Патент ссср 298131

 

ОПИСАНИЕ

ИЗОБРЕТЕНИЯ

К ПАТЕНТУ

298I3I

Со!сз Советских

Социалистических

Республик

Зависимый от патента №

МПК С 12d 9/10

Заявлено 04.IV.1968 (№ 1229809/30-15) Приоритет 07.IV.1967, № 21865/67. Япония

Опубликовано 11 111.1971. Бюллетень ¹ 10

Комитет по делам изобретений и открытий при Совете Министров

СССР

УДК 615.779.931:63 (088.8) Дата опубликования описания !8Х.!97!

Авторы изобретения

Иностранцы

Хамао Умезава, Томио Такеучи, Иосиро Оками, Маза Хамада и Кенджи Маеда (Япония) Иностранная фирма

«Заидан Ходжин Бисеибуцу Кагаку Кенкиу Каи» (Япония) Заявитель

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АНТИБИОТИКА КАЗУГАМИЦИНА

Изобретение относится к способам получения антибиотиков путем культивирования гриба-продуцеита на жидкой питательной среде, содержащей источники углерода, азота и минеральных солей, в особенности к способам получения казугамицина с использованием в качестве продуцента гриба из рода StreptomYces.

Известен способ получения казугамицина в культуре гриба-продуцента Str. kasugaen >is

АТСС 157!4 и ATCC !57!5.

Предлагается способ получения казугамицина, включающий культивирование гриба-продуцента из рода Streptomyces на жидкой питательной среде, содержащей источники углерода, азота и минеральных солей, глубинным методом, при котором в качестве представителя рода Streptomyces берут Str. kasugaspinus, а культивирование ведут при температуре от 25 до 35 С.

Str. kasugaspinus выделен из образца почвы, взятой в Маруяма, Усада-Хо в префектуре Нагано в июне !965 г. на глицерино-казенно-агаровую среду. Он получил лабораторный номер МА 350-СЗ и обнаружил следующие особенности.

На глицериновом огаре Чапека выращивание при 27 С: бесцветная или слегка желтоватая культура. Обильный воздушный мицелий ог белого до слабо коричнево-серого цвета

2 (серебряно-серый 3 fe, по Color Harmony

Manual. (СНМ) J. Растворимого пигмента нет или слегка желтоватый.

На глюкозо-аспар агино-агаровой среде

Краинского, выращивание при 27 С: бесцветная культура. Обильный воздушный мицелий от белого до коричнево-серого цвета (темно-серый 5 ih, по СНМ). Растворимого пигмента нет.

10 На агаре с яблочнокислым кальцием, выращивание при 27 С: культура от бесцветного до светло-желтого или светло-оранжевого цвета. Белый воздушный мицелий. Растворимого пигмента нет или желтовато-оранжевый. lá15 лочнокислый кальций вокруг культуры иногда растворен.

В пептоновом растворе, содержащем % азотнокислого натрия, выращивание при

27 С; бесцветная культура с белым воздуш20 ным мицелием. Растворимого пигмента нет или слегка жыповатыи. Восстанавливает нитраты.

На ломтике картофеля, выращивание при

27 C: мицелий от бесцветного до светло-синевато-серого или светло-серого цвета (пепельные 5 fe, по СНМ) . Растворимого пигмента нет.

На крахмально-агаровой пластинке, выращивание при 27 С: культура бесцветная с

30 обильным воздушным мицелием от белого до

298131 светло-серого или светло-коричнево-серого цвета. Растворимого пигмента нет или светложелтоватый, Отсутствие гидролиза или слабый гидролиз крахмала.

На пищевом агарс, выращивание при 37 С: культура от бесцветной до светло-желтоватокоричневого цвета, хороший рост. Тонкий и белый воздушный мпцелий. Растворимого пигмента нет.

На пищевом агаре, выращивание при 27 С: культура от бесцветной до >ке;ITOBBTO-коричневого цвета с белым воздушным мицелием.

Растворимого пигмента нет.

На кровяном arape (10 /о человеческой крови) выращивание при 37 С; бесцветная культура без воздушного мицелия. Растворимого пигмента нет. Сильный гемолиз.

На среде из коагулированной сыворотки (выращивание при 37 С): морщинистая, бесцветная культура. Воздушного мицелия и растворимого пигмента нет. Коагулированную сыворотку не разжижает.

На желатиновой среде (укол в твердую среду), выращивание при 20 С: культура от бесцветной до желтоватой. Скудный белый воздушный мицелий. Растворимого пигмента пет.

Желатину разжижает.

На молочном обрате, выращивание при

37 С: культура от бесцветной до бледно-желтоватого или коричневого цвета. Воздушного мицелия и растворимого пигмента нет. Сильная коагуляция и пептонизация среды.

На тирозиновом агаре, выращивание при

27 С: культура бесцветная с воздушным мицелием от белого до светло-оливково-серого или коричневато-серого цвета. Растворимого пигмента нет, реакция тирозиназы отсутствует.

На целлюлозе (фильтровальная бумага), выращивание прн 27 С: слабая культура, но без разложения бумаги.

С использованием углеводов на основной среде Придгема-Готтлиба, выращивание и ри

27 С: манноза, инозит, крахмал, декстрин, лактоза, глицерин, галактоза, глюкоза, фруктоза и мальтоза — хороший рост. С рамнозой, инулином, дульцитом и арабинозой роста нет.

Ксилоза, вероятно, непригодна. Маннит, сорбит, салицин, рафиноза и сахароза дают различные результаты.

Суммируя вышеуказанные характеристики, можно сделать вывод, что штамм МА 350-СЗ относится к стрептомицетам нехромогенного типа. Нет образования завитков, но имеегся спиральная структура.

Поверхность спор в отличие от Str. kasugaensis ворсистая. На различных средах культура от бесцветной до желтоватого цвета с воздушным мицелием от белого до коричневатосерого цвета. Растворимого пигмента иет или есть слегка желтоватый. Гидролиз крахмала отсутствует или слабый. Сильное протеолигическое действие на среду. Положительное восстановление нитратов.

Среди известных видов стрептомицетов штамм напоминает S. albus Ваксмана и Ген5

Ьо

4 рици (1948) (S. А. Waksman, The actinomyeetes, voh 2), но отличается от него ворсистой поверхностью спор. Установлено, что штамм может давать, помимо казугамицина, аурестрицин и тиолутин аналогично Str. kasugaensis.

Однако Str. kasugaspinus может быть ясно отличен от Ыг. kasugaensis по поверхности спор и по другим признакам, Получено 600 мкг/слй казугамицина на восьмой день ипкубации, когда штамм, выделенный из почвы, выращивали при 27 С в среде, состоящей из 3,0 /о порошка мальтозы соевой муки (продукт Прорич фирмы Аджимото) 0,1 /о КНР04, 0,1 _#_igSO4.7Н О, 0,3 /о

NaC1, 0,0007 /р CuSO4 7Н О, 0,0002 /р

ZnSO4 5 Н О, 0,5 /о пептона, 0,35 /о СаСОа и

0,08 /о соевого масла (рН 7,0), при взбалг:iвании в машине, делавшей 140 ходов/мин с амплитудой 8 см.

Получено 3950 мкг/см3 казугамицина, когда штамм при моноспоровой селекции выращивали таким >ке образом, как указано выше, в среде, состоящей из 5,0% порошка соевой муки (продукт SÇ вЂ” мясо фирмы Аджимото) и 4,0>/z соевого масла (масло Ширашими— продукт фирмы Аджимото) (рН не регулируют) . Считается, что путем надлежащей селекции из штамма можно получить штамм с высокой способностью образования казугамицина.

П ример 1. Среду, состоящую из 40>io мальтозы, 3,0 /, соевой муки (продукт Прорич фирмы Ад>кимото), 0,1 /о К НРО, 0>1%

Мд804 Н О; 0,3 NaC1, 0,0007 /о Си504 7 НоО, 0,001 /о ZnSO<, 0,0008 /о МпС1, 7Н О, 0,0002 /о ZnSO< 5 Н О, 0,05>/О пепгона (полипептон фирмы Дайго Сейяку), 0,35% СаСОЭ и 0,08 /о соевого масла, разливают по 125 мл в колбы емкостью 500 мл. рН доводят до 7,4 и автоклавируют 20 мин при температуре 120 С. Эту стерилизованную в автоклаве среду инокулируют чистым штаммом с помощью платиновой петли и культивируют во взбалтывающей машине при температуре

27 С в течение пяти дней. На пятый день рН достигает 7,6.

Культуральную жидкость фильтруют для отделения массы мицелия, в фильтрат добавляют 1 н. НС1 для осаждения нерастворимых веществ при рН 5,0. Затем фильт1>ат фильтруют, и получают 450 мл прозрачного раствора, в котором содержится 360 мг казугамипина, Фильтрат пропускают через колонку диаметром 1,2 см, заполненную кислотной ионообменной смолой (амберлит ХЕ-100) аммиачного типа. Казугамицин, адсорбированный смолой, вымывают 0,5 и. аммиаком. Активный элюат содержит 300 мг казугамицина. 90 см активного элюата заливают в колонку диаметром 0,8 см, заполненную активированным углем (продукт Wako). После промывки 50мл деионизированной воды казугамицин вымывают 05 н, НС1 в виде его солянокислой соли

30,2 мл активного элюата содержат 180 мг казугамицина. Злюат упаривают во вращаю2981М

Составитель М. Дранишников

Техред Л. Л. Евдонов

Редактор Н. Вирко

Корректоры: Л. Корогод и М. Коробова

Заказ 1227/19 Изд ¹ 532 Тираж 473 Подписное

ЦНИИПИ Комитета по делам изобретений п открытий при Совете Министров СССР

Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Типография, пр. Сапунова, 2 щемся испарителе при пониженном давлении и температуре ниже 40 С. К 5 мл концентрата добавляют десятикратный объем эталона для осаждения казугамицина, Осажденный казугамицин высушивают, и получают 140 мг сырых кристаллов, содержащих 132 мг казугамицина. Эти сырые кристаллы растворяют в 8 мл воды и добавляют 12 мл этанола. После отстаивания при комнатной температуре получают 96 мг кристаллического казугамицина. Идентичность этих кристаллов с солянокислым казугамицином подтверждена инфракрасным спектром, хроматографией на бумаге, хроматографией в тонком слое, высоковольтным электр офорезом и элементарным анализом.

Пример 2. В колбы емкостью 500 мл вносят по 80 мл среды, состоящей из 5% соевой муки и 4,0 /о соевого масла (рН не регулируют), и инокулируют ее штаммом. Инкубируют при 27 С во взбалтывающей машине, делающей 144 хода/мин с амплитудой 8 см. На восьмой день рН достигает 7 5. Получают

3570 мкг/смз казугамицина. 920 мл культуральной хкидкости центрифугируют для удаления мицелальной массы. К полученной прозрачной жидкости, содержащей 3570 мкг/мл антибиотика, добавляют 400 мл этилового эфира б для удаления оставшегося масла. Нижний слой упаривают для удаления этилового эфира, и получают 750 мл жидкости, содержащей

4250 мг/мл антибиотика.

5 Эту жидкость пропускают через хроматографическую колонку диаметром 3,2 см с углем.

После промывки водой элюируют 005 н. НС1 и собирают активные фракции, которые нейтрализуют и концентрируют до 20 мл. К ним

10 добавляют этанол для осаждения неочищенного порошка. Последний растворяют в 20 мл воды, добавляют 35 мл этанола и оставлгоот стоять на ночь, после чего получают 2,65 г кристаллического вещества. его идентифици15 руют с солянокислым казугамицином по точке плавления, оптическому вращению, инфракрасному спектру и другим свойствам.

Предмет изобретения

2О Способ получения антибиотика казугамицина, включающий культивирование гриба-продуцента рода Steptomyces в аэробных условиях глубинным методом на жидкой питательной среде, содержащей источники углерода, азота

25 и минеральных солей, отличающийся тем, что в качестве гриба-продуцента берут Streptomyces kasugaspinus, а культивирование ведут при температуре 25 — 35 С.