Способ получения "с-уридин-б^-трифосфата

 

ОПИСАНИЕ

ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

Союз Соеетскиз

Сониалистичесииг

Республии

Зависи»ое от авт. свидетельства №

М. Кл. С 07<1 51/50

С 07f 9/08

Заявлено 15.11!.1971 (№ 1631924/23-4) с присоединением заявки №

Комитет по делам изобретений и отнрытнй прн Совете Министров

СССР

Приоритет

" Д-К 547.963.3 26.118.07 (088.8)

Опубликовано 20.Х11.1972. Бюллетень ¹ за 1973

Дата опубликования оп,ca>

Авторы изобретения

П. П. Пумпен и 3. Я. Грен

Институт органического синтеза AH Латвийской ССР г т

Заявитель

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ -iC-УРИДИН-5г-ТРИФОСФА1А

Изобретение относится к способу получения меченых нуклеотидов, именно к новому споСОбу ПОЛуЧЕНИя г4С-урндИН-5г-трИфаефата.

Это соединение применяется в биохимических исследованиях.

ИЗВЕСТЕН СПОСОб ПОЛуЧЕНня г4С-урндпи-54трифосфата путем ферментативного фосфориЛИрОВаНИя ггС-урИдИН-54-МОНОфОСфата. ОдНако этот способ характеризует высокая стоимость и трудность синтеза исходного продукта.

С целью упрощения процесса за счет применения более доступного исходного продукта предложено в качестве последнего использовать г4С-урацил, а в качестве катализатора— ферментпую фракцию бесклеточного экстракта Escherichia coif АВ 259 Hfr 3000. Процесс проводят в присутствии D — рибозы, аденозин-5г-трифосфата, ионов Мд +, а также системы, регенерирующей аденозин-54-трифосфат, пируваткин азы и фосфоенолпирувата, при рН 77 — 79.

Процесс протекает при 37 С в течение 4 час.

Выход г4С-уридин-54-трифосфата (по урацилу) — 90 — 95%. Радиохимическая чистота полученного препарата — 95%.

Пример. Приготовление бесклеточных экстрактов Е, cali АВ 259 Hfr 3000.

Клетки выращивают на пептонной среде с интенсивной аэрацией при 37 С до средней логаршрмической фазы (7 — 8) 10з клеток/лгл), осаждают в центрифуге, отмывают от среды буферным раствором (0,01 М трпсНС1, рН 7,8; 0,005 М МдС1з). Бесклеточные

5 экстракты готовят растиранием клеток со стеклом при 1 — " С, разбавляют полученнуго массу двукратшпг объемом буфера (0,2 М трис-НСl, рН 7,8; 0,05 М М0С1 ), вносят дезоксирибонуклеазу (0,01 лг/лгл раствора), цент10 рифугируют 20 лгин при 10000 об/яин в низкоскоростной центрифуге. Надосадочную жидкость подвергают ультрацентрифугированию при 100 000 g в течение 1 час. Полученные экстракты быстро заморажпвают и хранят

15 при — 20 С. Непосредственно перед внесением в реакционную смесь бесклеточные экстракты нагревают при 50 С (в водяной бане) 3 1гин, образовавшийся осадок удаляют центрифугированием, надосадочную жидкость использу20 ют в качестве ферментной фракции E. coif.

Синтез 4С-уридин-5 -трифосфата. Ре",14öèoíную смесь, содержащую (в лгклголь/лгл): г4С-урацила — 1,8; D-рибозы — 9,0; аденозин54-трифосфата — 1,5; фосфоенолпирувата—

25 10; трис-НС1 — 100; МдС1 — 25; пируваткиназы — 30 лгкг; бесклеточного экстракта—

0,14 лгл на 1 лл реакционной смеси (рН 7,8), инкубируют 4 час при 37 С (в водном термостате). По истечении 3,5 час инкубации до30 полнительно вносят (на 1 лгл смеси): 62835

Предмет изобретения

Составитель М. Макаров

Техред T. Миронова

Редактор Е. Гончар

Корректоры: Л. Царькова и Л. Новожилова

Заказ 888!10 Изд. № 66 Тираж 404 Подписное

ЦНИИПИ Комитета по делам изобретений и открытий при Совете Министров СССР

Москва, К-З5, Раушская наб., д. 4г5

Типографпя, пр. Сапунова, 2

1,5,1гк 1голь аденозин-51-трифосфата, 10 лгкмо.гь фосфоенолпирувата и 30 лгкг пируваткиназы.

Инкубацию прекращают, помещая смесь в кипящую водяную баню на 3 мин. Образовавшийся осадок удаляется в низкоскоростной центрифуге, а надосадочная жидкость (после концентрировании в ротационном испарителе при 32 С) наносится на бумагу W15/10 ОЕ ав на 1 с.гг старта) для хроматографирования в системе изомасляная кислота — вода — конц. гндроокись аммония (66:33:5) нисходящим способом в течение 20 час. Хроматограммы сушат в струе холодного воздуха (2 — 3 час), отмывают в нисходящем токе эфира при 3—

4 С в течение суток, зоны 14С-уридин-51-трифосфата вырезают и элюируют водой, полученный раствор концентрируют в ротационном испарителе (32 С), замораживают и хранят при — 20 С. Выход конечного продукта (no урацилу) — 90 — 95%.

Полученный 14С-уридин-51-трифосфат анализируют хроматографическн в системах:

1) этанол — 1 М ацетат аммония — 0,1 М

ЭДТЛ (75:29:1), восходящая, 18 «ас; 2) изомасляная кислота — вода — конц. гидроокись аммония (66:33:1,5), нисходящая, 18 «ас; а также электрофоретически (0,05 М цитратный буфер, рН 5,0; 150/см. 1,5 час). Подвижности (R; — — для хроматограмм, E — для элек4 трофореграмм) полученного препарата в указанных случаях найдены аналогичными таковым для стандартных образцов уридин-5т-трифосфата (Reanai, Венгрия). Радиохимическая чистота препарата составляет 95 /о. Основные характеристики УФ-спектра получегьного препарата соответствуют характерным для урндин-51-трифосфата.

График, где по оси абсцисс отложено время г0 реакции (в мин), а по оси ординат — процент

14С-урацила, превращенного в 14С-уридин-51трифосфат, показывает, что при описанных условиях реакции уже за 3 час инкубации практически весь 1 С-урацил превращается в

15 14С-уридин-51-трифосфат.

2р Спосоо получения гаС-уридин-51-трифосфата путем ферментативпого синтеза, от,гича>ощиггся тем, что, с целью упрощения процесса, в качестве исходного продукта используют

14С-урацил, в качестве катализатора применя25 ют ферментную фракцию бесклеточного экстракта Escherichia coli AB259 Hfr 3000, и процесс проводят в присутствии D-рибозы, аденозин-51-трифосфата, ионов М +, пируваткиназы н фосфоенолнпрувата при рН 7,7 — 7,9.