Способ индентификации штаммов вируса ящура

 

всксо о% ля

ЗАТЕИ - -:- ""СИА6 кбл к:..Б

ИЗОБРЕТЕНИЯ

Союз Советскмх

Соцмалмстмиесимх

Респубамк (1!)503904

К МтОРСКОМ СВИДЕЛЛЬСтВЮ (61) Дополнительное к авт. свид-ву— (22) Заявлеио21 09 72 (21) 1830084/30-15 {51) М. Кл. (2 с присоединением заявки №183008B/30-15

С 12 К 1/00

Государстоеииый комитет

Совета Ииииотров СССР

Il0 делам иэооретаний и открытий (23) Приоритет (43) Опубликовано25 02 76 Бюллетень № 7 (45) Дата опубликования описания24.03.76 (53) УДК 576.8.078.

576 858 43(088 8) (72) Авторы изобретения

А. И. Собко, Ю. А. Черняев и А. Б. Смирнов

Всесоюзный научно-исследовательский яшурный институт

0 (7!) Заявитель (54) СПОСОБ ИДЕИТИФИКАБИИ ШТАММОВ ВИРУСА

ЯЩУРА

Изобретение относится к области диагностики вирусных болезней, в частности к способам идентификации штаммов вируса ящура для определения типовой и вариантной принадлежности вируса ящура.

Известен способ идентификации штаммов вируса яшура, с помощью реакции связывания комплемента, включающий соединение специфического комплекса ачтиген- аититело с комплементом с последующим добавлением к реакционной смеси гемолитической системы для проведения иммунного гемолиза, по результатам которого судят о типовой и вариантной принадлежности вируса.

Целью изобретения является ускорение и повышение чувствительности реакции.

Поставленная цель- достигается тем, что соединение специфического комплекса антиген-аптитело проводят в присутствии вдрйного количества комплемента в течение 5-10 мин, а после добавления к реагирующей смеси гемолитической системы результаты реакции учитывают по степени уменьшении мутности ре:гпрующей смеси в процессе гемолиза„ либо и, и последуюшем прерывании гемолиза, например, центри(фугированием, по количеству гемоглобина в надосадочной жидкости этой смеси.

Добавление двойного количества комплемента к специфическому комплексу анти,ген-антитело обеспечивает более быстрое

;протекание реакции и получение четких

:воспроизводимых результатов.

Как показали исследования комплемент

ip, более интенсивно связывается гемологич:ными комплексами антиген-антитело (на

80-90%) в первые 5-10 мин. при 37, что повышает специфичность реакции. В гетерологичной системе за это время

15 связывается незначительное количество комплемента.

При этом учет результатов реакции по степени уменьшения мутности реагирующей смеси в процессе гемолиза и хзволяет в знаgp чительной мере повысить чувствительность реакции, так как в гомологичной системе антиген-антитело гемолиз идет медленнее, чем в I етерологичной, поэтому четко выявляется различие в ходе гемолиза и ре25 зультаты реакции можно зарегистрировать

503904

s момент наибольшего различия гомологичной и гетерологччной систем по этому показателю, либо по количеству гемоглобина в реагирующей смеси после прерывания гемолиза, например, центрифугированием.

На фиг, 1 графически изображена кинетика иммунного гемолиза; на фиг, 2 - реэультаты реакции с ящурным анигеном Ост.; на фиг. 3 — результаты реакции с сывороткой крови бычка, взятой через 21 дней после экспериментального заражения вирусом ящура А22.

Способ осуществляют следующим образом.

Заранее готовят гемолихическую систему и рабочий раствор комплемента, которые хранят в течение 7-10 дней в холодильнике при температуре 4оС, Реакцию ставят в плавающей панели,: изготовленной иэ тонкого .органического стекла, с луночками объемом 0,25-0,4 мл. В трех рядах луночек готовят. разведения испытуемого антигена от 1:4 до 1:256 в объеме 0,1 мл добавляют по 0,025 мл рабочего разведения антисывороток: в луночки первого ряда - 0194, второго - А22 и третьего

- Ост. Йри необходимости можно изменить набор штаммов и количество рядов разведений антигена.

Затем во. все луночки вносят по 0,025 мл раствора комплемента, и "панель" опускают в водяную баню при 37оС на 5-10 мин. Панель должна плавать на поверхностг воды. По истечении 5-10 мин.. в момент наиболее интенсивного связывания комплемен та в гомологичной системе во все луночки вносят по 0,025 мл гемсистемы, и панель опускают в ту же водяную баню. На дне бани должен быть лист белой. пластмассы с четкой черной сеткой. Степень гемолиза отмечают через каждые 5 мин, Через 10 мин. отмечают первые результаты реакции.

Отрицательная реакция - через содержимое луночек видна сетка на дне водяной бани, положительная реакция — сетки не видно. Учет результатов производят до тех пор, пока не наступит четкое различие сред по степени мутности в гомологичной и гетерологичной системах, т.е. различие в титрах антигена с антисыворотками различных типов вируса ящура, Результаты реакции заносят в таблицу, обозначая цифрой время прохождения гемолиза в каждой луночке в минутах.

Обычно читку заканчивают на 15-ой минуте.

Результат реакции может быть получен через 30 мин. после поступления антигена Во исследование ° Подобным же способом можно исследовать и яшурные антисыворотки, Результаты реакции могут быть определены при прерывании гемолиза.

11ля этого берут 8 центрифужных пробирок, в три первые пробирки наливают по 3 мл испытуемого антигена в разведении 1:100 - 1:200, а в остальные — по

3,2 мл физиологического раствора (pH 7,0ф 7,2). Затем к ним добавляют по 2 дозы антисывороток (антител) в объеме 0,2 мл: в первую и четвертую пробирку — О во, вторую и пятую - А,, в третью и

22

J5 шестую - Ост. При необходимости можно изменить или увеличить набор штаммов.

После этого, в первые 6 пробирок добавляют по 1 мл рабочего разведения комплемента, а в 7 и 8 пробирки по 1 мл фи20 зиологического раствора. Все пробирки на 10 мин. помещают в водяную баню при

37 С. По истечении 10 мин. в момент о наиболее интенсивного связывания комплемен» та в гомологичной системе во все пробир25 ки добавляют гемсистему: в 1, 2, 3> 4, 5 и 6 пробирки по 0,2 мл, в седьмуюО, 15 мл, в восьмую - 0,1 мл, Пробирки помещают в ту же водяную баню и выдерживают до тех пор, пока мутность жидкосЗО,ти в 1, 2 и 3 пробирках будет меньше мутности жидкости в 7 пробирке и приблизится к мутности жидкости в 8 пробирке (обычно 8-.15 мин,), т.е. до наступления значительных различий в ходе гемолиза гомологичной. и гетерологичной систем.

Этот момент определяется по специаль но поставленному контролю реакции, Затем: иммунный гемолиз прерывают путе.. центрифугирования реагирующей смеси или путем @ добавления ледяного (при ОоС) 5%-ного раствора лимоннокислого натрия. Прерывание иммунного гемолиза осаждением эритpoQHToB путем центрифугирования:, дает лучшие результаты, так как при этом не происходит дополнительного разведения среды.

Все пробирки центрифугируют при 1000 в течение 10 мин, что вызывает осаждение нелизированных эритроцитов и прекращение их лизиса, надосадочную жидкость переливают в кюветы спектрофометра; в ячейку опыта-поочередно из 1, 2 и 3 пробирок, а в ячейку контроля — соответственно из 4, 5 и 6 пробирок. После записи результатов получают три кривых, характеризующих раз55 личие количества гемоглобина между средами контроля и опыта, При использовании спектрофотометра "Перкин Эльмер" запись кривых ведут на волнах в диапазоне 390420 нм, при использовании спектрофото60 метров или фотоэлектрокалориметров дру50З90 гих систем — нл волне 412 нм. По высоте пикОИ, спектрофОтограммы c) äÿò О ти» повой и нарчантной принадлежности исследуемого вируса, яшура, а также об актив ности антигена. Пик, характеризующий реак- 5 цию и гомологпчной системе, должен быть выше других пиков не менее, чем иа 1,5 см (Е = 0,15) (см. график 2 на фиг. 2).

В данном случае пик 1 выше пиков 2 и

Э на 8 см (Г = 0,8). Следовательно, ис- )p пытуемый антиген относи-.ся к Ост.

Подобным же образом исследуют и сыворотки крови переболевших ящуром живот»

:ных. В этом ""ëó÷àå вместо рабочих раз ведений антисывороток берут рабочие раз- 16 ведения антигенов. В качестве примера на фиг. 3 показан результат реакции при исследовании сыворотки крупнот о рогатого скота, взятой после болезни ящуром, Вирус, вызвавший заболевание животного, 20 отнесен к А, так как пик, характеризующий реакцию с данным ентигеном, на

11,2 см (Е = 1,12) выше остальных пиков.

Предложенный способ идентификЯтии Ю штаммон вируса ящура с помощью реакции связывания комплемента позволяет быстро определ",: ь тип и вариант вируса ящура при высокой специфичности реакции, Результаты исследования могут быть 30 получены через 30-40 мин после поступления антигена. Чувствительность реакции способа значительно выше чувствительности реакции, поставленной по известной методике, что достигается регистрацией З5 реакции в процессе гемолиза эритроцитов (кинетическая реакция), при этом он является, экономичным, так как значительно уменьшен объем смесей компонентов реак49 :ции, количество рабочих ра шедений сывороток и гемоль тической системы и антигена, необходимых для постановки реакции.

Предложенный способ целесообра;>но испольэовать в практических ветеринарных

:лабораториях для быстрой идентификации

1эпизоотических штаммов вируса яшура и определения соответствия эпизоотнческих штаммов вируса производственным> для исследования различных вируссодержаших субстратов и определения незначительных .количеств ящурного антитепа при проведе,нии различных научных исследований.

Формула .изобретения

Способ идентификации штаммов вируса ящура> включающий соединение спе;цифического комплекса антиген-антитело с комплементом с последующими: добавле:нием к реакционной смеси гемолитической ! сьстемы для проведения иммунного гемо лиза, по результатам которого судят о типовой и вариантной принадлежности вируса, о т л и ч а ю ш и и с я тем, что, с целью ускорения и повышения чувствительности реакции, соединение специфического комплекса антиген-антитело проводят в присутствии двойного количества комплемента в течение 5-10 мин, а после добавления к реагирующей смеси гемолитической системы результаты реакции учитывают по степени. уменьшения мутности реагирующей смеси в процессе гемолиэа, либо при последующем прерывании гемолиэа, например,,центрифугированием, по количеству гемоглобина в надосадочпой жидкости этой смеси.

Составитель Л.. Мурая

Редактор Д. Пинчук Техред М. Левицкая Корректор И. Гоксич

Заказ 101 Тираж 551, Подписное

ЦНИИПИ Государственного комитета Совета Министров СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж 35, Раушская наб., д. 4/5

Филиал ППП Патент", г. Ужгород, ул. Гагарина, 101