Способ извлечения белковых веществ из растворов

 

(11) 53363l

ОПИСАНИЕ

ИЗОБРЕТЕНИЯ

Союз Советских

Социалистических

Республик

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

6! б г (61) Дополнительное к авт. свид-ву— (22) Заявлено 22.10.75 (21) 2184892/13 с присоединением заявки М— (23) Приоритет— (43) Опубликовано 30.10.76. Бюллетень М 40 (45) Дата опубликования описания 19.11.7G 51).Ч.К1:Р С 12 D 13/06

С 07 G 7i 028

Государственный комитет

Совета Министров СССР (53) УДК 637.127.3 (088.8) ло делам изобретений и открытий (72) Авторы изобретения В. И. Лозинский, Б. И. Заславский, Ю. А. Давидович и С. В. Рогожин (71) Заявитель Ордена Ленина институт элементоорганических соединений

AH СССР (54) СПОСОБ ИЗВЛЕЧЕНИЯ

БЕЛКОВЫХ ВЕ1ЦЕСТВ ИЗ РАСТВОРОВ

Изобретение относится к микробиологической промышленности, точнее к способам извлечения белковых веществ из биологических источников, их экстрактов, гомогенатов и из белковых растворов.

Известны различные способы извлечения и очистки белковых веществ из экстрактов и гомогенатов биологических источников. Так, известен способ иммобилизации ферментов, заключающийся в том, что белок физически адсорбируется на нерастворимом в воде носителе и таким образом переходит в нерастворимую форму. (1) Физическая адсорбция при ттомощи сил Ван-дер-Ваальса (напрпмер, па активированном угле) или при помощи сил

Кулона (на ионообменниках) относится к старейшим методам иммобилизации.

Для выделения индивидуальных белков и их фракций в ряде случаев используют об ратимую иммобилизацию белка или белков определенного класса на нерастворимом носителе. (2), (3). Преимущество этого пути состоит в том, что при его реализации испо Ib зуются .не физические свойства бел ков, зависящие от их индивидуальных особенностей и от .природы сопровождающих примесей, а наличие в белках определенных функциональных групп, характерных для химических соединений белковой природы. В частности к таким группам относятся сульфгидрпльныс

SH-группы.

Наиболее близким аналогом является способ разделения белков со свободными сульф5 гидрильными группами от белков, у которых такие группы отсутствуют, путем иммобилизации содержащих SH-группы белков на ртуть-органическом носителе на основе полисахаридной матрицы. (4)

При введении раствора белков в контакт с этим носителем содержащие сульфгпдрпльные группы иммобилизуются на носителе в результате образования ртуть-меркаптпдных связей, после чего носитель с пммобилизовап15 ными белками промывают буферными и водносолевыми растворами для удаления непммобилизовавшихся веществ, а затем обрабатывают носитель раствором цистеина, восстанавливающего ртуть-меркаптидные связи, для деиммобилизации белков.

Недостатками указанного способа являются извлечение лишь белков, содержащих свооодные сульфгидрильные группы. относительное количество которых B суммарных белковых веществах источника может быть мало; расщепление под действием цистеина не только ртуть-меркаптидных связей, но и связей ртуть-носитель, в результате чего элюируемый с носителя белок содержит примеси

30 ртуть-органических соединений, обладающих

3 высокой токсичностью. Кроме того, в зависимости от источника извлекаемых белков в исход 1о» растворе может содержаться раз,«Н h«oå количество низкомолекулярных тиолсо держащих соединений.

Цель1о предлагаемого изобретения является разработка такого способа извлечения суммарнь1х белковых веществ из биологических источников, их экстрактов, гомогенатоз и нз белковых растворов, который не содержа.l бы указанных Bbllllc недостат! ов, Нс заВ!1 се;1 Оы от HpHpo«bi IicTo 1:1 и ка бел ха и позволил бы извлекать белковые вещества с

ВЫСОКНМ ВЫХОДО I. !!оставленная цель достигается те», что перед и»мобилизацией в раствор белковых зсщ -стз вводят восстанавливающий дисульфидные связ i агент, например меркаптоэтанол, натрийборгидрид, дитиотрептол, цистеин и др., после чего удаляют избыток зосстанавли .Oþùåãо агента, а иммобилизацию белкоBbIx веществ осущестзляют на носителе, содержащем S — S связи. При этом промывку носителя можно проводить водносолевыми, органическими, водноорганическими растворител «ми.

В зависимости от выбора биологичес кого ,источника, а также для увеличения выхода белка целесообразно в раствор белковых веществ вводить агент, способствующий разворачивачию полипептидных цепей белковых веществ, например додецилсульфат натрия, мочевину, гуанидин-гидрохлорид и т. и.

Пример 1. Пекарские дрожжи заморажнзают з дистиллированной воде и дезинтегрируют в прессе Хьюза. Дезинтегратор оттаивают, суспензию центрифугируют при

5000 об/мин, супернатант отбирают и лиофи-. лизуют.

75 мг лиофилизованного супернатанта растворяют в 5 мл буферного раствора (0,1М трис/НС1, рН 8,0), содержание белковых веществ в растворе по данным биуретозой реакции составляет 30 3 мг. Раствор 15 мин продувают током аргона, добавляя для гашения пены 2 — 3 капли этанола, затем вносят

50 мкл 2-меркаптоэтанола и инкубируют смесь 30 мин. Добавляют еще 50 мкл 2-меркаптоэтанола и инкубируют еще 30 мин. 3атем раствор наносят на колонку (15X400 мм), заполненную «Сефадексом Г-25», уравновешенным буфером, и элюируют со скоростью

40 мл/час тем же буфером. Отбирают фракцию элюата, содержащую высокомолекулярные вещества. Содержание белковых веществ в этой фракции по данным биуретовой реакции составляет 24,6 мг. Фракцию помещают в сосуд с мешалкой и добавляют навеску носителя для дисульфидно-обменной козалентной хроматографии из расчета 1,5 мкМ S — Sгрупп носителя на 1 мг белка. Суспензию перемешивают 6 час при комнатной температуре. Твердую фазу отделяют центрифугированием в течение 10 мин при 3500 об/мин, про50 Предлагаемый способ извлечения суммарных белковых веществ согласно изобретению обеспечивает высокий выход белка, не приводит к загрязнению извлекаемых белков токсичными примесями и является универ55 сальным, т. е. не зависит от вида источника белковых веществ и от природы сопровождающих примесей. Схема способа проста, не требует разработки нового технологического оборудования, причем одна и та же технологическая схема практически без перестройки и переналадки может использоваться для извлечения белков из различных источников, что позволяет варьировать загрузку производственных мощностей при переработке се65 зонных видов сырья.

l0 !

2Ь

Зо

45 мывают буфером (ЗМ50 мл), дистиллированной водой (ЗУ50 мм), 50О/о-ным водным раствором этанола (50 л1л), дистиллированной водой (Зх50 мл) и буфером (Зх50 мл). Г! .oIIbIBHbIc воды отбрасывают, носите Bb дируют в 4 11л буфера, добавляют 0,2 мл 2меркаптоэтанола и перемешивают 6 час при комнатной температуре. Твердую фазу отделяют центрифугирозанием в течение 10 мин при 3500 об/мин, вновь суспендируют в 4 мл буфера, перемешивают 1 час и вновь отделяют твердую фазу. Объединенную жидкую фазу лиофилизуют. Выход белка составляет

45",о, Продукт характеризуется отсутствием цвета, вкуса и запаха, хорошо растворяется в воде.

Пример ". 70 мг сухого изолята океанского криля растворяют в 5 мл буфера (0,1М трис/НС1, 0,15 М додецилсуль1рата натрия, рН 7,5). Содержание белковых веществ в растворе по данным биуретовой реакции составляет 44,Т мг. Раствор подвергают обработке, описанной в примере 1, с тем отличием, что раствор деиммобилизованных белков, отдел енный от твердой фазы носителя, не подвергают сушке, а наносят на колонку (15X400 мл1), заполненную «Сефадексом

Г-25» и элоируют дистпллирован11ой водой.

Фракцию э 7IQBTB, содержащую высокомолеку lap;-Ible вещества, лиофилизуют, растворяютт в 10 мл 0,1 М СН СООН и со скоростью

10 мл/час пропускают через колонку, заполненную анионообменной смолой «Дауэкс

2xI0» (200 — 400 меш., OAc-форма), для освобождения раствора от примеси додецилсульфата натрия. Злюат лиофилизуют. Вес белкового изолята составляет 40,2 мг, что соответствует выходу белка 91,3%.

Пример 3. 75 мг лиофилизованного супернатанта дезинтеграта пекарских дрожжей растворяют в 5 мл буферного раствора (0,1М трисЯС!, 0,15 моль/л додецилсульфата натрия, рН 8,0). Содержание белковых веществ в растворе по данным биуретовой реакции составляет 30,3 мг. Раствор подвергают обработке, описанной в примере 2. Выход белка составляет 78 О/о.

533631

Формула изобретения

Составитель М. Ларина

Текред В. Рыбакова

Редактор E. Дайч

Корректор И. Симкина

Заказ 954/1468 Изд, № 1731 Тира>к 575 Подписное

ЦНИИП11 Государственного комитета Совета Министров СССР по делам изобретений и открытий

Москва,, К-35, Раушска, наб., д. 4/5

Тип. Харьк. фил. пред. «Патент».

1. Способ извлечения белковых веществ из растворов путем иммобилизаци на нерастворимом носителе с последующей промывкой носителя и удалением белковых веществ с него, отличающийся тем, что, с целью увеличения выхода белковых веществ перед иммооилизацией в раствор белковых веществ вводят восстанавливающий дисульфидные связи агент, например меркаптоэтанол, после чего удаляют избыток восстанавливающего агента, а иммобилизацию белковых веществ осуществляют на носителе, содержащем S — S связи.

2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что прои:вку носителя ведут водно-солевыми и/пли органическими и/или водно-органическими растворителями.

3. Способ по п. 1, отличающийся тем, что в раствор белковых веществ вводят агент, способствующий разворачиванию полипептпдных цепей белковых веществ, например додецилсульфат натрия.

10 Источники информации, принятые во внимание при экспертизе: (1). Способы получения пммобплпзовапных ферментов п пх применение в пищевой промышленности, ЦНИИТЭИПищепром, М., 1973. (2) Biochem, J. 133/3/, 573 — 584, 1973 г.