Способ получения пептидов с последовательностью актг- человека,содержащих в -конечном положении аминооксикислоту

 

(1!) 49О284

Ой ЙСАКИЕ

КЗОБРЕТЕН И Я

Со?оз Советских

Социалистических

Республик

К ПАТЕНТУ

> >

»- (61) Дополнительный к патенту (51) )1. Кл. С 07с 103/52 (22) Зяявг!С(и) 17.08.73 (21) 1963873 23-4 (32) Приоритет 18.08.72 (31) RI-480

)33) BI(I) Государ "тве",íbté комитет

Совета Министров СССР ло делам изобретений и открытий (53) УД1 547.964.-1,07 (088.8) Оп1оликоваио 30.10.75. Б?оллс тень ¹ 40

Дt!TH Oslh бл и .ОВЯ I:IIH 0111102иия 1 0.05. > 6 (72) Авторы

1. 3 О О P C Т С I! i S i

Иностранцы

Лайош Кишфалудь, Миклош Лев, Лайош Данчи, Иштван Шеи, Тамаш Сиртеш, Ольга Ньеки, Мария Сирмаи, Ласло Спорни и Дьердь Хайош (BHP) Ипостраииое прсдпрпятие

«Рихтер Гсдеон Ведьессти Дьяр РТ:> (BI-?Р) (71) Заявитель (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПЕПТИДОВ

С ПОСЛ ЕДОВАТЕЛ ЪНОСТЫО АКТГ-Ч ЕЛОВЕКА, СОДЕРЖАЩИХ В N-КОНЕЧНОМ ПОЛОЖЕНИИ а-АМИ НООКСИ КИСЛОТУ

Изобрстсиис отиоситс?(к спосооу получсния ис оиисяииых В лит»()атур» псптидов, сОдсржа!и?!х от 16 до 39 ямииокис ioT посс!едоватсльности чсловс !с»кого адрснокортикотропного гормоия (АКТГ-Ч»ловска), в которых в (Х -КОН»>!Ио..i! !IO. IO)l(CI«lti !«! .ОДИТСЯ IJ-ЯМИНООКcHêèñëîò2.

Извсстси с..особ иолучсиия псптидов с послсдоватсльиостьк) АКТГ-человека, в которых

li Я>>ОД?! IЦИI!CSI В .> -КО!!(. ЧИО)! ИO. 10)КСНИИ ОСТЯток Х.-сср?(пя замсщси ия 0»T2Tîê 1-пролпиа или остаток ()-2лани(!2, заключающийся в том, 1 !О 32!ЦИИ(С!IH(IC ПО .>-КОНЦ> ПСПТИДЫ КОНДСИсируют с защ.ицсииыми по С-концу псптидами извсстиым способом с последующи.» удялеИИСХI ЗЯИ(>IТИЫХ I P; ПП ЯЦИДОЛИЗОМ.

Пол»чсииыс пспти.ill имеют низкую биолоГичсск",!О активlнnc i!> — -(0 50 д яктивности

IIpIlp0диог0 гормоия, краткос время их биоло1 l i I (. Ñ K O (О I С и С Т В И ?! .

Сol ëàñ«0 изоорстси !!0 прсдложси спосоо

ИОЛ 1 ilCI«!Si ПСIIT?I;l»ll С ПОС. (СДОВЯТСЛЬНОСТЬIО

АКТГ- !Сло lcii2 с длииой (спи от 16 до 39 амииоки»лот, содсржащих, Х-коиечио); положсиии с.-2ìètiîîê(.!(Kit».?îòó, я вместо ряда ЯмиИОКИ»,10T ПРИРОДНОГО ГОР)!«На ДР > ГИС;1)?ИНОКИ»ЛОТ! 1, И 32IIIII(ltCItilt>!Х ПО . > -КОИ» 1 пой ЯЗIИИОокси, и амииогрк ппям бок»вых ц»(!»il и по

С-кОНС IHOll 1:,Я)) )OITCll, It>l!0!I Групп(и кар»01 .сильным группам боковых цспсй, улалiм(и»м

ЗЯIЦИТНЫ>(1 P) ПП li BI>lltC»t»I«1».,t Ц»,!», »! 0 ИРОдмкта () видс сол:! П(«! ком?! Ich»

Пол > ч «HI>!с сос ill!i cï?(?!»б, 1(1 дll!(>T б». !» ВыСО? .Ой ()Ii», (ОГ?1 CCli»li 2 liTII i?!I »i ! !О ИО»P (В!((. 10 ии!О c H>H!c(.тиь?,;и (i(2 "ol .!

Изоорсте « !i» и, l, «0(1,) ир i Гi я л»,) 1()и;и. « прихlср2ми.

В Hpll)!Cp2х;l,»isl 0»03! „.:!i I«!H v., ?и:(ОK (, 0

И»ПО, t t>3> tOÒCSI »ОКР(1!Ц(ПИ: —., «П» „ . Ож»И I .?>!» КО) ) миссиe!),)ИРАС вЂ”,)1>)В.

Д, ?Я Об031! ЯЧСНП?1 Ñ вЂ” 2)«!l»-:. — 01.(. .! к:!(. . I(! и ) !— пяты символы ОС)м, ОА(2» т, t.; Pl:POI I

HcHT2x20pôcH0ë; D DC "iHI11KГ1ОГскси, к:) рбодииз!Пд; ДСИ - — дицикг!отек»!.,?карбамид:

20 ВОС -- T>()OT-» > TII.!Окси! Яр»ОП!I;l; Bitt ()) тил; О. Х )?! — — Окси» кцщ«i HH:t; 7. --- ".,-бсизилоксикярбопил.

Определсиис т»мп»г",гуры илявлсиия иро!юдилос! с помои(ьlо Япп lp2T(1 д. ToTT», l! I (Бl»;и, )5 Ш "» )!1(2))its!) . I 1(.i.3».-,0!)2H !is »i тод». !

490284 слойной хроматографии проводились на силикагеле по Штал1о со следующими системами растворителей.

Этилацетат — (пиридин — уксусная кислота — вода 20: 6: 11) =8: 2.

Этил ацетат — (пиридин — уксусная кислота — вода 20: 6: 11) =б: 4.

Этплацетат — пиридинмуравьиная кислота —вода 50: 20: б: 5,5.

Хл ор оф ор м — м ет а пол 98: 2.

Хлороформ — метанол 95: 5.

Пример 1. Амицооксиацетил --- тирозил —— серил — метпонил — глутамил — гистидил— — фенилаланил — аргинил — триптофил— — глпцил — лизил — пролил — валил — глицил — лизил — — лизил — аргинил — пролил— — валил — лизпл — валил — тирозил — пролил — аспарагпнил — аланил — глицил—

-- глутаминовая кислота.

0,600 r (0,143 моля) ВОС вЂ” аминооксиацеTII;I — тпрозил — серил — метпонил — — у—

OBut — глута мил — гистидил — фенил ал анил— — арпшил — триптофил — глицил — в — ВОС— — лизил — пролил — валил — глицил — в— — ВОС вЂ” лп".II;I — — е — ВОС вЂ” лизил — аргпнил — аргпнпл — пролил — валил †е † — лизил — — валил — OBut — тирозил — пролил — OBut — аспартил — аланил — глицил— — у — OBut — - глутампл — OBut ЗНС1 растворяют в смеси из 4,8 мл трифторуксуспой кислоты, G,б мл воды и 0,6 мл анпзола. Раствор оставляют стоять прп комнатной температуре в течение 1 час, а затем разбавляют 60 мл эфира. Выпавший осадок отфильтровывают, промывают эфиром и сушат в вакууме над нятпокисью фосфора и гидроокпсью калия.

Получают 0,538 г (87%) замещенного трифтор ацетата октакозапептида.

Полученный трифторацстат октакозапептида пропускают через колонку с Дауэкс 1х,8 в ацетатной форме. Лцстат октакозапептида наносят на колонку с ионообменником Ватман

СМ-51, разделение проводят с помощью аммопийацетатного буфера (0,01 М, рН 4,5; 0,4 М, рН 6,7). Содержащие целевое вещество фракции собирают и лиофилизуют, Получают

0,22 r (34%) октакозапептида.

Лминокислотный анализ показал следующее соотношение компонентов: лизин 4,05 (4); гпстидпп 0,93 (1); аргинин 3,08 (3); аспарагпн

0,99 (1); серии 0,79 (1); глутамиповая кислота

2,05 (2); пролин 3,09 (3); глпцин 3,04 (3); аланип 0,92 (1); валин 3,12 (3); метпонин

0,60 (1); тирозин 1,88 (2); фенилаланин 0,85 (1)

Применяемый в качестве исходного вещества гидрохлорид защищенного октакозапептида получают следующим образом:

А. трет-Бутилоксикарбониламинооксиуксусная кислота.

316,0 г (2,27 моль) трет-бутилоксикарбонилгидроксиламипа растворяют в 2680 мл этанола и к раствору при охлаждении добавляют

207,8 r (5,19 моль) гидроокиси натрия и

350,4 r (2,52 моль) монобромуксусной кисло10

1 t3

-10

50 дЭ

65 ты. Рсакционп ю смесь кипятят В течение

20 мип, затем отгоняют растворитель. Остаток растворяют в 1940 мл воды и подкисляют до рН 3 концентрированной НС1. После 2 час охлаж,ения и перемешивания отфильтровывают выделившиеся кристаллы. Сырой продукт (419 г) крпсталлизуют из смеси хлороформа и и-гексана. Выход 388,8 г (86%); т. пл. 115—

116 С.

Найдено, %: С 43,9; Н 6,9; Х 7,1.

С Н д1 Оь.

Вычислено, %: С 44,0; Н 6,8; Х 7,2.

h. трет-Бутилоксикарбонил — аминооксиацетил — тирозил — серил — - >IeIHoIIIITI — NH— — ХН,.

1.72 г (9,0 ммолей) трет-бутилоксикарбониламипооксиуксусной кислоты и 4,50 г (10 ммоль) хлоргидрата метилового эфира тирозил -- серил -- метионина растворяют в

10 мл диметилформамида. Раствор охлаждают до О"С и оорабатывают 1,11 мл (10 ммо Ib) метилморфолина, а затем 1,85 г (0,9 ммоль) дициклогексилкарбодиимида. Реакционную смесь перемешивают в течение 1 час при 0 С и оставляют стоять при комнатной температуре до следу)сщего дня. После этого выпавшу|о дипиклогексилмочевину отфильтровывают, фильтрат упарцвают, а остаток растворяют в

200 мл этилацетата. Раствор промывают 1 н.

НС1 (2 л,100), 8%-ным раствором КНСО (2>;100), водой (1 100), затем сушат и упарпвают. Получеш|ый мстпловый эфир тетрапсптида (4,5 г) растворя|от в 45 мл метанола, раствор смешивают с 1,26 мл (26,0 ммоль) гидрази и реакционную смесь остав;IHIoT стоять на ночь при комнатной температуре. После этого раствор упаривают, ocTBTQK растирают с этилацетатом, отфильтровывают, осадок промывают этилацетатом и эфиром и высушивают пад концентрированной серной кислотой. Получают 3,30 г (62,5%) гидразида защищенного тетрапептида. Температура плавления перекристал;шзованного из воды продукта около 137 С.

Найдено, %: С 49,0; Н б,б; N 14,4.

С,Нз,Х,О,.

Вычислено, ",о. С 49,1; Н 6,5; М 14,4.

В. Хлоргидрат трет-бутилокспкарбонил— амино — — оксиацстил — тирознл — серил —— — метионил — у — OBut — глутамил, гистидпл — фенилаланил — аргинил — трпптофил— — глицпл — в — ВОС вЂ” лизил — пролил — валил — глицина.

О 41 г (0,70 ммоль) трет-бутилоксикарбонпл — ампнооксиацетил — тирозил — — серил— метионин — N,Í растворяют в 5 мл диметплформамида. В охлажденный до — 20 С раствор IIo каплям вливают 0,4 мл этилацетата, насыщенного НС1 (4,4 н.), а затем 0,105 мл (0,85 ммоль) трет-бутилнитрита. Реакционную смесь перемешивают при — 10 С в течение

5 мин, затем охлаждают до — 20 С и к ней добавляют раствор 0,96 г (0,70 ммоль) у — But — глутамил — гистидил — фенилаланил— — аргиппл — триптофил — глицил — е — ВОС— о

490284 ()

П р и м с р 2. Лмииооксипропиоииг! — тирозил — серил — метиоиил — глутамил — гистидил — фсипл аланил — аргииил — триптофил — глицил — лизил — пролил — валил —— — - глицил — лизил — лизил — аргипил — ар- 60 гииил — пролил — валил — — лизил — валил— — тирозил — пролил — аспартил — алаиил —— глицил — — I;li тя (!Пшова5! кислот l.

n r nn < с> ... -, ° | л, ".>< >n<:"«> > <><>с> — лизин — пролил — валил — глиц|ша и 0,48 ii,лi (2,8 ммоль ) диизопропилаз!!?на в 8 мл димстилформамида. Реакционную смесь перемешивают при температуре от -- 5 до 0 С в течение

1 час и оставля|от стоять иа ночь при 0 С, После этого раствор СIIHpHIIHIoT< 3 ocTHTQK nc рстирают с 8%-иым раствором двууглски.-лого натрия, Осадок отфильтровывают, промывают водои:! сушат. Получают 0,93 г (69", ) защищенного тстрадскапептида. Последшш суспсизируют в 6 мл метанола и оорабатывают раствором клорп|драта иирид!ша, приготовлеиного из 1,35 мл пиридииа и 1.35 мл концентрированной соляной кислоты. Получси||ый раствор разбавля|от 50 ?мл воды, выпавший хлоргидрат тетрадекапсптида отфильтровывают, промывают водой, а зат«м суи!Ят Выкод

0,78 г (57% ); т, ил. 202 — 204 С; R(- 0,18.

С9 Н!З,Х,!О,(С18 (1959,66), Г. трет-Бутилоксикарбоиил — aiuiиооксиацстил — гирозил — серил — — мстиоиил — 1(—— — OBut — глутамил — гистпдил — - фсиила.|алиил — аргииил — триптофил гл!ш; л - -е— — ВОС вЂ” — лизил — — е — В ОС вЂ” ли;u, ipгииил — — а ргиHèë — пролил — 13алил —, — 23 — — ВОС лизил — валил — OBut- -тирозил-— пролил - -- аспа ртил — алаиил — — г..ицил— — у — OBut — г«! <та!!ПГ! — OBut ЗНС}.

0,346 r (0,176 миллимоль) хлоргидрата трет-бутилоксикарбопил — амииооксиацстил — 30

-- тирозил — серил -- мстионил — — у — -ОВц1— глутамил — — гистидил — ф(иилалаиил — Нргииил — триптÎфпл — глш?ил — — е — — ВОС— — — лизил- — пролил — валил — гли|цша. 0,400 г (0,176 ммоль) е — ВОС вЂ” лизил е — ВОС вЂ” 35 — лизил — е — ВОС вЂ” — лизил -- аргииил— — аргинил — пролил — - валил — е — ВОС— — лизил — валил — тирозил — и ролил — р— — OBut — аспартил — ал аиил — глицил— — глутамил — OBut ЗНС1 и 0,281 г (1,05 |ммоль) пеитахлорфеиола растворяют в 3,3 мл диметилфор(!амида и к раствору добавляют

G,025 мл (0,18 моль) триэтиламина. а затем

0,074 г (0,36 ммоль) дициклогсксилкарбодимида. Реакционную cìåñü оставля|от стоять при комнатной температуре двое суток, затсм отфильтровывают выпавшую дициклогекси.1мочевину, а фильтрат разбавляют 30 мл эфира. Выпавший продукт отфильтровывают, промывают эфиром, а затем сушат.

Гидрохлорид защищенного октакозапептида получают с выкодом 0>640 r (87%); т, пл.

208 — 212=С; R 0,22. С д.,Н i K((O.;9Ñ 11

4182,29 . р ил — м ети он ил — 1 — ОВ?11 — гл у та м ил—

ГИ(ТИ <11,1 ф(1111,1

4,8 i1,1 ТрифТор, и(." CIIOli I(II«,1OT!>I, 0,6 >1,1 Воды и 0,6 .Iл Hill!30л Я . Р Л CTII 011 ОСТ Л В;1 51 !(T «1 О я Г|> в тсчсиис 1 чл«ир|1 к01:il i о ; Г«.,:i:«1|ГСП«. и затсз! рлH(IHÂ,.!5110ò 60 мл э()1ипл, В1>1:?с,lив! 10 (110«(110Р сl И Г|IДPООКIIСЬIО К3,|IIЯ. ? РllфТО Р 31?С 1 ЯТ ЗHu?ИИ(«!:ИОГО ОКТЯ К,ОЗ. 1 П(П1 11 ? H ПО(|Ми с110Т С В!>1,0, ?OМ

0532 г (86.5%)

П 0 Г 1 м ч (> и и ы и c I>l p o 1 I т } > и (л т О р <1 1? «т < . т и л с" ! I 0 j i 5110 Г В 1 0 il, 1 ВО;> ь| и П }10П? (к< 1«>1 ч(рСЗ кuлОик>< с (лмэкс 1>с8 в лцетатиой фопмс. Полмчеииы?!

P 3CTBOP, СОДСРТК Я!1?ИИ Л!,С! 3 Т ОК Г,1 КОЗ<1<ПСПТИДЛ. па?!ОС. 1Т«я 113 кО,HOIII(i, 3 !Полll«lllli;Î иоиообi!el!!ioй смо!Oй Влт,;и СЧ-5 . Р;! дс,-:«i! Ilc

ПРОВОДЯТ С I!Oilulilb10 ГРЛДПСI 1!1010 Э ° IЕИРОВсl

IlIl5I амм шийацетатиым буфсром (0.01 Ó, рН

4,5; 0,4 М, рН 6.7). Фракции, содержащие цслс:>ой продукт, лиофилизу!От. Получают 0,23 r (42" ) ОКТ<1КОЗЛП«птцда.

Соотиошс|?ис тирозиш - — трип Гофли р:1:-.1 ястся 2>10.

AiIlII10IiII«, 10, Иый ЯИЛЛ>|З ПО!;,ЯЗЯ,| СОДСРс|СЯ?IIIC ЕОМПОИ«1110< В «,101, 101 (С. I СООТИОГЦСИИИ.

Ги>зии 3,89 (4); гистидии 0,97 (1); лргиипи 3,00 (3); аспарлпш 1,10 (1); ссрип 0,97 (1}; гт таill lI01I351 КИС,!0TH 1.9-((Э); I. 0(1 !" > I 0 (<> глицин 3.06 (3); Hë3íøl (1,15) (1); Влг|и|1

2,84 (3); мст||оиии 0,68 (1); тироз!ш 1,94 (2); фсиилллаиии 1,06 (1).

Пр||мспениый D качеств«искодиого вещества fp:!п(дрок IÎp111, злщищ«пиого октакозапспT1l3Я IIОЛ < Ч сllОТ С«1СД>< |ощllil ООР3ЗО .1.

А. треT-Вутиоксикарбоппл - L-с(.-ам:!пооксипропиоиову|о кислоту получают из 4,09 г (29 ммо 71>) 0-0. -бромпропи|оповой кислоты, 3,62 г (65 ммоль) гидроокиси ка .è. . и 4,39 г (33 мо II ) трет-бутилоксикарбоиил -- гидроксиламиия по способу, указаииому в примере 1. Сырой продукт растворяют В эфире и

ОбРЯ О с! ТЫ В Я|ОТ 6,3 il 1 (32 1|М0.1Ь), ?ИЦИКЛОГСКcIiламипа.

Получают дицик.!огсксиламоиийиую соль трет-О i ти.lоl"сикяроонl|л-L — o. - ям1?иооксипропиоиовои кис,|оты с вь!.;Одом 6,7 Г (60,, (1 ), j 5 I "С. Лици :.,10гскспл iiIOIII! lilli 10 СОль суспеидпруют в эфире, суспепзию встрякивают с 0,2 и. серной кислотой, эфирную фазу упарива!От и получают 3,05 г (50%) трет-г;т|1101спкарбопил-Е, — са - ямииооксипропиоповой кислоты, т. пл. 110 — 112 С; } а)з = — 91 (С=-1, этаиол) .

Найдено. .;: С 46.6; Н 7,5: X 6.8.

Г.1-1,;п<

490284

20 а

1г

-10

60 тл; т"mani *

Б, трет-Бутилоксикарбонил — а-аминооксипропиопил — тирозил — серил — метионпл— — Х Нз.

1,44 г (7,0 ммоль) трет-бутилоксикарбопил - а — аминооксипропионовой кислоты и

3,50 г (7,8 ммоль) хлоргидрата i(c) II;Iouol o эфира тпрозил — серил — метионина растворяют в 12 мл димстилформамида.

Раствор охлаждают до 0 С и обрабатывают

0,85 мл (7,8 ммоль) IU-метилморфолина, затем смешивают с 1,48 г (7,2 ммоль) дициклогексилкарбодпимида. Реакционную смесь при

О С перемешивают в течение 1 час и оставляют стоять ночь при комнатной температуре.

Отфильтровывают выпавц!ую дициклогсксплмочсвипу, фильтрат упаривают, а остаток перетирают с этилацетатом. Продукт отфильтровывают, промывают этилацетатом и эфиром, а затем высушивают над концентрированной серной кислотой. Гидразид защищенного тстрапептида получают с выходом 2,1 r (50%); т. пл. 147 С (после перекристаллизацни из воды); R 0,43.

Найдено, % С 49,6; Н 6,7.

С„-Н4о1 1.О, .

Вычислено, %: С 50,0; Н 6,7.

В. Хлоргидрат трет-бутилоксикар бои!1)! — -аамппооксипропионил — тирозил — ссрил — метионил — у — OBut — глутамил -- гистидил — фенилалапил — арганил — триптофил — глицил — е — ВОС вЂ” лизил — — пролил — валил — глицина.

0,266 г (0,44 моль) трет-бутилоксикарбонил — а - аминооксипропионил — тирозил — серил — метионил — NqH) растворяют в

3,2 мл диметилформамида и раствор охлажда-! от до — 20 С. Прп перемешивании по каплям вводят 0,41 мл этилацетата, насыщенного НС1 (4,4 н.), затем 0,07 мл (0,59 ммоль) трет-бтилнитритг. Реакционную смесь перемешивают при — 10 С в течение 5 мин затем охлаждают до — 20 С и добавляют к ней раствор

0,600 г (0,438 ммоль) глутамил — гистидил— — фенилаланил — аргинил — триптофил— — гл H II Hл — е — В О С вЂ” I H 3 H — H p 0 1 и.ч — валит! — глиципа, и 0,31 г (1,8 ммоль) диизопропилэтиламина в 5 мл диметилформамида. Реакционную смесь в течение 1 час перемешивают при температуре от — 5 до 0 С, а затем оставляют стоять ночь при 0 С. На следующий день диметилформамид отгоня1от, а остаток перетирают с 8%-ным раствором двууглекислого натрия. После фильтрования,промывки водой и последующей сушки получа)от

0,70 г (81%) защищенного тетрадекапептида.

Из 1 мл пиридина и 1 мл концентрированной соляной кислоты готовят раствор хлоргидрата пиридина и добавляют его к суспендированному в 5 мл метанола защищенному тетрадекапептиду. Полученный таким образом раствор разбавля1от 50 мл воды, выпавшии oc;I, .01(о!— тида получают с выходом 0,513 г (59,5%);

200 с Ос)сС, R 2 0 10

Г. трет-Бутплоксикарбонил — -- J.-аминооксипропиоппл — тироз!!л — ссрил -- мегионпл-— ОВц1 — глутамил -- гистидил — фенплаланил — аргинил — — триптофил — — глицил — в — ВОС вЂ” лизил — пролил — валил — глицил — в — — ВОС вЂ” - лизил — аргинил — аргипил пролил — валил — е — ВОС— —:!Ha!I,I — ва IH I — OBut — тирозил — IIpoлил — аспартил -- аланил — глицил — у— — — OBut — глутамил — OBut ЗНС!.

0,348 г (0,176 ммоль) xëoðl uäðàòà трет-бутилокспкарбонил — — а — аминооксипроппонил— — тирозил — серил метионил — 7 OBut— — глутампл — гистидил — фенилаланил †аргинил — триптофил — глицил — е — ВОС— — лизпл — пролил — валил — глицина 0,400 г (0,176 ммолсй) — е — ВОС вЂ” лизил — — лизпл — аргинил — аргинил — пролил — валил — е — ВОС вЂ” лизил — валил — OBut— — тирозил — пролил — P — OBut — аспартил — аланил — глицил — — ) — OBut — глутамил — OBut ЗНС! и 0,281 г (1,05 ммоль) пептахлорфенола растворяют в 3,3 мл диме-! илформамида. K раствору добавляют

0,025 мл (0,18 ммоль) триэтиламина, затем

0,074 r (0,36 ммоль) дициклогексилкарбодиимнда (DCC). Реакционную смесь оставляют стоять при комнатной температуре в течение двух суток, затем отфильтровывают дициклогексилкарбамид, а фильтрат разбавляют

30 мл эфира. Выделившийся продукт отфильтровывают, промывают эфиром, а затем сушат. Хлоргидрат защищенного октакозапептида получают с выходом 0,658 г (89%); т. пл. 175 — 177 С; R3 0,25.

П р и м с р 3. Аминооксипропио1!!!г! — тирозил — ссрил — метионил — глута мил — гистидил — фснилаланил — аргинил -- триптофил — глицил — лизил — пролил — валил — глицил — лпзил — лизил — аргинил — аргинил — пролил — валил — лизил — валил— — тирозил — пролил — — аспартил -- аланил— — глицил — глутаминовая кислота.

0,600 г (0,142 ммоль) трет-бутилокспкарбонил — 0 — G. -à)IHíооксипропиîHèë — тирозил — серил — мстпонил — глутамил — гистидил — — фенплалаHèë — — аргинил — триптофил — — глпцил е — ВО С вЂ” лизил — пролил — — валил — глипил — е — ВОС вЂ” лизил — в — В ОС вЂ” лизил — аргинил — аргинил -- пролил — валил — е — ВОС вЂ” лизил — валил — OBut — тирозил — пролил— — OBut — аспартил — аланил — глицил — - у — OBut — глутамил — OBut HC1 растворяют в смеси из 4.8 мл трифторуксусной кислоты, 0,6 мл воды и 0,6 мл анизола. Раствор оставляют стоять при комнатной температуре в течение 1 час, H ".атем разоавляют 60 мл

J(I)Hр I B I>I II II 1! iII Ii!I оса. I OI(о!()п п т!)О В! !на!Отр

490284

Выход трифторацета октакозапептида составляет 0,546 г (88,5,p).

Трифторапетат растворяют в 10 мл воды и трифторацетатиые ионы с помощью ионообмснной смолы Дауэкс 1к 8 обменивают на ацетатные ионы, Полученный таким образом раствор, содержащий ацетат замещенного QKтакозапептида, вносится на колонку, заполненную ионообменной смолой марки Ватман

СМ-52.

Целсвоif п родукт выделяют градиентныit элюированием аммонийацетатным буфером (0,01М, рН 4,5; 0,4М, рН 6,7). Фракции, содержащие целевое вещество, собирают и лиофилизуют, Выход октакозапептида составляет

0,245 г (39О/о). Содержание метионинсульфоксида 2,57 /о. Соотношение тирозина — триптофана равно 2,07.

Лминокислотный анализ: лизин 4,35 (4); гистидин 0,97 (1); аргинин 3,13 (3); аспарагиновая кислота 1,06 (1); серии 1,00 (1); глутаминовая кислота 1,92 (2); пролин 2 90 (3); глицин 3,00 (3); алании 1,00 (1); валин 2,92 (3); метионин 0,87 (1); тирозин 2,21 (2); фенилаланин 1,06 (1) .

Пример 4. а — Лминокси — I1 — гидрооксипропионил — тир озил — сер ил — метионил — глута мил — гистидил — фенил ал анил— — яргинил — триптофил — глицил — лизил— — пролил — валил — глицил — лизил — лизил — аргинил — аргинил — пролил — валил— — лизил — валил — тирозил — пролил — аспартил — алаиил — глицил — глутаминовая кислота.

0,600 г (0,142 ммоль) трет-бутилоксикарбонил — а — аминоокси — (3 — гидрооксипропионил — тирозил — серил — метионил — у— — — OBut — — глута мил — гистидил — фенилаланил — аргинил — триптофил — глицил— — е — ВОС вЂ” лизил — пролил — валил— — г,1ицил — е — ВОС вЂ” лизил — е — ВОС— — лизил — аргинил — аргинил — пролил— — валил — е — В ОС вЂ” лизил — валил— — OBut — тирозил — пролил — P — OBut— — аспартил — а — аминооксипропионил — глицил — у — OBut — глутамил — OBut. .ЗНС1 растворяют в смеси из 4,8 мл трифторуксусной кислоты 0,16 мл воды и 0,6 мл анизола. Смесь оставляют стоять при комнатной температуре в течение часа, а затем разбавляют 60 мл эфира. Выделившийся осадок отфильтровывают, промывают эфиром и сушат над пятиокисью фосфора и гидроокисью калия в вакууме. Получают 0,400 г (65 /о) трифторацетата за мещенного октакозапептида.

Сырой трифторацетат растворяют в 8 мл воды и пропускают через колонку с Дауэкс

1>(8 в ацетатной форме.

Полученный таким образом раствор, содержащий ацетат октакозапептида, наносится на колонку, заполненную ионообменной смолой марки Ватман СМ-52, и элюируется градиентным э;»»о1»рова»»ием яммонийацетатным буфером (0,1 М, рН 4,5; 04 М, рН 6,7). Фракции, содержащие це,1евое вещество, собирают и

10 лиофилизуют. Получают 0.240 г (41,5",, ) октякозапептида, пептидное содержание которого по измерениям методом поглощения ультрафиолетовых лучей составляет 81,6О»», Содержание метионина — сульфокс»»дя 4,4 /О. Соотношение тирозина — трпптофапя равно 2.13.

Лминокислотный анализ: лизшI 3.92 (4); гистидин 1,00 (1); аргинии 3,15 (3); аспярягин 0,99 (1); серии 0,83 (1): » !i z яituutu»яя

10 кислота 1,94 (2); про.1»ш 3,00 (3): г;пщш» 3,05 (3). алании 1,04 (1); вал»»»» 2,92 (3): мстионии

0,79 (1); тирозпи 1,83 (2): фснилял;шии 0,97 (1).

Пример 5. D-Лмипо — а - гидроксгц»роппо15 нил — тирозил — серил — — itñòèî»;ил — глутамил — гистидил — фенилаланил — — яргинил — трппфтоф!»л — гл»»п»», » —,1113»I,! — пролил — валил — глицил — лиз»»л — лизил— — аргинил — аргинил — пролил — вял»»,1—

20 — лизил — валил — тирозил — пролил --- яспартил — алапил — глш»ил — глут lìèt*îf»àÿ кислота.

0,600 г (0,142 ммоль) ВОС вЂ” -D-а-амииоокси — р-гидр оксипропионил — ти роз ил — серпл

25 — метионил — у-OBut — глутамил — г»»ст»»д»»л— — фенилаланил — аргинил — трпптофил -- глицил — е-BOC — лизил — пролил — валпл — глицил — е-ВОС вЂ” лизил — е-BOC — ли:.If, I —— — аргинил — арп»нил — пролил -- вялил

3(» — е-ВОС вЂ” лизил — валил — — ОВ»»» --- тирозил — пролил — р — OBut — аспяртил— — аланил — глицпл — у-ОВИ» — глутямил— — 0But.3НС1 растворяют в смеси из -1,8 мл трифторуксусной кислоты 0,6 ilл воды и 0,6 ilл анизола. Раствор оставляют в течение 1 час при комнатной температуре, а затем добавляют 60 мл эфира. Выпавший осадок отфильтровывают, промывают эфиром и сушат няд пятиокисью фосфора и гидроокисью калия в ва40 кууме, Трифторацетат замешенного октакозяпептида получают с выходом 0,533 r (86,5,p).

Сырой трифторацетат растворяют в 10 мл воды и пропускают через колонку с Дауэкс

1 8 в ацетатной форме. Полученнь»й раствор, 45 содержащий ацетат замещенного октякозапсптида, наносится на заполненную ионообменной смолой марки Ватман СМ-52 колонку и элюируется аммонийацетатным буфером линейным буферным градиентом. (0,01 М, рН 4,5; 0,4 М. рН 6,7). Фракции, содержащие целевое вещество, собирают и лиофилизируют. Получают

0,250 r (43Я>) октакозапептида, содержа»»(его

81,0,,р пептида. Содержание метион»»нсу, »ьфоксида 4,4 /о. Соотношение тирозина — триптофана составляет 2,05.

Лминокислотный анализ: лизин 3.76 (4); гистидин 0,8 (1); аргинин 3,05 (3); аспарап»н

1.00 (1); серин 0,73 (1); глутяминовая кислота

1,94 (2): пролпн 3,00 (3); глиц»ш 2 95 (3); бО алании 1,05 (1), валин 2.82 (3): мет»»о»»»»»» 0,78 (1); тирозин 1,6 (2); фенилалании 0,83 (1).

П р п it e р 6. 0-а-Лминоокси — P-гидроксипропиони1 — ».»»роз»»л ссри, l ме»1»о»»»», I— — глутамил — гистидил — фсп»»ляляп»»л

65 — аргинил — триптофил — глицил — лизил—

490284

Предмет изобретения

Составитель А. Нестеренко

Редактор Л. Герасимова Техред 3. Тараненко Корректор О. Тюрина

Заказ 71775 Изд. Ко 1994 Тираж 529 Подписное

ЦНИИПИ Государственного комитета Совета Министров СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, K-35, Раушская наб. д. 4!5

Типография, ир. Сапунова, 2 — пролил — валил — глицил — лизил — лизил — аргинил — аргинил — пролил — валил — лизил †валил †тирозил †пролил †аспарагинил — глицил — алании — глутамил— аспартил — глутамил — серил — алании.

1,00 r (0,214 ммоль) трет-бутилоксикарбонил — D-а-аминоокси — P — гидрокси — пропионил — тирозил — серил — метионил — у-OBut — глутамил — гистидил — фенилаланил — аргинил — триптофил — глицил— — в-ВОС вЂ” лизил — пролил — валил — глицил — в-ВОС вЂ” лизил — в-ВОС вЂ” лпзил— — аргинил — аргинил — пролил — валил— — в-ВОС вЂ” лизил — валил — OBut — тирозил — пролил — P — OBut — аспартил — глицил — аланил — у — OBut — глутамипил— — OBut — аспартил — OBut — аспартил у — OBut — глутамил — серил — аланил— — OBut-3HCI растворяют в смеси из 8 мл трифторуксусной кислоты, 1 мл воды и 1 мл анизола. Раствор при комнатной температуре оставляют на 1 час, а затем разбавляют

200 мл эфира. Выделившийся осадок отфильтровывают, промывают эфиром и сушат в вакууме над пятиокисью фосфора и гидроокисью калия. Трифторацетат замещенного дотриаконтапсптида получают с выходом 0,90 г (ЯЯо7 )

Сырой трифторацетат растворяют в 20 мл воды и пропускают через колонку с Дауэкс

1х, 8 в ацетатной форме. Полученный раствор, содержащий ацетат замещенного дотриаконтапептида, наносится на заполненную ионообменной смолой Ватман СМ-52 колонку.

Разделение проводят при помощи линейного градиентного элюирования аммонийацетатным буфером (0,01 М, рН 4,5; 0,4 М, рН 6,7).

Фракции, содержащие целевое вещество. собирают и лиофилизуют. Получают 0,46 г (46 /о ) дотриаконтапептида.

1. Способ получения пептидов с последовательностью АКТГ-человека, содержащих в

Х-конечном положении а-аминооксикислоту, отличающийся тем, что, от пептидов последовательности от АКТà —" до АКТà —" содержащих в N-конечном положении а-аминооксикислоту и вместо ряда аминокислот природного человеческого АКТГ другие аминокислоты и защищенных по N-конечной аминооксигруппе и аминогруппам боковых цепей, а также по конечной карбоксильной группе н карбокспльным группам боковых цепей, отщепляют защитные группы, и полученные соединения переводят в соли или комплексы известным способом.

2. Способ по и. 1, отлич а ю щийся тем, что в качестве N-конечной аминооксикислоты нспользуют аминооксиуксусную кислоту или

D- nëè L-а-aминооксипропионовую кислоту нли D- или L-а-аминоокси+оксипропионовую кислоту.

3. Способ по п. 1, отл и ч а ю щий с я тем, ITo в качестве исходного вещества используют пептид, в котором аспарагин в 25 положении замещен аспарагиновой кислотой или глицин в 26 положении замещен на А1а, или аланин в 27 положении замещсн на глицин.

30 4. Способ по пп. 1 — 3, отличающийся тем, что в качестве исходного вещества используют пептид, в котором аминоокси и аминогруппы защищены трет-бутилоксикарбонильной группой, и карбоксильные группы за35 щнщены трет-бутильной группой.

5. Спосоо по п. 4, отл ич а ющий ся тем, что защитные группы удаляют ацидолизом.

6. Способ по пп. 4 и 5, от лич а ю щий с я тем, что защитные группы отщепляют три40 фторуксусной кислотой.