Патент ссср 436464

 

ОПИСАНИЕ

ИЗОБРЕТЕНИЯ

К ПАТЕНТУ («) 436464

Союз Соаетских

Социалистиивсмих

Республик (61) Зависимый от патента (51) N. Кл. А 61k 27/10 (22) Заявлено 13.04.72 (21) 1774198/31-16 (32) Приоритет 14.04.71 (31) 24004 (33) Япония

Опубликовано 15.07.74. Бюллетень № 26

Государственный квинтет

C0BsTs Мнннстров СССР оо делаи нзооретеннй н открытнй (53) УДК 615.45:615. . 361.018. 51/55 (088.8) Дата опубликования описания 10.11.74 (72) Авторы изобретения!

Иностранцы

Сецуро Фудаии, Макаками Оцука и ссиису ОаЬт1 (Япония) Иностранная фирма

<Оцука Кагаку Якухин Кабусики Кайся» (Япония) (71) Заявитель

БИБЛк10ТГЕА

1 (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПРОТИВОВОСПАЛИТЕЛЬНОГО

СРЕДСТВА

Изобретение относится к медицине, в частности к лекарственным препаратам.

Предложенный способ получения противовоспалительного средства, ранее в патентной и специальной литературе не описанный, заключается в том, что к крови, например к сыворотке, добавляют протеазы в количестве

200 — 2000 у на 1 мл, выдерживают смесь при

20 — 60 С в течение 0,5 — 5 час и выделяют целевой продукт известным способом.

Модификацию крови протеазой осуществляют обычно при комнатной или умеренно повышенной температуре, предпочтительно от 20 до 60 С. Обычно рН реакционной системы зависит от типа крови и протеазы, но предпочтительнее нейтральный. Соотношение протеазы крови зависит от вида протеазы и крови и равно 200 — 2000у/мл крови. Реакция получения модифицированного вещества крови обычно заканчивается за 0,5 — 5 час. Полученное модифицированное вещество крови отделяют от непрореагировавших протеазы и крови различными способами, например при помощи органического растворителя, молекулярного сита, ионообменной смолы, центрифуги, метода противоточного распределения, метода электрофореза или другими известными способами.

Пример 1. В 10 л сыворотки бычьей крови вносят 1 г протеазы, полученной от бактерий Bacillus Sp 0 — 20. Используемая в примере протеаза обладает протеолитической активностью в 4000000 П. Е./г. Протеолитическая активность показывает ферментативную активность протеазы по продуцированию небелкового вещества, с цветом по фолину, соответствующим 1 мкг тирозина в 1 мин, как еди10 ницу ферментативной активности. Смесь нагревают 4 час при 45 С на водяной бане (с постоянной температурой). В реакционную смесь приливают до 70 вес. % ацетона и образовавшуюся смесь фугуют при 3000 об/мин, 15 в течение 10 мин для отделения фермента,. протеина и других, удаляемых в виде осадка.

В надосадочную жидкость приливают до

90 вес. % ацетона и смесь оставляют (стоять) на сутки. Образовавшийся осадок отфуговы20 вают при 3000 об/мин в течение 30 мин и сушат под вакуумом. Выделенный продукт растворяют в воде и фильтруют через сефадекс

С-15 для удаления неорганических веществ и низкомолекулярных (органических) веществ.

25 Часть продукта, ингибирующую отек, сушат вымораживанием и промывают метанолом для полного удаления растворимых в нем веществ. После отгонки метанола от нераство436464 рнмой в нем порции получают 25 мг модифицированного вещества крови в виде твердого вещества.

Состав вещества

Содержание, вес. %

Аминокислоты (в пересчете на лейцин) 14

Аминокислоты (в пересчете на лейцин) 70

Сахар (в пересчете на глюкозу) 12

П р и м е ч а н и е: 1) количество аминокислоты определяют реакцией вещества с нингидрином;

2) количество аминокислоты определяют реакцией нингидрина с веществом, гидролизованным 6 н. соляной кислотой при 110 С в течение 36 час.

Состав основных Содержание, аминокислот вес, %

Аспаргиновая кислота 7

Глутаминовая кислота 8

Цистин 3

Вещество растворяют в физиологическом растворе в концентрации 8 мкг/мл и вводят внутрибрюшинно крысам весом 150 — 160 г.

Через 80 мин в пятку задней лапы крысы вводят подкожно 0,05 мл 1%-ного раствора каррагенина в физиологическом растворе. Через

3 час измеряют размеры (увеличение объема) задней лапы с целью определения ингибирующего действия на отек. Оказывается, что доза

8 мкг (150 г вес тела крысы) вызывает 60% ингибирования отека. При этом отсутствуют явления кровотечения в брюшине и асциты.

Для сравнения крысам аналогично вводят протеазу (используемую для получения патентуемого вещества). Через 3 час после введения отмечается лишь 5% ингибирования отека при дозе 8 мкг/150 r. Доза 170 мкг/150 г вызывает 60% ингибирования отека, но при этом отмечается внутрибрюшинное кровотечение.

Пример 2. В 5 мл сыворотки крови крысы вносят 2 мг протеазы (протеолитическая активность 4000000 П. Е./г, определяется так же, как в примере 1), полученной из Bacillus

Sp 0 — 20, и смесь взбалтывают 1 час в водяной бане с постоянной температурой 37 С.

Образовавшийся продукт нагревают 2 час при

60 С для полной инактивации фермента и получают патентуемое модифицированное вещество крови в неочищенном состоянии. Вещество содержит пептид, аминокислоты и сахар и растворимо в воде. Модифицированное вещество крови растворяют в физиологическом растворе в концентрации 400 мкг/мл и вводят внутрибрюшинно крысам весом от 150 до 200 г в дозе 1 мл/200 r (веса тела крысы) для проверки ингибирующего действия на отек, вызываемый внутривенным введением каррагенина в пятку задней лапы крысы. Через 3 час после введения наблюдается 65% ингибирования отека, в дозе 400 мкг/200 г, определяемое измерением объема задней лапы. в концентрации 80 вес. %, осадок удаляют фугованием; он содержит пептиды, аминокислоты и сахар и растворим в воде. Все полученное модифицированное вещество крови растворяют в 10 мл физиологического раствора и полученный раствор разбавляют физиологическим раствором в 5, 10 и 100 раз (т. е. до ч0 5, 10 и 100 объемов от первоначального). Первоначальный раствор и разведенные (разбавленные) растворы вводят крысам в дозировке

1 мл/200 г (веса тела крысы) для проверки ингибирующего действия на отек, вызываемый подкожной инъекцией каррагенина в пятку задней лапы крысы. Степень ингибирования после 3 час с момента инъекции: 80% — с исходным раствором, 62% — с пятикратным разведением, 53% — с 10-кратным разведе40 нием и 51% — со 100-кратным разведением.

Не отмечены никакие побочные действия, вро5

15 г0

60 б5

Нет признаков чек ия.

Для сравнения при аналогичном введении немодифицированной протеазой сыворотки не наблюдается ингибирующее действие на отечное состояние. Так же определяют действие исходной протеазы на отек. При этом наблюдается внутрибрюшинное кровотечение при введении дозы 400 мкг/200 г с обеспечением

64% ингибирования.

Пример 3. В 1000 мл бычьей крови, содержащей лимоннокислый натр, в качестве антикоагулянта вносят для взаимодействия

1 r протеазы, полученной от Bacillus subtilis при 37 С в течение 2 час. В обработанную таким способом кровь приливают ацетон при

10 С в концентрации 60 вес. % и образовавшуюся смесь фугуют. (замороженную) для удаления осадка крови, ферментов и т. п.

Полученная надосадочная жидкость не имеет ферментативной активности. В надосадочную внутрибрюшинного кровотежидкость вновь приливают холодный ацетон де внутрибрюшинного кровотечения и асцитов.

В противоположность этому, ингибирующее действие не наблюдается при введении описанным выше методом крови, не модифицированной протеазой.

Аналогично вводят «Нагазу» для определения ингибирующего действия на отсек. Отмечено 40% ингибирования при дозе 1 мг/200 r, при увеличении дозы до 1,2 мг/200 r отмечается

51 ингибирования, но с заметным внутрибрюшинным кровотечением.

Пример 4. 5 мл сыворотки куриной крови приводят во взаимодействие с 100 мг нерастворимой протеазы (т. е. нерастворимый химотрипсин, полученный приготовлением нерастворимого химотрипсина азидным способом с использованием карбоксиметилцеллюлозы в течение 50 мин при 35 С). Нерастворимую протеазу отфильтровывают, получают

4,8 мл фильтрата, не имеющего ферментативноп активности. Фильтрат содержит пептиды, аминокислоты, сахар; растворим в воде, но нерастворим в метаноле. Фильтрат вводят внутрибрюшпнно крысам в дозе 1 мл/200 г

436464

Составитель С. Щенева

Редактор Л. Тюрина

Корректор Н. Аук

Текред 3. Тараненко

Заказ 2911/16 Изд. М 1757 Тираж 482 Подписное

Ц11ИИП1! Государственного комитета Совета Министров СССР по делам изобретений и открытий

Москва, Ж-35, Раушская иаб., д. 4,5

Типография, ир. Сапунова, 2 (веса тсла крысы) для проверки ингибирующего действия на отек, вызываемый подко>кной инъекцией каррагенина в пятку задней лапы крысы. Спустя 3 час после введения отмечается б8в/о ингибирования, без признаков внутрибрюшинного кровотечения. В противоположность этому, сыворотка куриной крови, не реагировавшая с нерастворимой протеазой, не оказывает (при аналогичном введении) ингибирующего действия на отек.

Упомянутую выше нерастворимую протеазу получают следующим образом. В метанольный раствор карбоксиметилцеллюлозы вносят гидразин, получают гидразид карбоксиметилцеллюлозы, который приводят во взаимодействие с нитритом натрия в разбавленной соляной кислоте (т. е. диазотиру1от). Затем продукт реакции приводят во взаимодействие с химотрипсином при рН 8,7 и 5 С при переме5 шивании; получают нерастворимый химотрипсин.

Предмет изобретения

Способ получения противовоспалительного

10 средства, о тл и ч а ю шийся тем, что, к крови, например к сыворотке, добавляют протеазы в количестве 200 — 2000у на 1 мл, выдерживают смесь при 20 — 60 С в течение 0,5—

5 час и выделяют целевой продукт известным

15 способом.