Способ получения амилолитических ферментных препаратов

 

Союа Советских

ИЗОБРЕТЕН Ия

К ПАТЕНТУ

Зависимый от патента №

МПК С 12d 13/10

Заявлено 27Л .1868 (№ 1244451/28-13)

Приоритет 02.VI.1967 (№ 34867/1967, Япония) Комитет по делам изобретений и открытий при Севете Миииотров

СССР

УДК 577,154.22 (088.8) Опубликовано 22.Х11.1970. Бюллетень ¹ 2 за 1971

Дата опубликования описания 16.II.1971

Авторы изобретения

Иностранцы

Язуйуки Иокобаяши, Канаме Зугимото и Иошинори Зато (Япония) Иностранная фирма

«Гайашибара Ко» (Япония) Заявитель

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АМИЛОЛИТИЧЕСКИХ

ФЕРМЕНТНЫХ ПРЕПАРАТОВ

Изобретение относится к ферм ентной промышленностити и касается способа получения амилолитических ферментных препаратов.

Известен способ получения амилолитических ферментных препаратов культивированием бактерий PseIIdomoIIas saccharophila, продуцирующих фермент, расщепляющий а-1,4-глюкозидную связь в крахмале.

В соответствии с настоящим изобретением предложен способ получения препаратов изоамилазы, расщепляющей а-l,б-глюкозидные связи в крахмале.

Способ характеризуется использованием нового штамма бактерий Pseudomonas amyloderamos SB-15, выделенного из природы.

Ниже приведена биологическая характеристика штамма.

Морфология. Размер клеток 0,4 — 0,6

+1,2 — 4.5 мк. Палочки, споры отсутствуют, жгутики полярные, одиночные. Грамотрицательный.

Органические среды. Штрих на агар-агаре (с бульоном при ЗО C): гладкая блестящая поверхность, клетки слегка желтоватые. Чашка с агаровой средой (с бульоном при ЗО С); колония круглая, сплошная, гладкая и блестящая поверхность, слегка приподнятая, слегка желтоватая, непрозрачная.

Столбик arapa (с бульоном при 30 С): линейный и хороший рост около поверхкости.

Столбик желатины (с бульоном при 30 С): медленно разжижается в форме воронки.

Культуральная жидкость (с бульоном при

30 С): становится мутной, слабый осадок, на

5 поверхности образуется очень тонкая пленка.

Картофельная среда: колония бурая, блестящая и влажная.

Физиологические и биохимические признаки.

10 Лакмусовое молоко: становится щелочным.

Производство пигмента: водораствопимый пигмент не образуется, клетки становятся желтоватыми.

Пооизводство аммиака: образуется.

15 Сероводород: не образуется.

Индол: не образуется.

Нитрат: не восстанавливается.

Производство ацетилметплкарбинола: не об и азуется.

20 Каталазная активность: положительная.

Использование сахаров и получение из них кислот: в аэробных yc,÷oâIIÿõ из глюкозы, арабинозы, маннозы и мальтозы образуется кислота. газа не образуется; фруктоза. галактоза, 25 лактсза, целлобиоза, сахароза, трегалоза, салицип, а-метилглюкозид, декстрин и крахмал используются в аэробных условиях как источники углерода. кислота не образуется. ксплоза, рамноза, целлюлоза, декстрин и инуЗО JIHH не HcIIOJIb3) ютсЯ, 290542

Предмет изобретения

С оста в итепь Г. Голе в а

Редактор M. В. Макарова Текред Л. В. Куклииа Корректор Т. А. Джамаикулова

Иад. № 84 Закав 207,:17 Тпрpæ 480 Подписное

ЦНИИПИ Комитета . 0 де,т., и" !:". е п: и о-.крьг,:. I прп CG",å;p Мп:шстроп СССР

Москва, Я-З5, Рауьпскап паб., д. - 1, 5

Сапунова, 2

Тппограйрпи, пр.

Сорбит, маннит, инозит, глицерин не используются.

Бензойная, п-оксибензойная, салициловая кислоты и другие ароматические соединения не используются.

Соли аммония и нитраты как единственные источники азота не используются, требуются органические источники азота, такие как глутаминовая, аспарагиповая кислоты или белковый гидролизат.

Оптимальная температура роста: 25 — 30 С.

Не может расти при 37 С.

Оптимальный рН роста: 6,5 — 7,5. Летальная температура: 70 С в течение 10 лин.

Потребность в кислороде: аэробный.

Способ получения амилолитических ферментных препаратов согласно настоящему изобретению заключается в культивировании штамма Pseudomonas amyloderamosa SB-15 на питательной среде, содержащей источники углерода, азота в присутствии необходимых для роста минеральных солей.

В .качестве источников углерода применяют крахмал, растворимый крахмал, декстрин, кислый гидролизат крахмала, ферментативный гидролизат крахмала, мальтозу и другие материалы, имеющие а-1,4- или а-l,б-глюкозидные связи.

В качестве источника азота используют соли аммония, нитраты и .мочевину вместе с глутаминовой, аспарагиновой кислотами или другими органическими азотсодержащи ми соединениями, например пептоном, кукурузным экстрактом, дрожжевым экстрактом, белковым гидролизатом и т. п. Органические вещества,могут использоваться без минеральных.

Широко используется натуральная среда, состоящая из порошков риса и сладкого картофеля, в которой существует хорошее соотношение источников углерода и азота.

Температуру культивирования поддерживают в интервале 20 — 30 С, рН 6 — 8. Для получения высокого выхода изоамилазы рН поддерживают в кислой области.

После завершения культивирования клетки отделяют центрифугированием. жидкость мо5

1О

25 зо яет использоваться в качестве неочищенного ферментного раствора. Для получения препаратов изоамилазы проводят осаждение с помощью растворителя, высаливание, адсорбцию, сгущение раствора и т. п.

Фермент устойчив при рН 3 — 6. Изоамилгза, полученная в соответствии с настоящим изобретением, может использоваться для получения амилазы из крахмала и других целей.

Пример 1, Среду состава, %: мальтоза

2,0; глутамат натрия 0,2; (Х1-1») НРО» 0,3;

КН РО» 0,1; МАЗО» 7НрО 0,05; остальное вода; рН 7,0, засевают культурой Pseudomonas агпу1о1»ега1поза SB-15 и процесс ведут при встряхивании при 30 С в течение 120 час.

Культуральную жидкость, имеющую изоамилазную активность 180 — 220 ед/лл, центрифугируют при скорости 10000 об(лин в течение

1G лин. Клетки отбрасывают. жидкость охлаждают, перемешивают, добавляют 75P/p-ный ацетон. Осадок фермента отделяют, лиофилизуют и получают изоамилазу в виде порошка.

Выделение обеспечивает выход 80 — 90 /о. Препарат устойчив, если хранится в сухом виде.

Он может быть очищен обработкой сульфатом аммония или другим методом.

Пример 2. Среду, имеющую состав, %. растворимый крахмал 1,0; (МН. ) НРО» 0,3;

КНеРО» 0,1; полипептон 0,1; MgSO4 7Hgp 0,05; остальное вода; рН 7,0, инокулируют тем же микроорганизмом, что в примере 1. Процесс ведут при 30 С в течение 72 час.

Получают выход изомилазы 82%.

Способ получения амилолитических ферме тпых препаратов путем выращивания их продуцентов, например Pseudomonas, на питательной среде, содержащей источники углерода, азота, в присутствии необходимых для роста минеральных солей, отличающийся тем, что, с целью получения изоамилазы, гидролпзующей только связанный с крахмалом а-l,бглюкозид, в качестве продуцента используют

Pseudomonas amyloderamosa SB-15.