Патент ссср 396014

 

ОПИСАНИЕ

ИЗОБРЕТЕН ИЯ

К ПАТЕНТУ

Союз Советских

Социалистимеских

Реотублик

Зависимый от патента №вЂ”

Заявлено 30.1Ч.1971 (¹ 1654637/31-16) М. Кл. А 61k 19/00

Приоритет 04Х.1970, № 34550 и 01.Х.1970, № 77334, США

Государственный комитет

Совета Министров СССР оо делам изобретений и открытий

Опубликовано 28.Ч111.1973. Бюллетень ¹ 35

Дата опубликования описания 20.XI I.19?3 сДК 57?.154.52(088.8) Авторы изобретения

Иностранцы

Карл Герман Гоффман, Джон Уильям Ротрок и Стюарт Рой Мичелсои (Соединенные Штаты Америки) Иностранная фирма

«Мерк энд Ко. ИНК» (Соединенные Штаты Америки) Заявитель

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПОЛ ИНУКЛЕОТИДФОСФОРИЛАЗЪ|

15

Изобретение относится,к биохимии, а имен но IK способам получения поли нуклеотпдфос,форилазы.

Иэвестен способ, получения полинуклеотидфосфорилазы, заключающийся в том, что суспензию клеток М1сгососcus lysodeikticus лизируют лизоци мом. Из беоклеточного экстракта целевой продукт выделяют, осаждая часть балласпных белков сернокислым а:ммонием (до 30 /о), из надосадочной жидкости фермент осаждают 30 — 65%-ным сульфато м ам мония и далее очищаеот ионообменными целлюлозами, сефадексами. Полученный препарат ис пользуют для синтеза в стационарных условиях поли нуклеотидов.

Целью предложен ного изобретения является получение водо нераст1воримого фермента.

Поставленная цель достигается тем, что очищенный пректа рат поли ну клеотидфосфорилазы cìе ши вают с целлюлозой, активированной галогенциа нс м.

Пример 1. Ферментативную среду, имеющую следующий состав (г): Difco дрожжевой экстракт 4670,0, MgSO, 7Н,О 186,8, NaCI 9,3, FeSO4. ?Н20 9,3, Мп$04 4Н О 7,4, ХаНСОз

3959,6, декстрозы 9340,0 воды до 467 л, стерилизуют, засевают 1,5 л культуры Micrococcus

Iysodeikticus (М. luteus, АТТС № 4698) и .инкубируют с перемешиванием и аэрацией при

28 С ia течение 20 час (посевной материал выращивают на той же среде при 28 С в тече ние 36 ac). Затем содержи мое фермесчтера быстро охлаждают до 0 — 5 С и центрифугируют, поддерживая ту же температуру. Надосадопную жидкость сливают, а охлажденную клеточную массу весом около 1,5 — 2,5 кг ресуспендируют в 0,5%- ном ледяном растворе хлористого натрия, используя около 1 л раствора хлористого натрия на каждый килограмм клеточной, массы.

К полученной суспензии при температуре, поддерживаемой на уровне 0 — 5 С, и перемешивании добавляют l,èë 2-мер капто-этаяольного антиаксиданта, процеживают через марлю, в результате чего удаляют .неразбитые .комки, которые затем повторно обрабатывают.

Полученную суспензию трижды гомогенизируют, охлаждая перед каждой гомогениза20 цией до 0 — 5 С, при давлснпп 562,48 кг/с.и манометру, в результате чег» происходит разрушение клеток. Затем гемо-.енизирова нн, ю суопензию цечтрифугируют в течение 40 мин при 11000 g, осадок удаляют, а прозрачную

25 надосадочную жггдкость замсраживают.

Анализ надосадо-:ной ж.такса-,и показывает, что содержание белка составляет

3,6 лтг/мл, активчость полинуклеотидфосфорилазы (ПНФазы) около 0„05 ед/л л; 0,014 ед.

З0 1НФазы/мг белка.

Зь6014

lO

15

45

Предмет изобретения

Щене ва

С оста в н тел ь С.

Техред 3. Тараненко

Корректоры Е. Михеева п Е. Миронова

1 едактор Д. Пинчук

Заказ 693/2275 Изд. ¹ 944 Тира>к 467 Подписное

Ц11ИИПИ Государственного комитета Совета Министров СССР по делам изобретений и открытий

Москва, Ж-35, Раушскаи наб., д. 4/5

Тин. Харьк. фил. пред. «Патент»

130,ял размороженной надосадочной жидкости, содержащей 24 ед. ПНФазы и охлажденной до 0 — 5 С, медленно добавляют при перемешивании 31 г твердого сернокислого аммония, образовавшуюся смесь .перемешивают IB течение 20 .чин, центрифугируют при 23000 o 30 чин rH îcадок уда Iяют.

К rragoicaaoaIIOH жидкости в объеме 140 лгл медленно добавляют при перемешивании 75лгл

BBA этанола, доводя его концентрацию до

35%, в результате чего происходит осаждение

ПНФазы. Полученную водно-этанольную смесь перемешивают при 0 — 5 С в течение

20 лгигг, а затем центрифугируют при 23000 g

35 лгин, в результате чего происходит отделение осажденной ПНФазы, надоса дочную жидI

Осажденную ПНФазу растирают в небольшом объеме (!5 — 20 лгл) охлажденного (5 С)

ПНФазного буфера, имеющето следующий соста в: 10 лгл 1 М трис- гидроксиметил/-агми нометан НС! раствора, 1 лгл 1М распвора уксуснокислого магния, 0,07 мл тиоэтанола, дистиллированную воду доводят до 1 л .и рН буфера до 8,2. Образующийся раствор затем диализируют при 5 C в течение 15 лгин против свежего ПНФаз ного буфера. Диализат осветляют центри1фугираванием, поддерживая температуру около 0 — 5 С, .и прозрачную надосадочную жидкость разливают в бутылки, замораживают и хранят в замороженном состоянии.

Пример 2. 20 г iiroporrrxa целлюлозы смешивают с четырьмя следующими друг за другом порциями двух объемов деионизи рованной воды, причем после каждой порции смесь отстаивают и надосадочну ю жидкость сливают.

К полученной суспензии добавляют 500 лг,г

5 !х! водного раствора едкого патра, и смесь осторожно перех<е шивают в азотной атмо сфере .при 0 С в течение 15 час. Во1дный раствор щелочи отделяют от порошка целлюлозы декантацией с последующей фильтрацией через

c

Промытый осадок мерсеризирсванной целлюлозы доводят до объема 600 лгл дооавлением деиони зирова нной воды. 3 лг г этой мерсеризирова нной целлюлозы центр и фуги руlo T и 2 лгл супернатанта декантируют с получениеМ приблизительно 50 г «сухого эквивалeíòà» в 1 мл остававшегося осадка, который охлаждак>т до 0 С. Около 150 лгл бромцHaiua оорабатывают 2 лгл воды, и раствор растирают с максимально возможной быстротой. Водный раствор бромциана сразу OR åäHiíÿþ T с охлажденной вод ной емесью згерсериз ированной целлюлозы и добавляют при перемешивании достаточное количество 5Х во1дного раствора едкого натра (около 0,1 — 0,2 лгл) для доведен ия р Н,до 10 — 11.

Полу чеяную «активированну|о» це;I;IIO;Ioзу немедленно промывают в маленькой фильтровальной воронке сначала ледяной водой, затем охлажден пыл< 0,1М водным раствором бикарбоната натрия, снова ледяной водой и дваокды «ПНФа зныьм буфером» (0,01М), кото рый имеет следующий со став: 10 лг,г 1М трггс-/пидроксиметил/-ах<и но-метан НС1 раствор, 1 лл 1М раствора уксуснокислого магния, 0,07 лгл тиоэтанол а, доба вляют дHc TH;Iëaрован ную воду для доведения общего объема до 1 л и рН сьмеси доводят до 8,2.

Промытую «активированную» целлюлозу смешивают с 2 лг г ПНФазного буфера. Эту смесь «акт и виро ванной» целлюлозы (содержащую 50 лгг,волокна «сухой эквивалент») объединяют в це1нтрифуж ной пробирке с 1 лгл

ПНФазы с приблизительной активно!стью

«1 ед» (1 единица ап<ти вности ПНФазы обозначает то количество энзиматччеоки активного белка, которое в 1 лгин полимеризует

1 лглголь нуклеози ддифосфата в нерастворимый в .кислоте полимер при 37 С и субстратной ко нцентрац ии 1 льяоль/.нл. Пробирку,промывают азотом, и смесь медленно перемешивают .при 5 С в течение 15 час, центрифугируют и дважды промывают порциями по 2 лгл свежего ПНФазного буфера. Полученный ковалентно связанный энзиматический ПНФазпый катализатор суспендируют 2лгл ПНФазного буфера, и суопензию хранят при температуре 0 С, 1 лгл этой суспензии дает адекватный уровень полимериза ции с 1 до 0,06 M раствора нуклеози(ддифосфата.

Способ получения полинуклеотидфоефорилазы из суопензии клеток Micrococcus lycodeil