Способ получения полипептидов

 

!

ОП ИСАНИЕ

ИЗОБРЕТЕН ИЯ

Союз Советских

Социалистических

Республик

К ПАТЕНТУ (6!) Дополнительный к патенту (22) Заявлено27 10. 71 (21)1709797/23-4 (51) М. Кл, С 07 с 103/52 (23) Приоритет (32) 29.10.70;

15992/70, 17.12.70 (31) 1 8706/7 0 (33) Государственный комитет

Саавта Мнниатрав СССР аа делам изаарвтеннй и открытий (43) Опубликовано 25 11 75 Бюллетень № 43 (53) УДК

547.964.4.07 (088. 8) (45) Дата опубликования описания 20.03.76 (72) Авторы изобретения

Иностранцы

Штеффан Гуттманн, Янос.Плесс и Хейнц Боссерт (Швейцария) Иностранная фирма

"Сандос АГ" (Швейцария) (71) Заявитель (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПОЛИПЕПТИДОВ

Изобретение относится к области получения новых физиологически активных пептидов, являющихся аналогами природных гормонов.

Известен способ синтеза гипокальцемического гормона лосося — кальцитонина:

:Н-11ис-сер-асн-лей-сер-тре-ц с-вал-лей-гли-лиз-лей-сер-глн-глу-лей-гис-лиз-лей- .

-глн-тре-тир-про-арг-тре-асн-тре-гли-сер-гли-тре-про-)ф заключающийся в том, а что указанный гормон синтезируют общеизвестными в химии пептидов приемами, например аэидной конденсацией фрагментов: (1-9) + (10-16) +((17-23) + (2432). В ходе синтеза для защитыЮ-амино- 15 группы используют карбобензокси (Кбз)и трет. — бутоксикарбонильную (БОК) группы, БОК вЂ” группу для f. -аминогруппы лизина, нитрогруппу для гуанидинового азота аргинина, Кбз-группу для гидроксиль- 20 нцй группы тирозина и бензильную (Бз) группу для тиольной группы цистеина. Прочие функции не защищают.

В соответствии с предложенным изобретением описывается основанный на при- 25 менении известных методов пептидной химии способ получения двух новых аналогов упьмянутог кал итонина с общей ормулой:

/ .Н-Ц с-сер-асн-лей-сер-тре-ц с-вал-лейгли-лиз-лей-сер-глн-асп-лей-гис-лиэ-лейглн-тре-фал-про-арг-тре-асн-тре-гли-Х,-гли-У-про- NH, где X — остаток валина, а У вЂ” остаток аланина или Х -остаток аланина, а У— остаток валина или их кислотно-аддитивных солей или комплексов с тяжелыми металлами. Оба пептида получают по одинаковым схе, мам, предусматривающим создание необ ходимой пептидной цепи конденсацией

:соответствующих фрагментов, походящим образом защищенных пептидных последовательностей, полученных ступенчатым синтезом. для защитыс(-аминогруппы приме,няют Кбз- и БОК вЂ” группы, для с — ами,ногрупп лизинов - БОК - группу, Кбз— группу для гуанидинового остатка аргинина и трет. — бутиловый эфир (Обут) для -кар боксильной группы аспарагиновой кислоты.

Прочие функциональные группы не защища

493064

4 „.-лизил (.-фенилаланил „-цистеинил „-аланил „-оксисукцинимид („-трет.-бутил лиз фал цис ала

Осу т,бут.

По бзл

БОК трт

ОТБ

ОНФ

ОХФ

Оме

Оэт

Щ сер асн этокси митро

,-серил

-аспарагинил

L; -аспартил

) -лейцил

-треонил -валил

,-аргинил

Q -глутаминил (.-гистидил

-пропил

I -глицил асп лей тре вал

apr глн гис про гли

3 ют. Конденсацию фрагментов проводят с помошью дициклогексилкарбодиимида в присущ =твин Я- оксисукцинимида, начиная с

g- конца в той же последовательности, что и для упомянутого кальцитонина, причем фрагменты (10-16), (17-23) и (2432) получают аэидной конденсацией (10-.12) + (13-16), (17-20) + (21-23) и ;(24-28) + (29-32) соответственно. Возможно использование альтернативного спо- соба получения фрагмента (17-32) иэ сле- дующих "блоков": (17-20) + (21-23) +(244k

К25-28) + (29-32) с использованием тех же методов конденсации. После создания необходимой пептидной последовательности зашитные группы удаляют трифторуксусной кислотой.

Согласно настояшему изобретению возможно также применение других общеизвестных защитных групп и методов конденсации для получения целевых соединений.

Для получения кислотно-аддитивных солей предлагаемых соединений могут быть использованы органические кислоты: уксусная, молочная, янтарная, бензойная, салициловая, метансульфокислота, толуолсульфокислота, таннин, карбоксиметилцеллюлоза а также неорганические кислоты: соляная, серная, фосфорная. Под комплексом с тяжелыми металлами подразумеваются производные с кальцием, магнием, алюминием, кобальтом, в особенности с цинком.

В примерах температура указана в градусах Цельсия; величина (с) для оптического вращения составляет 1; сокращения применяют следующие; карбобензилокси

7 (бенэилоксикарбонил) бензил трет,-бутилоксикарбонил тритил-трифенилметил трет,-бутилокси .-нитрофепилокси

2,4,5 туихлорфенилокс метокси

50 лучение исходного материала.

Частичная последовательность А1

Н-вал-гли -ала-про- NH ° г.

Суспендируют 27,5 гЯ -вал-глн-апа-про-ЯЯр 550 мл метанола и после прибавления 3 мл 96 -ной серной кислоты гидрируют в присутствии 4,1 мл ледяной уксусной кислоты и 3,1 r 10%-ного палладия на угле. После фильтрации и выпаривания раствора продукт (сульфат) в тонкослойной хроматограмме на силикагеле имеете =0,2. в °

Частичная последовательность А2:

Н-ала-гли-вал-про- NH

1. 2 -вал-про-ЯН

Растворяют 75 r Н-про-ЯНв 850 мл диметилформамида, прибавляют 312 г t -валОХФ и затем раствор в течение 16 час оставляют стоять при KoMHBTHQA температуре.

После выпаривания в вакууме остаток пере:кристаллизовывается из сложного уксусного эфира. Получают 2 -вал-про- NH т.пл. 1 30° ° с

1 3 1 fd) = — 41 в диметилформамиде. 1ц 2, -гли-вал-про-NHp °

Растворяют 2 -вал-про-ЯНр 2200 мл метанола, прибавляют 85 мл 6 н. соляной кислоты в метаноле, гидрируют в присутсто вии палладия на угле при 20 и нормальном давлении, затем отфильтровывают от катализатора. Продукт выделяют простым эфиром, промывают и затем высушивают. 120 г полученного Н-вал-про-ЯН КМ(.пл. 217218 С;

1" - о (g1 = — 57 в метаноле) суспендируют в 1800 мл диметилформамида, прибавляют 196 г -гли-ОХФ, затем 67 мл триэтиламина и в течение 17 час встряхивао ют при 20 . Выделенный гидрохлорид триэтиламина отфильтровывают и фильтрат упаривают в вакууме. Остаток растворяют в смеси этилацетата и воды. После высущивания над сульфатом натрия и выпари вания получают Ь -гли-вал-про- Щт.пл. 82 (с разложением);

jd) = — 76 в метаноле. о о

3. 7.-ала-гли-вал-про-Я, Растворяют 92 r L -гли-вал-про-МН< в 2000 мл метанола, прибавляют 27 мл уксусной кислоты и гидрируют в присутсто вии палладия на угле при 20 и нормальном давлении. Фильтруют, выпаривают досуха в вакууме, остаток растворяют в

1000 мл диметилформамида, прибавляют

100 гЯ-ала-ОХФ, встряхивают и в тече 93064 ние 17 час раствор оставляют стоять при о

20 . Затем выпаривают в вакууме досуха и остаток кристаллизуют из этилацетата и эфира. Получают -ала-"тли-вал-про-ЯН о 1 т.пл. 80 . (с разложением); о (<)> = — 31 в диметилформамиде.

4. Н-ала-гли-вал-про-НН

Суспендируют 27,5 г -ала-гли-вал-про-ЯНр 550 мл метанола и после прибавления 3 мл 96%-ной серной кислоты гидрируют в присутствии 4,1 мл ледяной уксусной кислоты и 3,1 r 10%-ного палладия на угле. После фильтрации и выпаривания раствора продукт (сульфат) в тонкослойной хроматограмме на силикагеле имеетА5= 0,4.

Система;хлороформ и метанол 7:3 +

0,5% воды.

Частичная последовательность В1: Я -тре-асн-тре-гли-ЯНИН .

Растворяют 98 rF -тре-асн-тре-гли,-оэт в 1000 мл диметилформамида и при,бавляют 100 мл гидразингидрата. После стояния в течение 16 час при комнатной температуре отфильтровывают и дополни,тельно промывают водой и простым эфиром. Получают указанное в заглавии сое.,д нение; т.пл. 221 /de= - 9 и ди етил

; формамиде.

Частичная последовательность С1. Н-apr-тре-асн-тре-гли-вал-гли-ала-про° /HE.

Растворяют 13,5 г БОК-ерг-тре-аснтре-гли-ЯКЯЯр 270 мл диметилформамида и воды (8:2), охлаждают до -15, прибавляют 40 мл 4 н, раствора соляной кислоты в диоксане и 2,5 мл трет-бутилиитрита. Перемешивают в течение 10 мин о при -15, прибавляют 28 мл триэтиламина, отфильтровывают, прибавляют 10,5 г .Н-вал-гли-ала-про-ЯН (частичная последо2

:вательностьЯ, перемешивают в течение

;16 час при 0 . Затем выпаривают досуха, о ! остаток промывают простым эфиром и высушивают. Остаток оставляют в метаноле, прибавляют десятую часть объема воды и .семикратное количество хлороформа н полученный раствор пропускают через колонку из 500 r силикагеля. После элюирова» ния метанолом получают после выпаривания

БОК-арг-тре-асн-тре-гли-вал-гли-ала-проф ° Последний суспендируют в 200 мл

+4 rr. pacxsopa соляной кислоты в диоксане о и в течение 2 час перемешивают при 25 .

Выпаривают досуха, остаток растворяют в 0,2 н, уксусной кислоте, обрабатывают амберлитом f Ц вЂ” 410 (в виде ацетата) и водный раствор лиофилизуют. Затем остаток промывают простым эфиром, этилаце татом и опять простым эфиром и и еу<:.и;вают над стружками гидроохиеи натрия, Получают указанное в заглавии соед» .еи .: в виде диацетата; т,пл. 19.э (c ра.хи х :

Г6, нием),щ -= — 64 в диметилформа. ...л»

;и 1 н.ПД(1:1).

Частичная последовательность(»: "..:и:—

i -тре-асн-тре-гли-ала-гли-.вал-про- Цj-(" .

1- --!

Аналогично способу получения частичщ,ной последовательности 6, получают из

ОК-арг-тре-асн-тре-гли-ййМЦ и Н= ала--гли-вал-про-МЦчастичная последовательностью ) указанное в заглавии соединение о ,в виде диацетата; т.пл. 155 (с разложе20 О у нием),f )rr = - 38 и диметилформамиде

Частичная последовательность С,:

3 -тре-асн-тре-гли-вал-гли-ала-цро- MHI о

К охлажденному до -15 раствору 11 г

I 4-тре-асн-тре-гли- НИМСЯ частичная пос.:.--3) довательностьВ ) в 350 мл диметилфармамида прибавляют 47 мл 1,85 н. ра<-.гвора соляной кислоты в диоксане и 2,2 ми трет.-бутилнитрита. Перемешивают г <" . t о ,ние 10 мин при -15, охлаждают до -30

25 прибавляют 12 мл триэтиламина и фильтруют в холодный раствор И-вал-гли-ала-

-про-Nrrg (частичная последовательност Л,) .в диметилформамиде. После 90 мин и...:р»;,:.о шивания при 0 сгущают в вакууме, и, .-30 бавляют хлороформ и выделенный матери. ал отфильтровывают и высушивают. Раст вор этого сырого продукта в воде метано ле фильтруют через дауэкс-50, доводят амберлитом 1НА410 до нейтрального

ЗЬ состояния и затем выпаривают в вакууме.

Остаток растирают в ацетонитриле, нагревают, фильтруют и высушивают. Получают указанное в заглавии соединение т.пл. о .220 (с разложеиием) . чЕО о

® (4р - 28 в диметилформамиде.

Частичная последовательность Qg . .$-тре-асн-тре-гли-ала-гли-вал-про=И

Аналогично способу полученич частич-ной последовательнос и С получали из g-тре-асн-тре-гли-ИНИН (частичная после довательностью ) и Н-ала-гли-вал-про-ИН (частичная последовательностью ) указано ное в заглавии соединение; т.пл. 206

{ с разложением );

Э), до о

= - 25 в диметилформамиде.

Частичная последовательность С .

Я > -арг-тре-асн-тре-гли-вал-гли-ала-про -ВН.

)ф; Растворяют 10 гЯ -тре-асн-тре-гли-вал-гли-ала-про-КН (частичная последовательность С ) в 800 мл метанола — воды, .прибавляют 0,5 r угля на палладии и гидрируют при нормальном давлении. Отфильт{9 ровывают от катализатора и выпаривают в

Э.

493064

Ьакууме. Полученное масло Н-тре-асн-тре-гли-вал-гли-ела-про- Й Н растворяют в

100 мл диметилформамида, прибавляют

10 гЕ -арг-Осу и в течение 16 час остав3 о лают стоять при 20 . Затем раствор сгушают в вакууме, продукт выделяют с помощью ацетона и отфильтровывают. Остаток суспендируют в ацетоне, нагревают до вскипания,, фильтруют и высушивают.

Получают указанное в заглавии соединение, 10

to o т.an. 201 (с разложением);АПЦН = — 15

B диметилформамиде.

Частичная последовач ельность С, -арг-тре-асн-тре-гли-ала-гли-вал-проб Н2 15

Аналогично способу получения частичной последовательностиС5получают из К -тре-асн-тре-гли-апа-гли-вал-apo-Qg{sacтичная последовательность С ) и,Е арг-Осу указанное в заглавии соединение; т.пп. 185 .20 .«20 о (с разложением),(4)> = — 14 в диметипформамице.

Частичная последовательность 3g

:,Е -гис-лиз- (БОК ) -лей-глн-трескал-про-OH. 25

1 . .Н-тре-фап-про-ОН.

Растворяют 176 г -фал-про-Оме в

1 000 мл метанола и ф 1 н. ), гидрируют о в присутствии палладия на угле при 20 и 1 атм и выпаривают. Остаток растворя- 30 ют в 400 мл диметилформамида, прибаво ляют при О 100 мл триэтипамина, выкристаллизовавшийся гидрохлоид триэтиламина отфильтровывают и к фильтрату прибавI ляют -, -тре-Ц {полученный из 87 гЬ-тре- 35

Ъ

) Д®путем растворения в 100 мл 1 н, соляной кислоты и прибавляют 35 мл 1.н. нитрита натрия). Затем в течение 16. час о оставляют стоять при О, выпаривают досу-, ха, остаток растворяют в этипацетате, про- 40 мывают разбавленной соляной кислотой и затем разбавленным GMMHBKQM, высушивают и выпаривают. Остаток пульвериэируют и гептане, промывают петролейным эфиром и высушивают. Получают t -тре-фал-про- 45 о z8 о

-Оме; т.пл. 92 (разложение),М = — 16 б в диметилформамиде.

Растворяют 53 гЬ -тре-фап-про-Оме в 530 мл метанола, прибавляют 100 мл

2 н. натрового щелока, в течение 1 часа 50 о оставляют стоять при 25, прибавляют

50 мл 2 н. соляной кислоты, концентрируют до приблизительно 200 мл, прибавляют еще 100 мл воды, устанавливают значение pH = 10, водный раствор, промы- .. Ж вают два раза этилацетатом, затем устанавливают значение рН =. 1 4 н. соляной кисГ лотой выделенный трипептид К -тре-фал-ппо-ОН экстрагируют этилацетатомб выо сушивают и выпаривают; т.пл. 105 60

8 .- 0 0

«Ыр = — 28 в диметипфор. ламиде. Остаток растворяют в смеси 500 мп диоксана и 100 мп воды и гидрируют в приз сутствии палладиевого катализатора при 20 и под нормальным давлением. Фильтруют, выпаривают досуха, остаток промывают эфиром и высушивают. Получают Н-тре-фапо

-про-ОН; т.пл. 192 (с разложением);

И = — 41 в 95%-ной уксусной кислоте.

2, g:-гис-лиз-(БОК ) -пей-гпн -тре-фап-про-ОН.

Растворяют 40 rg -гис-лиз(БОК)-лей-гпн-NHNH.a 400 мп диметипформамида, о охлаждают до -20, прибавляют 75 мл диоксана и,2 н.Щи затем 6 мп трет.-бутилнитрита, перемешивают в течение 10 мин о при -20, прибавляют 30 мл триэтиламина и 20 г Н-тре-фал-про-OH и в течение

16 час оставляют взаимодействовать. Затем выпаривают досуха, остаток промываю. простым эфиром, разбавленной уксусной кислотой, простым эфиром, и, наконец, горячим этилацетатом. Затем высушивают в высоком вакууме и получают . -гис-пизг) (БОК)-лей-гпн-тре-фал-про-ОН; т,пл. 200 (разложение );

zo о

& 3 в = — 47 в диметипформ амиде.

Частичная последовательность Bz

Я -гис-пиз-(БОК)-пей-гпн-тре-фап-про- шкин, 1, P. -гпн-тре-фал-про-Оме.

84,8 r Е-тре-(т.бут.)-Оме растворяют в 1500 мл метанола и прибавляют 125 мл

2 н. соляной кислоты и 10 r 10%-ного папладия на угле. После гидрирования в течение 4 час отфильтровывают от катализатора и полностью выпаривают.

61,2 г 2, -глн-OH и 25,6 r М -оксисукцинимида растворяют в 1000 мл ацетонитрила и диметилформамида и охлаждают о до -15 . Сперва прибавляют раствор 45,7 г дициклогексилкарбодиимида в 200 мл ацетонитрила и затем растворяют полученный НС1 Н =тре-(т.бут)-Оме в диметилформамиде при прибавлении 30,4. мл триэтиламина. При периодическом встряхивании оставляют стоять 16 час при комнатной температуре.

Выкристаллизовавшийся гидрохлорид триэтиламина или дициклогексилмочевину отфильтровывают и фильтрат полностью выпаривают. Остаток растворяют в сложном уксусном эфире и промывают 1н. соляной кислоты и 5%-ным бикарбонатом натрия. После высушивания над сульфатом натрия органическую фазу сгущают до объема приблизительно в 200 мл и прибавляют простой петролейный эфир. выделенное масло растирают в порошок и отфильтровы493064

9 вяют, (1олучяют Z, -глн-тре-(т.бут) -Оме; ,о, 2о о т.пл. 106; 5<) и — — +11 в диметилформа. миде.

78,0 г Ь -глн-тре-(т.бут)-Оме растворяют в 800 мл метанола и прибавляют

65 мл гидрязингидрита. После 48 час вы-держки при комнатной температуре раствор!. полностью выпаривают. Остаток обрабатывают водой и затем перекристаллизовывают из; метанола и воды. Г1олучают -глн-тре- 10 о

:-(т.бут)- ЙН NH; т.пл. 202

1 Яо, о

L j >-- — 13 в метаноле.

45,3 r L -фал-про-Оме растворяют в 750 мл метанола и прибавляют 55 мл 15

2н. соляной кислоты и 12 r 10%-ного паллядия на угле. После гидрирования в течение 2 час раствор отфильтровывают от катализатора и фильтрат полностью выпаривают. 20

49,5 г 2 -глн-тре-(т.бут) - И Н И Н растворяют в 500 мл диметилформамида о и охлаждают до — 20, прибавляют 77 мл

5н. соляной кислоты в простом эфире и

l3,4 мл трет,-бутилнитрита и продолжают перемешивать 10 мин и прибавлением 54 мл триэтиламина доводят до нейтрального состояния. Полученный НС Н-фал-про-Оме растворяют в 150 мл дйметилформ:,амида, прибавляют 15,4 мл триэтилямина и все прибавляют к дипептидазиду. После перемешивания в течение 4 час при комнатной температуре отфильтровывают от выкристаллизовавшегося гидрохлорида триэтил амина и фильтрат полностью выпаривают.

Остаток фильтруют при помощи хлороформа и метанола через колонку с силикагелем.

После кристаллизации из этилацетата и петролейного эфира получают -глн-тре-(т.бут) -фал-про-Оме; т.пл. 1 10 о 40 20 о (> э = — 41 в метаноле.

Тетрапептид растворяют в 250 мл трифторуксусной кислоты. После 20 мин

1 стояния при комнатной температуре раст- 45 вор сгушают до половины объема и продукт выделяют эфиром. Фильтруют и промывают эфиром, получают после высушивао ния X -глн-тре-фал-про-Оме; т.пл. 154;

Ъv о

E<)3 = — 59 в метаноле. 50

2. K -гис-лиз-(БОК)-лей- ИН ЙН

114 r -лиз(БОК)-ОН, 48 r Н-лей .-Оме и 69 r hl -оксисукцинимида растворяют в 600 мл этилацетата и охлаждают о

55 до -20 . К этому раствору прибавляют раствор 65 г .дициклогексилкарбодиимидав 300 мл этиляцетята, При периодическом встряхивании оставляют стоять в течение

16 чяс при комнатной температуре. Вык10 ристяллизовявшуюся диииклогексилмочевину отфильтровывают и фильтрят полностью выпаривают. Твердый остаток обрабатывают водой. После перекристяллизации из этилацетата и петролейного - )>H ра получают К -лиз-(БОК) -лей-Оме; о, 2о о т.пл. 1 13; Po() э = — 18 в метаноле.

101,5 Б -лиз-(БОК) -лей-Оме растворяют в 1000 мл этилацетятя и прибявляют предварительно охлажденный раствор 40 мл 5н. соляной кислоты в прос.том эфире и 300 мл сложного уксусного ,эфира. После прибавления 5 r 109 -ного палладия на угле в 50 мл диметилформямида гидрируют 31/2 часа. Затем отфильтровывают от катализатора и фильтрят выпаривают.

78,7 г Б -гис- ЖН ЙН растворяют в 400 мл диметилформамида, прибавляют

182 мл 5н. соляной кислоты в простом о эфире и охлаждают до — 10 . После прибавления 32,5 мл трет.-бутилнитритя продолжают и е реме шив ать еше 1 0 ли н и добавлением 140 мл триэтиламина доводят до нейтральной реакции.

Полученный ранее НС4 Н-лиз(БОК)— -лей-Оме растворяют в 300 мл диметилформамида, прибавляют 36,4 мл триэтил амина и прибавляют все к раствору язида.

После перемешивания в течение 4 час при комнатной температуре выкристаллизовавшийся гидрохлорид триэтиламина отфильтровывают и фильтрат полностью выпаривают„ Получают масло, которое растворяют в этилацетате, органическую фазу промывают водой, высушивают над сульфатом натрия, фильтруют и сгушают.

Затем продукт выделяют петролейным эфцром и отфильтровывают. Сырой продукт очищают путем хроматографии на силикагеле и элюирования хлороформол и метанолом. После кристаллизации из эфира и петролейного эфира получают ,.о.

;М -гис-лиз-(БОК)-лей-Оме; т.пл. 146

C<3 — - - 28 в метаноле.

64,5 г Ъ -гис-лиз-(БОК)-лей-Оме растворяют в 300 мл метанола и прибав l ляют 15 мл гидразингидрата. После 3 дней стояния при комнатной температуре раствор полностью выпаривают. К остатку прибавляют этилацетат и н-бутанол и несколько раз промывают насыщенным раствором хлорида натрия. Органическую фа:зу выпаривают досуха и остаток фильтруюя .через колонку силикагеля при помоши хлор<:-. форма и метанола. ПолучаютЕ -гис-лиз(БОК)

-лей-ЯНЙН т.пл. 181

za о

Г Цд — = — 26 в метаноле.

493064

11

3. т . -гис-лиз(БОК) -лей-глн-тре-фал-про— ИНИНЫ

38,4 г Я.-глн- тре-фал-про-Оме растворяют в 1500 мл метанола и диметилформамида прибавляют 10 г 10%-ного палладия на угле в 50 мл воды, гидрируют 1/2 часа, катализатор отфильтровывают н фильтрат выпаривают.

38„6 г) „-гис-лиэ(БОК) -лей-И КЙ Нд растворяют в 250 мл диметилформамида. щ

После охлаждения до - 1. прибавляют

„о

42 мл 5н. соляной кислоты в эфире и

7,3 мл трет.-бутилнитрита. Перемешивают 10 мин и доводят 29,5 мл триэтиламина до нейтрального состояния. Полученный 15 ранее H-глн-тре-фчл про-Оме растворяют в 250 мл пиметилформамида и прибавляют в раствооу пептпдазида. После перемешивания в течение 4 час при комнатной температуре выделившийся гидрохлорид триэм 20 тиламина отфильтровывают и фильтрат полностью выпаривают. Остаток . растворяют а этилацетате и ц бутаноле и промывают 1 и. аммиаком, 1н. серной кислотой и несколько раз водой. Органическую фа- 26 зу полностью выпаривают и остаток очи шают пропусканием через колонку силикагеля при помоши хлороформа, метанола, и воды. Получают Б -гис-лиэ(БОК}-лейглн-тре-фал-про-Оме; т.пл. 171 о

ВО о

И>= — 54 в метаноле.

43,6 г Б -гис-лиз(БОК)-лей-глн-тре-фал-про-Оме растворяют в 1000 мл метанола и диметилформамида и прибавляют

44 мл гидразингидрата. После 4 дней сто- 5 чния при комнатной температуре раствор лолностью выпаривают, Остаток вываРивают в ацетоиитриле. После охлаждения до приблизительно 20 отфильтровывают, Получают > -гис-лиз-(bQK j-лей-глн-тре-фало ." pо-!ч Н ЙН„; т.пл, 175;

Ю о

-. 58 в метаноле.

Р

Частичная последовательность Е 1

Н-гис-лиз(БОК)-лей-глн-тре-фал-проарг-тре-асн-тре-гли-вал-гли-ала-про-ИН

М е т о д A. Растворяют 10 r гептапеп-. тида (частичная последовательность| ) в 5Q

100 мл диметилформамида, выпаривают, остаток растворяют в 100 мл диметилформамида, прибавляют 1 5 г:Цаксисукцинимида, о охлаждают до О, прибавляют 5 г дициклогексилкарбодиимида, 3 часа оставляют вэа- 55 имодействовать, выделившуюся дициклогексилмочевину отфильтровывают, концентри руют до 30 мл и полученный сложный гептап"-.ïòèäîêñèñóêöèÿèìèäîâûé эфир g -гис-лиз(БОК)-лей-глн-тре-фал-про-Осу выде-. 60 ляют прибавлением эфира. После промывания простым эфиром остаток растворяют в

100 мл диметилформамида, прибавляют 10. нонапептидамида (частичная последовательнееть ) и в течение 16 чве аетевннют ввеимодействовать. Прибавляют 500 мл этилацетата и фильтруют. Остаток растворяют в циметилформамиде, прибавляют 10 мл уксусной кислоты и снова выделяют этилацетатом.

Фильтруют, промывают этилацетатом и эфиром и высушивают. Получаются -гис-лиэ(БОК)-лей глн тре-фал-про-арг-тре-асн-тре«гли-валгли-ела-про- Щ, » Д g Щ у

Я = «24 { в диметилформамиде ), который растворяют в 80%-ной уксусной кислоте. Затем прибавляют 5 г палладия на угле, гидрируют при нормальном давлении и комнатной температуре. Фильтруют, выпаривают в высоком вакууме досуха при 20 и остаток промывают эфиром. Посо

I ле высушивания над стружками KOH получают частичную последовательность Е1, триаце-

0 тат; т.пл. 185 (с разложением);

2á о

j<3y = — 42 в 1 н. уксусной кислоте.

М е т о д Б, Растворяют 12 r нонапептида (частичная последовательность С5 ) в

1000 мл диметилформамида и воды, прибавляют 1,8 r палладия на угле и гидри.руют при нормальном давлении. Отфильтровывают от катализатора и фильтрат сгушают в вакууме до 60 мл. Этот раствор Н-apr-тре-асн-тре-гли-вал-гли-ала-про-Й Н2 о хранят при -20 о

К предварительно охлажденному до -15 раствору 10 r Ь-гис-лиз(БОК)-лей-глн-тре-фал-про-) НКН2> (частичная последовательНОсть йв 2 ) В 1 00 мл диметилфОрмамида прибавляют 21 мл 1,85 н, раствора соляной кислоты в диоксане и 1,1 мл трет.— бутилнитрита. В течение 10 мин перемешио о вают при -15, охлаждают до -30, прибавляют 6 мл триэтиламина и фильтруют в холодный раствор Н-арг-тре-асн-тре-гли-вал,-гли-ала-про-ЦН2 в диметилформамиде. После перемешивания в течение 90 мин при

О раствор сгушают в вакууме, прибавляют хлороформ, Осадок отфильтровывают, промывают хлороформом, затем этилацетатом и ,вйсушивают. Сырой продукт растворяют в

1 смеси метанола, хлороформа и воды и нано» сят на колонку силикагеля. Элюируют, чистые фракции соединяют и выпаривают в вакууме досуха. Остаток растворяют в метаноле, продукт выделяют этилацетатом, фильтруют и высушивают. Получаются, -гис-лиз-(БОК)-лей-глн-тре-фал-про-арг-тре-асн-тре-глио

-вал гли-ала-лро- т.пл. 1 85 (с раэло20 имением);14Цп = -29 в диметилформамиде...

13

3,68 полученного таким образом гексадекапептида растворяют в 120 мл диметилформамида и воды, прибавляк,т 3 г

1 0%-ного палладия на угле в 1 0 мл воды и подвергают Каталитическому гидрированию.

Через приблизительно;.2 часа отфильтровывают от катализатора, фильтрат полностью выпаривают и получают частичную последовательность Е

Частичная последовательность E

Н -ги с-лиз-(БОК ) -лей-глн-тре-Q4-npo-арг-тре-асн-тре-гли-ала-гли-вал-про- Hg

1 15

М е т о д В. Аналогично способу получения частичной последовательности Е1 (метод А) получают из гептапептида (частичная последовательность2 ) и нонапептида (частичная последовательностьС ) частич20 ную последовательность(, триацетат; т.пл. о

164 (с разложением)

< 1го о (<=.(11 = — 19 в диметилформамиде.

М е т о д Г. Растворяют 30 г нонапептида (частичная последовательность Сг) в

450 мл диметилформамида и воды, прибавляют 3 г палладия на угле и гидрируют при нормальном давлении, Отфильтровывают от катализатора и фильтрат сгущают в вакууме до 250 мл. Этот раствор Н-арг-тре-асио 30

-тре-гли-ала-гли-вал-про-Изранят при -20 . о

К р охлажденному до -15 .раствору 24 r? -гис-лиз (БОК) -лей-глн-тре-фал- про- ЦН g H2 (частичная последовательность 2 ) в 200 мл диметилформамида прибавляют 52 мл 1,85н. раствора соляной кислоты в диоксане и

2,6 мл трет.-бутилнитрита. В течение о

10 мин перемен(ивают при -15, охлажо лают до — 30, прибавляют 14 мл триэтиламина и фильтруют в холодный раствор Н-арг-тре-асн-тре-гли-ала-гли-вал-про- N Н в диметилформамиде. После

2 о перемешивания в течение 90 мин при 0 ,: раствор сгущают в вакуум е, прибавляют хло- < 45, рофюрм, осадок отфильтровывают, промывают ° хлороформом, затем этилацетатом и высушивают. Сырой. продукт растворяют в смеси метанола, хлороформа и воды и наносят на колонку силикагеля. Элюируют, чистые фракции соединяют и выпаривают в вакууме досуха. Остаток растворяют в

<метаноле, продукт выделяют этилацетатом, фильтруют и высушивают. Получают Е -гис-лиз- (БОК ) -лей-г ли-тре-фал-п ро-а рг-тре55

-асн-тре-гли-ала-гли-вал-про- НН:ь; т.пл. 180 (с разложением); jcQ = - 30 о ге о в ди метил фор м амиде.

6,75 получаемого таким образом гексадекапептида растворяют в 22 0 мл метано14 ла и воды, прибавляют 6 r 10 "»< ( палладия на угле в 20 мл воды и <(»

Частичная последовательность Р

1 ,тре-гли-лиз-(БОК ) -лей-сер-глн-асп- (ОТН )—

1. Z icn(OTE)-лей-Оме, Растворяют 1 5 1 г Z, -асп (ОТБ) -OH и 54 г И-оксисукцинимида в 700 мл о ,ацетонитрила и охлаждают до — 20 Затем прибавляют 96,5 г дициклогек-, силкарбодиимида, растворенного в 360 мл

I ацетонитрила. После приблизительно

30 мин стояния полученнуюдициклогексилмочевину отфильтровывают. К фильтрату прибавляют 71,2 г Н-лей-Оме, затем

:в течение 4 час оставляют стоять и выпаривают в вакууме. К твердому остатку прибавляют этилацетат и воду. Органическую фазу затем промывают 5%-ным раствором бикарбоната натрия, водой и разбавленной серной кислотой (pH 3), водой, высушивают над сульфатом натрия и выпари вают. Остаток растворяют в хлороформе, к которому прибавляют 1".. > метанола, и фильтруют через колонку силикагеля (10-кратное количество) . Получают,-асп-(ОТБ)-лейо ,-Оме; т.пл. 58;

Г3

-<Ы " о

<3 y = — 1 6 в диметилформамиде.

2. -глн-асп(ОТБ)-лей-Оме.

Растворяют 118 r Ъ -асп(ОТБ)-лейОме в 2000 мл метанола. Затем смешивают 15 г 10%-ного палладия на активном угле в 63 мл 4н. соляной кислоты и прибавляют к раствору. Все подвергают гидрированию в течение 2 час при комнатной температуре и нормальном давлении. При этом употребляют приблизительно ! 85% (от теоретического количества)водо рода, Катализатор отфильтровывают и фильт

I рат полностью выпариваЮт, получают .Н-асп(ОТБ)-лей-Оме. НСС в виде аморф,ной пены.

91,7 r>-глн-ОНФ и 93,8 r Н-асп(ОТБ)-лей-Оме<НСС растворяют в 500 мл диме— тилформамида и прибавляют 51 мл > -метилморфолина, В течение 15 час оставляют стоять при комнатной температуре и затем раствор полностью выпаривают в вакууме.

Полученный таким образом остаток хорошо обрабатывают водой и отфильтровывают от воды. Затем перекристаллизовывают из метанола. Получают и -глн-асп(ОТБ) -лей о

-Оме; т.пл. 189 (разложение); га — оЖy = — 30 в диметилфордамиде.

493О64

3. Ъ -сер-глн-аоп(ОТБ) -лей-Оме.

Растворяют 44,4 г Ъ -глн-асп-(ОТБ) лей-Оме в 1300 мл метанола и диметипформамида. Затем к 50 мл воды прибавляют 15 r 10%-ного палладия на ак,тивном угле и прибавляют к полученному раствору, После гидрирования в течение

2 час катализатор отфильтровывают и фильт рат выпаривают в вакууме. . 2 1,4 g, -сер- и Н >Hg, растворенного в 100 мл диметилформамида, охлаждают до — 20 и прибавляют 50,6 мл 5н. соляной кислоты в эфире и 10,3 мл трет.бутилнитрита. После перемешивания в течение 10 мин устанавливают, значение р Н-7, 5 путем приливания 35, 6 мл триэтиламина и прибавляют 34,2 г Н-глн-асц-(ОТБ) -лей-Оме, растворенного в

100 мл диметилформамида. Перемешивао ют в течение 4 час при 20, отфильтровывают от выделившегося гидрохлорида триэтиламина и фильтрат полностью выпаривают. После обработки остатка водой и последуюшей кристаллизации из воды и метанола сырой продукт очищают путем фильтрации через колонку сидикагеля при помоши хлороформа и метанола. Получают Z -сер-глн-асп-(ОТБ)-лей

-Оме; т.пл. 172 (. 0 1 = — 24 в диметилформамиде.

4. Тре-гли-пиз(БОК)-лей- ЙН М Н

50,8 г Z -лиэ(БОК)-лей-Оме растворяют в 600 мл сложного уксусного эфира и после прибавления 25 мл 4н. соляной кислоты в простом эфире и 3 r 101-ного палладин на угле подвергают каталитическому гидрированию. Через приблизительно

4 часа отфильтровывают от катализатора и фильтрат сгушают до половины объема.

33,0 r тре-гли-ОН и 12,0 r М-оксисукцинимида растворяют в 150 мл димео тилформамида и охлаждают до -18 . К этому прибавляют раствор 21,6 г дициклогексилкарбодиимида в 100 мл ацетонитрила и смесь при периодическом встряхивании оставляют стоять в течение 3 час при комнатной температуре. Отфильтровывают от выкристаллизовавшейся дициклогексилмочевины и к фильтрату прибавляют при приливании 25 мл М-метилморфолина полученный укаэанным гидрированием раствор дипептида. После стояния в течение 16 час полностью выпаривают. Осо таток растворяют в этилацетате при О. обрабатывают 1н. серной кислотой и 5%нъ|м раствором бикарбоната натрия. После высушивания над сульфатом натрия органическую фазу полностью выпаривают.

Путем фильтрации полученной пены через .колонку силикагеля при помоши хлорофор16 ма и метанола получают тре-гли-лиз(БОК)

-лей-Оме s виде аморфной пены;

3D о с )»= - 10 в метаноле.

Остаток растворяют в 300 мг метанола, прибавляют 17 мл гидраэингидрита

М, в течение 16 час оставляют стоять при комнатной температуре. После полного выпаривания и дополнительного высушивания в высоком вакууме фильтруют

10 при помоши хлороформа и метанола через колонку силикагеля., Путем кристаллизации из хлороформа и петролейного эфира получают тре-гли-нализ(БОК) -лей- g Н М Н т.пл. 175; - 12 в метаноле.

20 о

5. Тре-гли-лйэ(БОК) -лей-сер-глн-асп (ОТБ)-лей- М Н М Н

26,6 r 7, -сер-глн-асп(ОТБ)-лей-Оме растворяют в 1 л метанола и диметил20 ! формамида, прибавляют 5 r 10%-ного палладия на угле в 100 мл воды и подвергают ка.талитическому гидрированию. Через 1 час катализатор отфильтровывают и фильтрат с гушают.

29 6 г тре-гли-лиз(БОК)-лей-NHNH<

) растворяют в 150 мл диметилформамида. о

Охлаждают до — 20 и прибавляют 26, 2 мл 5н. соляной кислоты в простом эфире и 5,3 мл трет.-бутилнитрита. После перемешивания

30 в течение 10 мин прибавляют 18,5 мл тритиламина и сгушенный раствор Н-сер-глн-асп (ОТБ) -лей-Оме. В течение 4 час перемешивают при комнатной температуре, затем отфильтровывают выделившийся гидро35 хлорид триэтиламина и фильтрат полностью выпаривают. Остаток растворяют в эфире, перерабатывают в порошок и фильтруют на нутче, Сырой продукт очищают путем фильтрации через колонку силикагеля при помо40 щи хлороформа и метанола. Получают тре-гли-лиэ (БОК ) -лей-сер-глн-асп (ОТБ ) -лейо и ° о

-Оме; т.пл. 217;N — 30 в метаноле.

Гептапептид растворяют в 400 мл метанола, прибавляют 1,4 мл гидраэингид= ,рата и в течение 48 час перемешивают при комнатной температуре. Выделенный гидразид отфильтровывают, промывают простым эфиром и высушивают до постоо м о янного веса; т.пл. 218 .. (eQ= — 16 в

50 диметилформамиде.

Частичная последовательность 6 " тре-гли-лиэ(БОК)-пей-сер-гпн-асп-t . ГЬ}

-лей-гис-лиэ(БОК)-лей-глн-тре-фал--.;ioарг-тре-асн-тре-гли-вал-гли-ала-про"- NH 2СН COOH ЗН О.

2 3

2,43 г гептапептида (частичная последовательность Р„) растворяют в 30 мл диметилформамида. После охлаждения о

60 до — 20 прибавляют 1,45 мл 5н. соля493064

Соотношение аминокислот после кислотного гидролиза (бн.НСй 16 час):асп 3,2; . тре 3,9; сер 2,7; глн 2,0; про 2,0; юли 3,0; ала 1,0; цис 1,6; вал 2,0; лей 5,0; фал 1,0; гис 1,0; лиз 2,0;

apr 1,0.

Способ получения полипептидов обшей формулы H-Цйс-сер-асн-лей-сер-тре-ц с-валf лей-гли-лиз-лей-сер-глн-асп-лей-гис-лизлей-глн-тре-фал-про-арг-тре-асн-тре-глиХ-гли-У-про-N Н

2 где Х вЂ” остаток валина, а У вЂ” остаток аланина или Х вЂ” остаток аланина, а У— остаток валина, или их кислотно-аддитивных солей или комплексов с тяжелыми металлами, о т— лич аюшийс я тем, чтопептиды

55 указанной формулы получают известными пептидными методами, например карбодиимидным, причем не участвующие в реакции свободные функциональные группы защищают промежуточно, в подходящей

60 стадии синтеза образуют дисульфидиый ! ной кислоты в эфире и 0,252 мл трет.— бутилнитрита. В течение 10 мин продолжают перемешивать и затем доводят 1,01 мл, триэтиламина до нейтральной реакции. Гексадекапептид E растворяют в 50 мл 5 диметилформамида и прибавляют к раствору гептапептидазида. После перемешивани в течение 4 час при комнатной температуре выделенный гидрохлорид триэтиламина отфильтровывают и фильтрат полностью вы, lQ паривают. Остаток растворяют в небольшом количестве метанола и высаживают егоприбавлением простого эфира. Сырой продукт хроматографируют на колонке силикагеля и элюируют хлороформом, метанолом 15 и водой. Получают указанное в заглавии соединение; т.пл. 225 о йй 2о о

Г 4р = - 18 в диметилформамиде.

Частичная последовательность. ь

2 тре-гли-лиз-(БОК) -лей-сер-глн-асп-(ОТБ) -лей-гис-лиз(БОК) -лей-глн-тре-фал-про-арг-тре-асн-тре-гли-ала-гли-вал-про-ИН2 2СН3СООН3Н2О.

Аналогично способу получения частичной последовательностиС получают из гептапептида (частичная последовательность| )

i и гексадекапептида (частичная последовательность Е2) указанное в заглавии соединение; т.пл. 2 1 6 о, >2o, о

Г 4д = — 19 в диметилформамиде. З0

Пример 1. Н-Цис-сер-асн-лей-сер&

-тре-иаэс-вел-лей-тли-лив-лей-сер-глн-неллей-гис-лиз-лей-глн-тре-фал-про-арг-тре. асн-тре-гли-вал-гли-ала-про-й Н2.

В 30 мл 607р-ной уксусной кислоты растворяют 650 мг тре-гли-лиз(БОК)-лейсер-глн-асп (ОТБ) . -лей-гис-лиз (БОК)-леи-глн-тре-фал-про-apr-тре-асн-трегли-вал-гли-ала-про- blH (частичная последовательность 5, ) и в течение

16 час оставляют стоять при комнатной температуре. После прибавления воды несколько раз промывают простым эфиром.

Водную фазу пропускают через колонку с амберлитом И А-410(ацетат) и элюат упаривают досуха.

Растворяют 295 мг БОК-цис-сер-асилей-сер-тре-цис-вал-лей-ОН в 10 мл диметилсульфоксида и диметилформамида, прибавляют 131 мг" — оксисукцинимида и 59 мг дициклогексилкарбодиимида и через 6 час отфильтровывают от выделившейся дициклогексилмочевины. Полученный отщеплением тритильной группы трикозапептид растворяют в 10 мл диметилформамида и прибавляют к фильтрату. Через

48 час при комнатной температуре продукт выделяют прибавлением эфира. Оса-! док переосаждают эфиром из метанола

) 8 и полученные после высушивания 220 мг сырого защищенного дотриаконтапептида растворяют в 4 мл смеси хлористого метилена, трифторуксусной кислоты и воды и через 1 час стояния при комнатной температуре упаривают досуха. Остаток растворяют в 0 2 н уксусной кислоте наносят на колонку (1х300см) с биоге.лем 1 и элюируют 0,2н. уксусной кислотой. Соединенные чистые фракции выпа— ривают и лиофилизуют. Получают указанное в заглавии соединение; т.пл. 2 1 5 (разложение); (К) = — 75 в 1н. уксусной кислоте.

Соотношение аминокислот после кислотного гидролиза (6н. НС, 16 час): асп 3, 1; тре 3,7; сер 2,8; глн 1,9; про 2,0; гли 2,9; ала 1,0; цис 1,6;.,вал 2,0; лей 5,2; фал1,0; гис 1,0; лиз 2,0. а >г 0,9„

-н - - — — -ce р и м е р 2. H-Цис сер-асн-лей-сер-тре-и с-вал-лей-гли-лиз-лей-се

"-сер-глн-асп«лей-гис-лиз-лей-глн-тре-фал-про-арг-тре-асн-тре-гли-ала-гли-вал-про- ИН

Получают аналогично примеру 1 из

300 мг тре-гли-лиз(БОК)-лей-сер-глн-асп(ОТБ) -лей-гис-лиз(БОК) -лей-глнтре- фал - про- арг- тре- ьсн- тре- глиала-гли-вал-про- МН, (частичная последо2 ввтельнсстьф 170 мг БОК-иис-сер-вено

-лей-сер-тре-цис-вал-лей-ОН; т.пл. 2 10 яо о (разложение);93)= — 18 и 50%-ной уксусной кислоте.

Формула изобретения

-1 0

Составитель В, Наэина

Техред М. Левицкая Корректор С; юлдижар

Редактор Т. Загребельная

Тираж 576 Подписное

ЦНИИПИ Государственного комитета Совета Министров СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва,.Ж-35," Раушская наб., д.4/5

Заказ 72

Филиал ППП "Патент", г. Ужгород, ул. Гагарина, 101 м<.стик и переводят карбоксильную группу конечного пролильного остатка в амидную группу, а затем, если необходимо, полученные пептиды переводят известными приемами в их кислотно-аддятивные соли с органическими или .Неорганическими кис.лотами или в комплексы с тяжели!мп 1 таллами.

Приоритет по признакам: 20.10,70 прп

Х вЂ” остаток валина, У вЂ” остаток аланпп»;

17.12.70 при Х вЂ” остаток аланпша,,,У вЂ” остаток валина.