Способ получения циклопептидных производныхполимиксинов

 

О П И С-А-Й -И-ИИЗОБРЕТЕНИЯ

Смз Советских

Социалистических

Республик

К ПАТЕНТУ

Зависимый от патента №

Заявлено 15,VI 1.1970 (№ 1459291/23-4)

Приоритет 05.VIII.1969, № б926912, Франция

М. Кл. С 07с 103/52

Комитет по делам

УДК 547.964.4.07 (088.8) Опубликовано 28.XI.1972. Бюллетень № 36 изобретений и открытий при Совете Мииистров

СССР

Дaòà опубликования описания 4.IX.1973

Авторы изобретения

Иностранцы

Жан Бушодои и Жорж Жоль (Франция) Иностранная фирма

«Рон-Пуленк С. А.» (Франция) Заявитель

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЦИКЛОПЕПТИДНЫХ ПРОИЗВОДНЪ|Х

ПОЛИМИКСИНОВ

Изобретение относится к циклическиМ 11pdизводным полимиксинов общей формулы (М) ДАМ-чЛАМ вЂ” Y-дАМ-ДАМ TPE и к их получению.

В общей формуле (1) различные символы имеют следующее значение:

Y — одна из цепочек Д-лей-ТРЕ, Д-фаллсй, Д-лей-лей, Д-лей-илей;

Х вЂ” радикал общей формулы

Ру — СН вЂ” Π— СО (11)

R где Py — радикал пиридина или N-окиси пиридина, незамещенный или замещенный метильным радикалом;

R — атом водорода или алкильный радикал с прямой или разветвленной цепью, содержащий 1 — 5 атомов углерода, или фенильный радикал, 2

Международный Союз чистой и прикладпотт химии использует сокращения для обозначе.ния аминокислот. Символ ДАМ обозначает сс,у-диаминомасляную кислоту, также было обусловлено, что за исключением противоположного указания аминокислоты имеют 1 -конфигурацию.

Циклические пептиды общей формулы (1) являются новыми прдуктами и могут быть

10 применены в качестве промежуточных продуктов при синтезе полусинтетических производ

Hb1x полимиксинов для модификации боковой цепи, обладающих высокой антимикробной активностью, особенно против Грамот-отрица15 тельных микроорганизмов, и имеющих пониженную токсичность по сравнению с полимиксинами, выделяемыми до настоящего времени из смесей, получаемых ферментацией.

Продукты общей формулы (1) могут быть

20 присоединены к полусинтетическим полнмиксинам, так как они содержат только одну свободную аминогруппу, способную к замещению при помощи методов, обычно используемых в химии пептидов.

25 Известно, что полимиксины, полученные

360766

Е ДАМ вЂ” ТРŠ— Z jfAN- ДАМ вЂ” Ъ -ДЬИ-ДАМ вЂ” ТРЕ (Ш) Е ДАг" — TPE-2 — ДАМ-Д AN — Y-ДАМ вЂ” ДАМ вЂ” ТРЕ

Х

Х Х Х (IV)

35 (V1) ферментацией, имеют различный вид, обычно обозначаемый буквами Л, В, Д, Е, М. Эти погде К вЂ” н-октанил, 1 -6-метилоктанил или 6метилгепта.нил;

Y — Д-фал-лей, Д-лей-лей; Д-лей-плей;

Z — ДЛМ.

Таки е известно, что боковая цепь полимиксинов может быть удалена при селективном разрыве пептидной связи, соединяющей указанную цепь с полипептидиым циклом без разрыва пептидных связей этого цикла. Для полимиксина E такое отделение было осуществлено с помощью энзимов. Но продукты, полученные при таком разрыве пептидной связи между боковой цепью и полипептидным циклом,,не пригодны для получения полусинтетических производных, потому что они помимо аминогруппы, освобожденной под действием энзима, имеют некоторое число аминиых функций в цикле из-за присутствия звеньев а,у-диаминомасляной кислоты в цикле; в самом деле невозможно осуществлять селективное вступление в реакцию аминной функции, освобожденной под действием энзимов.

Согласно предлагаемому способу аминные функции полипептидного цикла полимиксинов где Х, К, Z u Y имеют указанные выше значения, аминокислота, представленная символом

Х, является главным образом носителем одной из группировок, представляемых символом Х, когда Х означает а,у-диаминомасляную кислоту, при селективном гидролизе пептидной связи, соединяющей лине1гную боковую цепь с полипептидным циклом. Этот гидролиз осуществляют энзиматическим путем в условиях, подходящих по длительности, темпера гуре и рН.

Различные протеолнтические энзимы способны осушествлять этот селективный гидролиз, в особенности протеазы экзоклетчатки, переработанные различными тигами Bacilus subtilus, такими, как субтилизин, .нагарза, проназа, колистиназа, алказа и еще протеазы, переработанные в. subtilus И АХО 417, в. subtilus

А.Т.С.С.9524 или Вас. THE 4.

В зависимости от используемого энзима выгодно работать при температуре 20 — 70 С в буферной среде с рН 5 — 9.

Продукты общей формулы (IV), в которых символы К, Х и Z — имеют указанные выше лимиксины могут быть представлены общей формулой общей формулы (III) могут быть блокированы с помощью защищающих группировок общей формулы (IE). 1акие группировки могут быть (1>иксированы с хорошими выходами на защищаемых амииогруппах. Можно также получить полимикснны, у которых свободные вначале амииные функции, являются блокирован10 ными, растворимыми в водной среде, что позволяет подвергать их энзиматическим реакциям при таких условиях рН, температуры и продолжительности реакции, что активность используемых эпзимов вызывает специфичес15 кий разрыв только пептидной связи между боковой цепью и полипептидным циклом полимиксинов, без воздействия на последний.

Кроме того, такие защищающие группировки могут быть легко удалены впоследствии без

20 разрыва полипептидиого цикла, например, гидрогенолизом. Наконец, такие защищающие группировки, несмотря на модификации, которые они вызывают в цикле, не препятствуют действию энзимов.

25 Продукты общей формулы (I) по предлагаемому способу могут быть получены из продуктов общей формулы значения, мотут быть получены из полимиксй-. нов общей формулы (IIE) обычными методами, применяемыми в химии пептидов для блокиуоваиия аминных функций. Особенно удобно вводить во взаимодействие со смешанным карбонатом общей формулы

Ру — СН вЂ” Π— СΠ— Π— Т (V) !

К где Ру и 3 имеют значения, указанные вы40 ше; Т вЂ” фенильный радикал или замещенныи феиил, например н-ннтрофенил, 2,4,5-трихлорфенил, гетероциклический радикал, например радикал хинолил-8 или 2,5-диоксопирролиди45 пил-1. Реакц|ию предпочтительно проводить в среде диметилформамида при температуре

15 — 60 С.

Смешанные карбонаты общей формулы (V) можно получить при действии хлороформиата

50 общей формулы

Сl — СΠ— Π— Т

360766

6, где Т имеет указанное значение, на спирт общей формулы

Ру — СН вЂ” ОН (VII)

R в которой Ру и К имеют значения, определенные выше.

Эту реакцию предпочтительно проводят в среде пириднна примерно при 0 C или в смеси пиридинмстиленхлорид при температуре 0—

20 С.

Пептиды общей формулы (IV), смешанные карбонаты обще.i формулы (V) и спирты общей формулы (VII), у которых символ Ру означает радикал N-окиси пиридина, могут быть получены из соответствующих неокисленных продуктов при действии на них такого подходящего окисляющего агента, как и-нитропербензойная кислота. Обычно работают в среде инертного органического растворителя, которым может быть спирт, например метанол, хлорированный растворитель, например хлороформ, или сложный эфир, например этилацетат, при температуре 0 — 25 С.

Продукты общей формулы (1) главным оо разом могут быт1 очищены с помощью физических методов, таких как перекристаллизация, хроматография или распределение в противотоке, или химических методов, таких как превращение в соль присоетинения с подходящей кислотой и перекристаллизация ее из соответствующего растворителя с последующим разложением в щелочной среде. В этих операциях природа аниона соли несущественна.

Пример 1. К 109,1 г З-оксиметилпиридина, растворенным в 500 см охлажденного до 0 С пиридина, небольшими порциями прибавляют примерно в течение 1>/л час 201, 54 г — и-нитрофенилхлорформиата.

Реакционную среду перемешивают 1 час при 0 С, нагревают до 20 С и продолжают перемешивать еще 16 час прп этой температуре.

Прибавляют 1,6 л метиленхлорида, промывают три раза 500 сл1 дистиллированной воды, затем 500 сл на ыщенного раствора хлористого натрия. Органический раствор сушат над сульфатом натрия, затем упаривают досуха под уменыиенным давлением (20 л1м рт. ст.) при 50 С. Полученное масло раствопяют в 1,6 л этанола и выдерживают его

l6 час при 0 С. Полученный осадок отделяют фил. троваииом, промывают 100 си этанола и сушат в вакууме (0,3 ля рт. ст.), Получают

128 г смещенного карбоната 3-метилпиридила и и-нитрофенила, плавящегося при 93 C (т. пл. определена методом Кофлера).

Rr=0,73 (силикагель; соотношение метанол: 1,2-дихлорэтан равно 2: 8 по объему).

Найдено, о о: С 57,58; Н 3,86; N 9,89.

Вычислено, о о: С 56,94; Н 3,97; N 10,21.

Пример 2. К раствору 3,51 г колистина в

140 сл Р диметилформамида прибавляют 16,5 г смешанного карбоната 3-метилпиридила и

ЗЭ

65 и-нитрофенила. После 48 час перемешивапия при 20 С нерастворившуюся часть отделяют

1:ильтрованием и фильтрат упаривают досуха при уменьшенном давлени (0,3 ил рт. ст.) при

55 С. Стеклообразный осадок растворяют в 80 ся кипящего нитрометана; легкие нераство1 имые частицы удаляют фильтрованием.

Затем фнльтрат выдерживают 2 «а при 0 С и выделившийся осадок отделгцот фильтрованис.n, промывают е"o 10 слР ледяного нитрометана, затем сушат под уменьшенным давлением (0,3,ил рт. ст.) при 50 С в течение 16 час.

Таким ооразом получают 3,85 г пента-Х-пиридил-3-метокси карбонилколистина.

R<= — 0,74 (силикагель; соотношение и-бутанол: пнридин: уксусная кислота: вода равно ,0:;0: 6: 24 по объему) .

Найденo.,! С 57 70 11 6,67; N 15 78

Вычисче|о о/. С 57,28; II 6,82; N 15.94.

П р и м ". р 3. К раствору 1,3 г пснта-N-пиридил-3-метилокслкарбо| илколнсти! а ь 150 сч" метанола прибавляют 1,3 г и-нитропербензойnîй кислоты. Реакционную смесь перемешивают примерно при 20 С в течение 16 час, потом .паривают досуха в вакууме (° 0 мм рт, ст.) при 50 С, Твердый остаток нромывсиот три ра,а 20 см ацетона, затем три раза 20 слР ацетона при 50 C.

После сушки в вакууме (0,3 лл рт. ст.) при

20 С получают 959 л г пента-Х-(N-окиси пирид ч,л-3-метоксикарбонил) -колистина.

Rr= — 0,32 (силикагель; соотношение и-бутанол: пиридин: уксусная кислота: вода равно

50: 20: 6: 24 по объему) .

Пример 4. К суспензии 2,17 г полимиксина В в 145 сл диметилформамида прибавляют 3,18 г смешанного карбоната N-окиси 3-метил-пиридила и и-нитрофенила. После 24 час перемсшивания при 60 С и 65 час перемешивания при 20 С нерастворившуюся часть отфильтровывают. Фильтрат упаривают досуха в вакууме (0,3 мм рт. ст.) при 60 С, Остаток растворяют в 7 см метанола и раствор хром атографируют на колонке с сефадексом

I Н 20 (диаметр колонки 38 мм; высота 1.80,и).

Злюируют метанолом, собирая фракции по

7 ск

Собирают фракции 130 — 170 и упаривают досуха в вакууме (20 мм рт. ст,) при 50 С. Таким образом получают 3,2 г пента-N-(N-окиси

3-метилпиридилоксикарбонил)-полимиксипа В.

Rq= — 0,30 (силикагель; соотношение н-бутанол: пиридин: уксусная кислота: вода равно

50: 20: 6: 24 по объему) .

Пример 5. К раствору 5,45 г 3-оксиметилпириди а в смеси 3,95 г пиридина и 45 слР метиленхлорида по каплям прибавляют в течение 20 мин, выдерживая температуру реакционной среды ниже 35 С, раствор 13 г хлорформиата 2,4,5-трихлорфенила в 20 см метиленхлорида. Через несколько минут после окончания прибавления хлорформиата выделяется желтый осадок. Продолжают перемешивание реакционной смеси в течение 20 час при 20 С. Затем прибавляют 20 слР дистилли360766 рованной воды. Осадок растворяется. Отделяют органическую фазу, потом промывают ее два раза 25 смз дистиллированной воды, 25 см

5% -ного раствора (вес/объем) бакарбоната натрия и 25 см насыщенного раствора хлористого натрия. Органический раствор сушат пад сульфатом натрия, затем упаривают досуха в вакууме (20 мм рт. ст.) при 50 С, Полученный твердый остаток растворяют в минимальном количестве кипящего метанола (30 см ) и выдерживают раствор 1 час при

20 С. Выделившийся осадок отфильтровывают, промывают 30 см метанола и сушат в вакууме (0,3 мм рт. ст.) при 20 С. Получают 7,8 г смешанного карбоната 3-метилпиридила и 2,4.5трихлорфенила, плавящегося при 95 С (т. пл. определена по КоЛег у).

Найдено, %: С 47,69; Н 2,8; N 4,11; Сl 21,41.

Вычислено, %: С 46,95; Н 2,42; N 4,21; Сl

31,96.

Пример 6. К раствору 5 г смешанного карбоната 3-метилпир идила и 2,4,5-трихлорфепила (полученного, как описано в примере 9) в 80 см хлороформа прибавляют 3,3 г п-.íèòропербензойной кислоты. После 16 час перемешивания при 20 С выделившийся осадок отфильтровывают и промывают 20 см хлороформа. Собранные органические растворы концентрируют до 50 смз в вакууме (13 мм рт. ст.) при 50 С, затем концентрат 10 мин перемешивают с 15%-,ным водным раствором (вес/объем) карбоната натрия. Отделяют водную фазу и промывают ее 20 смз хлороформа; органические фазы объединяют и дополнительно промывают 20 см 15%-ного (вес/ооъем) водного раствора бикарбоната натрия, 20 см дистиллированной воды и 20 см насыщенного раствора хлористого натрия. Органический раствор сушат над сульфатом натрия, затем упаривают досуха в вакууме (13 мм рт. ст.) при 50 С. Таким образом получают

4,2 г смешанного карбоната N-окиси 3-метилпиридила и 2,4,5-трихлорфенила, плавящегося при 169 С.

Найдено, %: С 44,9; Н 2,6; N 3,75; С1 30,6.

Вычислено, %: С 44,79; Н 2,31; N 4,02; Cl

30,51.

Пример 7. К суспензии 1,169 г колизина в 80 см диметилформамида прибавляют 2,1 г смешанного карбоната N-окиси 3-метилпиридила и 2,4,5-трихлорфенила. После 44 час перемешивания при 50 С нерастворившуюся часть отфильтровывают. Фильтрат упаривают досуха в вакууме (0,3 мм рт. ст.) при 60 С.

К полученному маслянистому остатку прибавляют 60 см эфира. Выделившийся кристаллический продукт отфильтровывают, промывают 20 см эфира и сушат в вакууме (0,3 мм рт. ст.) при 20 С. Таким образом получают 1,5 г пента-N-(N-окиси 3-метилокоипиридилкарбонил) -колистина, идентичного продукту примера 7.

R =0,32 (оиликагель; соотношение и-бутапол: пиридин: уксусная кислота: вода равно

50: 20: б: 24 по объему).

8

Найдено, %: С 55,31; Н 6,8; N 14,90.

Вычислено, %: С 54,90; Н 6,54; N 15,28.

Пример 8. К раствору 5 г пента-N-(Nокиси 3-метилпиридилоксикарбонил)-колистина в 1 л буферного раствора с,рН 6 прибавляют 500 мг щелочной протеазы, обработанной в. subtilus (титр 9,5 U/ u), и перемешивают реакционную смесь 3 час при 21 С. Тотчас

>ке после этого доводят рН реакционной среды до 3 добавлением 1 н. соляной кислоты.

Лиофилизация полученного таким образом раствора приводит к получению порошкового крема, который извлекают 80 см метанола.

Отфильтровывают пер астворившуюся часть, затем упаривают досуха фильтрат в вакууме (20 мм рт. ст.) при 50 С. Полученный твердый остаток (5,9 г) растворяют в 30 см раствора этанол-метанол (75 — 25 по объему) и раствор хроматографируют на колонке с 320 г нейтральной окиси алюминия (высота колонки

70 см, диаметр 2,8 см). Последовательно элюируют: 1 л смеси этанолметанол (75 — 25 по объему), 4,5 л смеси этанолметанол (50—

50 по объему), 3 л смеси этанолметанол (25—

75 по объему), 3,5 л метанола и собирают фракции по 500 см, фракции 10 — 21 объединяют и в вакууме (20 мм рт, ст.) при 50 С упаривают досуха. Таким образом получают цикло- (Ny - Z., „-диаминобутирил-N y - (N-окись

3-метилпиридилоксикарбонил) -Z., - диаминобутирил-Д-лейцил-Z-лейцил-N, ) -N-окиси 3-метилпиридилоксикарбонил- (Z -диаминобутирил-Ny ) "N"îêèñè 3-метилпиридилоксикарбонил- (7, -диаминобутирил-2-треонил) .

Буферный раствор с,рН 6, использованный для растворения пента-N-(N-окиси 3-метилпиридилоксикарбонил) -колистина, может быть получен при введении раствора 454 мг монокалийфосфата в 1 л дистиллированной воды при рН 6 (определено на рН-метре) при добавлении раствора 1,2 г додекагидрата динатрийфосфата в 1 л дистиллированной воды.

Энзимной единицей является такое количество энзима, которое при рН 9,5 и при температуре 50 С высвобождает за 1 мин,из казеина достаточно пептида, растворимого в трихлоруксусной кислоте, для наблюдения увеличения оптической плотности от 1,00 до

280 нм. Титр энзима (U/ìã) есть, следовательно, число единиц на 1 мг вещества.

Пример 9. К раствору 10 г пента-N-(N-3метилпиридилоксикарбонил) -колистина в 2 л буферного раствора с рН 6 прибавляют 3 г щелочной протеазы, обработанной В. subtilus (титр 9,5 U/ìã) и реакционную смесь перемешивают при 21 С в течение 3 «àñ. Тотчас после перемешивания доводят рН реакционной среды до 3 добавлением 1 н. соляной кислоты и отфильтровывают нерастворившуюся часть.

Лиофилизация полученного таким образом .раствора приводит к образованию порошкообразной пасты (14,7 г), которую растворяют в 200 см дистиллированной воды; к раствору

360766

NHK1 CH, NHR

1 1 сн, (CBg) (QOH (СН ), C h — СН-(СН )»- C0-NH-CH- СО NH- СН- С01Ч-H — CH- СО-В g

9 пр|ибавляют 200 см смолы ДОСПЕХ 1)(2/ОН .

Смесь перемешивают в течение 1 час, фильтруют, промывают смолу 600 см дистиллированной воды и лиофилизируют водную фазу.

Получают порошкообразную пасту (8,5 г), которую извлекают 150 см метанола. Перемешивают в течение 1/2 час. Отфильтровывают нерастворившуюся часть и три раза промывают 50 см метанола. Фильтрат упаривают досуха в вакууме (20 л1м рт. ст.) при

50 С. Полученный твердый остаток (8,1 z) растворяют в 20 см раствора метанол — диоксан (95 — -5 по объему) и раствор хроматографируют на колонке с 138 г окиси кремния (высота колонки 75 сл, диаметр 2,2 сл ).

Злюируют смесью метанолдиоксан (95 — 5 по объему) и собирают фракции по 50 см .

Собирают фракции 22 — 60 и у|парива1от пх досуха в вакууме (20 мм рт. ст.) при 50 С.

Таким образом получают 3,25 г цикло-N (Z;, -дна минобутирил-Z, - (N-окиси 3-метилгиридплоксикарбонил) -Z -, -диаминобутирилjI-лейпил-Z-лейцил-N 1-М-окись 3-метилпиридилоксикарбоннл- (Z, -диамппобутирил-N )N-окись 3-метилпиридилоксикарбонпл- (Z,. диа мицобутирил-Z-треонпл) .

Приготовление буферного раствора с рН 6 и определение титра энзима такие же, как в примере 6.

Пример 10. К раствору 3,17 г пента-N(N-окиси 3-метилпиридилоксикарбонил) -полимиксина В в 634 см буферного .раствора с рН 6 прибавляют 1,02 г щелочной протеазы, переработанной В. subtilus (титр 9,5 U/ìz) и реакционную смесь 3 час перемешивают при

22 С, Тотчас же после перемешивания доводят рН реакционной среды до 3 добавлением 1 н. соляной кислоты. Нерастворившуюся часть отфильтровывают, затем фильтрат досуха упаривают в вакууме (20 мм рт. ст.) при 50 С.

Получают порошкообразную пасту, которую растворяют в 60 см дистиллированной воды; к раствору прибавляют 60 см Амберлита

IRA 400 (ОН-форма). Смесь перемеи ивают в течение 1 час, фильтруют, промывают смолу

200 слР дистиллированной воды и лиофилизируют водную фазу. Получают твердый продукт, который извлекают 50 смз метанола.

Перемешивают 1/2 час. Отфильтровывают нерастворимую часть и три раза промывают

15 см метанола. Фильтрат упаривают досуха в вакууме (20 мм рт. ст.) при 50 С. Полученный твердый остаток растворяют в 5 см раствора метанол-диоксан (95 — 5 по объему) и раствор хроматографируют на колонке .с окисью кремния (высота колонки 70 см; диаметр

1,8 сл1) . Элюируют смесью метанолдиоксан (95 — 5 по объему), собирая фракции по

25 см .

Таким образом получают цикло-(N - Z. „диаминобутирил-N, - (N-окиси 3-метилпиридилоксикарбонил) -Z,,; -диаминобутирил-Дфенилаланил-Z-лейцил-N - ) -N-окись 3-метилпиридилоксикарбонил- (Z-,; - диаминобутирпл-N; ) -N-окись 3-метилпиридилоксикарбонил (Z, -диамипобутирил-N-, )-N - окись-3-метилпиридилоксикарбонил(7„,, - диаминобутирил1 рео1 п — )

Rr=0,27 (силикагель; соотношение и-бутанол: пиридин: уксусная кислота: вода равно

50: 20: 6: 24 по объему) .

Приготовление буферного раствора с рН 6 и определение титра энзима такие же, как в примере 8.

Пример 11. К раствору 55 мг пента-N(N-окиси 4-метилпиридилоксикарбонил) колистина, приготовленного, как описано в примере 3, в 12 см буферного раствора с рН 6 (приготовленного, как в примере 8) прибавляют 12 мг переработанной В. subtilus ТНЕ 4 протеазы и перемешивают реакционную смесь

2 час при 20 С.

Сразу же устанавливают рН реакционной смеси равным 3 добавлением 1 н. соляной кислоты. Реакционную смесь охлаждают до — 70 С и лнофилизируют. Полученный твердый остаток растворяют в 4 см метанола и хроматографируют на колонке, содержащей в нижней части 5 г силикагеля, а в верхней ча сти 5 г окиси алюминия (диаметр колонки

10 мм, высота 30 см). Злюируют смесью метаполдиоксан (95 — 5 по объему), собирая фракции по 4 л л фракции с по 11 объединяют, упаривают досуха в вакууме (15 мл1 рт. ст.) при 50 С.

Таким образом получают !О л г цикло-(N

Z„... -диаминобутирил-N; - (N-окиси 4-метилпиридилоксикарбонил) -Z... - диампнобутирил-Д-лейцил-Z-лейцил-N., ) Х-окиси 4-метилпиридилоксикарбонил- (Z „. „- диаминобутирил-N> -) -N-окиси 4-метилпиридилокспкарбонил- (7.,, -диамипобутирил-Z-треонила) .

Р =О,24 (силикагель; соотношение и-бутанол: пиридин: уксусная кислота: вода равно

50: 20: 6: 24 по объему) .

Структура продуктов общей формулы (I), также как и эффективность процесса были доказаны синтезом из продуктов общей формулы (I) уже известных полимиксинов, получаемых до настоящего времени ферментацией.

Например, получают полимиксин Е, называемый также колистином А, прп действии продукта общей формулы (1), в котором символ Yп.ре.дставл.,яет соб,ой "îîòâåòñòâåííî Ллейцил-Z-лейцин, а символ Х означает радикал N-окись З-метилпиридилксикарбонила, на продукт общей формулы:

36О766

5

65 где символ R> — защищающая группировка аминной функции, лабильной при гидрогенолизе, например, бензилоксикарбонильная группа или группа общей формулы (П);

R — активированная карбонильная функция, обычно используемая в химии пептидов, такая, как азидогруппа, полученная из соответствующего гидразида при действии азотной кислоты. После удаления защищающих группировок получают продукт, идентичный полимиксину Е>, полученному ферментацией.

Пример 12. K суспензии 200 мг колистина в 10 см диметилформамида прибавляют

400 мг смешанного карбоната N-окиси 4-метилпиридила и п-нитрофенила, После 64 час перемешивания при 20 C раствор упаривают досуха в вакууме (0,3 мм рт. ст.) при 55 С.

К стеклообразному остатку прибавляют 10 см эфира; выпавшие кристаллы отфильтровывают, промывают два раза 3 сл Р эфира и сушат в вакууме (0,3 л л рт. ст.) при 20 С.

Таким образом, получают 250 мг пента-N(N-окиси 4-метилпиридилоксикарбонил) -колистина.

R<=0,29 (силикагель; соотношение и-бутанол: пиоидин: уксусная кислота: вода равно

50: 20: 6: 24.

Пример 13. К раствору 1,5 г пента-N-(Nокиси 3-метилпиридилоксикарбонил)-колистина в 230 смз буферного раствора с рН 7,5, нагретого до 37 С, прибавляют 50 мг субтилизина и реакционную смесь перемешивают при

37 С в течение 15 мин, тотчас же смесь охлаждают,до — 70 С

Лиофилизация полученного таким образом раствора приводит к крему, который растворяют в 10 см тяжелой фазы системы растворителей следующего состава, см : и-Бутанол 800

Пиридин 200

Уксусная кислота 100

Вода 900

Этот раствор подвергают распределению в противотоке в аппарате из 60 трубок, каждая из которых содержит 10 см тяжелой фазы и

10 см легкой. К концу распределения содержимое каждой трубки упаривается досуха в вакууме (25 мм рт. ст,) при 65 С. Остаток в трубках с 25 по 31 растворяют в 20 см воды и полученный таким образом раствор лиофилизируют. Получают 246 мг цикло- f N -Z,, -,диаминобутирил-N; - (N-окиси 3-метилпиридилоксикарбонил) -Z., -диаминобутирил-Длейцил-Z-лейцил-NT ) -N-окиси 3-метилпиридилоксикарбонил)-Z..., -диаминобутирил-N, )г -окиси 3-метилпиридилоксикарбонил- (Z дна минобутирил-Z-треонина) .

R<=0,27 (силикагель; соотношение и-бутанол: пиридин: уксусная кислота: вода равно

50: 20: б: 24 по объему).

После гидролиза общий анализ на автоанализаторе Technilon показал наличие следующих аминокислот: Dab 407 (теория 4), 1 еп=2,00 (теория 2), Ths=0,98 (теория 1), 25

При работе аналогичным образом, но заменяя субтилизин на наргазу, проназу, колистиназу, алказу или на протеазы, переработанные В. subfilis GZ АХО 417, В. subfilis

A.T.С.С. 9524, THE 4, получают также полипептидный цикл, описанный выше, идентифи HpoBBHHbIf1 хроматографией на силикагеле (Rr==-0,27; соотношение и-бутанол: пиридин:

: уксусная кислота: вода равно 50: 20: б: 24 по объему).

Буферный раствор с рН 7,5, использованный для растворения пента-N-(N-окиси 3-метилпиридилоксикарбонил) -колистина, может быть получен при введении 34 см уксусной кислоты в 700 см дистиллированной воды при рН 7,5 (определено на рН-метре) при добавлении 5 н. аммиака и доведения раствора до обшего объема 1000 смз добавлением дистиллированной воды.

Пример 13. К раствору 63 мг N„-метил-6октанил-N., -бензилоксикарбонил-Z, „-диаминобутирил-Z-тренил-IN.; -бенз илоксикарбогилZ-,; -дна минобутирилгидразида в смеси

1,6 см уксусной кислоты и 0,178 см 1 и. соляной кислоты, охлажденному до 0 С, прибавляют 6,2 мг нитрита натрия в виде раствора в 0,1 см, дистиллированной воды. После

20 мин перемешивания при 0 С реакционную смесь выливают в 20 см дистиллированной ледяной воды. Выпавший белый осадок отфильтровывают при 0 С и промывают 20 см ледяной дистиллированной воды. Этот осадок прибавляют к ледяному раствору 100 мг цикло- f N, - Z,, „-диаминобутирил-N „- (N-окиси 3метилпиридилоксикарбонил) -Z„,. -диаминобутирил-Д-лейцил-Z-лейцил-N, )Фокиси 3-метилпиридилоксикарбонил-(Z..., -диаминобутирил -N, )-N-окиси 3-метилпиридилоксикарбонил-(Z,-диаминобутирил-треонила). После

20 час выдержки при 2 С реакционную смесь упаривают в вакууме (0,3 мм рт. ст.) при

60 С. Полученное масло извлекают 20 см эфира. Образовавшийся осадок отфильтровывают и два раза промывают 10 см воды, После сушки в вакууме (О 3 мм рт. ст ) при 20 С получают 106 мг цикло-(Ы, -(Ni-метил-б-октанил-N; -бензилок-.икарбопил-Z ., диаминобутирил-Z-треонил-N; -бензилоксикарбонил-Z -,-диаминобутирил)-N Z..., -диаминобутирил-Д-лейцил-Z-лейцил-М, )-N-окиси 3метилпиридилокоикарбонил-(Z.,„ -диаминобутирил-N- )-N-окиси 3-метилпиридилоксикарбонил-(Z-.,- -диаминобутирил-Z-треонила).

Rr=0,51 (силикагель; соотношение н-буганол: пиридин: уксусная кислота: вода равно

50: 20: б: 24 по объему).

Пример 14, К раствору 90 иг никло- (N

-(N, -метил-б-октанилбензилоксикарбонил-Z. -,днами-Z-треонил-N „-бензилоксикарбонил-Z... -, -диаминобутирил-N-, ) -N-окси 3-метилпиридилоксикарбонил- (Z, -диаминобутирил-Д-лейцил-Z-лейцил) -N-окиси 3-метилпиридилоксикарбонил- (Z...; -диаминобутирил360766

К ДАМ вЂ” TPE — Z — ДАМ-Д AN — Y-ДАМ- ДАг1-ТРГ ! ! )

Х х х

Составитель А. Акимова

Техред Л. Грачева

Редактор И. Грузова

Корректор В. Жолудева

Заказ 2566/!3 Изд. № 29! Тираж 406 Подписное

ЦНИИПИ Комитета по делам изобретений и открытий прп Совете Министров СССР

Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4, 5

Типография, пр. Сапунова, 2

13

N- ) -N-окиси 3-метилпиридилоксикарбонил(Z,, -диаминобутирил-Z-треонила) в 7 см метанола и 1 см 1 н. соляной кислоты прибавляют 100 мг палладия на угле 3,15 и в течение 16 час пропускают слабый ток водорода. После фильтрования и упаривания фильтрата досуха в авкууме (25 мм рт. ст.) при

50 С полученный твердый остаток растворяют в 1 смз метанола и раствор хроматографируют иа колсике, .",аиолненной 40 г .сефадекса LH 20 (диаметр к ловки 14 мм, высота 1,7 м). Элюу!руют метанолом, собирают фракции по 3 см об.ьединяют фракции 33 — 35 и разбавляют их

10 смз дистиллированной воды, полученный раствор лиофилизируют. Таким образом получают 32 мг пентахлоргидрата колиина А.

Г<г=0,29 (силикагель; соотношение н-бутаиол: пиридин: уксусная кислота: вода равно

50: 20: 6: 24 по объему) .

Полученный таким образом,колиин идентичен природному! колиину А. где К вЂ” н-октанил, 1 -6-метилоктанил или

6-метилгептанил;

Z — Д-сер или Д-ДАМ;

Х и Ъ имеют значения, указанные выше, подвергают селективно му гидр олизу с поПредмет изобретения

Способ получения циклопептидных производных полимиксинов общей формулы

5 (сс) ДА 1"1- ДАМ вЂ” Y- ЛА)"1- А1 - -

Х Х X (11 где У вЂ” одна из цепочек Д-лей-ТРЕ, Д-фал10 лей, Д-лей-лей, Д-лей-илей;

Х вЂ” радикал общей формулы !

Ру — СН вЂ” Π— СО, ! !

5 К в которой Ру — пиридил или метилпиридил или радикал N-окиси пиридина, присоединенный через у-аминную группу аминокислоты, а

R=H, алкил с числом атомов углерода 1 — 5, 20 фенил, от.гичаюагийся тем, что производные полимиксинов общей формулы мощью протеолитических энзимов, например проназы, нагарзы, колистииазы, субтилизина, при температуре 20 — 70 С, рН 5 — 9 и продол>кительности процесса более 3 суток,