Способ получения ферментов

 

" 1 507635

ИЗОБРЕТЕН ИЯ

Союз Советских

Социалистических

Республик

К АВТОРСКОМУ СВИДИВДЬСТВУ (61) Дополнительное к авт. свид-ву(22) Заявлено27.03.74 (21) 2009413/28-13 с присоединением заявки № (23) Приоритет(43) Опубликовано 2 5.03.76.Бюллетень №1 1 (45) Дата опубликования onsrassa19,04,76 (51) М. Кл.

С 12 Э 13/10

Гасудврстаеаний квинтет

Советв Миннетров ССР во долом нэооретоннй н открытнй (53) УДК 576.15.08 (Oe8.8 ) Б. А. Величко, К. А. Калунянц, Э. Г. Ашомко, Н. А. Семенова, В. Д. Мурзенкова и Ю. И. Гончаров (72) Авторы изобретения

Всесоюзный научно-исследовательский биотехнический институт (71) Заявитель (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ФЕРМЕНТОВ!

Изобретение относится к ферментной отрасли микробиологической промышленности и может быть использовано в производстве ферментных препаратов и других биологически активных веществ, применяемых в винодельческой, соевой, консервной, фармацевтической, химической промышленности и сель оком хозяйстве.

Известен способ получения ферментов, предусматривающий культивяроваиие проду- О центов, например ASpéôÈèà еаб(}Ма, на питательной среде, содержащей источники углерода, азота и минеральные соли, отде ление клеток микроорганизмов, возврат их на стадию культивирования с ттоследующим ц отбором культуральной жидкости и выделе нием нз нее ферментов.

Однако известным способом нельзя получить ферменты, например пектолитичесхие, с заданным комплексом. 29

С целью получения пектолигическкх фер ментов с заданным комплексом и стабилизации на стадии активного бкосинтеза куль гивирование продуцента проводят нри пото%e среды, возврат продуцента на культиви- 35

2 рование осуществляют на стадии максимального биосинтеза ферментов вместе с продуктами ферментативного гидролиэа пектинсодержащего сырья, характерными для данной стадии биосинтеза.

Целесообразно для получения пектолити ческих ферментов с преобладанием эндополигалахтуронаэы нз продуктов ферментатив ного гидролиэа пектиисодержащего сырья использовать олигосахориды со степенью метоксилнрования 5-37%, прк этом возврат указанного вещества и продуцента осущест влять через 9-24 час от начала культиви-! рования, Для получения комплекса пектолктических ферментов с преимуществентяым содержанием пектинэстераэы кэ продуктов ферментативного гидролкза пекткнсодержащего сырья используют олигосахариды со степенью метоксилирования 37-95%, при этом возврат указанного вещества и продуцента осуществляют через 36-64 час от начала

;культивирования.

Для получения комплекса с преобладанием экзоцолигалактуроназы иэ продуктов ферк(ентативнОГО гидрОлиза (тектинсоде Ока,нег< с(прея используют полигалактуроиовые

КИСЛОТЫ, ПРИ этОМ ВОЭВРат ИХ И ПРОДУЦЕНта

<ыу(пествляют через 72-120 час от начала культивирования. 5

Целесообразно также продукт ферментативного гидролиза пектинсодержащего сырья вводить в среду в количестве 10-40%.

Предлагаемый способ осушествляют следуюшим образом. 10

Культивируют микроорганизм-продуцент периодическим способом-, определяя биологические и физико-химические параметры в процессе выращивания; определяют стадии развития культуры, специфические для обра- щ зования необходимого ферментативного комплекса, например." ,(. — для соковой громышленности;

М вЂ” для винодельческой промышленности: (и — для фармацевтической промышленности;

P — для химической промышленности и сельского хозяйства.

В комплексе I определяющими ферментами являются эндополигалактуроназы, во

П вЂ” кроме эндополигалактуроназ присутствуют пектинэстеразы, в IH — отсутствуют протеазы при наличии эндополигелактуроназ и пектинэстераз, в т(< — Определяюшими являются экзополигалактуроиазы. 30

Каждеч стадия развития культуры характеризуется своими возрастными морфологофизиологическими особенностями. При достижении необходимой стадии развития культуры,. включают проток, состоящий из спе- % цифической питательной среды, характерной только для данного конкретного состояния культуры. Скорость протока изменяют от

1 i 3 до 1! 25 полезного ооье((а в час.

Для голучения необходимого комплекса 40 пектолитических ферментов проток среды включают на стадии активного биосинтеза заданного комплексе ферментов., Гак для получения пектолитического комплекса ферментов с преобладанием эндо- 4 полигалактуроназы проток среды включают через 9-24 час от начала культивирования продуцента, для повышения содержания пектинэстеразы — через 36-64 час, экзоцолигалактуропазы@(через 72-120 час, син- @ хронно с притоком осушествляют отбор глуби(".ío(культуры и всзврат части биомассы продуцента вместе с продуктами гидролиза пектинсодериащего сырья, специфичными

aJ(s: полу *ения заданного комплекса ферментов.

Тек для получения пектолитического комплекса ферментов с преобладанием эндополи(ел ктуронеэы наряду с продуцентом в сост(1(; протока вводят олигосахариды со сте-®

lJ< >JhJC1 ".(Е 1 < K< ((. (И(1<;(,:1 (f 1(((). .,,(I )(НИЯ <: ЮЛЕ()>((ЕЕ(ИЯ <(<: K (И((Э« < (:(<: IÌ I !(««< Il . <" I i I

Олиу Осахариды СО < те((ень(<:;1< т

Пример 1. В ферментер загружа— ют питательную среду следуюшего состава, о

Экстракт свекловичного жома 89,15

Вытяжка из солодовых ростков 10,0 (NH ) 5П

0,70

КН PO 0, 0 g 04 2О 0,05, Ст рилизуют и засевают активировен— ными конидиями Ь)(Р!фЫ05 j0(Jt56US . Ha

21 часу развития культуры вклюлеют про— ток в количестве 1/3 полезного объеме в час, в состав протока входят следующие компоненты, в,4:

МАМБО -7Н 0

О. 05

KH PO 0 1 (2

Вытяжка и"-, солодовых ростков 10.0

Прогидролиэованчнь(й экстрет свекловичного жома до Оли0,7 госехаридов со степенью метоксилирования 5-37 о 69 15

Одновременно с включением протоке синхронно отбирают глубинную культуру, фильтруют, биомассу сушат и количественно включают в состав протока, е из культурельной жидкости выделяют ферментный препарат лтобым (э известных способов„Ферментативные активности глубинной культуры следуюшие,, ед/мл, ПГЬВ (эндополигалактуронаэная акт.) 3.- 4

ПГС/А (эндополигалактурочазная акт.) 0 1-0,2

ПЭ (пектинэстеразная акт.) 0,0

ПС (протеолитическая акт.) 300-500

Пример 2. Культивирование

Л ЬР > ((. И И Ь уО Е1 L И 8 . Осушествля, ют аналогично способу, описанному в примере

1, однако проток включают на 64 часу развития. культуры в количестве 1/10 полезного объ( ма в час, содержащий экстракт свекловичного жома., прогидролизованный до олигосахаридов со степенью метоксилирования 37-:-957о, Далее- как в примере Л 1. ферментативные активности глубинной культуры следующие, ед/мл:

ПГС/В

11ГС/Р, ние «леток ii 1 " н .:1 н

Составитель Б. Величко

Редактор В. Дибобес Техред М. Левицкая Корректор Н. Зинзикова

Заказ 175

Тираж 551

Подписное

UHHHHH Государственного комитета Совета Министров СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раун ская наб., д. 4/5

Филиал ППП "Патент", г. Ужгород, ул. Гагарина, 101

ПЭ 0. 7-1 (ПС 400-.;00.

Пример 3. Периодическое и непрерывное культивирование осуществляют аналоги™но способу, описанному в примере 2, включая в проток лактазу и количестве 0,5%

Получаемые при этом ферментативные активности глубинной культуры следующие, ед/мл:

ПГС/В 3-5,0

ПГС/В 3-5,0

ПЭ 0,7-1 6

ПС 0,0

П р и м 3 р 4. Культивирование периодическое до включения протока и непрерывное после включения протока осуществляют ана- 15 логично способу, описанному в примере 1 с той только разницей, чта проток включают на 110 часу развития культуры со скоростью 1/15 полезного объема ферментера в час и в состав протока включают прогидро- О лизованный до полигалактуроновых кислот жом.

Получаемые пои этом ферментативные активности глубинной культуры следующие, ед/мл: 25

ПГС/В 5-7

ПГС/А 1 8-22

ПЭ 0,8-1,2

Таким образом, предлагаемый способ позволяет эффективно решить вопрос получения ферментов с заданным комплексом в условиях непрерывного культивирования, удовлетворяет потребности различных отраслей народного хозяйства (винодельческой, соковой, консервной, фармацевтической про35 мышленности, сельского хозяйства) в специализированных высокоэффективных пекталитических ферментных препаратах.

46

Формула изобретения., Способ получения ферментов, предусматривающий культивирование продуцентов, например ЬРРГД f(uS jaati, dLLS, на пита- „ тельной среде, содержащей источники углерода, азота и минеральные соли, отделес

òÿnèEo ку. !ьтиднооii !Eiè÷ )(.1 ;г н н: тбаоом куль! урачьн .и .9oL..I!c . >c гн i . я,. в -н.n÷ñиз нее ферментов, т ч и н в Ii ш н и . я тем. что, о целью получения некто:нгтнческих ферментов г заданным к мнлексс i. u, стабилизации еероцесса на oòaдии активного

1, биосинтеза, культивирование продуцента проI водят при протоке среды„в возврат продуцента осуществляют на стадию максимального биосинтеза ферментов вместе с продуктами

:,ферментативного гидрализа пектинсодержа дега сырья, характерными для данной стадии биосинтеза.

2, Способ по п. 1, а т д и ч а ю щ и йс я тем, что. с целью возможносэи получения пектолитических ферментов о преобладанием эндополигалактуоаназы, из продуктов ферментативнога гидролиза пектинсодеожашего сырья используют олигосахариды со степенью метоксилирования 5-3 " oо, при этом возврат указанного вещества и ïðoäóцента осуществляют через 9-24 час ат начале культивирования.

3. Способ па и. 1, а т л и ч а ю ш и й-. с я тем, что, с целью повышения содержания пектинэстеразы в комплексе, из продуктов ферментативнаго гидролиза пектинсодержашегс сырья используют олигосвхариды са степенью метоксилиравания 37-95 о, прн этом возврат указанного вещества и прадуцента асу|лествляют через 36-64 час от начала культивирования.

4. Способ по и. 1, о т л и ч и ю щ и йс я тем, чта, с целью вазможности получения пектолитических ферментов с преобладанием экзаполигалактуроназы, из продуи- тов ферментативного гидролиза пектинсадержащего сырья используют палигалактуроно вые кислоты, при этом возврат их и лроду.цента осуществляют через 72-120 час от начала культивирования.

5. Способ по пп. 1-4, о т л и ч а ю— ш и и с я тем, что продукт ферментатив;ного гидролиза нектинсодержащега сыоья вводят в среду в количестве 10-40%.