Способ получения о-рибулозо-1,5-дифосфата
3O96IO
ОПИСАНИЕ
ИЗОБРЕТЕНИЯ
К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ
Союз Советских
Социалистических
Республик
Зависимое от авт. свидетельства №
МПЕ С 12d 13110
Заявлено 28.Х1.1969 (№ 1380369/30-15) с присоединением заявки №
Приоритет
Комитет по делам изобретений и открытий при Совете Министров
СССР
УДК 577.15.07:577.154 (088.8) Опубликовано 30.Х1.1971. Бюллстеш № 36
Дата опубликования описания 16.11.1972
Авторы изобретения Н. Г. Доман, А. К. Романова, H. Г. Русинова и Г. Н. Литовченко
Ордена Ленина институт биохимии им. А. Н. Баха
Заявитель
1!110 1 h,j ° г
СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ D-РИ БУЛОЗО-1,5-ДИ ФОСФАТА
D-рибулозо-1,5 - дифосфат (С5H»O»P>) соединение, являющееся акцептором углекислоты в уникальной реакции фиксации ее в процессах первичного биосинтеза органического вещества на нашей планете — фотосинтеза и хемосинтеза. Фермент, ответственный за эту реакцию, — рибулозодифосфаткарбоксилаза — изучен очень мало. Наличие достаточного количества D-рибулозо-1,5-дифосфата — необходимое условие для выяснения механизма этой важнейшей фермешативной реакции карбоксилпрования.
Принцип получения D-рибулозо-1,5-дифосфата основан на ферментативном превращении исходного продукта D-рибозо-5-фосфат в
D-рибулозо-1,5-дифосфат, протекающем в две стадии с участием ферментов рибозофосфатизомерами (D - рибозо-5-фосфат-кетол-изомераза, индекс по номенклатуре ферментов
1966 г. 5.3.1.6) и фосфорибулокиназы (АТФ:
D-рибулозо-5-фосфат-1-фосфат-трано — фераза, индекс 2.7.1.19) .
Схема реакции состоит в следующем:
I. D-рибозо-5-фосфат + рибозофосфатизомер аз а = D-р и булозо-5-фосфат.
II. D-рибулозо-5-фосфат + АТФ + фосфорибулокиназа = D — рпбулозо - 1,5 — дифосфат+- АДФ.
Согласно известным прописям получение
D-рпбулозо-1,5-дпфогфата состоит пз четырех основных стадий.
1) Получение ферментного препарата рибозофосфатизомеразы из листьев шп1шата.
2) Получение ферментного препарата фо"форибулокиназы также из листьев шп1шата.
3) Образование D-рпбулозо-1,5-дифосфата ферментагивным путем пз рпбозо-5-фосфата и
АТФ.
10 4) Выделение препарата D-рпбулозо-1,5-дпфосфата в виде барпевой соли и его очпстка.
Первые две стадии, если даже они объединены, весьма трудоемки и ненадежны. Это связано с тем, что участвующие в сшггезе
15 D-рибулозо-1,5 — дифосфата ферментные препараты рибозофосфатизомеразы и фосфорпбулокиназы по различным прич1шам часто бывают недостаточно активны или содержа" нежелательные пр меси, Ферменты рпбозофос20 фатизомераза и фосфорпбулокиназа, локализованные в хлоропластах, находятся в слабощелочной среде. Клеточный сок листьев больтнппства видов растений имеет явно кислую реакцию и часто содержит различные
25 ингибиторы, что неблагоприятно отражается
»а активности ферментов при их выделении из хлоропластов. Сравнительно редкое исключение представляют листья шпината, у которых реакция клеточного сока близка к нейтраль30 ной. Однако активность рибозофосфатпзоме309610
65
3 разы и фосфорибулокпназы, очевидно, зависит от физиологического состояния листьев, вследствие чего попытки получения ферментов не всегда успешны.
В отличие от известных способов предлагается в качестве ферментного препарата для получения D-рибулозо-1,5-дифосфата из рибозо-5-фосфата и аденозиптрифосфата (ЛТФ) использовать неочищенный бесклеточный экстракт тионовых бактерий Thiobacillus 58R (штамм выделен в Институте микробиологии
ЛН СССР).
Эти бактерии обладают рядом свойств, использование которых дает большие преимущества. Тионовые бактерии Thiobacillus 58R неприхотливы, растут достаточно быстро, не требуя ни дорогостоящих реактивов, ни сложного оборудования.
Разработан следующий спосоо получения бариевой соли D-рибулозо-1,5 дифосфата, Микроорганизмы выращивали в лабораторных условиях на минеральной среде состава:
Na SgQа 5 г
СаНРО 5 г
КН2РО 3 г
МДС1, 100 лгг
NH4Ñ! 100 лгг на 1 л водопроводной воды с непрерывной аэрацией (Emoto, 1929, Proc. Tmp. Acad.
Tokio, Ч, 5). Урожай сырой биомассы с 5 л среды от 1 до 2 г, Разрушали клетки для получения бесклеточного экстракта озвучиванием суспензий микробов в десятикратном количестве 0,05 л оль трис-С!-буфера рН 7,5 (триогидрокси) метиламинометан, нейтрализованный соляной кислотой) при 0 С в аппарате
MSE мощностью 500 в при 20 килоггиклах в течение 10 иин. Экстракт отделяли центр ифугированием при 15000 g в течение 30 лгин.
При составлении ферментпой смеси для превращения рибозо-5-фосфата в D-рибулозо1,5-дифосфат была принята за основу методика, предложенная для определения фосфорибулокиназы (J. Hurwitz, methods in
Enzymology т. 5, стр. 258), МдС1 бН20—
2000 лглоль. Навеску 406,7 лгг растворяли в
5 мл воды, перегнанной из стекла.
Цистеин солянокислый — 500 лииоль. Навеску 78,8 лгг растворяли в 2 лгл воды и нейтрализовали сухим трис-буфером до рН 7,5.
Рибозо-5-фосфат бария переводили в натриевую соль. Для этого 2000 лгло гь рибозо-5фосфата бария (навеска 840 иг с учетом содержания в препарате 15 /о гигроскопической воды) растворяли в 10 лл охлажденной до
0 С 0,1 н. соляной кислоты и добавляли
2000 лглголь (284 лгг безводной соли) сульфата натрия. Осадок BaSO удаляли центрифугированием, а супернатант нейтрализовали до рН 7,5 добавлением сухого трис-буфера.
Лденозин-3-фосфат — 2000 млголь, патриевая соль. Навеску 1267 лгг растворяли в 10 лл перегнанной из стекла воды и пейтрализова5
Таблица 1
Фосфор
D-рибулозо1,5-дифосфата неизвестный
Препарат минеральный
38,5
21,6
43,5
78,4
4 ли до рН 7,5 добавлением с xoro трис-б ф(ра.
Проведение реакции получения D-рибулозо-1,5-дифосф ата.
1(30 лл ферментного препарата добавляли
2 лл раствора цистеина, 5 лл раствора хлористого магния, 10 мл раствора рибозо-5фосфата натрия и 10 лг,г раствора ЛТФ. Конечный объем смеси около 60 мл.
Реакцию проводили в атмосфере аргона, который может быть заменен другим инертным газом, не содержащим углекислый газ, при комнатной температуре с подтитровкой
1 н. раствором NaOH для поддержания рН ферментной смеси 7,5 — 7,8. Реакция продолжалась от 3 до 5 лгин. Затем ферментную смесь охлаждали до 4 С, белок осаждали
5О/о -ной трихлоруксусной кислотой (конечная концентрация) и осадок удаляли центрифугированием.
Очистка и выделение D-рибулозо-1,5-дифосфата бария.
В основу дальнейшей процедуры частичной очистки и выделения бариевой соли положена методика Хореккера и сотр (Ногес1<ег
В. Z. et аl., Methods in Enzymology, 1957, т. 3, стр. 193, с некоторыми модификациями). Для удаления нуклеотидов (ЛТФ и ЛДФ) полученный раствор обрабатывали 60 г актпвированного угля марки БЛУ, предварительно промытого 1 н. НС1 и затем 10 /о ТХУ и orìûтого водой до нейтральной реакции. лКпдкую фазу отделяли от угля фильтрованием на
Бюхнеровской воронке с отсасыванием, уголь многократно (4 — 5 раз) промывали водой по
100 лл, каждый раз суспендируя уголь в воде. Опытный раствор и промывпые воды ооъединяли и нейтрализовали до рН 6,0 оглорожны и добавлением МаНСОа.
Затем к раствору добавляли 2 .ил 1 н. уксу снокислого бария и бариевую соль ГЭ-рибулозо-1,5-дифосфата осаждали добавлением
96О/р-ного этанола до конечной концентрации
30 об. /о. Осадок промывали. 80 /,-пым этанолом и высушивали до постоянного веса в вакумме эксикаторе над Р Оа.
Полученный продукт весил 300 лг, что соответствует выходу 25 /, от теоретического.
Препарат D-рибулозо-1,5-дифосфата весь— ма гигроскопичен. Он получается в виде дибариевой соли, склонной к присоединению криcràëëHçàöèoínoé воды.
Лпализ полученного препарата па содержание фосфора (в /О) представлен в табл, 1, 309610
Таблица 3
Стоимость реактива иа одно получение, р17>б
Количество реактива на одно получение, .иа
Стоимость за
1 н2, раб
Реактив
9,00
4,00
0,75
0,30
0,16
0,06
0,03
10900,00
2640,0
12,00
1100,00
1,00
0,25
840
13, 00
0,5
2500
150
100000
510
100000
2000
2000
180
Рибозо-5-фосфат
ЛТФ
15 Зтаиол
ТХУ
Глготатиои
К1 1.,1 0., с1а28аО.Ва (ООС вЂ” СНа) >
2р Са111 1- а f1gCI
1 1 Й,C l
Трис-Сl-буфер
Аргон
P O.—
Таблица
Радиоактивность, илп1.иин
Препарат
Контроль (без D-рибулозо-1,5-дифосфат) Опыт
0,05
3700
150
0,01
0,12
100000
Составитель М. Дранишников
Рс,1аьтор Н. Воликова Тсхред Е. Борисова Корректор Л. Орлов".
Заказ 154/7 Изд. № 1790 Тираж 473 Подписиос
ЦНИИПИ Комитета по делам изобретеши1 и открытий при Совстс 31ииистров СССР
Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 475
Типография, пр. Сапунова, 2
Фосфор D-p floe лазо-1,5-дифосфата определяли Ifo количеству щелочслабильиого фосфора.
Элементар ый анализ показал соответствие формуле
СвНа01тР Ва 7НзО.
Экспериментальные данные, о а: С 8,60; 8,69;
II 2,81; 3,09; Р 8,8,13; 7,72.
Рассчетцыс Iaffff1 le, %: С 8 49; Н 3 10;
P 8,79.
В табл. 2 дана ферментная активность препарата.
Состав фермецтиой смеси для проверки споcooIIocTH D-рибулозо-1,5-дифосфата акцептировать углекислоту, плоль/>ил фермеитиой смеси:
xgci„ 10
Глютатион восстановленный 10
NaHC,.1Оз или NagCg.10з 50 и бесклеточпый экстракт из хемосинтезирующих бактерий или гомогеиат высших растений. (Данные отдельных опытов ие сравнимы между собой и имеют качественный характер, так как использовались различные источники ферме1гга и пестапдартиыс препарагы радиоактивной соды). Результаты фермеитативиой проверки свидетельствуют о высоком качестве полученного препарата, как реактива — акцсптора С02.
Расчет себестоимости препарата D-рибулозо-1,5-дифосфата, полученного по предлагаемомуу способу.
Так как предлагаемый способ ис требует использования сложны.; дорогостоящих приборов (за исключением обычной центрифуги и генератора ультразвука MSE), то затраты, связанные с амортизацией оборудования, включая эти приборы, незначительны, При однократном получении препарата опи не преBIIIlIBIoT íескольких копеек и практически могут быть отброшены. Поэтому основные расходы па приготовление D-рибулозо-1,5-дифосфата составляют стоимость реактивов и ollлата труда.
Расходы иа одно получение (300 11г) препарата D-рибулозо-1,5-дифосфата приведены в табл. 3.
Стоимость расхода электроэнергии иичтожIla (мепьше 1 кот1), накладные расходы также меньше 1 кои и прп одноразовом получс30 пии могут быть отброшены, оплата труда (три рабочих дня старшего лаборанта)
15 руб. Итого около 30 руо.
Таким образом, все необходимые расходы иа однократное получение D-рибулозо-1,5-ди35 фосфата по предлагаемому cIIocooó при выходе 300 пг примерно в 10 раз ниже, чем существующая его цсlla. При систематическом пОЛ \ чеIIIIII стоимость р>сактива мОжст бь! 11> значительно снижена.
Предмет изобретс и и я
1. CIIOCOO 110 lb ICIIIIH D-11110 f 7030-1,5-дис)10сфата из рибозо-5-фосфата и адспозиптрифосфата с использоваписм биокатализаторов, 45 от,шиа1оп1пй1ся тем, что, с целью сокращеци» стоимости готового продукта, в качестве биокатализаторов берут оесклеточный экстракт штамма ThiobaciIIIfs 58 R (ИцституT микробиологии ЛН СССР).
50 2. Способ по п. 1, от>1анаюп(п11ся тем, что штамм Thiobacil los 58 g выращивают па среде Emoto в аэробцых условиях, предпочтительно при 30 С и рН среды начал1пом 5,2, конечном 2>0.
