Всесоюзная i

 

О Л И С А Н И Е 352468

ИЗОБРЕТЕН ИЯ

Союз Советских

Социалистических

Республик

К ПАТЕНТУ

Зависимый от патента Кв

М. Кл, C 12d 9/00

Заявлено 17.Х1,1967 (Л 1196860/30-15) Приоритет 25.XI.1966, М 52796/66, Великобритания

Комитет по делам изобрвтеиий и открытий при Совете Министров

СССР

УДК 631.937:615.779.9 (088.8) Опубликовано 21.IX.1972. Бюллетень М 28

Дата опубликования описания 9.Х.1972

Авторы изобретения

Иностранцы

Бернард Морис Лейн и Клод Реймонд Маньу (Франция) Иностранная фирма

«Бритиш Петролеум Компани Лимитед» (Великобритания) Заявитель

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АНТИБИОТИЧЕСКОГО КОМПЛЕКСА

Изобретение относится к способу получения антибиотиков и антибиотических комплексов.

Известен способ получения антибиотического комплекса, содержащего гризеофульвин, состоящий в культивировании микробиологического штамма-продуцента на питательной среде, содержащей источники углерода, азота и минеральных солей, в том числе содержащей углеводород, в аэробных условиях с последующим выделением комплекса из культуральной среды.

Используемый углеводород содержится преимущественно во фракциях минеральных масел, например нефти, сланцевого или угольного дегтя. Он может представлять собой керосин, газойль смазочные масла, экстракты, полученные при регенерации смазочных масел.

Углеводород обычно состоит из смеси углеводородов, содержащих не менее 10 атомов углерода.

В качестве источников углерода можно использовать моносахара, молочную сыворотку, мелассу, кукурузную барду, соевую муку, хлопковый жмых и т. д.

Источниками азота служат азотнокислый калий, азотнокислый аммоний, аммиак, мочевина, автолизат и гидролизат дрожжей, соевая мука, хлопковый жмых и т. д.

С целью получения комплекса, непосредственно пригодного для использования против фптопатогенных микроорганизмов культивирование продуцента осуществляют в две стадии с использованием в качестве продуцента в первой стадии дрожжей рода Candida, в частности С. tropicalis и С. Iipolytica, а во второй стадии — плесневых грибов рода Penicillium, в частности P. grseofulvum-АТСС 11855 и

P. nigricans-АТСС 9439, и выделяют антпбиотический комплекс в виде углеводородной

10 фракции, содержащей антибиотик, с добавлением при необходимости в культуральную среду дополнптельHого количества углеводорода.

В первой стадии соотношение между углеродом и азотом в питательной среде составля15 ет обычно не меньше 20: 1, преимущественно

10: 1 а во второй стадии — не меньше 80: 1, рН на первой стадии 4,5 — 5,0, на второй 5 — 8.

Используемый углеводород выделяется вместе с микроорганизмом первой и второй ста20 дии таким образом, что микроорганизм на первой стадии способен метаболизировать только лишь часть углеводорода, а на второй стадии способен метаболпзировать по меньшей мере ту часть углеводорода, которая не была мега25 болпзпрована ранее.

Антибиотик растворяется в углеводороде используемом в качестве растворителя, способного растворить более 1 «г культуры на 1 л раствора, преимущественно 0,001 — 5 г/л и

30 большей частью 0,5 г/л.

352468

0,1

0,01

0,01

100 лл

Таблица !

Антибиотик "., л г

Сухой вес мицелия, регенернрованНомер I примера ный йз газойля регенернрованный из водной фазы

1632

17,5

11,1

24,7 бб

53

105

Потребление углеводорода микроорганизмом при определенных условиях реакции может быть таким, что незначительное количество остаточного углеводорода не сможет растворить гризеофульвин, который при этих условиях в значительных количествах присутствует в водной фазе. Для перевода всего гризеофульвина в углеводородную фазу желательно добавить в культивируемый продукт углеводородсодержащую среду, которая может быть той же самой или отличаться от уже использованного углеводорода.

Обычно гризеофульвин переходит в углеводородсодержащую фазу, а микроорганизм— в водную. Для выделения используют метод фильтрования и/или центрифугирования.

Все стадии могут быть проведены одновременно и непрерывно.

Состав, содержащий раствор гризеофульвина в углеводороде, пригоден для использования в сельском хозяйстве, в частности в качестве соматического антибиотика, в концентрации 0,1 — 0,4 г/л, преимущественно 0,25 г/л.

Его можно использовать для обработки почвы, растений, деревьев или семян при борьбе с Alter ïàïà, Ielmir! thospor Fusarium, О! а1цгп.

При мер 1. В колбу емкостью 1 л, оборудованную системой аэрации, высевают 500 мл смеси субстрата с питательной средой, содержащей (в г):

Кукурузная вытяжка 48

Глюкоза 50

Фосфорнокислый калий 4

Хлористый натрий 1

Смесь разбавляют 1000 ч. мягкой воды, содержащей микроэлементы.

Соотношение между углеродом и азотом в смеси 20: 1. В 48 г кукурузной вытяжки содержится 4 г азота.

К этой смеси добавляют 50 ял суспензии спор штамма P. griseofulvum-ATCC 1! 885 и выдерживают при 26 С и рН 4,5 — 5 при аэрации культуры со скоростью 200 об час.

Через трое суток мицелий отфильтровывают на воронке Бюхнера и промывают равным объемом среды, состав которой указан ниже.

Мицелий высевают в колбу емкостью 1 л с системой аэрации, содержащей 500 нл смеси субстрата с питательной средой, содержащей (В г):

Лзотнокислый натрий 2

Газойль 200

Фосфорнокислый калий 4

Хлористый калий 1

Сернокислый магний 0,5

Раствор микроэлементов 5 лл

Водопроводная вода 1000 мл

Отношение углерода к азоту в смеси 80: 1.

Раствор микроэлементов содержит (в г):

Сернокислое железо 0,1

Сернокислая медь 0,015

Сернокислый цинк

Сернокислый марганец

Молибденовокислый калий

Минеральная вода

Лэрацию проводят со скоростью 600 oo/час.

Вначале добавляют 50 г газойля и затем через 1 сутки 16 г, через 2 суток 16 г, через 3 суток 16 г и через 4 суток 50 г газойля.

С целью регенерации неметаболизированного газойля и биомассы, культуру фильтруют на воронке Бюхнера через последующие четверо суток, получая фильтрат, состоящий из водной фазы и газойля, и остаток, содержащий мицелий.

Мицелий сразу же дважды обрабатывают гексаном и сушат при 90 С. Из фильтрата выделяют газойль с растворенным гризеофульвином.

Содержание антибиотика в неметаболизированном газойле определяют биологическим способом по Fusarium culmorum. Содержание антибиотика в мицелии определяют следующим способом.

Мицелий сушат при 50 С, взвешивают и измельчают. К 1 г мицелия добавляют 10 лл бутилацетата и перемешивают 1 час при 50 С.

После фильтрования на воронке Бюхнера фильтрат концентрируют в вакууме при 50 С, остаток обрабатывают гексаном и нерастворимую фракцию растворяют в ацетоне в пропорции 1 л л ацетона на 1 г остатка смеси. Эту смесь снова фильтруют на воронке Бюхнера и содержание гризеофульвина в ацетонном растворе измеряют спектрофотометрически в

УФ-свете при 288 линк, Результаты, полученные для P. grisenfuli шп, представлены в табл. 1.

Установлено, что мицелий почти свободен от ан тнбиотнка.

Пример 2. Повторяют способ обработки, описанный в примере 1, но вместо 50 г глюкозы в первой стадии обработки культуры в качестве источника углерода используют 150 г газойля.

Смесь разбавляют 1000 ч. мягкой воды, содержащей микроэлементы. Результаты представлены в табл, 1.

Пример 3. Повторяют способ, описанный в примере 2, но вместо 150 г газойля в первой стадии обработки культуры используют 25 г/л тяжелых жирных кислот, состав которых приведен в табл. 2.

352468

Таблица 2

Число атомов углерода

Вес. о;

1ин

14

16

16

17

17

18

18

)18

0,7

4,5

10,9

8,1

7,2 10

47.2

2,4

17,7

1,3

Насыщенньш

Насыщегшьш

Насыщенный

Ненасыщенный

Насыщенньш

Ненасыщенный

Насыщенный

Ненасыщенный

Таблица 3

Антибиотик. лгг

Номер примера регенерированный нз водной фазы регенерированный из газойля

384

768

1088

5

256

Тяжелые жирные кислоты получают при гидролизе дрожжей, выращенных на фракции нефти, в 10%-ном спиртовом растворе едкого кали в течение 3 час при температуре кипения.

После этого полученую смесь обрабатывают гетролейным эфиром до восстановления пены тяжелых кислот с последующим окислением и промыванием водой. Остаток представляет собой фракцино тяжелых жирных кислот.

Результаты опыта представлены в табл. 1.

В примерах 2 — 6, как и в примере 1, в качестве микроорганизма используют 1д. гг1веоЫvum.

Пример 4, Для получения культуры мпцелия повторяют первую стадию способа по примеру 1, но культуру выдерживают на кукуруз

IIo-глюкозном субстрате в течение девяти суток при аэрации со скоростью 200 об/час в течение трех суток и при аэрации со скоростью

400 об/час в последующие дни.

Затем культуру смешивают с 20%-ным газойлем rI выделяют антибиотик, как в примере 1.

Результаты опыта представлены в табл. 3.

Пример 5. Повторяют способ по примеру 4, но культуру выдерживают в гечепие семи суток па кукурузно-глюкозном субстрате и газойль перемешивают с культурой в течение бб час.

Полученные результаты приведены в табл.3.

П р и мер 6. Повторяют способ по примеру 5, но в культуру добавляют газойль и выделяют культуру в три стадии. Сначала перемешивают культуру 1 час в 20%-ном газойле с последующей регенерацией газойля, затем

1 час в 20%-ном свежем газойле с последующей регеп-рацией газойля и, наконец, 2 час в

20%-ном свежем газойле с последующей регенерацией газойля.

В целом это соответствует перемешивашпо

1 л культуры с 600 лг,г газойля в течение 4 час.

Полученные результаты представлены в табл. 3.

Пример 7. В ферментер-мешалку емкостью

15 л заливают 10 л водной минеральной среды, содержащей (в вес. %):

Фосфат натрия трехосновный 3,4

Xëoðèñòhø калий 0,6

Сернистый магний 0,3

Сернистый аммоний 2,5

Состав разбавляют 1000 ч. мягкой воды, содержащей микроэлементы.

В ферментер дополнительно вносят несколько миллионов едш.иц дрожжевого экстракта, а затем 50 г штамма культуры С, tropicalls в виде водной пены, содержащей 20 вес. % сухого материала и 150 г тяжелого газойля, содержащего 20 вес. % углеводородов парафинового ряда.

Температура культуры 30+1 С, рН 4. Условия аэрац;ш и переглешива1шя поддерживаются такими, что ь 1 лпи в 1 .г среды вводят

3 .ll.ноль 1 1Icдорода. Растворение аммиака контролируют автомат, чсскнм рН-метром.

Когда плотность ячеек пены достигает 4 г/л, скорость аэрац.ш ферментера составляет

0,1 об/час. К эгому времени содержание ra".îéëÿ в ферментере позышается до 120 г/л.

Обработанную среду удаляют пз ферментера, добаьляют (в г/л): 2 азотнокислого калия, 4 фосфорнокислого калия, 1 хлористого калия и 150 газойля и к 1 л смеси примешивают пнокулят, состоящий из P. griseofulvum, выращенного на кукурузно-глюкозном экстракте, как указано в примере 1. Эту смесь перемешивают с аэрациei четверо суток. За это врез я происходит регенерация газойля. Он содержит 2 г/л антибиотика.

Для получения дрожжевого экстракта к верхиси фазе, полученной после удалешгя

65%-ной отраоотанной среды и замены ее во".îïðîâîäíîé водой, добавляют 0,5 г/л неионi ого моющего средства «НИ-29:> и в результате конденсации получают продукт, который содержит 1 г-.ноль лауринового спирта и

8,75 г-лоль окиси этилена, После центрифугированпя регеперируют (в г/л):

Отработанная минеральная вода 839

Неметаболпзированный газойль 112

Пастообразная масса микроорганизма 49

Пастообразну1о массу микроорганизма промывают водои при комнатной температуре и цснтрпфугируют. Полученная пастообразная

;. асса дрожжей содержит 65 — 70% воды.

Для получеш1я пастообразной массы дрожi)(p. содер>кащей 50 вес. % сухих дрожжей II

50 вес. %- воды, из нее удаляют избыток воды.

После этого сырые дрожжи вносят под давлением в экстрактор, представляющий собой фильгровальный барабан, вращающийся на

3524о8

Таблица 4

После заключительной регенерации

До ооработки

Показатель, q

11,0

9,5 одержание азота в сухих дрожжах

Содержание всех липпдов в сухих дрожжах

0,2

13,8

Составитель M. Дранишников

Редактор T. Шарганова Техред Л. Евдонов Корректор Л. Бадылама

Заказ 3224!16 Изд. ¹ 1330 Тираж 400 Подписное

ЦНИИПИ Комитета по делам изобретений и открьггпй при Совете Министров СССР

Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4 5

Типография, пр. Сапунова, 2 горизонтальной оси. В сырые дрожжи добавляют смесь (при соотношении между смесью и сухими дрожжами 8: 1), состоящую из 50% гексана и 50% изопропанола. Дрожжи с водой и растворитель выдерживают 30 вин при

50 С, затем удаляют растворитель, содержащий основную часть загрязняющих веществ.

Оставшуюся часть сырых дрожжей снова обрабатывают смесью растворителей при 50 С в течение 30 лик, используя 1 ч. воды, 4 ч. смеси, состоящей из 50% гексана и 50% изопропанола, на 1 ч. сухих дрожжей. После удаления экстракта, содержащего загрязнения, остаток обраоатывают 2 ч, смеси, содержащей

80% и-гексана и 20% изопропанола.

Смесь выдерживают 10 лтин при 50 С, удаляют из нее под давлением растворитель, повторяя процесс очистки четыре раза.

Дрожжевой продукт высушивают перегретым паром.

Результаты анализа дрожжей до и после регенерации смесью растворителей представлены в табл. 4.

Полученный дрожжевой продукт, свободный от загрязнений, может быть использован в качестве кормового материала.

Характеристика используемого в опытах газойля:

Уд. вес. при 60 C 0,8698 п20 1,4835

Температура помутнения, С +16

Температура застывания, С + 15

Содержание серы, % 1,67

Содержание н-парафина, % 14,7

10 Предмет изобретения

1. Способ получения антибиотического комплекса, содержащего гризеофульвин, включающий культивирование микробиологического штамма-продуцента на питательной среде, содержащей источники углерода, азота и минеральных солей, в том, числе содержащей углеводород, в аэробных условиях и последующее выделение аптибиотического комплекса из культуральной среды, отличающийся тем, что, с целью получения комплекса, непосредственно пригодного для использования против фитопатогенпых микроорганизмов, культивирование продуцента осуществляют в две стадии с использованием в качестве продуцента в

25 первой стадии дрожжей рода Candidà, в частности С, tropicalis и С. )ipolytica, и во второй стадии — плесневых грибов рода Penicillium, в частности P. griseofulvum-ËÒÑÑ 11885 и

P. nigricans-ЛТСС 9439, а выделение антиби30 отического комплекса проводят в виде углеводородной фракции, содержащей антибиотик, с добавлением при необходимости в культуральную среду дополнительного количества углеводорода.

35 2. Способ по и. 1, отличающийся тем, что соотношение между углеродом и азотом в питательной среде составляет в первой стадии культивирования не менее 20: 1, а во второй стадии культивирования не менее 80: 1.