Способ диагностики кислородной недостаточности

 

ОПИСАНИЕ

ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

<п1 545335

Союа Советских

Социалистических

Республик (61) Дополнительное к авт. свид-ву (22) Заявлено 24.05.74 (21) 2028503, 13 с присоединением заявки Ме (23) Приоритет

Опубликовано 05.02.77. Бюллетень Ле 5

Дата опубликования описания 03.03.77 (54) М. Кл. - А 61В 10/00

G 01М 33/16

Государственный комитет

Сова1а Министров СССР оо делам изобретений и открытий (53) УДК 616.014.464 (088.8) (72) Авторы изобретения (71) Заявитель

Д. Г. Крыжановский и Е. Л. Эркес

Днепропетровский ордена Трудового Красного Знамени медицинский институт (54) СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ КИСЛОРОДНОИ

НЕДОСТАТОЧНОСТИ

Изобретение относится к биохимии и может быть использовано в клинической практике.

Известен способ определения гипоксических состояний в реанимации, который заключается в том, что о степени гипоксии судят по изоферментам лактатдегидрогеназы (1).

Однако известным способом не всегда возможно выявить начальные стадии кислородной недостаточности.

Целью изобретения является выявление начальных стадий кислородной недостаточности.

Эта цель достигается тем, что определяют в эритроцитах с помощью электрофореза дополнительную анодную фракцию изофермента лактатдсгпдрогеназы, расположенную между лактатдегидрогеназой — 2 (ЛДГ2) и лактатдегидрогеназой — 3 (ЛДГ3), при содержании которой свыше 40/О от общей активности диагностируют раннюю стадию гипоксии.

Исследование проводят в камере для электрофореза с применением охлаждения при использовании агарового носителя и мединалвероналового буфера (рН 8,6, ионная сила

0,0б) с подбором оптимальных концентраций гемолизата эритроцитов, режима проведения электрофореза и условий проведения энзимрсакции.

Гемолизат эритроцитов получают из гепаринированпой крови, лишенной центрифугированисм плазмы, лейкоцитов и отмытых трижды охлажденным гепаринизированным физиологическим раствором (5 F гепарина на 1 мл раствора) разведением дважды дистиллированной водой (1: 10) с последующим центри5 фугированпем (20 мин при 3000 об/мин) для осаждения стромы. Такое разведение обеспечивает достаточное количество белка-фермента для проведения электрофореза. Гемолизаты, полученные разведением 1: 3, 1: 5, дают

10 после окраски фореграмм более интенсивные, но мспсе четкие границы раздела фракций.

Более разведенные гемолпты не обеспечивают выявленпч катодных фракций, содержание которых в эрптроцптах низкое.

15 Агаровьш гель готовят из вымороженных сортов агара (10 г) после предварительной очистки путем промывания вначале водопроводной водой (5 дней), затем воду сливают, заливают дистиллированной водой (500 мл) и 0 агар расплавляют, поместив колбу в водяную баню. Расплавленный агар в теплом виде фильтруют через ватно-марлевый фильтр, цснтрпфугируют прп 3000 об/мин до полного застывания. Нижний сегмент, содержащий

25 загрязненные гсп1ества, отбрасывают. Измельченные (1Р,1 см) кубики агара отмывают дистиллированной ":îäîé 3 — 5 дней. Воду меняют ежедневно. После чего агар повторно расплавляют, цснтрпфугируют и осадок вновь

30 отбрасывают. Агар сохраняют в холодильни545335

Формула изобретения

Составитель С. Малютина

Техред Б. Рыбакова

Корректор Л. Орлова

Редактор Л. Гончарова

Заказ 242/3 Изд. № 407 Тираж 654 Подписное

ЦНИИПИ Государственного комитета Совета Министров СССР по делам изобретений н открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Типография, пр. Сапунова, 2 ке. Перед опытом агар расплавляют на водяной бане и смешивают с равным объемом мединал-вероналового буфера (рН 8,6). После смешения буфера и агара концентрация агара

1%, ионная сила 0,06.

Перед электрофорезом теплый раствор агарового геля наносят на 9 предметных стекол (26;к,76 мм), чтобы образовался слой геля толщиной 2 мм.

Разделение изоферментов продолжается 3—

3,5 ч при температуре Π— 2 С, сила тока 55—

60 мА, напряжение 90 В.

После окончания электрофореза предметные стекла (9) со слоем агара переносят в кювету из органического стекла и поверх агарового носителя наливают приготовленную непосредственно перед инкубацией смесь.

Состав инкубационной смеси: лактат натрия (0,2 M раствор 3,5 мл, рН 7,0); никотинамидадениндиноклеотид (НАД) (25 мг в

2 мл воды); нитросиний тетразолит (15 мг на

2 мл воды); цианистый натрий или цианистый калий (3 мл 0,05 М раствор в фосфатном буфере, рН 7,4); феназинметасульфат (2 мг на

2 мл воды); фосфатный буфер, рН 7,4 (50 мл), инкубация в этой смеси продолжается 120—

140 мин при 37 С. После инкубации субстратную смесь сливают и электрофореграммы несколько раз промывают дистиллированной водой, фиксируют 2 ч в смеси: уксусная кислота; этиловый спирт; вода (5: 70: 25). Затем предметные стекла с агаровым гелем осторожно извлекают и агаровым слоем вниз кладут на тройной слой хроматографической бумаги.

Через 12 — 16 ч из агарового геля образуется сухая пленка, плотно прилегающая к предметному стеклу.

Активность изоферментов оценивают после денситометрии, либо фотометрии и расчета относительной активности в процентах.

Наблюдениями группы больных в 27 человек с поражением бронхо-легочного аппарата в возрасте от 25 до 40 лет и контрольной группы в 25 человек в возрасте от 17 до 40 лет установлено, что использование предлагаемого способа диагностики выявило у клинически здоровых лиц в возрасте от 17 до 40 лет дополнительную фракцию лактатдегидрогеназы (ЛДГ) в количестве 3,30+-0,33% от всей ак10 тивности ЛДГ эритроцитов (P 0,001).

У больных уже в начальных стадиях кислородной недостаточности увеличение этой фракции достигает более 100 — 120%.

Таким образом, увеличение содержания до15 полнительной анодной фракции изофермента

ЛДГ, расположенной между ЛДГz и ЛДГ3, позволяет судить о гипоксии в клинически скрытых формах дыхательной недостаточности.

Способ диагностики кислородной недостаточности, заключающийся в определении ак25 тивности гликолитических ферментов, отл ич а ю щи и с я тем, что, с целью выявления начальных стадий кислородной недостаточности, определяют в эритроцитах с помощью электрофореза дополнительную анодную фракцию

30 изофермента лактатдегидрогеназы, расположенную между лактатдегидрогеназой — 2 и лактатдегидрогеназой — 3, при содержании которой свыше 4% от общей активности диагностируют раннюю стадию гипоксии.

35 Источник информации, принятый во внимание при экспертизе:

1. Маркелов И. М. «Оценка активности изоферментов в аспекте современных проблем реанимации. Афтореферат докторской диссер40 тации, Л., 1971, 3.