Способ получения 11-оксизамещенных прегенен-4-диол-17 ,21- диона-3,20 или его производных

 

О П И С А Н И Е (и) 5li946

ИЗОБРЕТЕНИЯ

Секта Соеетскнэ

Социалистических. Реестрик

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (61) Дополнительное к авт. свид-ву (22) Заявлено 22,01.75 (21) 2101277/28-13 с присоединением заявки № (23) Приоритет

Опубликовано 30.04.76. Бюллетень № 16

Дата опубликования описания 21.01.77 (51) М. Кл е А 61К 17/12

Государственный комитет

Совета Министров СССР (53) УДК 61 5.45:615.361.45 (088.8) ло делам изобретений и открытий (72) Авторы изобретения

А. К. Матвеева, А. Н. Коняхин, Б. И. Демченко, В. Г. Воронин, И. А. Андреев, Б. В. Шемерянкин, H В. Домрачев, В. Н. Васильев и Л. И. Иоанисьян

Филиал Всесоюзного научно-исследовательского химико-фармацевтического института им. С. Орджоникидзе (71) Заявитель (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ 11-ОКСИЗАМЕЩЕННЪ|Х

ПРЕГНЕН-4-ДИОЛ-17а, 21-ДИОНА-3,20

ИЛИ ЕГО ПРОИЗВОДНЪ|Х

Изобретение относится к микробиологическим методам получения гормональных препаратов.

Известны способы получения 11-оксизамещенных веществ S Рейхштейна (11-эпикортизола, гидрокортизона) путем микробиологической трансформации моноацетата вещества R с использованием культур Corgnebacterium

mediolanum штамм P/383, Beanveria spp. штамм Р/130, Curvularia lunata штамм Р/132.

Однако при таких способах необходимы выделение промежуточного продукта (вещества

S Рейхштейна или его производных) и последующая подготовка стероида для внесения на дальнейшую трансформацию, эти процессы довольно трудоемки и связаны с потерей целевого продукта.

Цель изобретения — упрощение процесса.

Это достигается тем, что по окончании трансформации моноацетата вещества R (или

его производных) в вещество S Рейхштейна (или его производные) с целью полного подавления жизнеспособности Corynebacterium

mediolanum P/383 культуральную жидкость с содержащимся в ней промежуточным продуктом подвергают термической обработке путем нагрева до температуры 75 — 90 С и выдерживают ее при этой температуре в течение 20—

30 мин с последующим охлаждением до 28 С.

В обработанную указанным выше способом культуральную жидкость вносят подготовленную культуру Beauveria spp. Р/130 или Curvularia lunata Р/132 для последующего 11,— или l lр — гидроксилирования вещества S

Рейхштейна или его производных.

Пример.

Культуру Corynebacterium mediolanum

10 P/383 поддерживают на плотной питательной среде следующего состава: пептон ферментативный 4,5 г, дрожжевой экстракт 3,0 r, мясопептонный бульон 150 мл, гидролизат казеина сухой 4,0 г, глюкоза безводная 1,0 r, агар

15 белый вымороженный 30,0 г, дистиллированная вода до 1 л.

При пересеве культуру выращивают в пробирках в течение 30 час при температуре

33 С, затем смывают ее с поверхности плотной

20 среды стерильным физиологическим раствором и полученной суспензией засевают колбы с

400 мл жидкой питательной среды СМ-6 следующего состава: дрожжевой автолизат 6,0 г, глюкоза безводная 3,0 r, К НРО4. ЗН О 2,46 r, 25 Na HPO4 ° 12Н О 4,0 г, NaCl 2,0 г, вода до l л.

Культуру первой генерации выращивают в течение 24 час при 28 С, вторую генерацию проводят в стеклянном ферментере (емк.

25 л), в который загружают 8 л среды СМ-6, 511946

Silufol UV — 254.

3

Среду стерилизуют в течение 20 мин при

120 С, рН среды после стерилизации 7,3 — 7,4.

Инокулятом является культура первой генерации, которую в строго стерильных условиях переносят в ферментер из расчета 0,6 "/о от объема питательной среды в ферментере.

Выращивание проводят в течение 24 час при температуре 33 С, скорости перемешивания

400 об/мин, аэрации 0,7 л/л в 1 мин. Третью генерацию проводят в стеклянном ферментере с жидкой питательной средой, следующего состава: дрожжегой экстракт 2,5 г, сахароза

0,5 r NaqHPO4 12Н О 4,5 г, КН РО4 1,0 r, вода техническая 1,0 л, рН среды 7,0 — 7,1.

Культуру выращивают в течение 14 час при температуре 33 С, аэрации 0,7 л/л в 1 мин и скорости перемешивании 400 об/мин.

К полученной трансформирующей культуре добавляют дробно водную суспензию 40 г моноацетата вещества R в течение 21 час.

Трансформацию проводят в течение 22 час при температуре 33 С, аэрации 0,2 л/л в 1 мин, скорости перемешивания 800 об/мин, рН 7,6-—

8,4, атмосферном давлении.

В качестве пеногасителя используют подсолнечное масло.

Контроль процесса трансформации осуществляют методом тонкослойной хроматографии на силикагельных пластинках Silufol

1Л вЂ” 254.

По окончании процесса трансформации культуральную жидкость нагревают до температуры 80 С и выдерживают ее при температуре в течение 20 — 30 мин, затем охлаждают до 28 С.

В обработанную таким образом культуральную жидкость вносят мицелий Beauveria spp.

Р/130.

Рабочую культуру Beauveria spp. Р/130 выращивают при 28 С в течение 9 дней в наклонном положении на плотной питательной среде следующего состава: сахароза 20,0 r, NaNOq

2,0 г, К НРО4 ЗН О 1,0 г, MgSO4 7Н О 0,5 г, КСl 0,5 г FeSO4 7Н О 0,01 r, агар белый вымороженный 30,0 г, вода дистиллированная до

1 л.

Культуру первой генерации выращивают в колбах Эрленмейера на жидкой питательной среде следующего состава: глюкоза безводная 20,0 г, пептон ферментативный 5,0 г, дрожжевой автолизат 5,0 r, КН РО4 5,0 г, вода дистиллированная до 1 л.

Рабочую культуру суспендируют в дистиллированной воде и вносят в колбы в качестве посевного материала, выращивают в течение

48 час при температуре 28 С.

Культуру второй генерации выращивают в стеклянном ферментере на жидкой питательной среде, используемой для первой генерации.

Инокулятом служит культура первой генерации. Инокулят в стерильных условиях вносят в ферментер из расчета Зо/о от объема питательной среды в ферментере и выращивают в течение 24 час при температуре 28 С, аэрации

0,6 л/л в 1 мин, скорости перемешивания

800 об/мин, слабо положительном давлении.

Третью генерацию проводят в стеклянном ферментере на жидкой питательной среде того же состава. Культуру второй генерации в стерильных условиях вносят в ферментер из расчета 7О/о от объема среды в ферментере.

Выращивают в течение 18 — 20 час при температуре 28 С, аэрации 0,6 л/л в 1 мин, скорости перемешивания 800 об/мин, слабо положительном давлении.

Культуральную жидкость фильтруют через тканевый фильтр, Отфильтрованный мицелий промывают 1 — 3 раза дистиллированной водой, отмывают из расчета 35 — 40 r хорошо отмытого мицелия на 1 л трансформирующей среды.

Отвешенный мицелий суспендируют в небольшом количестве воды и вносят в термически обработанную культуральную жидкость для трансформации содержащегося в ней вещества S Рейхштейна.

Трансформацию проводят в течение 18—

24 час при рН вЂ” 6,0 — 7,5 температуре 28 С, аэрации 0,6 л/л в 1 мин, скорости перемешивания 700 — 800 об/мин и атмосферном давлении.

В процессе трансформации рН среды контролируют и поддерживают в указанных ïðeделах 3 /О-ным раствором NaOH или 3/о-ным

НСl.

Пеногашение осуществляют добавлением подсолнечного масла.

Процесс трансформации контролируют методом тонкослойной хроматографии на силикагельных пластинках.

После окончания трансформации выделяют

11-эпикортизол. Для этого отделяют мицелий от жидкой фазы фильтрацией на нутч-фильтре.

Мицелий суспендируют в аппарате с мешалкой в 3 л воды при 30 С, перемешивают в течении 3 мин и отфильтровывают на нутчфильтре. Жидкие фазы объединяют и содержащийся в них целевой продукт экстрагируюг трижды по 8 л этилацетатом в аппарате с мешалкой в течение 2 час, после чего смесь отстаивают в течение 1 — 1,5 часов до полного разделения фаз. Объединенный экстракт упаривают в вакууме при температуре 40 С до

0,5 л, кристаллизуют при 0 — 5 С в течение

5 — 8 час.

Выделившийся кристаллический продукт отделяют фильтрацией на воронке Бюхнера, промывают этиловым эфиром (100 мл) до получения прозрачного фильтрата. Маточник снова упаривают в вакууме досуха. Остаток суспендируют в 150 мл этилового эфира, отделяют фильтрацией на воронке Бюхнера и присоединяют к основному веществу. Сушат продукт в вакуум-сушильном шкафу при температуре 60 С в течение 5 час. Получают

27,2 г 11-эпикортизола.

511946

Фор мула изобретения

Составитель Г. Смирнова

Текред 3. Тараненко Корректор T. Добровольская

Редактор M. Дмитриева

Заказ 164772 Изд. № 1406 Тираж 630 Подписное

ЦНИИПИ Государственного комитета Совета Министров СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4!5

Типография, пр. Сапунова, 2

Способ получения 11-оксизамещенных прегнен-4-диол-17п, 21-диона-3,20 или его производных путем микробиологической трансформации моноацетата вещества R в вещество S

Гейхштейна культурой Corynebacterium mediolanum P/383 с последующим проведением процесса 11-гидроксилирования культурами

Beanveria spp. Р/130 или Curvularia lunata

Р/132, отлич ающийся тем, что, с целью упрощения процесса, раствор, содержащий вещество S Рейхштейна, нагревают до инактивации культуры Corynebacterium mediolanum

P/383, а затем вносят культуру, осуществляющую процесс l l-гидроксилирования.