Совета Министров СССР (43) Опубликовано 15.04.78. Бюллетень № 14 по делам изобретений (53) УДК 663.14(088.8) и открытий. (45) Дата опубликования описания 21.04.78 (72) Авторы изобретения 3. А. Виестуре, T. М. Салмане, У. Э. Виестур, Г. P. Межиня, А. А. Лацар, М. E. Бекер, В. Т. Лука, Я. Я. Лаукевиц и В. Д. Москвин

Институт микробиологии им. Августа Кирхенштейна (71) Заявитель (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ L-ЛИЗИНА

Изобретение относится к микробиологической промышленности, а именно к способам получения L-лизина способом микробной ферментации.

Известен способ получения L-лизина путем глубинного культивирования продуцирующих его микроорганизмов в питательной среде, содержащей минеральные соли, с введением в нее источников углерода, необходимых для роста аминокислот и стимуляторов роста, с последующим выделением L-лизина из культуральной жидкости одним из известных способов.

В известном способе дефицитные вещества, метионин и треонин, необходимые для роста культуры, задают в начале процесса.

Однако в течение процесса биомасса стареет, в ней идут процессы автолиза, снижается активность ферментов и число живых клеток. Таким образом активность культуры снижается, и выход L-лизина уменьшается.

Повторное введение питательной среды ведет к быстрому росту биомассы, что нежелательно, так как одновременно уменьшается выход синтезируемого L-лизина.

С целью регулирования удельных скоростей роста биомассы и синтеза L-лизина и поддержания продуцирующих микроорганизмов в активном состоянии на протяжении всего процесса выращивания предложено в культуральную жидкость после достижсния оптимального для синтеза L-лизина уровня биомассы дополнительно вводить источники углерода, аминокислоты и стимуляторы роста, которые

5 можно вводить непрерывно или порционно.

В качестве дополнительно вводимых ассимилируемых источников углерода предложено использовать этиловый спирт, уксусную кислоту, сахар.

10 В качестве источников, необходимых для продуцента аминокислот, рекомендуется добавлять кукурузный экстракт, клеточный сок картофеля, дрожжевой автолизат, дрожжевой гидролизат и др.

15 Необходимые для продуцента аминокислоты вводят со скоростью 5 вЂ” 40 мг/л.ч, а источники углерода вЂ” со скоростью 2 вЂ” 4 г/л ч.

П р имер 1. Для получения L-лизина используют культуру ВгеиЬacterium sp 22 или

20 Brevibacterium sp 22Л, которые размножаются сначала на агаровых косяках, а затем в колбах на качалке в среде следующего состава о/о.

Мел асса 5,0 (по сахару)

25 Кукурузный экстракт 3,0 (NH4) г504 2,0

КНгРО4 0,05

Затем выращивание посевного материала продолжают в посевных ферментерах.

30 Основную ферментацию проводят в среде, 494040

Сахароза, (ХН4)2$04, %

KHgP04,%

КяНР04, %

DL-треонин, мг/л

DL-метионин, мг/л

Биотин, мкг/л

Тиамин, якг/л

5,0

1,0

0,025

100

3 содержащей 3% мелассы, источник азота, минеральные соли и кукурузньш экстракт. Начальное содер>канис дефицитных для продуцента аминокислот: DL-треонина и DL-метионина составляет соответственно 800 и 200мг/л.

Ферментацию ведут при 30 вЂ” 32 С, рН 7,0вЂ”

7,2, непрерывной аэрации и перемешивании.

В качестве пеногасителей используют силиконы.

Через 15 вЂ” 16 ч при концентрации биомассы

10 вЂ” 12 г/л уровень аэрации снижают с 40вЂ”

50% насыщения по растворенному кислороду до 1 вЂ” 3%, сохраняя интенсивное перемешивание системы.

В среде в этот момент содержатся следы треонина.

Одновременно со снижением уровня аэрации в систему непрерывно или порциями через каждый час вводят дефицитные аминокислоты: треонин со скоростью 34 мг/л ч и метионин со скоростью 8 мг/л.ч.

Введение треонина и метионина прекращают за 12 ч до окончания процесса ферментации.

Треонин и метионин могут вводиться в чистом виде или в виде кукурузного экстракта, клеточного сока картофеля, автолизата или гидролизата дрожжей.

Одновременно с подачей необходимых аминокислот добавляют этиловый спирт со скоростью 2,8 г/л ч. Суммарное количество источников углерода во время процесса не превышает 12 вЂ” 14%, считая по сахарозе.

Процесс ферментации прекращают после снижения концентрации редуцирующих веществ до 0,1%.

Далее в культуральную жидкость вводят нетоксичную кислоту, соляную или серную, и соли сернистой кислоты, например бисульфит натрия (0,1 вЂ” 0,2% от объема жидкости).

После этого стабилизированную жидкость (рН 3 вЂ” 5) упаривают в выпарной установке до содержания сухих веществ 30 вЂ” 40%, а затем высушивают на сушильной установке до

4 вЂ” 6% остаточной влажности.

Из культуральной жидкости можно получить кристаллический L-лизин любым из известных способов.

Пример 2. Процесс ферментации осуществляют непрерывным способом в гетерогенной системе. Система состоит из инокулятора и трех ферментаторов; инокулятор полезной емкостью 1 м, ферментаторы вЂ” 10 м . В инокуляторе осуществляют размножение культуры бактерий на следующей питательной среде:

Условия культивирования следующие: скорость протока D = 0,2 ч вЂ”, что соответствует

0,2 м /ч, интенсивность аэрации 3,0 вЂ” 3,6 r

0>/л ч, температура 31+-1 С; рН 7,2 вЂ” 7,3.

При указанных условиях культивирования в ферментационной среде устанавливается равновесное состояние на следующих уровнях:

Содержание биомассы, г/л 8,0 вЂ” 10,0

Концентрация лизина, г/л 3,7 4,6

Концентрация сахара, о 2,0 вЂ” 2,5

Далее процесс биосинтеза лизина осуществляют в трех ферментаторах. В первом происходит процесс размножения биомассы и синтез лизина, во втором вЂ” клетки бактерий поддерживаются в активном состоянии для синтеза лизина путем добавления специфических факторов роста, в третьем вЂ” добавляются витамины, входящие в состав ферментов синтеза лизина.

Скорость протока в ферментаторах

D=0,1 ч вЂ, что соответствует 1 м /ч.

Состав питательной среды для первого ферментатора:

Сахароза, 15,1 (NH4) zS04, % 3,5

КН Р04, % 0,075

К НРО О/ 0,075

DL-треонин, мг/л 800

ЙЕ;метионин, иг/л 200

Биотин, мкг/л 25

Тиамин, мкг/л 50

MgSO4 7Н О, % 0,01 рН поддер>кивают на уровне 7,3 вЂ” 7,5, иптснсивность аэрации 3,0 вЂ” 3,6 г/л.ч.

При указанных условиях культивирования в ферментационной среде установится равновесное состояние на следующих уровнях:

Содержание биомассы, г/л 8,0 вЂ” 10,0

Концентрация лизина, г/л 7,2 вЂ” 9,5

Концентрация сахара, % 5,0 вЂ” 6,0

Во второй ферментатор к культуральной жидкости добавляют непрерывно или периодически небольшими порциями следующие вещества:

DL-треонин, мг/л 200

DL-метионин, мг/л 50

Тиамин, мкг/л 50

Биотин, мкг/л 25 мд$04 7н о 0,01 рН поддерживается на уровне 7,7 вЂ” 7,9.

Интенсивность аэрации 20 вЂ” 24 г О /л ч.

При указанных условиях культивирования в ферментационной среде устанавливается равновесное состояние на следующих условиях:

Содержание биомассы, г/л 13 вЂ” 15

Концентрация лизина, г/л 19,7 вЂ” 25,5

Концентрация сахара, 1,9 вЂ” 2,1

В третий ферментатор к культуральной жидкости непрерывно или периодически небольшими порциями добавляют следующие вещества:

Биотин, мкг/л 25

Тиам,ин, мкг/л 50

MgS04 7Н О, % 0,01 рН поддерживается на уровне 6,9 вЂ” 7,1.

494040

Составитель Л. Минеева

Техред Н. Рыбкина

Редактор T. Никольская

Корректоры: Л. Орлова и А. Степанова

Заказ 583;5

Изд. № 403 Тираж 568

НПО Государственного комитета Совета Министров СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Подписное

Типография, пр. Сапунова, 2

Содержание биомассы, г/л 14,0 вЂ” 15,0

Концентрация лизина, г/л 35,5 вЂ” 38,5

Концентрация сахара, /о 0,4 вЂ” 0,6

Выход лизина из ассимилированного сахара 29,0 вЂ” 32 5 /о.

Для получения кормового концентрата лизина культуральную жидкость стабилизируют, упаривают и .высушивают на распылительной сушилке или отпускают в виде упаренного раствора с содержанием сухих веществ 40вЂ”

60%. Для получения кристаллического лизина культуральную жидкость центрифугируют и фугат обрабатывают одним из известных методов, например сорбцией на ионообменных смолах.

Формула изобретения

1. Способ получения L-лизина путем глубинного культивирования продуцирующих его микроорганизмов в питательной среде, содержащей источники углерода, минеральные соли, необходимые для роста аминокислоты, и стимуляторы роста, с последующим выделением L-лизина из культуральной жидкости одним из известных способов, о т л и ч а ю щ и йс я тем, что, с целью регулирования удельных скоростей роста биомассы и синтеза L-лизина и поддержания продуцирующих его микроорганизмов в активном состоянии на про5 тяжении всего процесса культивирования, в культуральную жидкость после достижения оптимального для синтеза L-лизина уровня биомассы дополнительно вводят полностью ассимилируемые источники углерода, необходи10 мые для роста аминокислоты и стимуляторы роста.

2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что дополнительный ввод источников углерода, аминокислот и стимуляторов роста осуще15 ствляют непрерывно или порционно.

3. Способ по пп. 1 и 2, отл и ч а ю щ и и ся тем, что полностью ассимилируемые источники углерода вводят в виде этилового спирта, летучих органических кислот и сахаров.

20 4. Способ по пп. 1 вЂ” 3, отлич ающийся тем, что в качестве необходимых для роста аминокислот и стимуляторов роста используют кукурузный экстракт, клеточный сок картофеля, дрожжевой автолизат и дрожжевой

25 гидролизат.

5. Способ по пп. 1 вЂ” 4, отлич ающийся тем, что введение необходимых для роста продуцента аминокислот осуществляют со скоростью 5 вЂ” 40 мг/л ч, а источников углеродавЂ”

30 со скоростью 2 вЂ” 4 г/л ч.