Способ выделения и/или очистки цефамицина с

 

Всесг;. нэ! еиа т е н т и о - т е х н е ч .- з ;,;! ее биб ото i.4i

E О П

ИЗОБРЕТЕНИЯ

1Щ 420l53

Союз Советски»

Социалистических

Республик

К ПАТЕНТУ (б1) Зависимый от патента (22) Заявлено 12.03.71 (21) 1633625/31-16 (32) Приоритет 13.03.70 (31) 19497 (33) (США)

Опубликовано 15.03.74. Бюллетень ¹ 10 (51) М. Кл, А 611< 21/00

Гасударственный квинтет

Савета Министрав СССР па делам изссретений и атнрытий (53) УДК 615.779.931 (088.8) Дата опубликования описания 19.08.74 (72) Авторы изобретения

Иностранцы

Томас Вилльям Миллер и Роберт Томас Гоегелман (США) Иностранная фирма

«Мерк эид Компани Инк» (США) (71) Заявитель (54) СПОСОБ ВЫДЕЛЕНИЯ И/ИЛИ ОЧИСТКИ ЦЕФАМИЦИНА С

Изобретение относится к области медицины, точнее к производству антибиотиков.

Предлагаемый способ выделения и/или очистки цефамицина С, ранее в литературе не описанный, за|ключается в том, что целевой продукт извлекают из культуральной жидкости или растворов сорбционными методами, например, с помощью сильноосновных анионообменных смол ти па Дауэкс 1)(2 в хлоридной форме, и/или гель-фильтрации, на пример, с помощью Биогеля Р-2.

Пример I. Колбы Эрленмейера с питательной средой (по 50 мл в каждой) засевают лиофилизированной культурой Streptomyces

Iactamdurans. Питательная среда 1 имеет следующий состав, г;

Гидролизат дрожжей 10,0 (ардамин)

Глюкоза 10,0

Фосфатный буфер 2,0 мл

Гептагидрат сульфата маг- 0,05 ния

Дистиллированная вода до 1000,0 мл

Фосфатный буфер имеет состав, г:

Монокалийфосфат 91,0

Динатрийфосфат 95,0

Дистиллированная вода до 1000,0 мл.

Инкубацию проводят при 28 С в течение

72 час при постоянном встряхивании. Затем

4 колбы с такой средой засевают полученной культуральной жидкостью, инкубируют способом, описанным выше, и их содержимое используют для засева 11 колб Эрленмейера, каждая из которых содержит по 350 мл среды

11 с 2 — 3", > прививочного материала.

Среда 11 имеет следующий состав, r:

Янтарные дрожжи № 300 10 0

Растворимые продукты пе- 20,0 регонки

1О Декстроза 10,0

Дистиллироваешая вода 1000,0 мл рН среды 70.

Выращивание культуры проводят при 28 С в течение 4 дней при постоянном встряхивании

15 (145 качаний в минуту, ход 5 см). Затем содержимое 10 колб сливают, центрифугируют, мицелий удаляют. рН культуральной жидкости доводят до 7,0 разбавленной соляной кислотой, 2900 мл полученного продукта пропу20 скают через 100 мл Дауэкса 1 2 (сильноосновпая аниопообмепная смола, содержащая решетку стирол-дивинилбензола) хлоридного типа со скоростью 10 емл/мин. Фракции по

500 мл собирают. Колонку со смолой промывают водой и элюируют 3%-ным раствором хлористого аммония в 90 /о-ном метаноле. Собирают фракции по 100 мл. Затем все фракции испытывают ееа активность на дисковых пластинках по отношению к микроорганизму

30 вида Vibrio регсо1апэ АТСС 84б l. Фракции

420153

3 — 6 объединяют, получая 1960 мл раствора, доводят значение рН 1860 мл раствора до

7,2 — 8,0 разбавленным раствором едкого натра и пропускают через 100 мл Дауэкса 1+2 хлоридного типа со скоростью 14 мл/мин. Вытекающую жидкость собирают в виде четырех равных фракций, анализ которых показывает наличие 5% активности. Колонку промывают водой и элюируют 5%-ным раствором хлори стого натрия. Элюат собирают в виде фракций по 50 мл и подвергают анализу. Анализ показал, что во фракциях 3 — 16 наблюдается

90% активности. Эти фракции объединяют и концентрируют. 50 мл соединенных фракций

3 — 16 разбавляют до 500 мл, доводят значение рН до 2,0 разбавленной соляной кислотой и подвергают адсорбции на 25 мл смолы Дауэкс 50)(2 (сильнокислая катионообменная смола сульфонатного типа, содержащая решетку стирол-дивинилбензола) водородного типа со скоростью 2,5 мл/мин. Колонку промывают 25 мл воды и затем элюируют

2%-ным водным пиридином до рН 7,0. Анализ вытекающих фра кций и элюата показал, что наблюдается 9% активности вытекающей жидкости и 90% пиридинового элюата. Элюат содержит пиридиниевую соль 7-(D-5-амиио-5карбоксивалерамидо) - 3- (карбамоилоксиметил) -7-метокси-3-цефем-4-карбоповой кислоты.

Доводят рН до 8,0 разбавленным раствором гидроокиси натрия,и концентрируют под вакуумом для удаления пиридина. Идентификация продукта показала, что он представляет собой мононатриевую соль 7- (D-5-амино-5карбоксивалерамидо) - 3 - (карбамоилоксиметил)-7-метокси-3-цефем-4-карбоновую кислоту. Молекулярный вес 468 на основе эм пирической формулы C>

Пример 2. Культуру выращивают, как указано в при мере 1, культуральную жидкость обрабатывают смолой Дауэкс 1;(2 по описанной выше методике и элюируют

1%-ным водным раствором хлористого натр,ия.

Элюат собирают в .виде фракций по 50 мл и ,подвергают анализу. Фракции с высоким содержанием 7- (D-5-амино-5-карбоксивалерамидо)-3-(карбамоилоксиметил)-7 - метокси - 3цефем-4-карбоновой кислоты подкисляют разбавленной соляной кислотой до рН 5,0 и смешивают с образованием 4300 мл раствора.

4200 мл этого раствора, перемешивают с 42 г активированного угля (Дар ко С-60) в течение

30 мин, фильтруют и промывают водой. Фильтрат и промывные воды не активны. Угольный осадок элюируют дважды lkko 1 л 60%-ного водного ацетона путем перемешивания смеси в течение 30 мин с последующим фильтрованием.

Элюаты концентрируют под вакуумом до

108 мл. Биологические испытания с примепе5

55 нием микроорганизма Vibrio percolarks АТСС

8461 показали, что активность первого элюата составляет 76%, а активность второго элюата

17%.

Оба концентрата соединяют и концентрируют до 61 мл, подщелачивают разбавленным раствором гидроокиси натрия до рН 4 — 5.

Этот концентрат содержит 40 мг/мл сухого вещества и образует зону диаметром 25 мм в отношении микроорганизма Vibrio percolarks

АТСС 8461 при разбавлении 1: 100 (400 мкг/

/мл) .

Идентификация;продукта показала, что оп представляет собой мононатриевую соль

7- (D - 5 - амино - 5 - карбоксивалерамидо) - 3(карбамоилоксиметил) -7-метокси-3-цефем - 4карбоповой кислоты.

Пример 3. 22 мл соединенных фракций

3 — 16, полученных iso методике примера 1, подщелачивают до рН 7,0 разбавленным раствором гидроокиси натрия и хроматографируют на колонке, содержащей 388 мл Биогеля

P-2, фракции по 5 мл собирают и проверяют

»а активность. Фракции 50 — 60 объединяют и концентрируют досуха, получают 10,8 мг продукта, содержащего преимущественно мононатриевую соль 7-(D-5-амино-5-;карбоксивалерамидо)-3-(карбамоилоксиметил) - 7 — метокси-3-це фем-4- карбоновой кислоты. Продукт при испытании на микроорганизм /1Ыго

percolans дает зону размером 25 мм при

8 мкг/мл.

Пример 4. Мононатриевую соль 7- (D-5амино-5-карбокси валерамидо) - 3 - (карбамоилоксиметил)-7-метокси - 3 - цефем -4-карбоновой кислоты из примера 3 (1 г) растворяют в 20 мл 1%-ного водного бутанола и хроматографируют на колонке, содержащей 2,530 мг

Сефадекса G 10 (модифицированный декстрановый гель в форме шариков). Колонку промывают 1%-ным водным бутанолом со скоростью 10 мл/мин и собирают фракции по

10,5 мл.

Наиболее активные фракции 99 — 122 собирают и концентрируют досуха. Получают

670 мг продукта, содержащего преимущественно мононатриевую соль 7- (D-5-амина-5карбоксивалерамидо) - 3 - (карбамоилоксиметил) -7-метокси-3-цефем-4-карбоновой кислоты.

Колонку затем калибруют путем хроматогра фии на смеси голубого декстрана 200 и хлористого натрия в идентичных условиях.

Замеряют фракции 85 — 93 голубого декстрапа

200 и фракции 140 — 155 хлористого натрия.

Предмет изобретения

Способ выделения и/или очистки цефамицина С, отличающийся тем, что целевой продукт извлекают из культуральной жидкости или растворов сорбционными методами, например, с помощью сильноосновных анионообменных смол типа Дауэкс 1р, 2 в хлоридной форме, и/или гель-фильтрации, например, с помощью Биогеля P-2.