Способ получения l-лизина

 

298632

ОЙИСАНИ Е

ИЗОБРЕТЕНИЯ

К ПАТЕНТУ

Оаюэ Советскик

Социалистических

Республик

Зависимый от патента ¹

Заявлено 14Х! !.1968 (№ 1266532/28-13)

Приоритет ЗОХ1П.1967, № 55213f67. Япония

МПК С 12d 13/06

Комитет по делом изобретений и открытий при Совете Министров

СССР

Опубликовано 11 !!!.1971. Бюллетень № 10

УДК 663.15:668.394 (088,8) Дата опубликования описания 12Х.1971

Автор изобретения

Иностранец

Казуми Араки (Япония) Иностранная фирма

«Киова Хакко Когио Ко., Лтд.» (Япония) Заявитель

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ L-ЛИЗИНА

Изобретение относится к микробиологической промышленности и касается способа получения L-лизина.

Известен способ получения L-лизина культивированием штамма Corynebacterium glutaписшп М-901 в аэробных условиях в водной питательной среде, содержащей источники углерода, азота, минеральные соли и аминокислоты, в которых нуждается штамм для синтеза лизина, а именно гомосерин, или треонин+

+ метионин, или треонин + цистин, или треонин + гомоцистин. Аминокислоты обычно вводятся в питательную среду в виде различных белковых гидролизолитов.

Для повышения выхода L-лизина на стандартных средах предложено использовать мутанты, полученные из штаммов Corynebacterium glutamicum АТСС 14296 и М-901 АТСС

13287 ультрафиолетовым облучением, например Corynebacterium glutamicum M-901-2347

АТСС 21253, Corynebacterium glutamicum

М-901-2279 АТСС 2154, Corynebacterium glutaппсшп М-901-2234 АТСС 21255, Corynebacteгшгп glutamicum КУ9494 АТСС 21299, Corynebacterium glutamicum КУ 10092 АТСС 21300.

Эти мутанты отличаются от родительского штамма повышенными питательными требованиями, Мутант АТСС 21253 требует дополнительно лейцин, АТСС 21254 — гистидии, АТСС

21255 — изолейцин + валин, по сравненшо с мутантом АТСС 13287 АТСС 21299 требует гистодин, АТСС 21300 лейцин по сравнени о со штаммом АТСС 14296.

Ниже приведены сравнительные данные ио питательным требованиям известных и предложенных штаммов.

1о По предлагаемому способу пригодны как синтетические, так и природные питательные среды, содержащие источники углерода, азота, минеральные соли и необходимые аминокислоты.

15 В качестве источника углерода можно использовать углеводы (фруктозу, глюкозу, мальтозу, сахарозу, крахмал, гидролизаты крахмала, глицерин, сорбит, органические кислоты (например уксусная и т. п.). Эти веще2р ства можно использовать как в отдельности, так и в смеси одно с другим. В качестве источника азота можно использовать различне неорганические или органические соединения, например мочевину, аммониевые соли (хло25 рид, сульфат, нитрат, ацетат, фосфат), или природные вещества, содержащие азот, например, кукурузную барду, дрожжевые или мясные экстракты, пептон, рыбную муку, бульо298132

Питательные требования

Штамм

Corynebacterium

glutamicum

М-901 АТСС

13282 (исходный штамм)

Corynebacterium

glutamicum

М-901 2347

АТСС 21253

Corynebacterium

glutamicum

М-901 ¹ 2279

АТСС 21254

Corynebacterium

glutamicum

М-901 № 2234

АТСС 21255

Треонин

Corynebacterium

glutamicum

АТСС 14290 (исходный штамм)

Corynebacterium

glutamicum

КУ9494 АТСС

21299

Corynebacterium

glutamicum

КУ10092 АТСС

21300

Треонин + гистидин

Треонин + лейцин

Гомосерин или треонин + метионин, или треонин+ циста тионин, или треонин + гомостеин.

Гомосерин или лейцин, или треонин —,метпонин -! лейцин, или треонин + цистатионин + лейцин, или треонин +

+ гомоцистеин + лейцин.

Гомосерин вЂ, гистидин или треонин + метионин + гистидин, или треонин + цистатионин + гистидин, или треонин + гомоцистеин вЂ, гистидин

Гомосерин + изолецин + валин или треонин + метионин +

+ изолейцин + валин, или треонин + цистатионин +

+ изолейцин + валин. ны, гидролизат казеина и т. п. Указанные вещества могут применяться как в отдельности, так и в комбинации одно с другим.

К числу минеральных солей относятся сульфат магния, фосфаты, натрия и калия, сульфаты железа и марганца, хлориды марганца и кальция, углекислый кальций, хлористый натрий и т. п. Однако при использовании такого сырья, как меласса, которое содержит некоторое количество неорганических веществ, ферментацию ведут без добавления их в среду

Кроме того, для продуцирования L-лизина в среду необходимо добавлять соответствующие аминокислоты, необходимые для роста микроорганизма. Можно использовать аминокислоты или смеси аминокислот, полученные из природных веществ.

Предпочтительно применять различные виды белковых гидролизатов, например Миеки (торговое наименование гидролизата глутена или соевои муки, из которых удалена ГлуTaминовая кислота), микробные гидролизаты, гидролизаты сои, пшеничной клейковины и т. п.

Необходимое количество гидролизатов значительно меньше, чем количество исходных штаммов. Зто условие для предлагаемого способа.

Процесс получения L-лизина по предлагаемому способу ведут в аэробных условиях при температуре 24 — 30=С (лучше при 30 С) и

60 рН 5 — 8,5 (лучше при рН около 7,0). ПосЛе выращивания при этих условиях в течение 2—

5 дней в культуральной жидкости накапливается значительное количество L-лизина.

По окончании ферментации L-лизин отделяют от культуральной жидкости обычными способами, например обработкой ионообменной смолой, экстракцией растворителями, осаждением металическими coJIHMH, хроматографией и т. п.

Одной из важных особенностей предлагаемого способа является то, что попутно получают лишь небольшое количество L-валина, в то время как при использовании исходных штаммов получают значительные количества этого вещества.

Пример 1. Среду, содержащую 5 г/дкл мелассы (глюкоза), 0,05 г/дкл кислого фосфата калия, 0,05 г/дкл дикалийфосфата, 0,3 г/дкл мочевины и 4 г/дкл Миеки, инокулируют Cory1Iebacterium glutamicum М-901-2234 АТСС

21255 и выращивают при аэробном встряхивании при 30=С в течение 24 час, 3 л среды, содержащей 18 г/дкл мелассы (глюкоза), 4 г/дкл сульфата аммония и

1,5 г/дкл Миеки, помещают в ферментер емкостью 5 л и стерилизуют. 500 мл засевной культуры высевают в ферментационную среду.

При выращивании подают 3 л/мин воздуха, перемешивание ведут со скоростью 400 Об/мин, при температуре 30 С, рН среды 6,8 — 7,0 (с помощью аммиачной воды). После 70 час выращивания концентрация L-лизина в культуральной среде составляет 48,7 мг/мл (в виде гидрохлорида), выход по сахару составляет

27,0>/а. Концентрация попутного L-валина составляет менее 0,3 мг/мл. При выращивании в таких условиях исходного штамма АТСС

13287 концентрация 1.-лизина составила

37,2 мг/мл, концентрация L-валина 1,8 мг/мл.

По окончании выращивания культуральную среду отфильтровывают и обрабатывают сильнокислой катионообменной смолой обычным способом.

Пример 2. 3 л культуральной среды, содержащей 16 г/дкл сахарозы, 0,15 г/дкл кислого фосфата калия, 0,05 г/дкл дикалий — фосфата, 4 г/дкл сульфата калия, 0,05 г/дкл сульфата магния, 0,002 г/дкл сульфата марганца, 0,02 г/дкл сульфата железа, 30у/мл биотина, 120у/мл метионина 30 у/мл треонина, 50 у/мл лейцина и 100 у/мл цистина, помещают в чашечный ферментер емкостью

5 л и стерилизуют. 500 мл зародышевой культуры Car ylIebacterium glutamicum М-901-2347

АТСС 21253, полученной предварительным выращиванием (пример 1), инокулируют в ферментационную среду. Выращивание ведут так, как описано в примере 1.

После 70 час выращивания концентрация Lлизина в среде составляет 54,6 мг/мл (в виде гидрохлорида). Выход по сахару равен 34,2

Концентрация попутного L-валина составляет менее 0,5 мг/мл.

298132

Предмет изобретения

Составитель Г. Голева

Редактор В. Ф. Смирягина Техред Л. Л. Евдонов Корректор Л. Б. Бадылама

Заказ 1228/IS Изд. № 533 Тираж 473 Подписное

ЦНИИПИ Комитета по делам изобретений и открытий при Совете Министров СССР

Москва, 3(-35, Раушская наб., д. 4/5

Типография, пр. Сапунова, 2

В контрольном опыте при выращивании в тех же условиях исходного штамма Corynebacterium glutamicum АТСС 13287 и без использования лейцина в исходной ферментационной среде концентрация L-лизина составляет

42,1 мг/мл, концентрация попутного L-валина составляет 1,7 мг/мл.

Пример 3. Выращивание ведут, как описано в примере 1, но в качестве зародышевого штамма применяют Corynebacterium glutamicum М-901-2279 АТСС 21254. Получают культуральную среду, содержащую 50,7 мг/мл

L-лизина (в виде гидрохлорида).

Выход по сахару 28,1е/о.

Пример 4. Выращивание ведут, как описано в примере 1, но в качестве зародышева штамма применяют Corynebacterium glutamiсшп КУ 9494 АТСС 21299. Получают культуральную жидкость, содержащую 53,2 мг/мл

L-лизина (в виде гидрохлорида).

Пример 5. Выращивание ведут, как описано в примере 1, но в качестве зародышевого штамма применяют Corynebacterium glutamib

curn КУ 10092 АТСС 21300. Получают культуральную жидкость, содержащую 51,б мг/.ил

L-лизина (в виде гидрохлорида).

Способ получения L-лизина культивированием штамма Corynebacterium glutamicum в аэробных условиях в водной питательной сре1О де, содержащей источники углерода, азота, минеральные соли и необходимые аминокислоты, например в виде белкового гидролиза га, отличающийся тем, что, с целью повышения выхода продукта, используют мутанты, полученные из штаммов Corynebacterium glutamiсшп М-901 АТСС 13287 и АТСС 1429б ультрафиолетовым облучением, например Corynebacterium glutamicum М-901-2347 ATCC 21253, Corynebacterium glutamicum M-901-2279 АТСС

2о 21254, Corynebacterium glutamicum М-901-2234

АТСС 21255, Corynebacterium glutamicum КУ

9494 АТСС 21299, Corynebacterium glutamicum

КУ 10092 АТСС 21300.