Способ определения активности антитрипсина в сыворотке крови

 

м . -т

ОПИСАНИЕ

ИЗОБРЕТЕНИЯ ((() 474735

Союз Советских

Социалистических

Республик (61) Дополнительное к авт. свид-ву (22) Заявлено 16.08.71 (21) 1694984/28-13 (51) М, Кл. G Оlп 33/16 с присоединением заявки №

Совета Министров СССР

an делам изобретений и открытий (53) УДК 591.111.1(088.8) Опубликовано 25.06.75. Бюллетень № 23

Дата опубликования описания 22,09.75 (72) Автор изобретения

В. В. Карпицкий

Крымский медицинский институт (71) Заявитель (54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АКТИВНОСТИ АНТИТРИПСИНА

В СЫВОРОТКЕ КРОВИ

ГосУдаРственный комитет (2 g) 11риоритет.

Изобретение относится к медицине и может быть использовано в клинических и экспериментальных исследованиях.

Известен способ определения активности антитрипсина путем инкубации трипсина с исследуемой сывороткой, заключающийся в определении уменьшения трипсиновой активности по перевариванию казеина.

С целью повышения специфичности и точности результатов, предложено неингибированный после инкубации трипсин оттитровывать специфической иммунной прсципптпрующей сывороткой.

Активность антитрипсина определяют следующим образом.

Готовят раствор кристаллического трипсина на 0,85%-ном растворе NaC1 в день определения, содержащий 500 мкг препарата в 1 мл, рН раствора 5,5 — 7,0; 0,3 мл исследуемой сыворотки вносят на дно обычных центрифужных пробирок, затем добавляют 0,2 мл раствора трипсина (100 мкг препарата), размешивают и инкубируют в термостате при 37 С

30 мин. Ставится три параллельные пробы.

После инкубации пробирки извлекают из термостата и добавляют 0,4 мл специфической иммунной преципитирующей сыворотки, содержащей в 1 мл 0,54 мг белка антител. Иммунную сыворотку перед употреблением осветляют при 10000 д 10 мин. Количества добавленной иммунной сыворотки колеблется в зависимости от количества белка антител в 1 мл.

Оно должно быть таким, чтобы 100 мкг трипсина связывали все антитела, т. е. в зоне эквивалентности. Пробы инкубируют при

37 С 30 мин в термостате. "àòåì их переносят в холодильник (1 — 5 С) и выдерживают в течение суток.

К о н т р о л ь 1. Вместо исследуемой сыво-!

0 ротки 0,2 мл раствора трипсина инкубируют с 0,3 мл 0,85%-ного раствора NaC1, а затем проделывают те же операции, что и с опытной пробой. Ставится три параллельных контроля.

К о и т р о л ь 2. К 0,4 мл иммунной сыворотки добавляют 0,5 мл 0,85%-ного раствора

NaC1. Ставится два контроля. Спустя сутки пробы и контроли извлекают из холодильника, центрифугируют при 1500 — 2000 д 10 мин и отсасывают надосадочную жидкость. Оора20 зовавшийся преципитат отмывают от посторонних белков. Для этого во все пробы (опытные и контрольные) добавляют 0,85% -ньш раствор NaC1 в объеме реакций. Затем преципитат осторожно взбалтывают, чтобы не

25 было комков. Снова центрифугпруют при

1500 — 2000 д 10 мин и отсасывают центрифугой. Осадки промывают два раза 0,85% -ным раствором NaC1 и два раза в дистиллированной воде. Затем определяют количества бел30 ка по ЛОУРИ: в каждую пробирку добавля474735

Составитель С. Малютина

Техред 3. Тараненко

1(орректор Е. Рогайлина

Реда кт ор А,. Бер, Заказ 2314/10 Изд. _#_0 809 Тира>к 902 Подписное

ЦНИИПИ Государственного комитета Совета Министров СССР по делам изобретений и открытии

Москва, )K-35, Раушская наб., д. 4, 5

Типография, пр. Сапунова, 2 ют по 5 мл реактива для растворения преципитата, получаемого вдень опыта путем смешивания 50 мл 2%-ного раствора Na>CO> в

0,1н. растворе NaOH и 1 мл 0,5%-ного раствора CuSO4 5НзО в 1%-ной сегнетовой соли. Затем добавляют 2 мл 0,85%-ного раствора

NaC1 через 10 мин 0,5 мл реактива Фолина.

Окраска развивается через 30 мип. Фотометрирование производят на ФЭК-М при красном светофильтре.

По полученным экстинциям определяют количество оставшегося неинкубированного трипсина в опытных пробах и количество прореагировавшего трипсина в контроле 1.

Лктивность антптрипсина определяют по разности количества трппсина, прореагировавшего в контроле 1, где не было ингибитора, и опытной пробе (выра>кается в мкг ин5 гибированного трипсина) .

Предмет изобретения

Способ определения активности антитрипсина в сыворотке крови путем ее инкубации с

l0 трипсином, отличающийся тем, что, с целью повышения специфичности и точности результатов, неингибированный после инкубации трипсин оттитровывают специфической иммунной преципитирующей сывороткой.