Способ очистки вируссодержащей суспензии

 

ОП ИСАНИЕ

ИЗОБРЕТЕН ИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

Союз Советских

Социалистических

Республик (11) 543674 (61) Дополнительное к авт. свид-ву (22) Заявлено 28.03.74 (21) 2009475/15 с присоединением заявки №вЂ” (23) Приоритет (43) Опубликовано 25.01.77. Бюллетень № 3 (46) Дата опубликования описания18.05.77 (51) М. Кл. С12К 7/00

Государственный комитет

Соната Министров СССР оо делам изоорвтеннй и открытий (53) УДК 616.988.43 (088.8) (72) Авторы изобретения Н. А. Улупов, А. И. Дудников, П. А. Гембицкий и Д. С. Жук

Всесоюзный научно — исследовательский ящурный институт (71) Заявитель (54) СПОСОБ ОЧИСТКИ ВИРУССОДЕРЖАЩЕЙ СУСПЕНЗИИ

Изобретение относится к очистке биологических смесей, в частности к способам очистки вируссодержащих суспензий от белластных белков и жиров.

Известные способы очистки подразделяются на три группы: физические, химические и физико-химические. Для очистки, например, вируса ящура широко используются физико-химические методы, в частности хлорированные и фторированные углеводороды и двухфазные системы полимеров (1) .

Однако эти методы имеют низкую производительность, сложны в исполнении и не обеспечивают необходимой степени очистки вируса при использовании больших объемов вируса в производственных условиях.

Известен также промышленный способ очистки вируссодержащей суспензии, например, вируса ящура, с помощью хлороформа (2).

Сущность этого способа состоит в следующем.

Готовят 10 ную вирус содержащую суспензию из тушек 2-3-дневных крольчат. После размола и экстрагирования в суспензию добавляют S хлороформа, который тщательно эмульгируют в суспензии с помощью коллоидных мелыгиц. Затем хлороформ и денатурированные белки удаляют сспарированием или центрифугированием.

Однако очистка лапинизиров;шпого вирус» ящура с помощью хлороформа в производствснных условиях не позволяет получать суспензию с содержанием белка ниже 150 мг.%,при этом несмо)ря на многократное сепарирование очищенная, суспензия имел высокую мутность.

Кроме того. хлороформ является легко ucIp паряющейся жидкостью, а его пары являются вредными для человека.

Целью изобретения является повышение качества очистки при использовании больших объемов вируса.

Это достигается тем, что в известном спосоое очистки вируссодержащей суспензии, например, вируса ящура, включающем операцию обработки суспензии вируса химическими реагентами, в качестве химического реагента используют полиэтиленимин в виде 5-10 .-ного раствора, рН 7,4 — 7,8, который добавляют в вируссодержа:цую суспензию при постоянном перемешивании до конечной концентрации

0,025 — 0,1% с последующим центрифугированием или сег.арированием суспензии.

543674

При этом полиэтиленимин используют с мол.в, равным 10000-70000.

Полиэтиленимин, как катионный полиэлектролит,преципитирует белки в нейтральной и щелочной средах вследствие изменения их эффективных зарядов и электрокинетического равновесия в растворе.

Для достижения этого эффекта необходимо создать определенную концентрацию полиэтиленимина, зависящую от количества белка в суспензии. Такой способ очистки не требует специального оборудования, которое играет решающую роль при очистке вируссодержащей суспензии хлороформом, Флоккулированные полиэтиленимином белки и жиры осаждаются низкоскоростным центрифугированием или сепарированием. В противоположность очищенной хлороформом суспензия, очищенная полиэтиленимином, не имеет мутности.

Полиэтиленимин может быть использован для очистки вирусов, чувствительных к растворителям жиров, Выбор молекулярного веса полиэтиленимина в пределах 10000 - 70000 обусловлен тем, что флоккулирующая активность полиэтиленимина возрастает с увеличением молекулярного веса, однако и стоимость полиэтиленимина также увеличивается с увеличением молекулярного веса.

Способ осуществляют следующим образом, Для очистки вируса ящура раствор полиэтиленимина с мол.в. 10000-70000 разбавляют дистиллированной водой и 5 н. раствором соляной кислоты до концентрации 5 - 10% и рН 7,4 - 7,8. Раствор полиэтиленимина, выпускаемый химической промышпенностью и разбавленный для очистки вируса, хранят в стеклянной или полиэтиленовой таре при

2-10 С. Суспензию лапинизированного вируса ящура готовят путем измельчения (размола) тушек или цельных неразделанных крольчат в смеси с фосфатным буферным раствором или буферным физиологическим раствором хлористого натрия в отношении 1:10. При непрерьвном перемешивании суспензии в нее добавляют раствор полиэтиленимина до концентрации 0,025 - 0,1%. Затем для удаления флоккулята вируссодержащую суспензию центрифугируют при 1500-3000 об/мин в течение 20-10 мин или сепарируют.

Количество белка в очищенной суспензии определяют на спектрофотометре при длине волны

280 нм с использованием калибровочной кривой, построенной на растворимые белки ткани крольчат.

В данном случае метод Лоури не применим в связи

5 с тем, что полиэтиленимин образует с ионами меди комплексное соединение синего цвета.

10 ная суспензия вируссодержащей ткани крольчат содержит в среднем 1000 — 1200 мг.% белка, в том числе 380 — 420 мг% растворимых белков.

Результаты очистки 10%-ной суспензии лапинизированного вируса ящура полиэтиленимином приведены в табл,1. Приведенные в таблице данные показьвают, что очищенная полиэтиленимином суспензия содержит 117 - 55 mfa белка. !

Увеличение концентрации полиэтиленимина в два или три раза не сопровождается пропорциональным снижением количества белка.

Инфекционность суспензий лапинизированного вируса до и после очистки полиэтиленимином определяют заражением мышат- сосунов десятикратными разведениями суспензии. Результаты опытов приведены в табл, 2.

Данные табл,2 показывают, что очистка суспензии сопровождается незначительным снижением ее инфекционности, Величина молекулярного веса полиэтиленимина в этом снижении роли не играет, как не играет роли и модификация полиэтиленимина.

Снижение инфекционности связано с ионной силой раствора.

Иммуногенность противоящурных вакцин из лапинизированного вируса, очищенного полиэтиленимином, определяют на взрослых белых мышах

35 по 50%-ной защитной дозе (ИмД ). Результаты опытов приведены в табл,3.

Данные табл,3 свидетельствуют что очистка лапинизированного вируса ящура полиэтиленимином позволяет получать высокоиммуногенную вак40 цину. Причем иммунизирующая доза на фосфатном буферном растворе равна 0,04 - 0,32 мл. Большая разница в иммуногенности вакцин обусловлена тем, что при очистке суспензии вируса используют полиэтиленимин, нефракционированный или содержащий

45 инициаторы полимеризации. Иммунизируюшая доза аналогичной вакцины при очистке вируса хлороформом равна 0,50 - 0,12 мл.

543674

Таблица 3

1. Способ очистки вируссодержащей суспензии, :апример, вируса ящура, включающий обработку успензии вируса химическими реагентами, о т л и а ю шийся тем, что, с целью повышения качеста очистки при использовании больших объемов ,ируса, в качестве химического реагента испольуют полиэтиленимин в виде 5-10 -ного раствора, Н 7,4 — 7,8, который добавляют в вируссодержацую суспензию при постоянном перемешивании до

:онечной концентрации 0,025 - 0,1% с послеующим центрифугированием или сепарированием успензии.

Составитель д. длексеенок

Техред О . Лугорая Корректор И. Гоксич редактор Д. Пинчук

Тираж 578 Подписное

ЦНИИПИ Государственного комитета Совета Министров ГССР ло делам изобретений и открыл ий

113035, Москва, Ж вЂ” 35, Раушская наб., д. 4, 5

Заказ 6125/53

Филиал ППП Патент", r. Ужгород, ул. Проектная. 4

Формула изобретения

2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что полиэтиленимин используют с мол. в. 10000-70000.

Источники информации, принятые во внимание при экспертизе;

1. "Временное наставление по изготовлению и контролю противоящурной вакцины А, з", утверж35 денное Главветупром MCX СССР, 23.03.197 1 (прототип) .

2. Гринин А. С., Титов И. Н. "Очистка, концентрирование и фракционирование вирусов животных", М., "Колос", 1971.