобретению, составленной для введения человеку-субъекту.

Согласно варианту осуществления единичная лекарственная форма содержит 75,0 мг стабилизированной ковалентно связанной α-галактозидазы человека согласно настоящему изобретению, составленной для введения человеку-субъекту.

Согласно варианту осуществления единичная лекарственная форма содержит 100,0 мг стабилизированной ковалентно связанной α-галактозидазы человека согласно настоящему изобретению, составленной для введения человеку-субъекту.

Согласно варианту осуществления единичная лекарственная форма содержит 125,0 мг стабилизированной ковалентно связанной α-галактозидазы человека согласно настоящему изобретению, составленной для введения человеку-субъекту.

Согласно варианту осуществления единичная лекарственная форма содержит 150,0 мг стабилизированного поперечно сшитого растительного рекомбинантного белка альфа-галактозидазы человека, составленного для введения человеку-субъекту.

Согласно варианту осуществления единичная лекарственная форма содержит 175,0 мг стабилизированной ковалентно связанной α-галактозидазы человека согласно настоящему изобретению, составленной для введения человеку-субъекту.

Согласно варианту осуществления единичная лекарственная форма содержит 200,0 мг стабилизированной ковалентно связанной α-галактозидазы человека согласно настоящему изобретению, составленной для введения человеку-субъекту.

Согласно варианту осуществления единичная лекарственная форма содержит 250,0 мг стабилизированной ковалентно связанной α-галактозидазы человека согласно настоящему изобретению, составленной для введения человеку-субъекту.

Согласно варианту осуществления единичная лекарственная форма содержит 300,0 мг стабилизированной ковалентно связанной α-галактозидазы человека согласно настоящему изобретению, составленной для введения человеку-субъекту.

Согласно варианту осуществления единичная лекарственная форма содержит 350,0 мг стабилизированной ковалентно связанной α-галактозидазы человека согласно настоящему изобретению, составленной для введения человеку-субъекту.

Согласно варианту осуществления единичная лекарственная форма содержит 400,0 мг стабилизированной ковалентно связанной α-галактозидазы человека согласно настоящему изобретению, составленной для введения человеку-субъекту.

Согласно варианту осуществления единичная лекарственная форма содержит 430,0 мг стабилизированной ковалентно связанной α-галактозидазы человека согласно настоящему изобретению, составленной для введения человеку-субъекту.

Согласно варианту осуществления единичная лекарственная форма содержит 480,0 мг стабилизированной ковалентно связанной α-галактозидазы человека согласно настоящему изобретению, составленной для введения человеку-субъекту.

Согласно варианту осуществления единичная лекарственная форма содержит 500,0 мг стабилизированной ковалентно связанной α-галактозидазы человека согласно настоящему изобретению, составленной для введения человеку-субъекту.

Способ лечения болезни Фабри у субъекта-человека в соответствии с настоящим изобретением можно предусмотреть в качестве самостоятельного лечения болезни Фабри или можно комбинировать с дополнительными вариантами лечения, традиционными или нетрадиционными видами лечения. Пациенты с болезнью Фабри, подходящие для лечения с помощью способа или стабилизированной ковалентно связанной α-галактозидазой человека согласно настоящему изобретению, могут также получать до, во время или после лечения с помощью способа или белка согласно настоящему изобретению, например, лечение с помощью не относящегося к ERT терапевтического средства, такого как без ограничения: мигаластат гидрохлорид (Chaperone Amicus Therapeutics), ибиглустат (INN) (ингибитор глюкозилцерамидсинтазы (GCS)) (Genzyme Corp), луцерастат (INN) - производное пиперадина (Actelion Ltd), NP-003 (ингибитор гликопротеина-1 (MDR-1 или АВСВ1)) (Neuraltus Pharmaceuticals, Inc), SBLSD-4- (генная терапия (редактирование генов in vivo) - Sangamo BioSciences, Inc.), Genz-78132 (ингибитор глюкозилцерамидсинтазы (GCS)) (Genzyme Corporation), миглустат (ингибитор глюкозилцерамидсинтазы (GCS) GlaxoSmithKline Plc и Actelion Ltd).

Пациенты с болезнью Фабри, подходящие для лечения с помощью способа или стабилизированной ковалентно связанной α-галактозидазой человека согласно настоящему изобретению, могут также получать до или после лечения с помощью способа или стабилизированной ковалентно связанной α-галактозидазой человека согласно настоящему изобретению лечение с помощью относящихся к ERT терапевтических средств и схем лечения, таких как без ограничения Fabrazyme® и Replagal® или пегунигалсидаза альфа по общепринятой схеме.

Популяции пациентов, подходящие для лечения с помощью способа или белка согласно настоящему изобретению, включают в себя пациентов с болезнью Фабри всех возрастов, как мужчин, так и женщин, и пациентов с болезнью Фабри с тяжелыми симптомами или без них, медленно прогрессирующих пациентов, рано диагностированных, а также пациентов с установленной болезнью Фабри, молодых пациентов и пациентов с устойчивой болезнью Фабри.

Используемый в настоящем документе термин "устойчивые" пациенты с болезнью Фабри относится к пациентам с болезнью Фабри, которые поддерживают уровень по меньшей мере одного из параметров болезни Фабри в течение заранее определенного периода времени и/или поддерживают сходную скорость ухудшения этого параметра (например, сердечного, почечного параметра [такого как снижение рСКФ], параметра боли, параметра желудочно-кишечного тракта и биомаркеров [таких как Gb3 и лизо-Gb3 в плазме или моче] и тому подобное). Согласно некоторым вариантам осуществления устойчивые пациенты с болезнью Фабри могут включать в себя пациентов из популяций, содержащих вновь диагностированных пациентов с болезнью Фабри с легкой и средней степенью тяжести симптомов, ранее не получавших лечение пациентов и пациентов, ранее лечившихся от болезни Фабри. Согласно некоторым вариантам осуществления устойчивые пациенты с болезнью Фабри включают в себя пациентов, которые были устойчивы до начала лечения с помощью способов и/или композиций согласно настоящему изобретению.

Количество композиции, подлежащей введению, будет, конечно, зависеть от субъекта, подлежащего лечению, тяжести поражения, способа введения, решения врача, назначающего лечение и т.д.

Композиции согласно настоящему изобретению могут, при желании, быть представлены в упаковке или дозирующем устройстве, таком как набор, одобренный FDA/EMA (Управление США по контролю за качеством пищевых продуктов и лекарственных средств/Европейское агентство по лекарственным средствам), который может содержать одну или несколько единичных лекарственных форм, содержащих активный компонент. Упаковка может, например, содержать металлическую или пластиковую фольгу, такую как без ограничения блистерная упаковка или герметизированный контейнер. Упаковка или дозирующее устройство могут сопровождаться инструкциями по применению. Упаковка или дозатор также могут сопровождаться уведомлением, связанным с контейнером, в форме, предписанной государственным органом, регулирующим производство, использование или продажу фармацевтических препаратов, причем это уведомление отражает одобрение агентством формы композиций для введения людям или ветеринарного применения. Такое уведомление, например, может представлять собой этикетку, одобренную Управлением США по контролю за качеством пищевых продуктов и лекарственных средств для отпускаемых по рецепту лекарственных средств, или утвержденный вкладыш продукта, или ЕМА, или любым другим регулирующим органом. Композиции, содержащие белковую структуру согласно вариантам осуществления настоящего изобретения, составленные в совместимом фармацевтическом носителе, также могут быть получены, помещены в соответствующий контейнер и маркированы для лечения указанного состояния или диагноза, как подробно описано в настоящем документе.

Таким образом, согласно варианту осуществления настоящего изобретения, в зависимости от выбранной стабилизированной ковалентно связанной α-галактозидазы человека согласно настоящему изобретению, фармацевтическая композиция, описанная в настоящем документе, упакована в упаковочный материал и идентифицирована в печатном виде, в или на упаковочном материале, для применения в лечении состояния, при котором активность поперечно сшитой белковой структуры является полезной, как описано в настоящем документе выше.

Согласно некоторым вариантам осуществления упаковочный материал, упаковка или дозатор, набор или контейнер могут содержать или сопровождаться инструкциями по введению стабилизированной ковалентно связанной α-галактозидазы человека или композиций, содержащих ее, нуждающемуся в этом субъекту. Согласно некоторым вариантам осуществления инструкции по введению могут быть включены в этикетку, прикрепленную к контейнерам и/или флаконам, содержащим стабилизированную ковалентно связанную α-галактозидазу человека или содержащие ее композиции согласно настоящему изобретению.

Инструкции по применению и введению могут включать в себя, среди прочего, конкретные показания (например, болезнь Фабри), инструкции по приготовлению стабилизированной ковалентно связанной α-галактозидазы человека или содержащих ее композиций согласно настоящему изобретению для введения, подробности по введению стабилизированной ковалентно связанной α-галактозидазы человека или композиции согласно настоящему изобретению и протокол после введения, а также подробности, касающиеся дозировки и схемы лечения с помощью стабилизированной ковалентно связанной α-галактозидазой человека или содержащих ее композиций согласно настоящему изобретению. Согласно конкретным вариантам осуществления инструкции могут включать в себя инструкции для внутривенного введения стабилизированной ковалентно связанной α-галактозидазы человека согласно настоящему изобретению в виде инфузии с интервалами между введением доз, составляющими больше чем две недели (14 дней ± 3 дня), один раз в три недели, или один раз в 4 недели ±3 дня (например, ежемесячно). Согласно другим вариантам осуществления инструкции включают в себя инструкции по введению с интервалом между введением доз, составляющим один раз в 4 недели. Согласно дополнительному варианту осуществления инструкции включают в себя инструкции по введению стабилизированной ковалентно связанной α-галактозидазы человека согласно настоящему изобретению с интервалами, составляющими три недели ±3 дня между введениями.

Используемый в настоящем документе термин "приблизительно" относится к ±10%.

Термины "содержит", "содержащий", "включает в себя", "включая в себя", "характеризующийся" и их родственные по корню и значению слова означают "включая в себя без ограничения".

Термин "состоящий из" означает "включающий в себя и ограниченный этим".

Слово "иллюстративный" используют в настоящем документе для обозначения "служащий в качестве примера или иллюстрации". Любой вариант осуществления, описанный как "иллюстративный" не обязательно должен истолковываться как предпочтительный или преимущественный по сравнению с другими вариантами осуществления и/или исключать включение признаков из других вариантов осуществления.

Слово "необязательно" используют в настоящем документе для обозначения "предусмотрен в некоторых вариантах осуществления и не предусмотрен в других вариантах осуществления". Любой конкретный вариант осуществления настоящего изобретения может включать в себя множество "необязательных" признаков, если такие признаки не конфликтуют.

Используемые в настоящем документе формы единственного числа включают в себя ссылку на формы во множественном числе, если контекст явно не предписывает иное. Например, термин "соединение" или "по меньшей мере одно соединение" может включать в себя множество соединений, включая в себя их смеси.

В настоящей заявке различные варианты осуществления настоящего изобретения могут быть представлены в формате диапазона. Следует понимать, что описание в формате диапазона предназначено только для удобства и краткости и не должно рассматриваться как негибкое ограничение объема настоящего изобретения. Соответственно, следует считать, что описание диапазона конкретно раскрывает все возможные поддиапазоны, а также отдельные числовые значения в пределах этого диапазона. Например, описание диапазона, такого как от 1 до 6, должно рассматриваться как конкретно раскрытые такие поддиапазоны, как от 1 до 3, от 1 до 4, от 1 до 5, от 2 до 4, от 2 до 6, от 3 до 6 и т.д., а также отдельные числа в этом диапазоне, например, 1, 2, 3, 4, 5 и 6. Это применимо независимо от ширины диапазона.

Всякий раз, когда в настоящем документе указан числовой диапазон, это подразумевает включение любого цитируемого числа (дробного или целого) в указанный диапазон. Фразы "диапазон/диапазоны между" первым указанным числом и вторым указанным числом и "диапазон/диапазоны от" первого указанного числа "до" второго указанного числа используются в настоящем документе взаимозаменяемо, и они предназначены для включения первого и второго указанных чисел и всех дробных и целых чисел между ними.

Используемый в настоящем документе термин "способ" относится к способам, средствам, техникам и процедурам для выполнения данной задачи, включая в себя без ограничения те способы, средства, техники и процедуры, которые являются известными или которые могут легко разработать на основании известных способов, средств, техник и процедур специалисты-практики в химической, фармакологической, биологической, биохимической и медицинской областях техники.

Используемый в настоящем документе термин "лечение" включает в себя отмену, существенное ингибирование, замедление или обращение вспять прогрессирования состояния, существенное ослабление клинических или эстетических симптомов состояния или существенное предотвращение появления клинических или эстетических симптомов состояния.

Следует понимать, что определенные признаки настоящего изобретения, которые для ясности описаны в контексте отдельных вариантов осуществления, также могут быть предусмотрены в комбинации в одном варианте осуществления. И наоборот, различные признаки настоящего изобретения, которые для краткости описаны в контексте одного варианта осуществления, также могут быть предусмотрены отдельно или в любой подходящей субкомбинации или, в зависимости от ситуации, в любом другом описанном варианте осуществления настоящего изобретения. Определенные признаки, описанные в контексте различных вариантов осуществления, не должны рассматриваться как существенные признаки этих вариантов осуществления, если только вариант осуществления не работает без этих элементов.

Различные варианты осуществления и аспекты настоящего изобретения, описанные в настоящем документе выше и заявленные в разделе формулы изобретения ниже, находят экспериментальную поддержку в следующих примерах.

ПРИМЕРЫ

Теперь приведена ссылка на следующие примеры, которые вместе с приведенными выше описаниями иллюстрируют некоторые варианты осуществления настоящего изобретения неограничивающим образом.

Пример I

Протокол клинических испытаний: фаза 1/2, открытое исследование с целью определения оптимальной дозы для оценки безопасности, переносимости, фармакокинетики и поисковых параметров эффективности пегунигалсидазы альфа, вводимой с помощью внутривенной инфузии каждые 2 недели взрослым пациентам с болезнью Фабри

В этом исследовании оценивают безопасность, переносимость, фармакокинетику и поисковую эффективность растительной рекомбинантной α-галактозидазы человека, поперечно сшитой с помощью бис-NHS-PEG₄₅ (prh-alfa-GAL-I-CL45) (пегунигалсидаза альфа) в целевой популяции. Субъекты должны были иметь точный диагноз болезни Фабри, основанный на активности альфа-GAL-A (мужчины) или генетическом тестировании (женщины) с проявлениями заболевания, и не должны были проходить лечение ERT в последние 6 месяцев. Параметры, выбранные в качестве конечных точек, представляли собой параметры, наиболее релевантные для заболевания и позволяющие проводить значимую и актуальную оценку конечных точек безопасности, фармакокинетики и эффективности. Изучение трех уровней доз предоставило важную информацию о трех уровнях доз в отношении безопасности, переносимости и клинического результата.

Отбор исследуемой популяции

Критерии включения:

1. Проявляющие симптомы взрослые пациенты с болезнью Фабри (≥18 лет, мужчины и женщины)

2. Мужчины: активность альфа-галактозидазы в плазме и/или лейкоцитах (с помощью анализа активности) ниже нижнего предела нормы (LLN в плазме = 3,2 нмоль/ч/мл, LLN в лейкоцитах = 32 нмоль/ч/мг/белок)

3. Женщины: результаты ретроспективных генетических тестов, согласующиеся с мутациями Фабри

4. Концентрация глоботриаозилцерамида (Gb3) в моче больше чем в 1,5 раза выше нормального диапазона значений

5. Пациенты, которые никогда не получали ферментозаместительную терапию (ERT) в прошлом, или пациенты, которые не получали ERT в течение последних 6 месяцев и имеют отрицательный тест на антитела к пегунигалсидазе альфа

6. рСКФ≥60 мл/мин/1,73 м²

7. Подписание информированного согласия

8. Пациенты женского пола и пациенты мужского пола, чьи партнеры детородного возраста согласились использовать приемлемый с медицинской точки зрения метод контрацепции, не включая в себя календарный метод

Критерии исключения

Наличие любого из следующих исключало зачисление субъекта:

1. Участие в любом испытании исследуемого лекарственного средства в течение 30 дней до фазы скрининга исследования

2. Лечение любым из Fabrazyme® (агалсидаза-бета), Replagal® (агалсидаза-альфа) или любым другим исследуемым лекарственным средством для лечения болезни Фабри

3. Хроническая почечная недостаточность стадий 3-5 (CKD 3-5)

4. Диализ или трансплантация почки в анамнезе

5. Начата терапия ингибитором ангиотензинпревращающего фермента (АСЕ) или блокатором ангиотензиновых рецепторов (ARB) или изменена доза за 4 недели до скрининга

6. Тяжелый фиброз миокарда на основании МРТ (≥2 позитивных сегментов левого желудочка с поздним усилением [LE]) (Weidemann et al. 2009)

7. Клинический инсульт в анамнезе

8. Беременность или кормление грудью

9. Наличие инфекций ВИЧ и/или HBsAg и/или гепатита С

10. Известные аллергии на ERT

11. Известная аллергия на контрастные агенты на основе гадолиния

12. Наличие любого медицинского, эмоционального, поведенческого или психологического состояния, которое, по мнению исследователя и/или директора по медицинским вопросам, могло бы повлиять на соблюдение пациентом требований исследования.

Введение лекарственных средств

Все инфузии производили во время госпитализации, с периодом наблюдения после инфузии с возможностью амбулаторного мониторинга, где это необходимо.

Три группы лечения составляли исследуемую популяцию. Группа лечения I: 0,2 мг/кг каждые 2 недели. Группа лечения II: 1 мг/кг каждые 2 недели. Группа лечения III: 2 мг/кг каждые 2 недели.

Субъекты (4-8 пациентов на группу) получали внутривенные инфузии каждые 2 недели (14 дней).

Фармакокинетические (PK) параметры

Для определения профиля исследуемого лекарственного средства на основании профиля зависимости концентрации в плазме от времени получают следующие параметры PK: C_max, t_1/2, T_max, AUC_0-t и AUC_0-∞. Образцы отбирали в 1-й день лечения (первая инфузия), при инфузии при визите через 3 месяца, при инфузии при визите через 6 месяцев и при инфузии при визите через 12 месяцев. Кровь для PK брали в следующие моменты времени: до инфузии (исходный уровень); через 1 час после начала инфузии; в конце инфузии; через 1, 4, 8, 24, 48±3, 72±3, 96±3 часа и 2 недели ±3 дня после инфузии (последний образец крови брали непосредственно перед следующей инфузией пациента)

Переменная(ые) эффективности

Параметры эффективности оценивали для анализа конечных точек следующим образом:

Концентрации Gb3 в плазме и осадке мочи на исходном уровне и при каждой инфузии во время исследования

Концентрация глоботриаозилсфингозина (лизо-Gb3) в плазме крови на исходном уровне и при каждой инфузии во время исследования

Оценка желудочно-кишечных симптомов на исходном уровне и при последней инфузии

Функции почек (рСКФ и протеинурия) на исходном уровне и при последней инфузии

Краткая форма опросника оценки боли (BPI) на исходном уровне и при последней инфузии

Следующие дополнительные процедуры дополнительно выполняли на исходном уровне:

Биопсия почки для концентрации Gb3

Пункционная биопсия кожи для определения концентрации Gb3

МРТ сердца и мозга

Индекс оценки степени тяжести Майнца (MSSI)

Оценка сердечной функции (эхокардиография и ЭКГ под нагрузкой)

Переменные безопасности

Безопасность оценивали по частоте, степени тяжести и продолжительности возникающих при лечении АЕ (нежелательных явлений), включая в себя клинически значимые лабораторные отклонения, изменения ЭКГ от исходного уровня, результаты физического осмотра и оценку места инъекции после введения исследуемого лекарственного средства.

Антитела к пегунигалсидазе альфа оценивали перед введением дозы: на исходном уровне, каждый месяц, при последней инфузии и через 1 и 3 месяца после последней инфузии.

Клиническая лабораторная оценка

Следующие клинические параметры оценивали в ходе введения растительной рекомбинантной α-галактозидазы человека, поперечно сшитой с помощью бис-NHS-PEG₄₅ (prh-α-GAL-I-CL45, пегунигалсидаза альфа):

Гематология: общий анализ крови; общее количество лейкоцитов с лейкоцитарной формулой (нейтрофилы, лимфоциты, моноциты, эозинофилы и базофилы), общее количество эритроцитов (гемоглобин, гематокрит, средний эритроцитарный объем, средняя гемоглобин эритроцитов и средняя концентрация гемоглобина в эритроците) и тромбоциты.

Профиль коагуляции: протромбиновое время (РТ) и частичное тромбопластиновое время (РТТ).

Биохимия: содержание натрия, калия, глюкозы, азота мочевины крови, креатинина, кальция, фосфата (неорганического), мочевой кислоты, общего белка, альбумина, билирубина (общего), щелочной фосфатазы, аспартаттрансаминазы, аланинтрансаминазы, гамма-глутамилтрансферазы, лактатдегидрогеназы и креатинфосфокиназы.

Общий анализ мочи: индикаторная полоска для определения содержания крови, глюкозы, кетонов и белка.

Антитела к пегунигалсидазе альфа

Оценивали антитела к пегунигалсидазе альфа, включая в себя нейтрализующие антитела у субъектов, характеризующихся положительным ответом антител IgG.

Нежелательные явления (AE) и серьезные нежелательные явления (SAE)

Нежелательное явление (АЕ) определяют как любое неблагоприятное медицинское явление у субъекта, участвующего в клиническом испытании, включая в себя любое неблагоприятное и непредусмотренное проявление, симптом или заболевание, временно связанные с применением пегунигалсидазы альфа, независимо от того, считается ли это связанным с исследуемым лекарственным средством. АЕ собирали от начала лечения до 90 дней после дозы в последнее посещение. АЕ также включает в себя случайные травмы, причины любых изменений в лекарственной терапии (лекарственном средстве и/или дозе), кроме запланированного подбора дозы, причины для госпитализации или причины для хирургических процедур (за исключением незначительных плановых операций в отношении ранее существовавшего состояния).

Пример II

Пегунигалсидаза альфа является безопасной и эффективной в уменьшении симптомов болезни Фабри

Пациентов подвергали мониторингу в отношении безопасности (нежелательных эффектов) и улучшения клинических параметров после внутривенного введения 0,2 мг/кг, 1,0 мг/кг и 2,0 мг/кг пегунигалсидазы альфа. Данные в отношении безопасности указывали на то, что пегунигалсидаза альфа хорошо переносится, с низкой частотой нежелательных эффектов (АЕ) среди 18 пациентов. Пегунигалсидаза альфа также была эффективна в снижении содержания глоботриаозилцерамида в плазме и глоботриаозилцерамида перитубулярных капилляров почек (Gb3).

Значительное снижение в плазме Gb3 и лизо-Gb3 также наблюдалось у пациентов мужского пола при мониторинге через 6 месяцев лечения пегунигалсидазой альфа. Функция почек (рСКФ и белок в моче/креатинин) оставалась стабильной у всех пациентов в течение 12 месяцев лечения пегунигалсидазой альфа. Таким образом, лечение пегунигалсидазой альфа, вводимой раз в две недели, является явно безопасным и эффективным для пациентов с болезнью Фабри.

Пример III

Фармакокинетический профиль пегунигалсидазы альфа:

Поперечное сшивание усиливает биодоступность пегунигалсидазы альфа

Фармакокинетические параметры подвергали мониторингу у пациентов, получавших 0,2 мг/кг, 1,0 мг/кг и 2,0 мг/кг пегунигалсидазы альфа, в 1-й день лечения (первая инфузия), при в/в инфузии при визите через 3 месяца, при в/в инфузии при визите через 6 месяцев и при в/в инфузии при визите через 12 месяцев, на основании содержаний пегунигалсидазы альфа в плазме. Кровь для PK брали непосредственно перед введением и в течение 14 дней между введениями доз.

Значительная концентрация фермента в плазме (измеренная иммуноанализом с использованием антител к пегунигалсидазе альфа) являлась явно обнаруживаемой в течение всех 14 дней после введения для всех дозировок (см. примеры на фиг. 1) зависимым от дозы образом. Во всех дозировках концентрация в плазме достигла максимума вскоре после введения и демонстрировала медленное, устойчивое снижение в течение следующих 14 дней. На фиг. 2 показан фармакокинетический профиль концентрации в плазме клинически одобренной коммерческой агалсидазы бета (r-αhGalA, рекомбинантная человеческая α-GAL А клеток млекопитающих, Fabrazyme™, Genzyme Corp, Cambridge MA) после введения. В отличие от фармакокинетического профиля пегунигалсидазы альфа, агалсидаза бета, как видно из графика, едва обнаруживается в плазме пациентов через 10 часов после введения. Таким образом, пегунигалсидаза альфа, по-видимому, обладает значительно улучшенной биодоступностью, продолжающейся более 14 дней, показанных в настоящем документе, и явно превосходящей таковую у клинически одобренного Fabrazyme™.

При оценке конкретных фармакокинетических переменных преимущества пегунигалсидазы альфа становятся еще более очевидными. Как максимальная концентрация фермента в плазме после введения (C_max, фиг. 3А), так и общая биодоступность (площадь под кривой зависимости концентрации в плазме от времени, экстраполированная на бесконечность, AUC_0-∞, выраженная в виде массы (например, мкг или нг) фермента на время (например, мин или ч) на мл плазмы, фигура 3С) зависят от дозы и согласуются с общим фармакокинетическим профилем, показанным на фигуре 1. По сравнению с агалсидазой бета, как C_max, так и AUC_0-∞ пегунигалсидазы альфа явно превосходят коммерчески доступный фермент. Период полужизни пегунигалсидазы альфа при каждой дозировке был почти на два порядка величин выше, чем у клинически одобренной, коммерчески доступной агалсидазы бета (Fabrazyme™, Genzyme Corp, Cambridge MA) и агалсидазы альфа (Replagal™, Shire Human Genetic Therapy (HGT), Inc., Cambridge, MA, USA) (фиг. 3B).

В приведенной ниже таблице I приведены подробные значения фармакокинетических параметров пегунигалсидазы альфа.

Экстраполяция концентрации в плазме через 14 дней после 14-дневного периода с учетом периода полужизни пегунигалсидазы альфа (см. фиг. 3В) указывает на то, что даже на 21-й и 28-й день или позже, как предполагают, значительные потенциальные терапевтические количества пегунигалсидазы альфа остаются в плазме пациентов.

Пример IV

Иммуногенность и биодоступность поперечно сшитой prh-α-GAL-I-CL45:

Образцы сыворотки отбирали один раз в месяц в течение 4 первых месяцев, а затем один раз каждые 2 месяца. Проанализировали 144 образца, из которых 123 являлись отрицательными в отношении антител к лекарственному средству (ADA). Подтвержденные положительные образцы были дополнительно охарактеризованы в отношении нейтрализующей активности, антител к гликану и к PEG.

Сообщалось о низкой частоте образования антител к поперечно сшитой prh-α-GAL-I-CL45. Три пациента (19%) были идентифицированы как положительные в отношении вызванных лечением АДА по меньшей мере в одно посещение, причем двое из трех содержали нейтрализующие антитела. Присутствие ADA было временным, и ни у одного из этих пациентов не обнаружили ADA через 6-15 месяцев лечения. Примечательно, что после 12-месячного лечения ни у одного из пациентов в когорте, получавшей 2,0 мг/кг поперечно сшитой prh-α-GAL-I-CL45, не выработались вызванные лечением антитела к поперечно сшитой prh-α-GAL-I-CL45.

Не ограничиваясь одной гипотезой, эти результаты позволяют предположить, что повторное лечение с помощью поперечно сшитой prh-α-GAL-I-CL45, которая благодаря своей улучшенной стабильности обеспечивает постоянное воздействие, может привести к индукции иммунной толерантности.

Пример V

Улучшенная фармакокинетики поперечно сшитой пегунигалсидазы альфа и расширенная схема введения доз: многоцентровое открытое исследование с переключением

Общепринятая ферментозаместительная терапия для пациентов с болезнью Фабри требует введения лекарственного средства с максимальными интервалами в две недели (14 дней) между введениями. Увеличение интервала между введениями без значительного снижения клинической эффективности лечения или увеличения связанных с лечением нежелательных явлений может иметь большое клиническое значение, уменьшая количество вмешательств и улучшая соблюдение пациентом режима лечения. Принимая во внимание усиленную фармакокинетику, наблюдаемую у пациентов с болезнью Фабри, получающих инфузии пегунигалсидазы альфа раз в две недели, можно оценить эффект расширенной схемы введения доз.

Отбор пациентов для исследования можно провести в соответствии с вариантами критериев включения и исключения, включая в себя без ограничения: лечение пациентов с болезнью Фабри без тяжелых симптомов, относительно медленно прогрессирующего пациента, пациентов с ранней диагностикой, пациентов с постоянными симптомами заболевания или с сохранением сходного уровня ухудшения в течение выбранного периода времени.

Иллюстративными критериями включения в исследование могут являться без ограничения пациенты с подтвержденной болезнью Фабри, как определено, например, по активности альфа-галактозидазы и генетическим тестам, с симптомами от легкой до умеренной степени, как определено, например, в соответствии с наклоном рРКК (расчетный резерв коронарного кровотока) и рСКФ пациента, пациенты в возрасте 16-65 лет, по меньшей мере 3 года на ERT.

Клиническая лабораторная оценка, мониторинг переменных безопасности и эффективности и нежелательных явлений, а также регистрация фармакокинетических параметров выполняют, как подробно описано в примере I, с изменениями, необходимыми для увеличенного интервала между введениями (например, образцы берут во время первой и последней инфузий в следующие моменты времени: до инфузии (исходный уровень), через 1 час после начала инфузии, в конце инфузии, через 1, 4, 8, 24, 48±3, 72±3, 96±3 часа, 2 недели ±3 дня и 3 недели ±3 дня после инфузии (последний образец крови будет взят непосредственно перед второй инфузией пациента). Необязательно, образцы также берут в интервале между 2-й и 3-й неделями после инфузии и, дополнительно, необязательно, в моменты времени, превышающие 3 недели после инфузии, например, через 4 (четыре) недели после инфузии ±3 дня и/или в интервале между 3-й и 4-й неделями после инфузии.

Постоянные терапевтические уровни пегунигалсидазы альфа в плазме у пациентов, получающих дозу раз в три недели или раз в четыре недели или любую дозировку с интервалом, превышающим две недели после инфузии, без значительных нежелательных эффектов и с поддержанием удовлетворительных или сходных уровней клинических параметров, например, как и в предыдущем лечении ERT, клинические параметры на протяжении всего периода лечения могут составлять основу нового улучшенного протокола расширенной схемы введения доз для ферментозаместительной терапии при болезни Фабри с помощью пегунигалсидазы альфа. Оптимальные интервалы между инфузиями можно определить (или аппроксимировать) из анализа клинических данных и фармакокинетических параметров.

Пример VI

Прогнозный анализ для 2 мг/кг пегунигалсидазы альфа по сравнению с 1 мг/кг Fabrazyme®:

Для определения возможных фармакокинетических характеристик пегунигалсидазы альфа, когда интервал между введениями увеличен с 2 недель до 3 или 4 недель, и сравнения предполагаемого воздействия пегунигалсидазы альфа с предполагаемым воздействием фабразима, выполняли прогнозный анализ.

Кинетические характеристики поперечно сшитой prh-α-GAL-I-CL45 (пегунигалсидазы альфа)

Данные пациентов, получавших 2 мг/кг пегунигалсидазы альфа (n=4), показанные в примере 1, использовали для основной части прогнозов в отношении пегунигалсидазы альфа. Прогнозы, как правило, зависят в линейной пропорциональности от дозы. В качестве отправной точки для этих прогнозов выбирали 3-месячные данные. Значения периода полужизни в 3 месяца находились в диапазоне от 70,1 до 105 часов для четырех субъектов.

Поскольку существовали измеримые концентрации до введения дозы в 3 месяца из-за предыдущей дозы пегунигалсидазы альфа, концентрации до введения дозы экстраполировали на каждое время забора образца с использованием значения конечной скорости элиминации (λz) для каждого субъекта. Эти экстраполированные концентрации вычитали из измеренных концентраций для получения концентраций, которые были обусловлены дозой, введенной в 3 месяца. Скорректированные 3-месячные данные для каждого субъекта сопоставляли с 2-компартментной моделью с использованием программного обеспечения Phoenix WinNonlin. Средние оценки для модельных переменных использовали для моделирования трех последовательных доз, составляющих 2 мг/кг, с интервалами, составляющими 2, 3 или 4 недели. Время гипотетической инфузии составило 6 часов. Значения C_max, AUC_tau (площадь для времени между дозами) и C_min (концентрация перед последующей дозой) показаны в таблице II.

Фармакокинетика фабразима

Фармакокинетические параметры фабразима получали из листка-вкладыша и в публикации Eng с соавт., 2001 (Am J Hum Genet, 68:711-722), фиг. 2.

Частичная AUC и C_ave

В таблице III показано сравнение прогнозируемых фармакокинетических параметров после различных схем введения доз пегунигалсидазы альфа и фабразима в дозе 1 мг/кг каждые 2 недели.

Данные для пегунигалсидазы альфа получали из продолжающегося исследования фазы I/II. Информация о фармакокинетических характеристиках фабразима доступна в листке-вкладыше и в публикации Eng с соавт., 2001 (Am J Hum Genet, 68:711-722). Перспективное моделирование выполняли с использованием программного обеспечения Phoenix WinNonlin (версия 6.3).

Еженедельные расчеты частичной AUC и C_ave позволили провести сравнительную оценку/анализ доступности лекарственного средства на 1, 2, 3 и 4-й неделях введения пегунигалсидазы альфа и сравнение с фабразимом каждые две недели.

Данные рассчитывают за неделю и представляют последовательно. Толстые линии представляют время повторного введения. Таким образом, для интервала 2-й недели 3-я, 5-я и 7-я линия представляют введение дозы, для интервала 3-й недели 4-я 7-я и 10-я линия представляют введение дозы и т.д.). Серые и белые прямоугольники визуально определяют различные интервалы инфузии. Средние еженедельные концентрации фермента, в 168 часов (1 неделя) и 336 часов (2 недели), интерполировали или экстраполировали для оценки охвата лекарственного средства по неделям. Как показано в таблице: для пегунигалсидазы альфа, 2 мг/кг, каждые 2, 3 или 4 недели, значения еженедельной C_ave (709, 87 и 11 нг/мл соответственно) значительно выше, чем незначительные значения C_ave на 2-й неделе для фабразима.

Уровни C_ave фабразима через 10 часов после инфузии аналогичны расчетным уровням C_ave пегунигалсидазы альфа на 4-й неделе после введения 2 мг/кг каждые 4 недели (11 нг/мл).

На фигуре 4А графически проиллюстрирована экстраполированная доступность фермента (концентрацию в плазме) в течение четырехнедельного периода после однократной инфузии 2 мг/кг пегунигалсидазы альфа. Когда прогнозируемую AUC после лечения с помощью пегунигалсидазы альфа в течение четырехнедельного периода сравнивают с этим значением фабразима, вводимого раз в две недели, в течение того же периода, поддержание доступности фермента для пегунигалсидазы альфа явно выше, чем у фабразима (см. фиг. 4В, особенно вставку).

Результаты показывают, что в отличие от фабразима, ожидается, что значительные содержания фермента будут оставаться в кровотоке в течение всего периода лечения, доступные для достижения органов-мишеней, после введения 2 мг/кг пегунигалсидазы альфа с интервалами между инфузиями, составляющими 3 и 4 недели.

Взятые вместе, результаты, представленные в настоящем документе, указывают на то, что фармакокинетические свойства поперечно сшитой альфа-галактозидазы пегунигалсидазы альфа отличаются и обладают преимуществами по сравнению с таковыми у обеих полученных из клеток млекопитающих одобренных в настоящее время коммерчески доступных ERT при болезни Фабри агалсидазы бета (Fabrazyme™, Genzyme Corp, Cambridge MA) и агалсидазы альфа (Replagal™, Shire Human Genetic Therapy (HGT), Inc., Cambridge, MA, USA). Более длительный период полужизни и существенно более высокая общая биодоступность (AUC_0-∞), наблюдаемые для всех дозировок пегунигалсидазы альфа, отражают присутствие доступного активного фермента в течение 2 недель между инфузиями (введениями). Улучшенный фармакокинетический профиль указывает на то, что она подходит для эффективной долгосрочной ферментозаместительной терапии при болезни Фабри и ее можно вводить с интервалами, составляющими по меньшей мере 2 недели - каждые 4 недели.

Пример VII

Протокол клинических испытаний: фаза 3, открытое исследование с переключением для оценки безопасности, эффективности и фармакокинетики пегунигалсидазы альфа, вводимой с помощью внутривенной инфузии каждые 4 недели взрослым пациентам с болезнью Фабри, которые в настоящее время получают ERT: Fabrazyme® (агалсидаза бета) или Replagal® (агалсидаза альфа)

В этом исследовании оценивают безопасность, эффективность и фармакокинетику растительной рекомбинантной α-галактозидазы человека, поперечно сшитой с помощью бис-NHS-PEG₄₅ (prh-α-GAL-I-CL45) (пегунигалсидаза альфа), у пациентов с болезнью Фабри, которые в настоящее время получают лечение с помощью коммерчески доступной ERT (агалсидаза альфа или агалсидаза бета). Субъекты должны иметь точный диагноз болезни Фабри, основанный на активности альфа-GAL-A (мужчины) или генетическом тестировании (женщины) с проявлениями заболевания, и проходить лечение с помощью ERT в течение не менее 3 лет. Растительную рекомбинантную α-галактозидазу человека, поперечно сшитую с помощью бис-NHS-PEG₄₅ (prh-α-GAL-I-CL45) (пегунигалсидазу альфа), будут вводить в дозе, составляющей 2 мг/кг каждые четыре (4) недели, в течение 52 недель. Параметры, выбранные в качестве конечных точек, являются параметрами, наиболее релевантными для заболевания, и позволяют провести значимую и актуальную оценку конечных точек безопасности, фармакокинетики и эффективности.

Дозировка и введение лекарственного средства:

После подтверждения пригодности пациента к участию в исследовании пациенты должны быть переведены на прием пегунигалсидазы альфа 2 мг/кг, вводимой внутривенно каждые 4 недели. Время инфузии пегунигалсидазы альфа варьируется в зависимости от массы тела пациента, принимая во внимание: переносимость пациента, оценку исследователя и одобрение медицинского наблюдателя спонсора/директора по медицинским вопросам и после попытки постепенного снижения дозы.

Фармакокинетические (PK) параметры

Следующие параметры PK получены из профилей зависимости концентрации в плазме от времени для определения профиля PK исследуемого лекарственного средства: C_max, t_1/2, T_max, AUC_0-t и AUC_0-∞. Кровь для PK анализа будет взята в 1-й день и в конце лечения (52 недели). В дни взятия крови образцы крови берут в следующие моменты времени: до инфузии (исходный уровень); через 1 час после начала инфузии; в конце инфузии; 1±0,25, 2±0,25, 4±0,25, 8±0,25, 24±0,5, 48±3 и 96±3 часа после инфузии и через 14±3, 21±3 и 28±3 дня после инфузии (последний образец крови будет взят непосредственно перед следующей инфузией пациента) (всего 13 временных точек в течение 28 дней).

Переменная(ые) эффективности

Параметры эффективности, оцененные для анализа конечных точек, являются следующими:

1. Расчетная скорость клубочковой фильтрации (eGFRCKD-EPI)

2. Индекс массы левого желудочка (г/м²) по эхокардиограмме

3. Концентрация глоботриаозилсфингозина (лизо-Gb3) в плазме

4. Концентрации Gb3 в плазме

5. Лизо-Gb3 в моче

6. Соотношение белок/креатинин в разовой порции мочи

7. Частота употребления обезболивающих лекарственных средств

8. Толерантность к физическим нагрузкам (ЭКГ под нагрузкой)

9. Краткая форма опросника оценки боли (BPI)

10. Индекс оценки степени тяжести Майнца (MSSI)

11. Опросник качества жизни EQ-5D-5L

Переменные безопасности

Безопасность оценивают по изменениям по сравнению с исходным уровнем: клинические лабораторные анализы, физикальное обследование, оценка места инъекции после введения лекарственного средства, электрокардиограмма (ЭКГ), частота, тяжесть и продолжительность возникающих при лечении НЯ (нежелательных явлений), способность к сокращать премедикацию перед инфузией, потребность в использовании премедикации вообще для контроля за реакциями на инфузию и вызванными лечением антителами к пегунигалсидазе альфа.

Предыдущие результаты выявили более длительный период полужизни (t_1/2) и существенно большую общую биодоступность (AUC_0-∞) для пегунигалсидазы альфа во всех дозах при схеме инфузии раз в две недели (введения). Увеличенные интервалы между введением доз могут оказывать существенное влияние на удобство, стоимость, степень соблюдения режима лечения и частоту нежелательных эффектов ERT для болезни Фабри. Для оценки пригодности растительной рекомбинантной α-галактозидазы человека, поперечно сшитой с помощью бис-NHS-PEG₄₅ (prh-α-GAL-I-CL45) (пегунигалсидаза альфа), для эффективной долгосрочной ферментозаместительной терапии при болезни Фабри, пегунигалсидазу альфа вводят с интервалом каждые 4 недели.

В открытом исследовании с переключением, оценивающем безопасность, эффективность и фармакокинетику лечения с помощью пегунигалсидазы альфа в дозе 2 мг/кг каждые 4 недели у пациентов, ранее получавших лечение с помощью ERT, агалсидазы альфа или агалсидазы бета, в течение по меньшей мере 3 лет и в стабильной дозе (>80% меченой дозы/кг) в течение по меньшей мере последних 6 месяцев, будут включены в испытание и переведены с их текущей ERT на внутривенные (в/в) инфузии пегунигалсидазы 2 мг/кг каждые 4 недели в течение 52 недель (всего 14 инфузий).

Существенные доказательства сохранения улучшенных фармакокинетических свойств поперечно сшитой альфа-галактозидазы пегунигалсидазы альфа в течение 4-недельного интервала между инфузиями помогут установить, что поперечно сшитая альфа-галактозидаза пегунигалсидаза альфа отличается и обладает преимуществами по сравнению с другими одобренными в настоящее время, коммерчески доступными ERT для болезни Фабри агалсидазой бета (Fabrazyme™, Genzyme Corp, Cambridge MA) и агалсидазой альфа (Replagal™, Shire Human Genetic Therapies (HGT), Inc., Cambridge, MA, USA).

Хотя изобретение было описано в связи с его конкретными вариантами осуществления, очевидно, что многие альтернативы, модификации и вариации будут очевидны для специалистов в настоящей области техники. Соответственно, подразумевается, что охватываются все такие альтернативы, модификации и вариации, которые подпадают под сущность и широкий объем прилагаемой формулы изобретения.

Все публикации, патенты и заявки на патенты, упомянутые в настоящем описании, включены в настоящий документ полностью посредством ссылки в настоящее описании в той же степени, как если бы было указано, что каждая отдельная публикация, патент или заявка на патент конкретно и индивидуально включена в настоящий документ посредством ссылки. Кроме того, цитирование или указание любой ссылки в настоящей заявке не должны рассматриваться как признание того, что такая ссылка доступна в качестве предшествующего уровня техники для настоящего изобретения. В той степени, в которой используются заголовки разделов, они не должны рассматриваться как обязательно ограничивающие.

1. Применение единичной лекарственной формы в лечении болезни Фабри, причем единичная лекарственная форма содержит растительную рекомбинантную α-галактозидазу человека, поперечно сшитую с помощью бис-NHS-PEG45, причем мономеры указанной рекомбинантной α-галактозидазы человека ковалентно связаны друг с другом посредством поли(алкилен) гликолевого связующего фрагмента, содержащего по меньшей мере 20 алкиленовых групп, причем указанная единичная лекарственная форма составлена в виде жидкости для внутривенного введения и причем введение обеспечивают в дозировке 2 мг/кг с интервалами, составляющими 4 недели.

2. Применение по п. 1, в котором указанная растительная рекомбинантная α-галактозидаза человека содержит белок α-галактозидазу человека, характеризующийся аминокислотной последовательностью, как представлено в любой из SEQ ID NO: 1-3.

3. Применение по п. 1 или 2, содержащее 20, или 30, или 40, или 50, или 75, или 100, или 125, или 150, или 175, или 200, или 250 мг указанной растительной рекомбинантной α-галактозидазы человека.

4. Применение по любому из пп. 1-3, содержащее 20 мг указанной растительной рекомбинантной α-галактозидазы человека.

5. Применение по любому из пп. 1-4, содержащее 30 мг указанной растительной рекомбинантной α-галактозидазы человека.

6. Применение по любому из пп. 1-4, содержащее 40 мг указанной растительной рекомбинантной α-галактозидазы человека.

7. Применение по любому из пп. 1-4, содержащее 50 мг указанной растительной рекомбинантной α-галактозидазы человека.

8. Применение по любому из пп. 1-4, содержащее 75 мг указанной растительной рекомбинантной α-галактозидазы человека.

9. Применение по любому из пп. 1-4, содержащее 100 мг указанной растительной рекомбинантной α-галактозидазы человека.

10. Применение по любому из пп. 1-4, содержащее 125 мг указанной растительной рекомбинантной α-галактозидазы человека.

11. Применение по любому из пп. 1-4, содержащее 150 мг указанной растительной рекомбинантной α-галактозидазы человека.

12. Применение по любому из пп. 1-4, содержащее 175 мг указанной растительной рекомбинантной α-галактозидазы человека.

13. Применение по любому из пп. 1-4, содержащее 200 мг указанной растительной рекомбинантной α-галактозидазы человека.

14. Применение по любому из пп. 1-4, содержащее 250 мг указанной растительной рекомбинантной α-галактозидазы человека.

15. Применение по любому из пп. 1-14, причем указанная рекомбинантная α-галактозидаза человека характеризуется периодом полужизни в кровотоке (T1/2), составляющим по меньшей мере 50 часов после введения.

16. Применение по любому из пп. 1-15, причем указанная рекомбинантная α-галактозидаза человека характеризуется Cmax, составляющей по меньшей мере 8000 нг/мл после введения 2 мг/кг.

17. Применение по любому из пп. 1-16, причем указанная рекомбинантная α-галактозидаза человека характеризуется биодоступностью (AUC0-∞), составляющей по меньшей мере 400000 нг⋅ч/мл после введения 2,0 мг/кг указанной рекомбинантной α-галактозидазы человека.