Способ получения комплекса протеолитических ферментов

 

о и и с-,к -й--зт-E

ИЗОБРЕТЕНИЯ 10 546648

Союз Советских

Социалистических

Республик

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (61) Дополнительное к авт. свид-ву (22) Заявлено 30.07.75 (21) 2173552/13 с присоединением заявки № (23) Приоритет

Опубликовано 15.02.77. Бюллетень ¹ 6

Дата опубликования описания 20.04.77 (51) Л1. Кл.- С 12D 13/10

Государственный комитет

Совета Министров СССР па делам изобретений (53) УДК 577.15.08 (088.8) и открытий (72) Авторы изобретения

Л. А. Елякова и Э. П. Козловская (71) Заявитель

Тихоокеанский институт биоорганической химии

Дальневосточного научного центра АН СССР (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ

КОМПЛЕКСА ПРОТЕОЛИТИЧЕСКИХ ФЕРМЕНТОВ

Изобретение относится к ферментной промышленности.

Ближайшим техническим решением по своей сущности и достигаемому положительному эффекту является способ получения комплекса протеолитических ферментов, включа|ощий гомогенизацию исходного сырья — гепатопанкреас криветок, осаждение комплекса ферментов сульфатом аммония и его выделение, например, путем гельфильтрации и ионообменной хроматографии, центрифугирования осадка с последующим диализом и высушиванием (1).

Однако в известном способе получают комплекс ферментов, состоящий из трех ферментов карбоксипептидаз A и Б, а также трипсиноподобного фермента.

Цель изобретения — увеличение количества ферментов, входящих в комплекс и обладающих широким спектром действия на белок н белоксодержащие биополимеры, расширение сырьевой базы и утилизация промышленных отходов.

Для этого в предложенном способе в качестве исходного сырья используют гепатопанкреас промысловых видов крабов Paralithoides

camtchatica илн Paralithoides platypus, нли Paralithoides brevipes, или Chiorioecets opilio, или

Telmessus cheiraqonus, или Erimacrus beckii, гомогеннзнруют данное сырье в водном растворе при соотношении ткань: вода, равном

l: 3, гомогенат отстаивают и полученную прн этом жидкую фазу очищают от примесей пу5 тем введения сульфата аммония до насыщения 0,3, отделения полученного прн этом осадка и фильтрации жидкой фазы, после чего осаждают комплекс ферментов нз очшценного раствора прп его насыщении сульфатом

10 аммония до 0,8.

Предложенный способ заключается в следующем.

Гепатопанкреас промысловых видов крабов, таких как Par alithoides camtchatica, Paralitho15 ides platypus, Paralithoides brevipes, Chionoecets opilio, Telmessus cheiraqonus, Епп1асги

becl

Все операции осуществляют прн 4—

10 С. Комплекс ферментов, полученный по

546648

Формула !!зоор: т: !!un

Составитель П. Бонарцев

Корректор О. Тюрина

Техред Е, Жаворонкова

Редактор T. Девятко

Бекаа 441 20 Иас(. ¹ 191 Тира>к >39 Поди>!свое

Ц(11(1((ТИ Гост.!>)рств! иного ко;; !Тот:! >...> >е> а .>!аниса,:ов С>..Г1 ио делам Il. e>ái)ere!!iii! и открь)!.и(!!! "93о, Моск );i, )>(-35 Ра!) гн)кая iia>>.. д 4 Б

Тииографiiÿ, нр. Cаиуиова, д. 2 сп()со(>т, г,)дс:)/кип 1:::! 1.:",и, (;Iрооксии(и гидазы Л Il Б, леицинямиио!Гсптидязу, щслочные и нейтрал !laic upOTeasü!. l ! 1 KI Гепятопанкрсас крабов полу!3!OT 20 г лиоф)(льного порои)л(а комплекса фермен гов.

П р и м с р. 300 г гсиатоияикрсяс iq)3,)3

Р I a I i!1!Oi(.Cs cai!Htscill1(ica lta. Jc I I> 1310 i Ilpu

1000 оо/м(гн в гомогсиизаторе B течение 5 мин !!р соогиoи!Сипи TK;i!!I: вода, равном 1: 3.

I 0li0! снят 0ТсТ3!! 133 ю г в тсченис () I, затем ири иерем uliIBB!Ill!I,10()BEjляют Ilo частям тв рдый сул фат аммония до насыщения 0,3, 158,42(> г. 110C, le добав Iculi)1 и0следней порции суг!ьсрятя аммсиия гомогеияг оставляют стоять в течение 4 ч при 4 С. Осадок о(дел IIOT цеитрисругированием при 20000 об/

/м!ип в течение 1 ч. Полученную жидкую фазу фильтруют через слой ваты для удаления неряс-.Hop«J!!E!K липидов. К 825 мл прозрачного раствора добавляют по частям твердый сульфат аммония до насыщения 0,8, т. е. 270 г.

Гомогенат отстаивают в тсчсиис 10 «4"С и цситрифугируют. Полученный oca )OK растворяют в минималь)!ом количестве дисти1лироваииой воды (200 мл) и далее диализуют через целлофан в течение 1 сут, причем по

lIcTeчении первых 3 ч от начала диялиза проводят перемешивание на магнитной мешалке.

Вначале периодически ка)кдый чяс используют нову(о порцию дистиллированной воды.

Отд). ализованиый раствор лиофильно высуиц>вя !1)т. Bbix0д препарата по активности

68,5",). Специфическая удельная активность, выра)ксниая в ед мг, равна 102,5, гд за единицу активности принято количество ферментиого препарата, освобождающее 1 микромо1ь аминокислоты в минуту (калибровочная Kривая построена по тирозину).

1. CnOCOO Ilo;ll Heиия KolI IICICKC3 «ро С0;IHT!1ческих ферментов, включающий гомогенизацию исходного сырья, осаждение комплекса ферментов сульфатом аммония и его выделение, отличающийся тем, что, с целью увел, кения количсства ферментов, входящих в комп.текс, расширения сырьевой оазы и у u((j . (изяции промывl. 1с1!пь1х От ч)дов, в кя Ствс

IIcx01IIo! о сырья используют геilriòо )аикреас

ii p0. ыс, Oil I>I. (видов яр Я бо» 1 3 ra 1 ithoi 0c :> !!i! сl!Btica, или Par ilithoides platypus, i!;»l Paralitli01de l)г Yipes, liëè Chioilocccts oplllo, llë:!

Teln1essus cheiraqoJuis, или Erimacrtis Ьсс1(!!. ири этом гомоге(! зацию сырья осуи(ествляют в водном растворе при соотнои:сниц ткань:

: водя, равном 1:3, после «е о гомогснат отстаивают и полученную при этом жидкую фа2(! зу очищают от примесей, à oca)кдение комплекса ферментов сульфатом ам 10HIIH осуществляют из очищенного раствора.

2. Способ fio и. 1, QT.ëii÷àiîùийся тем, то î lllcTKy я;идкой фазы от примесей осуществляют IJ), >ем введения сульфата аммония 10 насыщения 0,3, отделеHHH иолу IcHHoi о 1!pli этом осадка it ф! льтрации жидкой фазы.

3. Способ по п. 1, отл и чающий с я тем, что осяж1а!от комплекс ферментов из очищен3(E ного раствора lip!1 насыщении сго сульфатом ям JOJII!H до 0,8.

Источники информа!(ии, иринятыс Но вииман,lе при эксчepòèaе

35 1. GJ! tes В. I яп(1 Travis 1 Piirification Bnd

Сllaracterization of СягЬохуpeptirlases Л and

В 1гоп1 и 11)с )white Shrimp Pcnqeus setiferus В!0011еп1Ыгу», 1973, 1 г, ¹ 10, 1867 — 1874.