Устройство для подсчета и классификации взвешенных в исследуемой жидкости частиц

 

пц 434664

Союз Советских

Социалистических

Республик (61) Зависимый от патента (51) М. Кл. G 01п 15/02 (22) Заявлено 28.02.72 (21) 1755880/18-10 (32) Приоритет 10.03.71 (31) Р2111356.4 (33) ФРГ

Государственный комитет

Совета Министров СССР оа делам изобретений н открытий (53) УДК 621.351(088.8) Опубликовано 30.06.74. Ьюллетснь М 24

Дата опубликования описания 14.11.74 (72) Авторы изобретения

Иностранцы

Том Рейнхард и Шульц 1Орген (ФРГ) Иностранная фирма

«Лиценция-Патентфервальтунг ГмбХ» (ФРГ) (71) Заявитель (54) УСТРОЙСТВО ДЛЯ 11ОДСЧЕТА И КЛАССИФИКАЩ14И

ВЗВЕШЕННЫХ В ИССЛЕДУЕМОЙ ЖИДКОСТИ ЧАСТИЦ

Изобретение относится к устройствам для подсчета и классификации частиц, взвешенных в исследуемой жидкости.

Известно устройство для подсчета и классификации частиц, взвешенных в жидкости, которое состоит из двух сосудов, связанных между собой небольшим отверстием (измерительным). В первом сосуде находится исследуемая жидкость, в которой взвешены частицы, предназначенные для подсчета и классификации. Жидкость перетекает через небольшое отверстие во второй сосуд. По обеим сторонам отверстия, сообщающего сосуды, в жидкость погружены электроды, включенные в электрический измерительный контур и имеющие различные потенциалы.

При прохождении какой-либо частицы через отверстие ток, протекающий через электролитическую жидкость, изменяется так, что величина этого изменения служит мерой геометрических размеров частицы.

Однако практика показала, что в результатах, полученных с помощью такого устройства, могут быть ошибки, если не использовать дополнительные вспомогательные средства, улучшающие его работу.

Ошибки возникают прежде всего из-за того, что амплитуда изменения тока, которое происходит при движечии частицы через измерительное отверстие, зависит от того, движется частица в середине отверстия или ближе к его стенкам. Поэтому предложили содержать электролитическую жидкость в первом сосуде свободной от частиц и подводить частицы к измерительному отверстию через предусмотренный спсциально для этого подвод таким образом, что электролитическая жидкость, поступая из выходного отверстия (сопла) подвода в измерительное отверстие, гидродинамически фокусирует частицы, выходящие из сопла во взвешенном состоянии, к центру измерительного отверстия.

Кроме того, предложили выбирать расстояние между соплом и измерительным отверстием столь малым, чтобы протекающая мимо сопла электролитическая жидкость вытягивала из него необходимую суспензию. Таким образом, подвод не находится под влиянием внутреннего давления суспензия.

С помощью известных измерительных устройств удается, главным образом, отличать одну от другой частицы различного объема.

Однако часто бывает необходимо с помощью измерительных средств отделить частицы, исходя из величины их диаметра. Известные в настоящее время измерительные установки, включая и установки с раздельным подводом частиц, не могут этого обеспечить.

Другая задача непосредственно вытекает из

30 основной области применения таких измери434664 тельных устройств, а именно: измерения клеток крови. Если попытаться отличить друг от друга лейкоциты и эритроциты на основе использования метода Coulter-Counttng, то это удается лишь в том случае, когда после обогащения лейкоцитов значительно уменьшена разница в концентрациях.

В нормальной крови на 700 эритроцитов приходится один лейкоцит. В нефракционированной крови объемные р азмеры, соответствующие размерам лейкоцитов, могут иметь те эритроциты, которые проходят в измерительное отверстие не по отдельности, а по два и более, так что объем одного лейкоцита равен примерно объему двух или четырех эритроцитов. Вероятность одновременного прохождения в измерительное отверстие двух или нескольких эритроцитов не может быть уменьшена произвольно за счет разбавления, поскольку расстояния между эритроцитам и определяются не только статистическими законами распределения. Обычно в зависимости от используемой суспенз ионной среды от

1 до 10 / эритроцитов также и при высокой степени разбавления агломерируют (образуют шарики геля), поэтому подсчет или измерения лейкоцитов в крови нормальной концентрации или в разбавленной крови невозможны, если с помощью препаративных методов перед измерениями число эритроцитов не оудет понижено по крайней мере до 0,2 / .

При использовании препаративных методов, базирующихся на сел ективном гемолизе эритроцитов, изоляционное свойство мембраны лейкоцита, необходимое для регистрации результатов измерения, уменьшается или полностью исчезает, в то время как применение методов осаждения полностью исключает возможность количественных оценок, так как степень обогащения лейкоцитов не может быть определена достаточно точно.

Таким образом, задача заключается в том, чтобы в процессе измерения лейкоциты и эритроциты могли регистрироваться раздельно друг от друга.

Для повышения точности измерения и производительности .предлагают устройство, в котором имеется два измерительных отверстия с соответствующими электродами и измерительными контурами, которые расположены в потоке жидкости последовательно друг за другом, и диаметры отверстий и/или их длина отличаются друг от друга и подобраны таким образом, что с помощью одного измерительного отверстия регистрируется, главным образом, объем, а с помощью другого — поперечное сечение частицы.

Вместо оценки по размерам поперечного сечения может проводиться оценка по длинам частиц, поскольку частицы с одинаковым объемом при различной площади поперечного сечения неизбежно имеют разную длину.

Применение специальных мер при подводе частиц необходимо, потому что в тех случаях, когана оцениваются частицы, имеющие при5

1О

65 мерно одинаковые порядки величин, но одни из них движутся вблизи стенок измерительного отверстия, а другие вблизи его центральной области (т. е. отсутствует гидродинамическая фокусировка), то результаты измерения отличаются так, как если бы частицы в действительности имели разные размеры.

На входе и выходе измерительных отверстий, особенно в случае коротких отверстий, имеют место значительные искажения тока и электрического поля так, что помимо формфактора могут быть определены другие коэффициенты, зависящие от геометрии измерительного отверстия, пластичности взвешенных частиц, а также вязкости суспензионной среды.

Если измерительное отверстие имеет столь малые размеры, что область, в которой электрическое поле может считаться приблизительно однородным, меньше, чем длина проходящей частицы, то при измерениях получаются заниженные значения объема такой частицы, поскольку в момент регистрации конец частицы выходит из области концентрированного электрического поля в отверстии и, таким образом, не вся частица участвует в формировании результата измерения. В результате при коротких измерительных отверстиях объем удлиненной частицы оценивается по сравнению со случаем с круглой частицей такого же объема не в соответствии со своим истинным формфактором, а черезмерно заниженно, поэтому в предлагаемом устройстве предусмотрены два измерительных отверстия с разной геометрией. Одно из этих отверстий должно быть достаточно длинным для того, чтобы проходящая через измерительное отверстие частица удлиненной формы полностью располагалась в области с равномерной напряженностью поля. С помощью более короткого отверстия оценивается преимущественно поперечное сечение частиц. Таким образом, обеспечивается дифференциация проходящих через измерительное отверстие частиц в отношении их формы. При этом оценка осуществляется исключительно на основании измерения амплитуды изменения тока при прохождении частицы через измерительное отверстие.

Для различения агломерированных эритроцитов от лейкоцитов используется явление, сущность которого вытекает из различной природы исследуемых клеток.

Эритроциты и лейкоциты отличаются друг от друга не только объемом, но и пластичностью. В отличие от лейкоцитов безъядерные эритроциты из-за их незначительной внутренней вязкости легко деформируются. При прохождении через измерительное отверстие они теряют линзовую форму и под действием гидродинамического давления в отверстии вытягиваются на величину до 20 мм, составляющую примерно до трех диаметров эритроцита, находящегося в спокойном состоянии.

434664

Предлагаемое устройство, в котором предусмотрены относительно короткое и относительно длинное измерительные отверстия оценивает частицы, проходящие через длинное отверстие, иначе, чем частицы, которые проходят через короткое отверстие. В силу своей относительной жесткости лейкоциты при прохождении через оба отверстия сохраняют свою круглую форму с диаметром or 6 до

8,5 мк и в отверстиях длиной порядка 40 мк оцениваются еще пропорционально объему, в то время как эритроциты при такой длине измерительного отверстия оцениваются примерно на 10 /О ниже. Деформация частиц зависит также от диаметра измерительного отверстия. Если уменьшить размеры измерительного отверстия, т. е. его длину или поперечное сечение или оба размера одновременно, то различия в оценках лейкоцитов и эритроцитов оказываются еще значительнее.

Устройство для подсчета и классификации взвешенных в исследуемой жидкости частиц, состоит в основном из включенных последовательно друг за другом измерительных устройств, имеющих различную геометрию измерительных отверстий. С помощью известных электронных или аналоговых методов можно оценивать соотношение амплитуд импульсов, которые возникают вследствие прохождения частицами через измерительное отверстие и обусловленного этим изменения тока.

Давления в отдельных сосудах следует выбирать относительно друг друга таким образом, чтобы из сосуда, расположенного за первым измерительным отверстием, вытекало во второе измерительное отверстие больше жидкости, чем в него поступало бы из первого измерительного отверстия. В результате этого при коаксиальном расположении обоих измерительных отверстий на незначительном расстоянии друг от друга предотвращается .расширение струи суспензии и обеспечивается то. что все частицы, которые прошли через первое измерительное отверстие, достигают и второго измерительного отверстия.

Таким образом, при рассмотрении выше дифференциальных измерений не наблюдается отсутствия отдельных частиц. В соответствии с этим целесообразно в качестве первого измерительного отверстия на пути потока суспензии использовать то, которое имеет меньшие размеры, а в качестве второго то, в котором определяется абсолютный объем частиц.

Подобная конструкция устройства обеспечивает еще одно существенное преимущество, а именно улучшает определение объема частицы во втором измерительном отверстии.

Струя суспензии поступает во второе измерительное отверстие и связанный с ним токовый контур полностью сфокусирован. Фокусировочный конус на выходе сопла перед первым измерительным отверстием не находится в этом токовом контуре. Благодаря этому

65 достигается улучшение в одновременном определении больших и малых частиц, т. е. повышение объемной динамики измерительной установки.

Предположим, что выходное отверстие подвода частиц (сопло) находится как обычно перед измерительным отверстием, а фокусировочный конус — в электрическом измерительном контуре. Частицы, выходящие из сопла, сначала движутся медленно, а затем вследствие сжатия струи, происходящего под влиянием гидродинамической фокусировки, осуществляемой потоком окружающей жидкости. происходит ускорение частиц. Поэтому импульсы, которые регистрируются в электрическом приборе для обработки данных, сначала медленно возрастают, а затем при вхождении частицы в измерительное отверстие резко возрастают из-за увеличения напряженности поля, которое имеет место в отверстии.

До тех пор пока частица находится в отверстии, амплитуда импульса остается постоянной. При выходе частицы из измерительного отверстия амплитуда резко уменьшается.

Вследствие того что струя суспензии окружена потоком жидкости, имеющим значительно более высокую плотность, расфокусировка струи происходит далеко за измерительным отверстием и не оказывает влияния на процесс измерения.

В случае, когда из сопла подвода выходит крупная частица, величина соответствующего ей импульса уже в стадии возрастания значительно превосходит амплитуду импульса небольшой частицы, которая как раз в это время находится в измерительном отверстии.

Это может привести к погрешностям при анализе импульсов, создаваемых маленькими частицами.

Если в измерительном отверстии находится большая частица, а другая частица в это время входит в фокусируюгцпй конус, то создаваемый ею импульс накладывается на импульс частицы в измерительном отверстии и происходит уменьшение точности измерения.

В этом случае был бы зафиксирован больший диаметр частицы, чем действительный.

В предлагаемом устройстве предусмотрено наличие зоны, в которой частицы ускоряются. не находясь при этом в электрическом поле токового контура, принадлежащего второму измерительному отверстию, в результате чего указанный выше эффект полностью отсутствует при измерении во втором токовом контуре. Поскольку уменьшается также количество частиц, находящихся во втором электрическом измерительном контуре, шумы, создаваемые частицами в предлагаемом устройстве меньше, чем в известном.

Это устройство позволяет более точно определять объем частиц также и тогда, когда разрешающая способность устройства в отношении формы или способности частиц к деформации недостаточна. В этом случае первое измерительное отверстие служит лишь

434664 для улучшенной фокусировки и экранировки поля перед вторым измерительным отверстием от влияния фокусировочного конуса, расположенного перед первым измерительным отверстием.

Кроме повышения точности измерения, предлагаемое устройство имеет и другие преимущества. Благодаря возросшей крутизне фронтов импульсов длительность счетных импульсов становится значительно меньше, что обеспечивает возможность увеличения числа подсчитываемых импульсов в единицу времени.

Таким образом, если измеряется объем частиц с помощью лишь второго отверстия, то при выполнении определенных условий разрешающая способность может быть увеличена с 1000 частиц в 1 сек до 10000. Кроме того, одновременная регистрация двух или более частиц происходит редко.

Рассмотренное выше влияние фокусирово -тного кончса на форму импчльсов имеет место и для тех импульсов, которые возникают при прохожленич частицами первого измерительного отверстия. Однако поскольку с помощью первого отверстия осуществляется лишь различение равных по объему, но разных по форме частиц, то нет необходимости в столь высокой точности измерения для первого измерительного контура.

На фиг. 1 показано предлагаемое устройство.

Сосуд 1 стенками 2 и 3 разделен на ттттт объема. В объеме 4 находится жилкость 5, солержащая частицы, которые должны бт..тть классифицированы. Эта жидкость чепез отверстие 6 в стенке 2 попадает в объем 7, а через отверстие 8 в стенке 3 — в объем 9.

В жидкость, находящчюся в объемах 4, 7 и 9, погрчжены электролы 10. 11 и 12, иметощие различные потенциалы. Электролы 10 тт 11 связаны с измерительным устройством 13, в котором регистрирчются изменения тока. возникающие при прохождении частицы, содержащейся в жидкости 5 через измерительное отверстие 6. Электроды 11 и 12 подсоединены к измепительномч устройству 14, которое регистрирует изменения тока при прохождении частиц через отверстие 8.

Отверстие 6 имеет меньший диаметр, чем отверстие 8, поэтому в отверстии 6 определяется в основном поперечное сечение, т. с. форма тастттц, а в отверстии 8 — главным образглт объем. ттиаметр отверстия 6 .,то>ктто выбирать таким же, как и отверстия 8, но длина отверстия 6 должна быть такой. чтобы концы удлиненных по форме частиц выходили из отверстия, а круглых по форме частиц не выходили. В этом случае возможно различение частиц в соответствии с выбранным заранее критерием. Можно также комбинировать оба конструктивт.ых вапианта т. е. выбирать лиаметр и длинч отверстия 6 меньтттими, чем отверстия 8. Данные, тто.ччченные г измерительных устройствах 13 и 14, 5

1О

15 го

65 подводятся к устройству 15 переработки данных, в котором осуществляется оценка частиц, имеющих одинаковый объем, но разную форму.

На фиг. 2 показаны частицы в момент прохождения через отверстия.

Частица (эритроцит) при прохождении через узкое измерительное отверстие 6 приобретает торпедообразную форму, т. е. линзообразная форма эритроцита вытягивается в длину. Измерительное отверстие выполнено таким образом, что его длина меньше, чем длина вытянутого эритроцита и концы последнего выходят из отверстия 6. При прохождении отверстия 8 частица не испытывает леформации. Жидкость из объема 7 между обоими измерительными отверстиями соединяется с жидкостью, поступающей из измерительного отверстия 6 и протекает через измерительное отверстие 8 в объем 9.

Перед отверстием 6 на небольшом расстоянии находится выходное отверстие (сопло)

16 подводящего устройства 17. Электролитическая жидкость 5 в объеме 4 перед первым измерительным отверстием лишена частиц.

Частицы подводятся к измерительному ответтстию 6 в суспензии через полволящее устройство 17. Поступающая в измерительное отверстие 6 жидкость из-за малого расстояния между соплом 16 и отверстием 6 вытягивает из сопла суспензию, динамически фокусирует ее и вводит в центральную область этого отверстия.

С помощью предлагаемого устройства возможно проведение исследования в нормальной разбавленной крови без необходимости понижения в исследуемом образце концентрации эритроцитов по отношению к конттентоации лейкоцитов перед исследованиями. Оно позволяет отчетливо различать от лейкоцитов лва или более склеившихся эритроцита.

Рассмотрим подробнее особенности вт.тполнения областей измерительных отверстий и подвод частиц.

B случаях, когда необходимо исследовать тельца крови, диаметр измерительных отверстий имеет величину примерно 50 мк. Расстояние между измерительными отверстиями и между первым измерительным отвер тием и выходным отверстием (соттлом) имеет такую же величину, поэтому представляет значтттелт.ттт,те трудности расположения этих отверстий в стенках сосуда без каких-либо вспомогательных средств с требуемой вь сокой степенью точности, а также с достаточно высокой точностью UpHTDOBKH отверстий относительно друг друга. Предлагают по крайней мере первое измерительное отверстие и сопло выполнять в элементах конструкции, изготавливаемых отдельно от остальной констрчкции и крепить эти элементы с помощью общего несчщего элемента.

Может возникнуть необходимость исследования с помощью устройства частиц с другими размерами диаметров. Из этих сообра434664

10 жений предусмотрено, что элемент, несущий отдельные элементы конструкции с отверстиями, выполняют заменяемым. Это позволяет использовать прочную измерительную аппаратуру, которая входит в состав установки при рассмотрении частиц самых различных диаметров, при условии, что в каждом конкретном случае будет производиться замена конструктивных элементов с отверстиями.

Целесообразно выполнять несущий элемент, если он располагается в устройстве, в виде составной части промежуточной стенки и/или стенки сосуда. Наиболее целесообразно выполнять несущий элемент в виде трубки, в которой размещается рассмотренный выше конструктивный элемент. Таким образом, в этой трубке последовательно расположены: отверстие сопла, первое измерительное отверстие, а в данном случае и второе измерительное отверстие. Эту трубку вводят в выемку в стенках сосуда.

В объемы, образованные между элементами внутри трубки, выполняющей функции держателя, должны быть сквозь стенки трубки проделаны отверстия, обеспечивающие возможность подвода жидкости внутрь трубки.

В рассматриваемом случае в стенках трубки имеются сквозные отверстия, впадающие в пространство между выходным отверстием сопла и первым измерительным отверстием и составляющие угол по отношению к отверстиям, впадающим в пространство между первым и вторым измерительными отверстиями.

Это сделано для того, чтобы наличие отверстий не нарушало механическую устойчивость трубки. Предлагают выполнять эти отверстия воронкообразной формы.

Расположенные в трубке элементы имеют значительно больший по величине диаметр, чем диаметр имеющихся в них измерительных отверстий. Объем содержащейся в трубке суспензии определяется внешним диаметром элементов, являющимся одновременно внутренним диаметром трубки, и черезмерно большой. Полное опорожнение такого объема (выход жидкости через отверстие сопла) потребовало бы слишком длительного времени, поэтому в трубку вводят капилляр.

С помощью этого капилляра уменьшается эффективное поперечное сечение трубки до значения соизмеримых с поперечным сечением отверстия сопла или даже меньше.

Трубку, в которой расположены элементы с отверстиями, в местах, где она прилегает к стенкам сосуда, изготавливают конической, она проходит через соответствующие отверстия в стеклянных стенках. В качестве материала для трубки используют стекло. Внутренние элементы выполняются из сапфира, в котором просверливают необходимые отверстия.

На фиг. 3 показано выполнение измерительных отверстий, расположенных в трубке.

Измерительное отверстие б и второе измерительное отверстие 8 выполнены в элемен5

so

65 тах 18, 19 и 20 конструкции, изготавливаемых отдельно от прочей части устройства. Эти элементы представляют собой сапфиры с отверстиями, размещенные в цилиндрической стеклянной трубке 21 в заданном положении друг относительно друга. Конец стеклянной трубки выполнен коническим и вводится в отверстия в разделительных стенках 2 и 3.

Отверстия в разделительных стенках также конические.

Для подвода жидкости, которая засасывает из сопла суспензию, в стенках стеклянной трубки предусмотрены отверстия 22, а для возможности проникновения электрического поля от электрода 11 в объем 7 перед отверстием 8 и для дальнейшего подвода жидкости — отверстия 23. Кроме того, жидкость через отверстия 23 вводится для уменьшения завихрения и лучшей фокусировки через отверстие 8:

Если электрод 11 располагается в объеме 7 и необходимые соотношения в потоке обеспечиваются за счет выбора диаметров отверстий 23, то стенку 2 сосуда можно убрать.

Это позволяет упростить конструкцию, поскольку в этом случае имеется лишь одно место, в котором трубка 21 проходит через оставшуюся разделительную стенку 3 сосуда.

Необходимо обеспечить через стеклянную трубку подвод для электродов, которые располагаются в объеме перед вторым измерительным отверстием.

Для уменьшения поперечного сечения пространства перед отверстием сопла 1б, т. е. для уменьшения объема предназначенной для измерения суспензии, в стеклянную трубку введен капилляр 24, конец которого входит в элемент 18. Этот капилляр уменьшает эффективное сечение трубки до величин, соизмеримых с размерами отверстия сопла 16 и меньших.

Для анализа кровяных телец при использовании в качестве электролитической жидкости солевого раствора оптимальными являются следующие размеры измерительных отверстий. Для первого отверстия форма цилиндрическая, длина 15 мк, диаметр 40 мк. Это отверстие может быть выполнено конической формы с длиной 22 мк, диаметром входного отверстия порядка 50 мк и диаметром выхочного отверстия примерно 43 мк. Второе измерительное отверстие имеет цилиндрическую форму с диаметром порядка 40 мк и длиной

40 мк. Диаметр отверстия сопла подвода суспензии равен примерно 40 мк, так же как и расстояние между соплом и первым измерительным отверстием и расстояние между обоими измерительными отверстиями.

Если сделать диаметр всех измерительных отверстий одинаковым, то процесс сборки всех элементов с отверстиями в единый комплекс значительно упрощается. В этом случае все элементы (например, сапфиры), в которых просверлены отверстия, могут быть нанизаны на общую проволоку и фиксированы па необ434664 ходимом расстоянии друг от друга. Нанизывание на проволоку обеспечивает coocHOcTJ> измерительных отверстий одно относительно другого.

Предмет изобретения

1. Устройство для подсчета и классификации взвешенных в исследуемой жидкости частиц, содержащее заполненные электролитом сосуды, соединенные между собой измерительным отверстием, подводящий исследуемую жидкость канал, выходное сопло которого расположено коаксиально с измерительным отверстием на расстоянии, обеспечивающем неразрывность потока исследуемой жидкости, и размещенные в сосудах катод и анод, включенные в электрическую цепь, о т л и ч а ющ е е с я тем, что, с целью повышения точности измерения и производительности, оно снабжено расположенным концентрично с первым измерительным отверстием на расстоянии, обеспечивающем неразрывность потока жидкости, вторым измерительным отверстием, причем диаметр и длина отверстий различны и подобраны друг относительно друга так, что первым регистрируется, глав5 ным образом, объем, а вторым — поперечное сечение исследуемой частицы.

2. Устройство по п. 1, отлич ающееся тем, что диаметр второго по направлению потока отверстия больше, чем диаметр первого

10 отверстия.

3. Устройство по и. 1, о т л и ч а ю щ е е с я тем, что длина первого измерительного отверстия короче, чем длина исследуемой частицы.

15 4. Устройство по п. 1, отличающееся тем, что первое измерительное отверстие выполнено цилиндрическим длиной около 15 мк и диаметром порядка 40 мк.

5. Устройство по п. 1, отличающееся

20 тем, что первое измерительное отверстие выполнено коническим длиной около 20 мк, диаметром входного отверстия около 50 мк и диаметром выходного отверстия около 43 мк.

434664

11 2 16 5 стиг, 1 д 2

Фиг.2

ВЯ2В

22

Составитель Г. Невская

Редактор Т. Рыбалова Техред P. Юсипова Корректор В. Кочкарева

Заказ 3010/15 Изд. № 1787 Тираж 651 Подписное

ЦНИИПИ Государственного комитета Совета Министров СССР по делам изобретений и открытий

Москва, 7К-35, Раушская наб., д. 4 5

Типография, пр, Сапунова, 2