Способ получения связанных носителем протеинов
ОПИСАН И Е
ИЗОБРЕТЕНИЯ
К ПАТЕНТУ (») 463268
Союэ Советских
Социалистических
Республик (61) Зависимый от патента (22) Заявлено 24.05,72 (21) 1787934/23-5 (51) М. Кл. С 08h 1/00 (32) Приоритет 09.06.71 (31) P 2128743.4 (33) ФРГ
Опубликовано 05.03.75. Бюллетень М 9
Государственный комитс.
Совета Министров СССР по делам изобретений н открытии (53) УДК 678.765(088.8) Дата опубликования описания 04.09.75 (72) Авторы изобретения
Иностр анпы
Клаус Букамп, Ханс Ульрих Бергмайер, Карл-Хейнц Боч и Дитер Яворек (ФРГ) и Михаель Нельбек-Хохштеттер (Австрия) Иностранная фирма
«Берингер Маннхайм ГмбХ» (ФРГ) (71) Заявитель (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ СВЯЗАННЫХ НОСИТЕЛЕМ
ПРОТЕИНОВ
Изобретение относится к новому способу получения связанных носителем протеинов.
Интерес к связанным носителем протеинам, особенно к связанным носителем ферментам, постоянно возрастает, и уже описано много веществ-носителей и методов фиксации. Однако только некоторые из известных до сих пор методов и веществ-носителей дают удовлетворительные продукты с высокой активностью и с хорошим выходом и достаточной стабильностью. Поэтому до сих пор в продаже имеются только некоторые связанные носителем ферменты, причем преимущественно речь идет об особенно стабильных протеолитических ферментах. Это объясняется тем, что более чувствительные ферменты или ферментные комплексы при фиксации по известным до сих пор методам или полностью теряют свою активность, или настолько неустойчивые, что не могут применяться для технических целей.
Цель изобретения — разработка способа связывания протеинов с нерастворимыми носителями, т. е. получения продукта с высокой активностью, стойкого продукта, который может быть использован для технических целей.
Известен способ получения связанных носителем протеинов, заключающийся в том, что псактивныс прогсины подвсргают взаимодействию с соединением, содержащим эпоксидную группу и двойную связь, способную к сополимеризации. При этом получают привитые
5 полимеры, используемые для получения во,"окна.
С целью получсния биологически активных продуктов предлагается в качестве протеинов использовать биологически активные протеи10 ны и процесс осуществлять в водной среде, а полученный продукт подвергать сшиванию путем его взаимодействия с акриламидом или дифункциональным сшивающим агентом. При необходимости в реакционный раствор могут
15 быть введены сополимеризующиеся мопомеры.
По способу согласно изобретению протеин образует ковалентную связь с содержащим эпоксидную груш)у соединением при открывании эпоксидной группы. Полученный таким пу20 тем промежуто шый продукт без дальнейшего выделения соединяется с соответствующим носителем, причем другая функциональная группа эпоксидного соединения вступает в реакцию с веществом-нссителем.
25 Вещество-носитель может вводиться как таковой в водный раствор для получения связи с промежуточным продуктом, цо может быть
463268 псссов ферментпос или протеиновое соединение сохраняется. Это !!роявлястся, например, в том, что при фиксации фермента уреазы на
ДЕЛЕ-целлюлозе по известному триазиновому способу получают продукт с активностью
4,9 ед./r, а по предлагаемому — с активностью
1200 ед./г при той >ке ферментативной активности. Причем и после хранения в течение нескольких сдсль при температуре 34 C продукт не теряет активности. Лналогично по известному способу можно фермент глюкозаоксидазу с активностью 300 ед./г лиофилизата связывать с целлюлозой. Но после 11 дней хранения активность сни)кается менее чем на половину.
По предлагаемому способу, используя одинаковые количества фермента, можно получать продукты почти с удвоенной активностью. Такие продукты сохраняются более 6 месяцев в готовой форме как катализаторы без существенного уменьшения активности.
Продукты, получаемые по изобретению, стойки к поражению микроорганизмами, ре)ким абухания их управляемый, что ва)кно, если продукты применяют для насадки колонны, кроме того, они обеспечивают легкое регулирование требуемого заряда или отсутствие заряда. Преимущество способа состоит также в простоте его осуществления.
Пример 1. Исходные вещества: глюкозаоксидаза (GOD, 220 ед./мг) акриламид, 2,3эпоксипропиловый сложный эфир акриловой кислоты, N,N -метиленбисакриламид, 3-диметиламинопропионитрил, перекисный сульфат аммония.
0,1 г GOD растворяют в 2 мл. 0,5 М буферного раствора триэтаноламина (рН 8,0) в атмосфере азота при 30 С, смешивают с 0,25 мл
2,3-эпоксипропилового сложного эфира акриловой кислоты и перемешивают 30 мин. Затем охлаждают до 10 С, смешивают с 3 г акриламида и 0,1 г N,N -метиленбисакриламида, растворенного в 18 мл дистиллированной воды.
В атмосфере азота приблизительно через
15 мн!! начинается полимеризация при помощи 0,5 мл 5%-ного 3-диметиламинопропионитрила и 3 мл 5%-ного перекисного сульфата аммония. Раствор приблизительно через 5 мин становится вязким, затем он полимеризуется и желтьш прозрач ы и твердый гель. Блок полимсризации оставляют на 18 час в холодильном шкафу. Далее полимеризат продавли1ают сквозь металлическое сито с отверстиями диамс!ром 0,5 мм и промывают 2000 мл дистиллированной воды. Частички геля помещая)т в колонну внутренним диаметром 2 см с 0,2 М буферным раствором фосфата калия (p1- 7,5), промывают адсорбционно связанной
GOD, пока активность элюата не будет равна нул1о. Ферментативная активность связанного носителем фермента (лиофилизата) 500 ед./г.
Пример 2 (сравнительный пример) . Повторяют пример 1, однако не вносят эпоксидное соединение.
3,0 г акриламида и 0,1 r N,N -метиленбисакриламида в 18 мл дистиллированной воды
G5 смешивают, псрсмсшивая и ",àìîðàæèâàÿ с
0,1 г GOD. распюрснной в 2 мл 0,05 Ч буферного раствора триэтанолампна (р1-! 8,0). Заieii, как в примере 1, в атмосфере азота добавляют раствор инициатора, и продукт обрабатывают, как описано в примере !. Лктпвность элюата около 40О/о от активности введенного GOD. После IItoQIIлпзацпн получснHОГ0 прoдукта активпост>> лпоtt)1!л!1 эата сост!!1!— ляст от 90 до 100 сд./г.
П р и м с р 3. Исходныс вещества: GOD-1, 220 Сд./мг. акрп,72 1ид, 2,3-эпоксппропиловый сложны11 эфир 2! рилОГОЙ кислОты, Х, 3 -i !етилснбпсакриламид, 3-диметиламинопроппонитpIt;i, перскпсньш сульфат аммония.
0.15 г GOD в 1,5 мл дистиллированно« иоды и 1,5 мл 1,0 М буферного раствора трпэтапола)пша (pli 8,0) охлаждают в атмосфере азота до 10 С. Этот раствор разбавляют 3.0 г акрп72)Ii!72 и 0,1 г Х,Х -метпленбпсакрплампда, растворенного в 14 мл воды. Прп добавке в реакппонный раствор 0.25 мл 2,3-эпоксппроппловОГО сло>1 НОГО эфира анри,)ОВОЙ кислоты, 0,5 )!л 5%-ного 3-диметиламипопро!и!Он!!!р!1ла и 0,2 мл 5,II-íoão псрекисного сульфата аммония начинается реакция полпмсризации.
Время полимерпзацпи около 10 »пш. Полпмеризационный блок продавливают сквозь металлическое сито Ii обрабатывают, как описано в примере 1. Опредслсш1с активности элюата показывает, ITQ связывается ковалептпо
100 "1р протеина. Лктивность лпофплпзата
140 ед./г.
Пример 4. Исходные вещества: GOD-1, 200 ez./t, акри,7ампд, 1- (а 7 111ло! сп) -2.3-31IoI<сипропан, N,N -метиленбпсакрпламид, 3-димстилаilппопропиошп рпл, псрекпсный сульфат аммония.
50 мг GOD в 0,5 мл дпсп1ллпрова ной воды и 0,5 ii;t 1 М буферного раствора )рпэтаноламина (pI 8,0), растворенные в атмосфере азота при 30 С, и 0,1 мл 1- (аллилоксп) -2,3эпоксппропана выдерживают 40 мин, затем охлаждают до 10 С, смешивают с 3 г акриламида и 0,1 г Х!.N )toòè 7åíOitñ2êðè72)lèä2. растворенного в 20 iiл бпдпсп1ллпрованной воды. Дальнейшую обработку гедут, как Оппсап0 в 11римсрс 1.. .!.Г!!И«ость эл!Оата сосlавляс Г 10 /О OT 21 Тl! -I!!OCT!I liOitОЛьзовапно! 0 (!)Сpмента. Лктивность лиофплпзата 210 Сд./!.
П р и ii е р 5. Исходные вещества: урпказа.
4,, ) ед./мг, растворенная i! 50",, ; глицсри1!а, 0,05 !1 глицин и 0,13 М раствор Ха СО„, акрпламид, 2,3-эпокси!!рош!ловый сложный эфир акриловой кислоты, Х,Х -мстплспбпсакрпламид, З-дпмстпламппопропнонптрил, перскисиый сульфат ам);Опия.
10 мг уриказы подвергают дпалпзу в 1 л
0,01 .!1 буферного раствора глпцина (р1-! 10)
«рп 4 С около 4 час. Диализат смсшпвают с
1 мл 1 Ч буферного раствора триэта« (рН 8,0). При 10=C в атмосфере азота выдерживают получсш1ую смесь с добавлением
0,1 мл 2.3-эпоксппропплового сложного эфира
463268
1Ip lм т I оj)ñтен l)i (оi )ii:, ),..., (), окачев". :пи
Pc;(cilcloI) Л. Ушакова Тс: рсд М. Семенов Корректор H. Лебедева
9,3 >б,"1 () И,;,;,о;б) (;3 1и:>и;>(>)еб 1, о; !i: if i оc
Ц1(ИИПИ 1 осударс>ве:lio;o коми.ега Сове.а Ми;и!стров .ССР по делам иаобретеиий и открытий
Москва, )К-ео, Раушская иаб., д. 4/5
Типограс.ии, ир (;апуиова. р акриловой кислоты при пере)испи!ваппи В гечение 30 мин. Оорабоп<у ведут по при.!сру 1.
Акт!)Впость лиофилизя )3 З,o (z./c.
П р и м с р 6. Ис <олпыс вс)цсства: гсксокипаза, 140 сд./мг, акрила)(ил, 2>3-эпокси))рспп) loВы и ел 0)к I! ы)1 э (1) и р 3 I< p и л 0 В 011 и и с л 0 T»), мстплспбисакр!! 13! H-;д, 3-дпметил амi! Hîilðoïèо пт!три" 1, пеpcкпcп»))1 c)T!»(I! 3T 3 м а)оипя.
20 мг сjcllcll3!III кристяллоь гсксокипазь..
1)астворяют 13 5 )lл волы и подвсрга от,чгализу в 1 1 0,0! М тфсрпого раствора гр! 13lloламина (ph 8.0) при -1"C. В ирису)с!В)п! 2,3эпоксипропи:101)ОГО с.!Оя<(ioi 0 эфира е!!(рило:30Й кислоты Вылсрж f»310 ИО, (>>чспп (ю )l(.с!> Б я1мосфсрс азота прп 10 С с о<лат)<лси!!См lloc.)с
30 мип выдсржпвапия (o 10 С. Раствор фсомента смешивают с 3 г акриламида и 0,1 г
N,N ìcTiIëåiIoHc3êpH,13ì)f.Т3, растворепиого
20 м I дистиллпроваппой воды. Да II>!Iclf ill) обработку ислут по примеру 1. X)< I.II»I(oc f, лпофилпзата 12 сд., ".
П р и м ср 7. Ис.<о,чпы(. Вс!цества: глюкозаОксидаза, 220 сл./мг (GOD), 1,2-эпоксибутсп3,4> акриламид, Х,Х -мст))лспбисакриламил, 3-ДH!>(0TH.131IEIIIOI PОIIIIOПH PH, ic IICPC(фя 31! >)опия.
100 мг G0D В 2 мл 0,5 Ч буферного p3c1:3()ра триэтаноламипа (pII 8,0), рас 130р lfili)п В а)()осфсрс азота прп 30""С. и 0,05 мл 1.2-эпоксибутсиа-3,4 и>)((сржп)3(1)от» тсчсппс 30 мип.
Затем оклаж,чают ло 10 С, с» сп!)1)33)оl с 3 г акриламида и 0,125 г Х>N -мстилспбпсакрпламида. растворе»I!»u и в 18 мл бплистплл)!роВВH П011 ВодЫ., (ЕIЛ I>ПC!)111> 10 Оор яб(ТГЕМ (30 ×у! I!О примеру 1. )кт)!Виост! элюата 37,о от )fcj)!30начальной ак и»иост!) Ис.;одного фер,)ciiта.
АктивноcTь лиофилизата 540 ед., г.
П р и м с р 8. Иско (I(i>ic вещее!!33: г,иокозаэксидаза, 220 сд./мг, 3! Iol 00 мг глюкозаоксидазы, раствореипой в ат;; ос(рсрс азота при 30 С в 2 мл 0,5 М буферного расТ!30.)а триэтаполамипа (рН 8,0), и (),25 мл 2,3-эпоксипропи ioBofo сложного эфира акриловой кислоты выдерживают 30 мии. :(атс:: раствор переводя(в диас!изну!О камеру ) диализпая трубка (Калле — целлофан) ) и .(Важлы подвергают диализу в 1000 мл 0,05 Ч буферного раствора гриэтаиоламина, рН 8,0. Прслзарптсл»но инкубированиый раствор фермсп а (объс:.. 10 мл) оклажлают до 10 С, объем л )lio)H як) г до 20 мл билисти !Лировапио!! 3о. )ой, сисH;!:»àþò с 3 г акриламида и 0,15 r N,N -,;ñlпг!Спбисакриламида. Далее процесс ! )с, ц i )ю:!римеру 1. Ак-! !31!oc ), элюата 5о() от первоначальной 3!<1Ï)3ПОСТП ПСПОЛЬЗОВЯППОГО фСРМСIIT3. (I<1ИВIlU(TIc,! II 0(i) il. lH33T3 305 C +.cc . С и 0 с о б: o, ) I с и и )1 с 13 Я 3 Я п п »1:; I I o c i(T c c > I l p оГсипо! Иут(о )3 >аи. !Очсйс ) 1)и)1 протсииов с сос, пп)(ill!(3!. Гi)3(01))!<31!Tèì эпоксидиУ(0 ГP)i!!!(У и С!10(.,)()111 )О ) СОПО, IH)1 Pll»cllllill ДВОЙИУ)0 СВЯЗЬ, О 1 i 1! I Е! 10 (il, lf )1 С и Са), ЧТО, С ЦЕЛ ЫО ПОЛ>)>HC If È3I () ПО .Oi. П -ICC; Т i l l! i l! >l c. I! j) 0 l С I I I l »I i f. I I p O U PC C O C у Гцс С Т ВЛ Я !ОТ В иолпой срслс, а получеииый продукт по,чвсргаю 1 с: I I I!13 3 i f H Io ) пут с:>! 13;3 а и а Од с и с т В и я с я к р и л31!H, ., )1! 11. Iп:lифупк (иоп альпы>1 сп!иВЯIОИ1иа! ЯГCII ГО\!.
