Патент ссср 413654
413654
ОП ИСАНИЕ
ИЗОБРЕТЕНИЯ
К ПАТЕНТУ
Со©3 Соеетских
Социалистических
Республик
Зависимый от патента Хе
Заявлено 09Х.1964 (Ж 899278/31-16) М. Кл. А 61k 21/00
С 07g 11/00
С 124 9/14
Приоритет
Гасударственный каиитет
Саввта Министров СССЯ аа делам иеааретений и с"крытнй
УДК 615.779.931(088.8) Опубликовано 30.1.1974. Бюллетень N 4
Дата опубликования описания 17Х1.l974
Авторы изобретения
Иностранцы
Умезава Хамао, Маеда Кензди, Оками Иосио и Такеучи (Япония) Иностранная фирма
Исследовательский институт микробиолого-химическ промышленности (Япония) Заявитель
СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ БЛЕОМИЦИНА
Изобретение относится к медицине, в частности к производству антибиотиков.
Предложенный способ получения блеомицина, не описанный ранее в патентной литературе, заключается в том, что культуру
Streptomyces verticillus АТСС 15003 выращивают в аэробных условиях на среде, содержащей источники углерода, азота и минеральные соли, при температуре 25 — 35 С в течение 7—
10 дней, целевой продукт выделяют из фильтрата культуральной жидкости сорбцией на ионообменной смоле, водный элюат, имеющий рН вЂ” 6,0 — 7,0, концентрируют или упаривают досуха под вакуумом, промывают органическим растворителем, например ацетоном, осаждают блеомицин из водного или метанольного раствора органическим растворителем, например этанолом, и водный раствор разделяют хроматографией на колонке сефадекса G-35 на блеомицин А и блеомицин В.
Блеомицин обладает противоопухолевой активностью и активен в отношении ряда граммположительных и грамм-отрицательных бактерий.
Блеомицин А и блеомицин В в различной степени активны в отношении различных бактерий.
Пример 1. Два ферментера объемом по
30 л, содержащих по 10 л питательной среды, засевают культурой Streptomyces verticillus
АТСС 15003 (в количестве 600 см ), выращенной на той же среде в течение 2 суток.
Среда имеет следующий состав (а/а):
Соевая мука 3,5
5 Крахмал 2,5
Глюкоза 0,5
NaC1 0,3
КгНРО4 0,1
Сульфат цинка 0,05
10 Сульфат меди 0,01
Исходное рН 7,0
Ферментацию проводят при 27 — 29 С, аэрации 10 л/мин и перемешивании со скоростью
500 об/мин. До начала ферментации в среду
15 добавляют в качестве антивспенивающего вещества 0,0033 /О силиконового масла, а затем еще 50 см соевого масла в процессе фермента ции.
Каждый день из ферментера берут пробы, в
20 которых определяют рН и содержание блеомицина.
После 10-суточной ферментации культуральную жидкость из ферментеров охлаждают, рН доводят до 4,6 соляной кислотой. Мицелий
25 отфуговывают на холоду, надосадочную жидкость фильтруют. Полученный фильтрат, содержащий 358,5 мг блеомицина, пропускают через колонку диаметром 5,5 см, содержащую
1750 смз Амберлита IRC-50. После промывки
З0 колонки дистиллированной водой производят
413654
Предмет изобретения
Составитель С. Щенева
Текред 3, Тараненко
Корректоры; А. Николаева и Л. Корогод
Редактор Н. Спиридонова
Заказ 1!66;20 Изд. ¹ 12!2 Тираж 482 Подписное
ЦНИИПИ Государстве1и1ого комитета Совета Министров СССР по делам изобретений и открытий
Москва, Я-35, Раушская наб., д. 4,5
Типография, пр Сапунова, д. 2 десорбцию 0,2 и. НС1. Фракции с 3 по 6 соединяют вместе, нейтрализуют Амберлитом IR-4В (ОН-типа), концентрируют под вакуумом и экстрагируют 150 см метанола. Нерастворившаяся в метаноле часть (11,59 г) содержит о7,5 мг блеомицина с активностью 4,98 мкг/мг.
Метанольный раствор перегоняют, высушивают до порошка, экстрагируют 100 см этилового спирта. Нерастворившийся порошок (4,038 r), содержащий 293 мг блеомицина с активностью 72,5 мкг/мг растворяют в дистиллированной воде, обрабатывают на колонке сефадекса G-25 и фракционируют до 5 см .
Фракции, содержащие блеомицин, хроматографируют па бумаге Тойо № 51 и проявляют
10% -ным хлористым аммонием восходящим методом. Биоавтограф на хроматографической бумаге испытывают против Mycobacterium
pheei. Наиболее активными являются фракции №№ 16 — 23 с большой зоной подавления роста при Rf 0,94 — 0,88 (блеомицин А) и фракции
¹¹ 24 — 29 при Rf 0,70 — 0,66 (блеомицин В).
Пример 2. Фракция 24 хроматографии на сефадексе G-25 в примере 1 дает 244,6 мг блеомицина — порошка, содержащего 76 мг блеомиципа (310 мкг/мг). Этот порошок растворяют в 20 см метанола в подогретом состоянии. После охлаждения нерастворимый порошок весом 35,5 мг, содержащий 1,48 мг блеомицина (42 мкг/мг), отфильтровывают и к метанольпому раствору добавляют 20 смз этилового спирта, что приводит к осаждению мелкого порошка. Этот порошок весом 46,9 мг, содержащий 1.87 мг блеомпцппа (39,8 !кг/а!г), отделяют фильтрованием. При добавлении к фильтрату еще 70 см этилового спирта осадок не выделяется. Этот раствор перегоняют под вакуумом, после чего выпадает бесцветный осадок блеомицпна. После упаривания до
20 см, выдержки при (О) — (— 5) С в течепие 6 час, фильтрования и сушки из него получа!от 95 мг синеватого порошка. Этот порошок разлагается при 192 — 196 С и содержит
742,5 мкг солянокислого блеомицина на 1 мг.
Элементарный анализ этого порошка солянокислого биомицина дает следующие результаты (% ): С вЂ” 42,43; Н вЂ” 6,72; N — 14,57;
Π— 22,99, S — 2,22; С1 — 10,06; Cu — 0,81 (зола пересчитывается на медь). По данным бумаж10 ной хроматографии с хлористым аммонием в этом порошке содержится в основном блеомпцин В.
С другой стороны, 100 мг фракции № 22 (содержащей 27,5 мг блеомицина, 275 мкг/мг)
15 обрабатывают таким же образом и получают
27,9 мг очищенного белого порошка. Элементарный анализ этого порошка солянокислого блеомицина дает следующие результаты (%):
С вЂ” 44,60; Н вЂ” 7,33; N — 15,61; Π— 23,09; S—
20 2,55; Сl — 7,39; Cu — 0,15.
Способ получения блеомицина, о т л и ч а ю25 шийся тем, что культуру Streptomyces
verticillus АТСС 15003 выращивают в аэробных условиях на среде, содержащей источники углерода, азота и минеральные соли при температуре 25 — 35 С в течение 7 — 10 дней, 30 целевой продукт выделяют из фильтрата культуральной жидкости сорбцией на ионообменной смоле, водный элюат, имеющий рН 6,0—
7,0, концентрируют или упаривают досуха под вакуумом, промывают органическим раствори35 телем, например ацетоном, осаждают блеомицин из водного или метанольного раствора органическим растворителем, например этаполом, и водный раствор разделяют хроматографией па колонке сефадекса G-25 на блеоми40 цин А и блеомицин В.
