Способ получения интерферона

 

Союз Советскин

Социапистическик

)веса убпии

ОП ИСАНИЕ

ИЗОБРЕТЕН ИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (61) Дополнительное к авт, свид-ву № (22) Заявлеио26.02.70 (21)1406708/31-16 с присоединением заявки ¹ (23) Приоритет (43) Опубликовано 25 12 77 Бюллетень:%47 (45) Дата опубликования описания 24.12.77 (>ii 297296 (51) М. Кл.

С 12 К S/00

Гооудвротовииьй иомитвт . Соввтв Минивтров СССР но,авлам наобрвтвиий н открытий (53) УДК 615.45 (088.8 ) (72) Авторы изобретения

В. 3 Соловьев, В, П. Кузнецов и В. И. Марченко

Институт эпидемиологии я микробиологии им. Н. Ф. Гамален

{71) Заявитель (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ИНТЕРФЕРОНА

Изобретение относится к области медицины, точнее к способам получения медицинских препаратов, а именно ннтерферона.

Известен способ получения интерферона путем воздействия на лейкоциты, выделенные нэ донорской крови и взвешенные в питательной среде, вирусом - интерфероногеном с последующим удалением лейкоцитов, нейтрализацией вируса-ннтерфероногена, очисткой и лнофнльным высушнваннем. 10

Однако известный способ не обеспечнI веет получения препарата с достаточно концентрированной актнвностью.

)Лель предлагаемого изобретения - повышение качества препарата и концентриро- 15 ванне его активности. с

Для этого ннтерферонсодержашую культуральную жидкость пропускают через молекулярные разделителя, например, Сефадекс

Г-25 грубый, 20

Для получения интерферона по предлагаемому способу выделенные нэ донорской крови лейкоциты взвешивают в среде hh 199 (1Î- лейкоцитов на 1 мл среды), соде

7 жащей 100 ед/мл пеницилина,, 50 ед/мл 25 стрептомнцина н 10 ед/мл гепарина, переносят в стерильные матрицы нз нейтрального стекла н добавляют 5 % плазмы илн сыво ротки крови человека. В качестве вируса-ииь> терфероногена используют вакцинный штамм

Н вируса болезни Ньюкасла в количестве

10-100 ТОД на лейкоцит нлн 10-20 гемагглютннирующнх единиц на 10 лейко» цитов. Вирус вводят в среду с лейкоцитами о и ннкубнруют взвесь 3 ч прн 37 С в стационарном горизонтальном положении. Затет>в лейкоциты отделяют центрнфугированием при 1250g в течение 15 мин. Осадок лейкоцитов ресуспендируют в свежей порции среды Ж 1 9 9 (1 0 лейк оци тов на 1 мл среды) > содержащей укаэанное выше количество антибиотиков н гепарнна, добавляют

5-10% плазмы илн сыворотки крови, переносят в матрацы и ннкубнруют в тех жв условиях 18-20 ч. По окончании ннкубацня клетки отделяют центрифугнрованнем прн

1500-2000 в течение 15 мнн, осадок отбрасывают, а надосадочную жидкость повторно центрнфугнруюг. К очищенной жидкости добавляют 10-20%-ный раствор со297296 з линой кислоты до рП 2,2-2,4 и выдержио вяют не менее 4-5 суток при 4 С, после чего отбирают образцы для контроля стерильности, токсичности и активности, Стерильность контролируют высевом 1 мл раствора на бульон с тиогликоллатом и бульон .Сабуро. После 10 суток инкубации

1 о» бульоняРс тиогликоллятом при 37 С и, о бульона Свбуро при 20 С посевы до. жны оставаться стерильными. Вирусологическую стерильность определяют введением по 0,2 л,л ж дкости в пробирки с 3-суточной культурой куриных фибробластов. Через 3-4 суток при наблюдении под микроскопом в мо ослое клеток не должно быть признаков цитоплатического действия. Дополнительный контроль проводят путем введения 0,2 мл жидкости в аллянтоисную полость 9-10-дневных куриных эмбрионов; через 3 суток инкубации в при 37 С не должно быть гибели эмбрионов и отобранная из них аллантоиснвя жидкость не должна содержать гемагглютининов петушиных эритроцитов. Противовирусную активность раствора определяют по задержке цитопатического действия вируса возикуляр» ного стоматита (вакцинный штамм "Индиана, взятого в дозе 100 ТЕРЦ в культуре клеток первично-трипсинизированной кожно-мышечной ткани 10-12 недельных эмбрионов человека или в перевиваемой зо культуре диплоидных клеток кожно-мышечной ткани эмбрионов человека. Тигр противови- . русной активности должен составлять не ме нее 32 ед/мл в культуре фибропластов и не менее 250 ед/мл в культуре диплоидных з клеток. Определение токсичности проводят в монослойной культуре клеток кожно-мы-. шечной ткани эмбрионов человека. В культуру со сформированным монослоем вводят

1 мл разведения 1:16 (первично-трипсини- 40 зи рова иная культура ) или 1: 1 00 (диплоидная культура) в среде с гидролизатом лактальбумина, 14 199 или Игла. Через 2-3 о суток инкубации при 37 С не должно

1 быть никаких признаков дегенерации моно- Б слоя и морфология клеток должна оставаться неизменной. для концентрирования активности проверенную иитерферонсодержашую культурвльную жидкость через систему сифонов под у давлением в условиях стерильности и герметичности подают в колонку, заполненную заранее подготовленным молекулярным pasделителем Сефвдекс Г-25 "грубый, При диаметре колонки 60 мм и высоте

2000 мм зв один цикл очистки можно пропустить 3 л жидкости. Элюирование проводят стерильной дистиллированной водой.

Сначала на выходе появляется активная белковая фракция, регистрируемая по жел- М

ГОBB т(3 K ори чне иой О! Iя Jlес пеи! Iии раствора или -с пом«нные проточного деисиметра, После прекряш«.иия опялесиеииии отбор белковой фракции иренрящяюг. Элювт контролируют на бактериологическую стерильность и на полноту очистки or иизкомолекулярных веществ. Последнюю проверяют пробой на феноловый красный, Koторый присутствует в исходной жидкости и должен целиком оставаться во фракции низкомолекулярных веществ (при подщелачивянии пробы белковой фракции не должно отмечаться покраснения, раствора). Провереиныи элюат разливают в стерильные ампулы и зямораживают При

» v .. темперятуг -40 С, Затем из ампул откачивают воздух и подогревают до температуо ры не выше 30-35 С в reчение 48-72 ч.

После высушивания ампулы зяпяивают под вакуумом. Остаточная влажность не должна превышать 49о. Готовую продукцию вновь контролируют на бактериологическую и вирусологическую стерильность, токсичность, а также безвредность путем внутрибрюшинного введения - ° белым мышам весом

10-12 r по 0,5 мл раствора препарата.

При наблюдении в течение 5 суток мыши должны оставаться здоровыми. Кроме того контролируют физические свойства, растворимость и остаточную влажность препарата.

Для подготовки геля Сефядекс Г-25 грубый" необходимое количество смолы заливают 0,05-0.1% раствором поваренной соли в дистиллированной воде и выдержио вают 2-3 суток при 4 С. Затем многократной декантацией отделяют мелкую фракцию смолы, а остаток загружают в герметично закрываемую колонку. Через слой геля пропускают

5 объемов дистиллированной воды, после чего в колонку вводят 5Ъ раствор.. формальдегида и оставляют на 1 сутки. Для удаления формальдегида через гель пропуска ют 1 О объемов с те рильн ой дис тиллир ованной воды, последние порции которой на выходе из колонки проверяют на стерильность, После осуществления цикла очистки культурной жидкости и элюции белковой фракции элюируют низкомолекулярные вещества пропусканием 10 объемов стерильной дистиллированной воды. В случае уплотнения слоя геля и гнижения скорости фильтрования гель извлекают из колонки, отделяют мелкую фракцию и вновь подвергают вышеуказанной обработке.

Формула изобретения

Способ получения интерферона путем. воздействия ня лейкоциты, выделенные из донорской крови и взвешенные впитательной

29729 ) Составитель В. Таратута

Редактор A. Калашникова Техред 3. Фанта Корректор Н. Яцемирскчя

Закаа 4989/27 Тираж 541 Подписное

11НИИПИ Государственного комитета Совета Министров СССР по делам изобретений и открытйй

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Филиал ПГ1П Патент, r. Ужгород, ул. Проектная, 4 среде вирусом-интерферогеном с пос" епуюшим удалением лейкоци roe, п.йгралиэапией вируса-ннгерферогена, очисгкой н лиофильным высугпиванием продукта, о г л и и а юш и и с я тем, что, с целью повышения а каче<-.гва препарага и ко ценгрирования е1 активности, интерферопсолержшпую культуральную жидкость пропускакгг чирея мтлекулярные разделители„например, Сефадекс

Г-25 "грубый .