Способ получения ингибитора протеаз
ОП И САНИ Е
ИЗОБРЕТЕНИЯ
К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ
Сокга Советских
Социалистических
Республик
За виси мое от авт. свидетельства №
Заявлено 3iI.XI I.1970 (№ 1612362/ 3 1-16)
ic присоединением заявгии №
Приоритет
Опубликовано 17.IV.1973. Бюллетень № 18
Дата опубликования описания 29Х1.1973
М. Кл. А 61k 19/00
С 07g 7/02
Комитет па делам иаобретений и открытий при Совете йгинистрав
СССР
УДК 615.45:615З6:
:615.342.4 (088.8) Авторы изобретения
Л. Б. Полонская, Л. Д. Зуева, В. Н. Цыганкова, Ф. H. ГиллерРожанская, Л. Л. Борткевич, К. М. Лакин, В, М. Царенков, Н. М. Рукина и 3. Б. Идельчик
Всесоюзный научно-исследовательский институт мясной промышленности
Заявитель
СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ИНГИБИТОРА ПРОТЕАЗ
Известен способ получения ингибитора протеаз путем автолиза измельченного животного сырья, отделения жмыха, экстрагирования, подщелачивания, обработки экстракта сульфатом аммония, нагревания, подщелачивания раствора, фильтрации, высушивания.
Однако известный способ не обеспечивает получения ингибитора протеаз в едином технологическом цикле с гепарином и пептоном и, кроме того, ингибитор протеаз недостаточно активен.
Для повышения активности ингибитора протеаз с одновременным получением гепарина и пептона из белковых отходов после извлечения ингибитора экстракт после автолиза обрабатывают водой и перед нагреванием осадок обрабатывают 0,65 и. раствором соляной кислоты, жмых обрабатывают хлористым натрием с последующей обработкой осадка ацетатом калия, далее осадок после извлечения гепарина охлаждают, обрабатывают водой и известным способом выделяют пептон.
Пример. 10 кг замороженных легких крупного рогатого скота измельчают на куттере и выдерживают при комнатной температуре в течение 17 «ас. Затем добавляют
3 объема воды, охлажденной до 8 — 12 и перемешивают в течение 2 «ас.
Легочную ткань (жмых) отделяют центрифугированием, промывают небольшим количеством (около 0,5 объема) воды при рН 7,0 и используют для выделения гепарина.
Выделение ингггбитора протеаз.
Экстракт и промывные воды объединяют и добавлением 5 н. раствора едкого натра устанавливают рН 7,0 и высаливают балластные белки сульфатом аммония из расчета 113 г/л.
Осадок отделяют фильтрованием через сукно
10 бета и выбрасывают, а из фильтрата высалпвают игггибитор-сырец сульфатом аммония из расчета 510 г/л. После отстаивания в течение
10 — 12 «ас при температуре 5 С надосадочную жидкость сифонируют, а осадок отделяют
15 фильтрованием на путч-фильтре. Затем осадок, содержащий ингибитор протеаз, растворяют в 3,5 объемах 0,65 н. раствора соляной кислоты, прогревают при 80 С в течение 4 инн, после чего быстро охлаждают до комнатной
20 температуры и центрифугируют. Белковый осадок промывают 2 объемами воды. Промывные воды объединяют с основным раствором и добавлением 5 н. раствора едкого натра устанавливают рН 7,5. Ингибитор протеаз выса25 ливают сульфатом аммония из расчета
600 г/л, отделяют фильтрованием на воронке
Бюхнера, растворяют в 10 объемах воды, обессоливают методом диализа и лиофилизируют.
Выход ингибитора протеаз активностью 650—
30 700 ЕД. из 1 кг легких составляет 320 мг, i377159
Предмет изобретения
Составитель С. Щенева
Техред 3. Тараненко
Корректор Н. Стельмах
Редактор К. Шанаурова
Заказ 1838717 Изд. М 1437 Тираж 467 Подписное
ЦНИИПИ Комитета по делам изобретений и открытий при Совете Министров СССР
Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5
Типография, пр. Сапунова, 2
3 жмых после извлечения ингибитора трипсина и промывания экстрагируют 1,5 объемами
0,7 мол. раствора хлористого натра при рН
9 — 9,5 и температуре 55 — 60 в течение 1,5 час.
Затем температуру смеси поднимают до 100 С для коагуляции балластных белков, охлаждают до 35 — 40 С и фильтруют. Осадок используют для получения пептона. В полученном фильтрате добавлением 17о/о-ного раствора соляной кислоты устанавливают рН 2,5. Выпавший солянокислый осадок гепарина-сырца отделяют центрифугированием и суспендируют в 4 объемах 15%-ного раствора хлористого натра. К суспензии прибавляют 20о/о-ный раствор хлористого кальция пр рН 9 — 9,5 и температуре 70 — 75 С, смесь нагревают до 95 С, скоагулированный балласт отделяют фильтрованием, а раствор охлаждают до 30 — 35 С и подкисляют соляной кислотой до рН 2,5. Выпавший осадок отделяют центрифугированием.
В растворе устанавливают рН 8,2 — 8,3 добавлением 5 и. раствора едкого натра и осаждают гепарин 1,5 объемами этилового спирта.
Через 12 — 15 час надосадочную жидкость удаляют сифонированием, а осадок отделяют центрифугированием, растворяют в 10 объемах воды при рН 9 — 9,5 и температуре 60—
70 С. После этого добавляют к объему смеси
30%-ный раствор перекиси водорода для обесцвечивания, охлаждают до комнатной температуры, фильтруют. К прозрачному фильтрату добавляют до двух молей ацетата калия и уксусной кислоты до рН 5,5, нагревают до 55—
60 С и быстро охлаждают до 5 — 8 С, после чего выдерживают при этой температуре в течение 10 — 12 час. Выпавший осадок отделяют центрифугированием, растворяют в 10 объемах воды, обрабатывают ионообменной смолой
КУ-2 в Н-форме в статических условиях и после отделения смолы из раствора осаждают гепарин при рН 6,0 — 6,5 (устанавливают добавлением едкого натра) равным объемом спирта. Выход: 1 кг легких — 11700 ед. с активностью 96 ед/мг.
Получение пептона.
Остатки легочной ткани после извлечения гепарина быстро охлаждают до 15 — 18 С во4 дой, снижая рН до 6,0 — 6,5. Остаток суспендируют с двумя объемами воды и нагревают до 40 С. В нагретую смесь добавляют фосфорную кислоту с таким расчетом, чтобы начальное рН смеси было 1,7 — 1,8. В смесь добавляют 8о/о слизистой оболочки свиных желудков и выдерживают при 45 С в течение 18 — 23 час до полного переваривания ткани. После окончания гидролиза прозрачную жидкость кипятят с добавлением гидроокиси кальция, устанавливают в растворе рН 8,2 — 8,5. Горячий раствор отделяют от осадка и при 50 С добавляют 1 /о поджелудочной железы уоойных животных.
Трипсиновый гидролиз проводят при 50 С, рН 8,2 — 8,5 до полного переваривания белка, что определяется по качественной реакции на белок в присутствии 20 /о-ной трихлоруксусной кислоты.
20 По окончании протеолиза лизат доводят до кипения, затем добавлением фосфорной кислоты устанавливают рН 6,0 — 7,0 и фильтруют в горячем состоянии через сукно бета.
Прозрачный раствор высушивают известны25 ми методами, например на распылительпой сушилке.
Выход пептона — 50 г из 1 кг легких.
Способ получения ингибитора протеаз путем автолиза измельченного животного сырья, от35 деления жмыха, экстрагирования, подщелачивания, обработки экстракта сульфатом аммония, нагревания, подщелачивания раствора, фильтрации, высушивания, отличающийся тем, что, с целью повышения выхода целевого про40 дукта с одновременным получением гепарина и пептона, после автолиза экстракт обрабатывают водой и перед нагреванием осадок обрабатывают 0,65 н. раствором соляной кислоты, жмых обрабатывают хлористым натрием с
45 последующей обработкой осадка ацетатом калия, далее осадок после извлечения гепарина охлаждают, обрабатывают водой и известным способом выделяют пептон.
