Способ получения рибонуклеозид-5 @ -монофосфатов,меченных изотопами с @ или н @

 

ОПИСАНИЕ

ИЗОБРЕТЕНИЯ

Союз Советских

Сое4налнстнчесинх

Республик

«I>530520

К АВТОИ:КОМУ СВИ П!ЛЬСТВУ (б1) Дополнительное к авт. саид-ву(22) Заявлено 3011.73 (2т) 1973774/04 с присоединением заявки Но (23) Приоритет— (51)М. Кл.з

С 07 Н 19/02

Госуяаретаеяяна конятет

СССР

IIo яеааю язобретеяяя я открытяя

Опубликовано 070 8 1 Бюллетень М 33

Дата опубликования описания 970981

Ж ) НЖ 547,963.3..26.118.07 (088.8) (72) Авторы изобретения

П.П.Пумпен и Э.Я.Трен

Ордена Трудового Красного Энамени институт органического синтеза AH Латвийской CCP э (71) Заявитель (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ РИНОНУКЛЕОЭИЛ-5" МОНОФОСФАТОВ, МЕЧЕНЫК

ИЭОТОПЛМИ С ИЛИ Н . / . щ Й y- .gyp Д Щ.

Изобретение относится к области получения меченых природных соединений, а именно к новому c îcîáó получения меченых С или Н рибонуклеоэид-5-монофосфатов — компоненI тов РНК.

Эти соединения могут быть использованы для различных исследований в области биохимии, молекулярной биологии и медицины.

Известен принцип фосфорибоэилирования аэотистых оснований (как пуриновых, так и пиримидиновых), входящих в состав нуклеиновых-кислот..

Индивидуальные ферменты осуществляющие данные превращения, выделены и очищены в различной степени.

Однако каждый фермент осуществляет лишь одну соответствующую реакцию.,и следовательно, применение какого-либо фермента для создания общего способа получения различных рибоиукле- оэид-5 -монофосфатов невозможно.

Известно также использование сложного биологического катализаторабесклеточного экстракта Brevibacterium ammoniegenes — для синтеза раэI личных рибонуклеозид-5-монофосфатов.

Однако этим способом удается лишь осуществить йерментативный синтез уридин-5- монофосфата и получить незначительное количество аденозин-5монофосфат.

С целью усовершенствования известного способа и создания общего ° способа получения меченых нуклеотидов, пригодного,для синтеза различных нуклеозид-5-монофосфатов иэ сооТветсцующих меченых оснований, предложен способ получения меченых рибонуклеозид-5-монофосфатов, заключающийся в том, что меченое основание подвергают фосфорибоэилированию в присутствии ферментной фракции бесклеточного экстракта Escherichia .cori AB 259НЕГ3000. Процесс протекает, как.и в известном способе, при

37оС в присутствии 5-фосфо-Д-рибоэил1-пирофосфата и ионов магния при рН

20 7,8. Выходы иуклеозид-5-монофосфатов (в расчете иа меченое основание) .практически количественные. В качестве катализатора процесса в предложенном способе используется бескле2 .точный экстракт иэ Е сов1.

Высокие выходы целевых продуктов позволяют осуществлять синтез важнейших меченых рибонуклеозид-5монофосфатов .в препаративных количест.

ЗО вах.

530520

Формула изобретения

Составитель A.Êîñò

Редактор Н.Потапова Техред М,Табакович Корректор В. Синицкая

Заказ 6671/58 Тираж 397 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по..делам изобретений и открытий..

113035, Москва, Ж-35, РаушскаЯ наб., Д. 4/5

Филиал ППП Патент, r. Ужгород, ул. Проектная, 4

Пример ы. Приготовление бесклеточного экстракта E соби AB259HKr

3000 °

Растирают клетки Е col i co стекпяиным порошком, разбавляют полученную массу двукратным объемом буфера (0,1 М трис-НС8; рН 7,8) 0,05 М

MgCE ), вносят 0,01 мг/мл раствора дизоксирибонуклеезы, центрифугируют

20 мин при 10000 об/мин. Надосадочную жидкость подвергают ультрацентрифугированию при 100000д в течение

1 ч. Экстрат замораживают и хранят при -20 С.

Синтез рибонуклесэид-5-монофосфатов.

1 .Реакционная смесь содержит, М

5 ° 10. актрис-HCO p) 7,8) 1,2 10 MgCQ 1$

0,6 10 > С или Н вЂ” основание

3 10 9 5-фосфорибозил-1-пирофосфат и 0,15 мл экстракта на 1 мл смеси.

Время инкубации при 37 С 10 мин при фосфорибозилировании аденина и гуа- Я нина или 30 мин.при фосфорибозилировании урацила, 5-фторурацила и цитозина. Инкубацию прекращают, помещая смесь в кипящую водяную баню на

2-3 мин. Образовавшийся осадок уда- 25 ляют, конечный продукт выделяют при помощи препаративной бумажной хромоioãðàôèè после концентрирования при

35О С смесь наносят на бумагу % 3/100Е иа 1 см стартовой линии) и хроматографируют в системе иэомаслян ая кислота вода и концентрированная гидроокись аммония (66:33:5) нисходящим способом в течение 20 ч. Хромо4 тограммы. сушат и повторно подвергают нисходящей хромотографии в системе Н -бутанол,ацетон, уксусная кислота 5%-ный раствор гидроокиси аммония и вода (9i3s2s2r4) в течение 15 ч.

Зоны нуклеозид-5-монофосфатов вырезают и элюируют водой.

С целью получения продукта в виде амониевой соли элюат обрабатЫвают катиОнитом Дауэкс 50 (Н+), смолу отфильтровывают, фильтрат нейтрализуют

5%-ным раствором гидроокиси аммония °

В случае необходимости раствор концентрируют, замораживают и хранят при -20ОС °

ПодвижнОсти полученных препаратов на бумажных.хроматографах, а также основные. характеристики. уФ-спектров соответствуют величинам, характерным для стандартных соединений.

Способ получения рибонуклеозид5-монофосфатов, меченых изотопами

С"4 или Н, вэаьжодействием соответствующих меченых оснований и 5-фос» форибозил-Ьпирофосфата под действием ферментативного катализатора при 3540 С и рН 7,8 в присутствии 0,05 М трис-.НСВ и 0,01 М MgCE с последующим выделением целевого продукта, отличающийся тем, что, с целью упрощения процесса, в качестве катализатора применяют Ферменты

Escherichia coE 1 AB 259H tr 3000,