Патент ссср 433206
ОЛЙСАИМЕ
HЗО5РЕТHй WЯ (11), 433206
Союз Советских
Социалистических
Республик (Gl) Зависимое от авт. свидетельства (22) Заявлено 09.06, 72 (21)I794565/30I5 (51) М Кл.
С Т2к I/04
С Х2к 5/00 с присоединением заявки Л/- —
Государственный квинтет
Совета Министров СССР ео делаи изобретении и открытий (32) Приоритет—
Опубликованй 5е Ж74 Бюллетень Л" 23
Дата опубликования описанияМ, 10, Т (. (Ьз) чдк 6I9:576. .8.097.2:576. ,876.72(088.8) (72) Авторы Юе А е МАЛАХОВУ Ие А е ЛОГИНОВ А е Не ШУПЛИКО е Ие Be ЗВ П ИН е изобретения Г,ф.ДЕНИСЕНКО,А.М.КОСИК(.)В и H,Н.ГУПИ (71) Заявитель (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АНТИГЕНОВ ДЛЯ
ДИАГНОСТИКИ ЛЕПТОСПИРОЗА
2 рН 5,5-5,5 добавлением лимонной кислоты, l
Изобретение относится к спосо-! бам получения диагностических препаратов, используемых в ветеринарии для серологической диагностики инфекционных болезней.
Известные способы получения антигенов, включащие вырецивание микроорганизмов на альбуминовои питательной среде, обработку культур формалином, осаждение, очистку, например дйализом, и высушивание, не позволяют получить достаточйо активных и специфичных антигенов в необходимом количестве.
Аля получения специфических и активных антигенов после обработки культур формалином лептоспиры осаждают белком среды, который переводят в состояние rom действием трихлоруксусной кислоты с последующим сублимационным высушиванием осажденной массы, а пе ред высушиванием устанавлйвают
Способ осуществляют следующим б образом.
Берут эталонные штаммы (или их аналоги) лептоспир семи сврологических групп и готовят из них моно- и полиантигены (см. таблицу).
Перечисленные группы лептоспир взяты с учетом этиологической структуры лептоспироза, у сельскохозяйственных животных в Советском Союзе. При необходимости антигены могут быть приготовлены рекомендуемым методом из лвптоспир любых других серологичвских групп.
Полиантигены готовят в следующих сочетаниях:
I антиген: помона и тарассоВи, 433206 эталонные штаммы
3.
П антигон: гебдомадис и гриппотифоза, Ш антиген: иктерогеморрагия, каникола и батавия.
Аля приготовления полиантигенов культуры лвптоспир соответствующих серологических групп с одинаковым накоплением бактериальной массы смешивают в равных соотношениях и обрабатывают по методике, принятой для изготовления моноантигенов.
Выращивают лептоспиры на альбуминовой среде ГНКИ ветеринарных препаратов МСХ СССР при 2 (28 С в течение пяти-семи дней до максимального накопления бактериальной массы, но не менее I00 мл о микробных тел в I мл среды. Goдержание альбумина в среде0,2 г /.
Непригодны для получения антигенов культуры, загрязненные постороннеи* микрофлорой, не типичные по морфологии, лизирующиеся, с признаками самоагглютинации. зо
Серогруппы лвптоспир å å Са.ei eo 8а. Ролана Ыор о ррАоза. 3 ЕРй алии ;У 3a/a z ia.е Ь а=ио ж в) на центрифуге сепараторного типа при скорости вращения ротора до I5000 об/мин производительность до 50 л/час. Центрифу гирование проводят при I-5 Ы. Осадок разводят дистиллированной водо" в 20-25 раз в зависимости от концентрации лептоспир в исходной культуре и помещают по I00-200 мл в диализационные veшочки. для диализа используют Вольфенскую вискозную кишку производства 1 ДР. Культуры проверяют на чистоту и интенсивность роста путем просмотра баллонов в проходящем свете и раздавленных капель в темном поле микроскопа. Охлаждают отобранные культуры до I-5 С. добавляют нейтральный формалин до концентрации 0,25/. (в пересчете на 40/-ный формальдегид), псремешивают и выдерживают в течение I8-2Ì час при 1-5 С. Приливаю к формалинизирован ноИ культуре при постоянном перемешивании насыщенный раствор трихлоруксусной кислоты до 2,5 -ной концентрации в среде. Отделяют осадок от надосадочноИ жидкости центрифугированием при одном из следующих режимов: а) на центрифуге с угловым ротором при 5000 оо/мин в течение 5 мин; 6) на центрифуге с горизонтальным ротором при 5000 об/мин в течение 5 мин; Диализ ведут в проточной воде при I-l0 С в течение трех-четырех суток до перехода альбумина в состояние золя при рН 5,54,5 и последующего выпадения в осадок в изоэлектрической точке при рН 4,7-+-,8. .опустимо смещение рН до любых значений в пределах 4.,5-7,0. добавляют к полученной после диализа массе по каплям 10о-ный раствор лимонноИ кислоты до установления рН 3,3-5;5, Испытывыот приготовленные моно- и полиантигены на активность 433206 15 55 5 и специфичность с агглютинируюп1ими групповыми сыворотками в реакции макроагглютииации на стекле и на самоагглютинацию - с физиологическим раствором. Уоноантигены считают активными, если го:,:олог1!чная cblacрpотка с титром до I:I0000 не разведенная и разведенная I:5 и раскапанная по 0,04, 0,02, O,OI и 0,005 мл вызывает во всех случаях агглютина цию не менее, чем на три креста. Специфичность антигенов проверяют с гетерологичными лептоспирозными сыворотками. Антигены из лептоспир серологическ1 х групп тарассови, гриппотифоза, батавия и гебдомадис не дают перекрестных реакций. допустима агглютинация, как и в реакции микроагглютинации-лизиса, у антигена помона с сывороткамй каникола и иктерогеморрагия, у антигена иктерогеморрагия — с сыворотками каникола и у антигена каникола с сывороткои иктерогеморрагин. Агглютинация в этих случаях наступает в первых I-3 каплях неразведенной сыворотки при активности реакции в I-3 креста. Для исключения самоагглютинации каплю антигена смешивают с каплей физиологического раствора. В этой смеси не должно быть хлопья и зернистости. Полиантигены считают активными, если каждая из гомологичных сывороток к лептоспира11, входящим в состав антигена, раскананная по Q,04 и 0,02 мл, агглютинирует полйантиген на 2-3 креста в обеих каплях. Препарат, признанный активным и специфичным, разливают в ампулы по 2 мл и высушивают методом сублимации по следующим режимам: замораживают нтиген до минус 40 — минус 45 С и выдерживают заданную температуру в течение. 2-3 час; у с танав ли вают вакуум в 100мк рт.ст., включают подогрев и выравнивают температуру на всех этажах кам!- Ры; повышают температуру в камере в течение каждого часа на 2-3 С 3О 6 до температуры !»!!".нус I00Ñ на от k ë " l„",с L» До IO О. и на 2-3 С От I0 до 25ОС. досушивают при 25 С в течение 2 час. Проверяют высушенные антигоны на активность и специфичность по той же методике, что и перед сушкой. Хранят антигены при 0-IO С. о Срок годностli препарата при соблюдении условий хранения не менее одного года. 1 етод;1;;а постановки и учета р еакци и с ле дующая. Растворяют сухие антигены физиологическ -м раствором. Быораковыва!ат ампулы с неполностью растворившимся препаратом или содЕржащие хлопья. Ставят реакцию при комнатной температуре на стеклянных пласт.. х с квадратами 9-I6 см . Исс71сдуе!»у 0 сйворотку раскапывают в три квадрата по 0,L4 мл и добавляют к каждой кайле по 0,04- мл полиантигена. Сыворотку с полиантигено!! сме ивают стеклянной палочкой, а затем покачиванием стекла. Учитывают реакцию в проходящем свете используя осветитель типа О, i-Л. Оценивают реакцию в крестах по четырехбалльной системе. Ha;«äóko сыворотку, вызвавшую агглюти1-:ацию полиантйгена, исследуют с моноантигенам!!, входящими в состав данног0 полиантигена, по той же методике. Пр необходимости оп 07е л;! ть ти p сыворотки неазведен!4ую и разведенную I:5, :25 и I:125 сыворотку раскапйвают по 0,04-, 0,02, 0,0I,i 0,005 мл и добав7!яют к каждой капле по 0,04- мл антигена. Учитывают реакцию в срок до IO мин. Агглютинация не менее чем на два креста свидетельствует о наличии лептоспирозных антител в исследуемой сыворотке. для постановки диагноза досlàòî÷íî выявления антител в первой капле. 1i0 реакпии макроагглютинации можно исс71едОВать свежие и NGH08p Вированные фенолом ил!! оорной кис лотой сь1воротки. Составитель @е 1 аЛВХОВ P„.дакторДфПИЕЧУК ТехРеДЕ ОРИ:О >Д КоРРектоР Л.ЦсЦ)ЬКОВ Г „„,ЬВчс Р1зд. ¹ 6 1 ТиРаж Подписное Ц11И11!1И Государственного комитета Совета Министров СССР но делам изобретений и открытий Москва, 113035, Раушская наб., 4/л Предприятие <Патент», Москва, Г-59, Бережковская наб., 24 i 532(- и ПРЕ;цМЕТ ИЗОБРЕТЕНИЯ тигенов, после обработки культур формалийом лептоспиры осаждают I. Способ получения антигенов белком среды, который переводят в для дйагностики лептоспироза, вклю- состояние геля действием т и л чающий выращивание микрооргайизмов уксусной кислоты с последующим на альбуминовой питал ной среде, 5 сублимационным высушивандем осажобработку культур формалином, осаж- "денной массы дение, очистку, например, диализом, 2. Способ по п., отл, ча и » и сублимационное высушивание, от- .ся тем что перед вы,, личающийся тем, что, с целью полу- устанавливают рН 3 3 ) 5 Ф д выстшиванивм чения специфических и активных ан- ыо нием лимонной кислоты е
