Способ получения 5"-нуклеотидов
ОП ИСАНИ Е
ИЗОБРЕТЕН ИЯ с (11) 521281
Союз Советских
СЬц аяистических
Реснублик
К АВТОРСКОМУ СВИДВПЛЬСТВУ (61)Дополнительное к авт. свид-ву (22) Заявлено 08;07.74 (21) 2042572/04 (51) М. Кл,в
С 07 Н 21100, С 07, Н 21/02 с присоединением заявки №
Гюсударстееииый июмитет
Co9Na Ииииютрюа СССР пе делам иаююретеиий и втираний (23) Приоритет (43) Опубликоваио15.07.76,Бюллетеиь № 26 (53) УДК 547.863.32 .02 (088.8) (45) Дата опубликоваиы описаиия11.10.76
Ь (72) Авторы B. П. Варламов, Y. Н, Львова, 1 . 1 анинкова Н, М. АбросймоваиэобРЕтЕиии Амельянчик, Q, Г. Вальховский, С. В. Рогожин и Р. И. Татарская
Институт элементоорганических соединений AH СССР (71) Заявитель (54) СПЕХОВ ПОЛУЧЕНИЯ 5 -НУКЛЕОТИДОВ и аидонуклеазу А2 36, присоединенную к водо нерастворимому носителю.
Изобретение относится к способу получе4ия 5-иуклеотидов, которые находят приме кение как промежуточные вещества в синте! зе лекарственных препаратов и витаминов.
Известен способ получения 5 -нуклеотидов путем ферментативного гидролиза нуклеиновых кислот водонерастворимым Фермен» том эндонуклеазой А-5 актиномицетов, ковалентно связанным с органическим или неорганическим носителем.
Однако для полного расщепления субстра-. та на 5 -мононуклеотиды требуется большое количество водонерастворимой экзонуклеазы А-5 и много времени, так как фермент действует только с 3 -конца полимерной
f цепи..
По предлагаемому способу, чтобы существенно сократить» время ферментолиза нуклеиновых кислот до 5 - нуклеотидов и увеf личить выход целевого продукта на единицу активности фермента 5 -нуклеотиды получают путем последовательного ферментативного гидролиза нуклеиновых кислот-эцщ нук аеазой и экзонуклеазой. При этом используют .
Водонерастворимая эндонуклеаза A-23$ а может быть использована многократно либ в проточной колонке, либо в реакторе с м шалкой, тогда как водорастворимая эндону
1 ! клеаза может быть использована лишь одн кратно вследствие полной потери активнос
10 ти в процессе гидролиза.
Предлагаемый ферментативный гидролиз нуклеиновых кислот позволяет существенно
1 повысить выход 5 -нуклеотидов на, единицу активности фермента. Если при использоваИ нии водонерастворимой экзонуклеазы для расщепления 100 мг нуклеиновых кислот требуется 10 ч, то при использовании предварительного гидролиза водонерастворй-
Мой эндонуклеазой A-236. одйн цикл.за-, 20 верщается за 0,5-1 ч, причем после отделения нерастворимого фермента от продуктов простой фильтрацией, он может быть опять использован для гидролиза, После
10 циклов иммобилнзованная эцдонуклеаза
Ф А-236 теряет не более 15% своей актив Э Ф
521281
Ш11ИЦИ Зака;> 1902/5 14 Тираж 575 о
О
Г1одпис»cx
Ф IIIIIII|I 1 1ПП "1 1;I I t II I ", и. 3 2lcI op0g ул. 1роек I лая, ности. Фермент эндонуклеаза A-236, присоединенный- к водонерастворимому носите» лю, проявляет до 70% исходной. нуклеаэной активности, гораздо более устойчив к тепловому воздействию: активность нераствори-. 5 мого фермента сохраняется при инкубации при 50 С в течение 5 ч (при наличии ионов Са в концентрации 10 М), в то время как растворимый фермент теряет за это время 90% своей активности. 16
Пример 1, Макропористый кремнезем силохром кипятят в 0,1-10%-ном растворе f -амин опропилтриэтоксисилана в среде органического растворителя в течение 30 ч. Получают аминированное:, произ- 35 водное силохрома, К 5 I. аминированного силохрома добавляют 2,;5 r хлорангидрида и-нитробензойной кислоты в 80 мл хлороформаи2 мл „ триэтиламина. После перемешения в тече- 20 ние 1 ч при кипении производное высушивают на фильтре, добавляют 1 r дитиони та натрия в 10 /-ном водном растворе пиридина и перемешивают 1-5 ч при 5090 С. 25
Полученное соединение обрабатывают
14%-ным водным раствором нитрита натрия в 2,5 н, НС1 при температуре 0-5 С в течение 0,5-1 ч.
Образовавшееся диазопроизводное пере- @ мешивают с 10 мл 0,01 / ного раствора фермента эйдонуклеазы актиномицетов в
0 1 И трис-НС1 буфера, рН 8,5, Са )= 10 И в течение 4-20 ч при 0 5 С.
1После этого носитель с присоединенным ферментом промывают 1 М раствором поваренной соли и ледяной водой. Фермент сохраняет до 70% исходной нуклеаэной активности
Ферментолиз нуклеиновых кислот.
0,5 г носителя с присоединенным ферментом (1000 ед. акт/г) загружают в сосуд с мешалкой, термостатированный при 37 С. Затем добавляют 200 мл 1 / ного раствора нуклеиновых кислот, суммарная дрожжевая PHK в.0,05 М трис-НС1 буфере с рН 7-9, Для действия фермента
++ необходимы ионы Мц в концентрации 5х
-Ъ -т х 10 И 1и ионы Са +в концентрации 10
Под действием фермента происходит расшепление субстрата в течение 8 ч иа олигонуклеотиды, содержащие 70;. кпслстно-
1 расторимых фракций, которые подают в проо точную термостатированную при 37 С колонку, емкостью 5 см,,заполненную„водо1
t нерастворимым ферментом экзонуклеазой
А-5. Раствор подают со скоростью 1525 мл/ч. B конечном гидролизате содержится 90% 5 -нуклеотидов, которые разделяют на ионообменной колонке и лдентц i фицируют с помошью бумажной и тонкослойной хроматографии 5 -нуклеотидаэой! и по УФ-спектрам.
Пример 2, 5 r твердого носите-ля для газо-жидкостной хроматографии. хромосорб Р кипятят в 0,1-2%-ном раст1 воре g -аминопропилтриэтоксисилана в органическом растворителе в течение 24ч
Полученное .при этом промежуточное соединение обрабатывают 1-20 -ным водным раствором,глутарового альдегида при температуре 0-5 С в течение 0,5»1 ч и затем перемешивают с 5 мл 0,1 / ного раствора фермента энцонуклеазы яктиномицетов pl
0 1,И трис-НС1 буфере 1Са .1 =10, И при
4 С в течение 4-24 ч.
Полученный водонерастворимый, ковалентно связанный с хромосорбом Р фермент o6 .ладает 35%-ной исходной нуклеазной активностью. Ферментолиз и идентификация продуктов аналогичны приведенным в примере .
I Пример 3. По одному из известных. способов активируют целлюлозу, например полу% р чают диазотированную м-амминобензилоксиме»". тилцеллюл озу; 1%-ную суспензию диазотир ован-.
Вой м-аминобензилоксиметилцеллюлозы. пере- мешивают с 0,1%-ным раствором эндонукле;зы актиномицетов в течение 4-24 ч при о
С. Фермент; присоединенный к целлюлозе„ обладает нуклеазной активностью.
Ферментолиз и идентификация продуктов аналогичны приведенным в примере 1. ормула изобретения
Способ получения 5 -нуклеотидов путем ферментативного гидролиза нуклеиновых кислот экзонуклеазой А-5, о т л и ч а ю щ и йс я тем, что, с целью увеличения выхода целевого продукта,нуклеиновые кислоты предварительно гидролизуют эндонуклеазой А-236, присоединенной к водонерастворимому носите« ,ШО.
