Способ получения антибиотиков

 

«111 552907

ОПИСАНИЕ

ИЗОЬЕИТИНИЯ

Союз Советских

Социалистических

Респубттик

Н ПАТЕНТУ (61) Дополнительный к патенту (22) Заявлено 15.04.75 (21) 2137352/15 (23) Приоритет — (32) 16.04.74 (31) 461298 (33) США

Опубликовано 30.03.77. Бюллетень № 12

Дата опубликования описания 24.06.77 (51) М. Кл е С 12D 9/14

А 61К 35/70

Гасударственный комитет

Совета Мииистров СССР оо делам иэооретеиий и открытий (53) УДК 615.779.9 (088.8) (72) Авторы изобретения

Иностранцы

Вальтер Даниель Селмер, Вальтер Патрик Каллен и Джон Бродерик Раутии (США) Чарльз Эдвард Моппетт (Великобр!итания) Риичиро Сибакава и Дзюнсюке Тоне (Япония) (71) Заявитель

Иностранная фирма

«Пфайзер ИНК» (США) (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АНТИБИОТИКОВ

Изобретение относится к способам получения антибиотиков, в особенности синергической смеси антибиотиков, образуемой при культивировании микроорганизмов-продуцентов их.

Известны способы получения различных антибиотиков путем культивирования определенных микроорганизмов-продуцентов, например, вида Actinoplanes sp. 1ЧКК1 3884 (1), Антибиотики, получаемые по известному способу, обладают, в, частности, способностью ускорять рост животных и антимикробной активностью против ряда патогенных микроорганизмов.

Предлагаемый способ получения антибиотиков в литературе не описан. Согласно ему при производстве антибиотиков используют культуру штамма Actinoplanes auranticolor

АТСС 31011, которую выращивают в жидкой питательной среде, содержащей усвояемые источники углерода и азота, в аэробных условиях до достижения значительной антибиотической активности с последующим выделением из среды выращивания смеси антибиотиков или отдельных ее соединений.

Смесь антибиотиков содержит макроциклические лактоны и депсипептиды и может быть

5 выделена и рекуперирована из ферментационного бульона с помощью экстракции растворителем, противоточного распределения, колоночной хроматографии или комбинации этих способов.

10 Индивидуальные компоненты антибиотиков обладают существенной бактерицидной активностью. Сырая смесь антибиотиков или комбинация чистого макроциклического лактона и чистого депсипептида, полученного из сырой

15 смеси, показывает значительную синергетическую бактерицидную активность. Сырая смесь антибиотиков, чистые индивидуальные компоненты и смеси чистых макроциклических лактонов и депсипептидов являются эф20 фективными агентами стимулирования роста цыплят и свиней, а также активными терапевтическими средствами для лечения дизентерии у свиней, И2907

Микроорганизм, используемый для получения антибиотика согласно данному изобретению, выделен из образца почвы в Египте.

Для выращивания применяли картофельноморковный агар-агар и установили, что он принадлежит к классу актиномицетов, дающих спорангий, подобный спорангию вида

Actinoplanes. Поэтому для роста его применяли различные среды, использующиеся при выращивании этих видов. Суспензии культуры готовили путем дробления кусков культуры, снятой с пластинок с агар-агаром, и вели выращивание в небольших пробирках сдобавлением стерильной дистиллированной воды и доведением объема культуры до 5 мл.

Затем эти суспензии выращивали в пробирках, на пластинках или в чашках Петри на различных средах. Температура инкубации составляла 28 С. Результаты оценивались через

14 — 22 дней. Эта новая культура (Пфизер

F.D. 24090) была доставлена в Американскую

Коллекцию типов культур в Роквилле, Мэриленд, 11 марта 1974 г. и получила название

Actinoplanes auranticolor АТСС 31011.

Использовали следующие среды для идентификации кульгуры:

1) 2 /О -ный агар-агар на водопроводной воде;

2) картофельно-морковный агар-агар по

M. П. Лешевалье (1968 г.);

3) сахарозный агар-агар Чапека по Уоксмен (1961 r.);

4) глюкозно-аспарагиновый агар-агар по

У о к с м ен (1961 г. );

5) агар-агар с экстрактом дрожжей и солодом;

6) агар-агар Хики и Треснера;

7) картофельно-глюкозный агар-агар;

8) крахмальный агар-агар;

9) желатина;

10) тирозиновый агар-агар;

11) железо-пептоновый агар-агар Дифко;

12) снятое молоко Дифко;

13) декстрозно-нитратный бульон;

14) бульон на основе органического соединения и нитрата;

15) среда АТСС 172, американский Каталог типов культур;

16) с применением углерода.

Признаки, характеризующие данную культуру.

Рост на среде, содержащей агар-агар на водопроводной воде, слабый, колонии тонкие, плоские, примерно 9D2 (очень слабо-розовые); воздушный мицелий отсутствует, субстрат мицелия от бесцветного до 9D2, растворимый пигмент отсутствует.

Сахарозный агар-агар Чапека. Рост от умеренного до хорошего, колонии плоские, примерно 9G6 (светло-оранжевые); воздушный мицелий отсутствует; субстрат мицелия около

9G6; растворимый пигмент отсутствует.

Глюкозно-аспарагиновый агар-агар, Рост умеренный, колонии возвышающиеся, шероховатые, примерно 9G9 (светло-оранжевые); воздушный мицелий отсутствует, растворимый пигмеи r отсутствует.

Агар-агар с экстрактом дрожжей и солодом. Рост не наблюдается.

Агар-агар Хики и Треснера. Рост от умеренного до хорошего, колонии слегка возвышающиеся и шероховатые, примерно 9Г9 (мутно-оранжевые), слабый беловатый налет на поверхности, субстрат мицелия примерно

918, бледно-коричневый растворимый пигмент.

Картофельно-глюкозный агар-агар. Рост умеренный, колонии возвышающиеся, шероховатые, примерно 91 9 (светло-оранжевые), воздушный мицелий отсутствует, субстрат мицелия примерно 9L9, растворимый пигмент отсутствует.

Тирозиновый агар-агар. Рост от слабого до умеренного, колонии плоские, примерно

13А10 (мутный красновато-оран>кевый цвет) воздушный мицелий отсутствует, субстрат мицелия примерно 10D11, коричневый растворимый пигмент.

Желатина. Рост умеренный, колонии плоские, примерно 9К12 (красновато-оранжевые); следы беловатого налета, субстрат мицелия примерно 9К12, растворимый пигмент отсутствует.

Крахмальный агар-агар. Рост от умеренного до хорошего, колонии возвышающиеся, примерно 9К10 (оранжевые), слабый беловатый налет, субстрат мицелия примерно 9К10, светло-желтый растворимый пигмент.

Крахмал подвергается слабому гидролизу, степень о>ки>кения желатины высокая, нитраты не восстанавливаются до нитритов в любой среде, содер>кащей нитраты, даже за 22 дня (рост очень слабый в декстрозно-нитратном бульоне, но хороший в бульоне, содер>кащем органические вещества и нитрат).

Образование сероводорода незначительное.

В железо-пептоновом агар-агаре образование растворимого пигмента не наблюдается. В молоке не наблюдается каогуляции или гидролиза даже по истечении 22 дней. Тирозин не дегидрируется.

Рост в среде АТСС 172 наблюдается при температуре от 21 до 37 С, наилучший рост при температуре от 28 до 37 С, при температуре 45 С роста не наблюдается.

Арабиноза, фруктоза, маннит, раффиноза, рамноза, сахароза и ксилоза потребляются, инозит не потребляется. Ни на какой из сред не наблюдается запаха.

Спорангий образовывается лишь на картофельно-морковном агар-агаре. При этом образовывается палисадный слой, 5,5 — 11Х4,5—

8 мкм по ширине и 9 — 12 мкм по высоте. Колонии многочисленны, неправильные по форме и выбрасывают споры при постепенном размягчении. Спорангий на картофельно-морковном агар-агаре по прошествии трех недель инкубации выделяет споры за несколько часов при температуре около 21 С, если куски колоний погружают в небольшое количество

552907 раствора: 1 г глюкозы и 1 мл «Твина 80» в

1 л воды.

Споры образовывают цепочки неправильной формы в спорангии, но будучи освобожденными от спорангия, становятся субглобозными и имеют ширину от 1,6 мкм до эллиптической формы 1,6 — 2,2X1,1 — 1,6 мкм. Почти все они подвижны.

Культивирование А. auranticolor АТСС 31011 предпочтительно происходит в водной питательной среде при 26 — 36 С в погруженном аэробном состоянии при перемешивании, К числу питательных сред, пригодных для его выращивания относятся те, которые включают источник усвояемого углерода, такие как сахара, крахмал и меласса; источники органически связанного азота, такие, как казеин, продукт энзиматического расщепления казеина, соевая мука, мука из семян хлопчатника, мука из арахиса и глютен пшеницы. Источниками роста могут также являться отходы винокуренных заводов, рыбная мука и экстракт дрожжей, а также соли, такие, как хлористый натрий и карбонат кальция, и микроэлементы, например, железо, магний, цинк, кобальт и марганец. При черезмерном пенообразовании во время культивирования можно вводить в питательную среду антивспениватель, например растительные масла или силиконы.

Аэрация среды в резервуарах при выращивании культуры глубинным способом проводится предпочтительно со скоростью около

1,2 — 2,0 объема свободного воздуха на 1 объем бульона в минуту. Скорость перемешивания поддерживается при помощи мешалок, обычно употребляемых в бродильной промышленности.

Агент инокулирования для приготовления антибиотиков может быть получен путем использования культуры с пластинки на среде, например, АТСС 172, упоминавшейся выше.

Эта культура может быть использована для инокулирования либо содержимого колб, находящихся на встряхивателе, либо содержи»ого в резервуарах для инокулирования, или в резервуары могут быть внесены зародыши из колб, подвергавшихся встряхиванию.

В колбах на встряхивателе рост культуры обычно достигает своего максимума примерно через 4 дня, в то время как при инокулировании в резервуарах наиболее благоприятен период от 2 до 3 дней. Значительная антибиотическая активность достигается на конечной стадии ферментации примерно за 20 — 30 час.

Способ производства антибиотиков во время процесса ферментации обычно контролируется биологической проверкой бульона с применением чув. твительного штамма Staphylococcus aureus. При этом используется стандартный метод испытаний на пластинке, при котором зона ингибирования, окружающая кружок фильтровальной бумаги, насыщенной бульоном, принимается за меру антибиотической активности, После того, как антибиотическая активность сораживаемого бульона достигла желательного уровня, продукты выделяют либо из всего бульона, либо из профильтрованного бульона. В последнем случае

5 мицелий удаляют фильтрованием или центрифугированием. Можно использовать также метод тонкослойной хроматографии на силикагеле. Этот метод служит для анализа смеси антибиотиков, полученных в ферментационной

10 среде, и дает возможность установить состав сырых и очищенных материалов, выделенных экстракцией из сбраживавшихся бульонов.

Разделение компонентов смеси антибиотиков зависит от содержания антибиотиков в

15 системе. Слишком малая бактерицидная активность не дает возможности обнаружить те компоненты антибиотика, которые присутствуют в малых количествах; слишком высокая бактерицидная активность приводит к эффек20 ту сопротивления с вытекающим из этого неудовлетворительным разделением.

Система проявителей при тонкослойной хроматографии представляет собой смесь хлороформа с этанолом (9: 1). Тонкослойные

25 хроматограммы после проявления могут просматриваться в ультрафиолетовом свете при длине волны 254 ммк и 366 ммк. Биоавтографическое обнаружение бактерицидных компонентов может быть осуществлено путем налоЗО жения тонкослойной хроматограммы на агарагар с питательными веществами, в который внесены зародыши чувствительного штамма

SZ. aureus или другого чувствительного организма.

К числу главных компонентов смеси антибиотиков, выделяемой А, auranticolnr АТСС

31011, относится ряд макроциклических лактонов и депсипептидных антибиотических компонентов. Появление или непоявление или

4о процентный состав смеси этих антибиотиков меняется от ферментации к ферментации и является функцией впемени, величины рН, состава среды и т. д. При соблюдении условий, приведенных в помещаемых ниже примерах, 45 главными бактерицидными компонентами смеси антибиотиков являют я соединения № 37 277 (депсипептпд) и № 39 926 (макроциклический лактон), в то время как к числу антибиотических компонентов, присутствующих в незначительном количестве. относятся соединения № 37 932 (депсипептид) и

¹ 35 763 (макроциклический лактон).

Компоненты смеси антибиотиков могут быть разделены и выделены из ферментапион55 ного бульона при применении самых различных способов, включающих экстракцию растворителем, противоточное распределение по

Крэгу, колоночную хроматографию или комбинацию этих способов. Прп экстракции антибиотиков из бульона можно использовать различные органические растворители, такие как лороформэтплацетат и метилизобутилкетон.

Экстракцию растворителем предпочтительно проводят путем двукратной экстракции бульо55 на при величине рН 7 при помощи объема ра

552907 створителя равного - 1/3 — 1/2 объема бульона, из которого желательно выделить смесь антибиотиков.

Наиболее рекомендуемый метод выделения и рекуперации компонентов смеси антибиотиков заключается в следующем. В неосветленном или осветленном бульоне доводят рН до величины около 7 и экстрагируют его двумя порциями метилизобутилкетона, объем которых составляет примерно 1/3 до 1/2 объема экстрагируемого бульона.

Экстракг в растворителе концентрируют в вакууме, и концентрат обезжиривают путем экстракции его гептаном или петролейным эфиром. После этого обезжиренный экстракт в растворителе вызапивают досуха в вакууме.

Твердые вещества подвергают противоточному распределению по Крзгу (6 тапелок) с использованием толуола (5 ча стей), этанола (2 части) водного Фосфатного буферного раствора с рН 4,5 (3 части) . Разделившиеся слои обпазчют верхнюю и .нижнюю фазы системы ппотивоточного паспределения. После распределения слои анализируют методом тонкослойной хроматограФии. Разделенные фракции выпапивают досуха в вакууме.

Твердые вещества, содержащие депсипептиды, растворяют в хлороформе, обрабатывают активированным древе-;ым глем, фильтг>уют и выпаривают в вакууме. Остаток, полученный после выпаривания xлоpофоомa, растворяют в ацетоне. Твердые вещества, осадившиеся при прибавлении гептана, растворяют в небольшом количестве хлоооформа и вносят в колонку силикагеля, забуференного до пН6. изготовленную в присутствии хлопоАопма и н.-пропанола в соотношении 99: 1. Колонк проявляют той >ке истемой паствопителей под давлением 5600 Н/м . Отдельные уча тки колонки контролиоуют методом тонкослойной хроматографии. Фоакции. содер>кащие разделенные депсипептиды, объединяют, выпаоивают в вакууме, и содержимое их кристаллиз ют из апетона — гептана.

Фракиии, полученные противоточным м годом, содеожа.пие макпоциклические лактоны, объединяют. выпаоивают в вакъ ме. и тв идые вещества растворяют в этилачетате. Раствор перемешивают с силикагелем. Фи.л тотют. и растворитель удаляют в вакч ме. Остаток растворяют в этилапетате и производят осаждение гексаном. Твеодые вещества nacI.воряют в небольшом количестве хлопоФопмя и хроматограФируют под давлением 5600Н1м на колонке силикагеля, забуференной до рН

6,0 и изготовленной в присутствии этилапетата. Для проявления пользуются системой из этилацетата, тетоагидрофурана и гексана в соотношении 80: 20: 20. Участки колонки контролируют методом тон кослойной хроматографии. Фракции, содепжашие разделенные макропиклические лактоны, объединяют и выпаривают в вакууме. Отельные фракции обрабатывают дополн1 т".льиым противоточным распределением по Крэгу и/или колоночной

65 хроматографией с использованием различных систем проявителей. Тщательное контролирование каждой стадии очистки дает возможность выделить индивидуальные макроциклические лакгоны в достаточно чистом состоянии, так что фракции в растворителе могут быть выпарены досуха с получением чистых компонентов.

А. auranticolor ЛТСС 31011 образует по меньшей мере четыре депсипептида (из них главное соединение № 37 277 и побочное

М 37932) и четыре макроциклических лактона, (соединение № 36 926 — главное, № 35763 — побочное). Однако первичными компонентами являются депсипептиды.

Сырые смеси антибиотиков, получаемые непосредственно из бульона, и очищенные индивидуальные компоненты обладают широким спектром антибактериальных свойств. К числу организмов, не способных к размножению в присутствии антибиотиков, относятся:

Salmonella typhasa, Shigella dysenteriae, Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Staphylococcus aureus, Streptococcus pyogenes, Streptococcus faecalis, Diplococcus pneunoniae, Bacillus subtiiis, Corynebacterium diphtheriae, Clostridium septicum, Brucella abortus, Neisseria sicca, Lactobacillus acidophilus„Pasteurella

multocida.

Лнтибиотики, охватываемые настоящим изобретением, как в форме сырой смеси, так и в форме очищенных индивидуальных компонентов или их смесей могут применяться при лечении различных инфекционных заболеваний у людей и у животных. Как правило, эти антибиотики вводят орально ежедневными дозами в 0,5 — 1,0 г или парэтераrrb«o дозами в 100 — 500 мг в зависимости от типа и серьезности инфекционного заболевания и особенностей больного.

Они могут вводиться в отдельности или в комбинации с фармацевтически приемлемым носителем, и для лечения можно использовать как одинарные, так и многократные дозы.

Для орального введения можно применять таблетки, содержащие различные дооавки (нитрат натрия, карбонат кальция и дикальиийфосфат), а также различные агенты дезинтеграции, такие как крахмал, альгиновая кислота и некоторые комплексные силикаты, л. е т со связующими, такими как поливинилпирролидон, сахароза, желатина и аравийская камедь. Кроме того, можно вводить смазочные вещества, такие как стеарат магния, луарилсульфат натрия и тальк, которые часто создают преимущества при таблетировании. Твердые вещества сходного типа могут также применяться в качестве наполнителей в мягких и твердых желатпновых капсулах. К числу рекомендуемых материалов относятся лактозы, а также полиэтиленгликоли высокого молекулярного веса. При применении суспензий и/или эликсиров важным ингредиентом могут о 52907

Таблица 1

Минимальная ингибирующая концентрация, соединения (мкг, мл) Микроорганизм

Сырая смесь

A+B

i)0, 10

)0,78

1,56

0,10

Staph. aureus 005

Staph. aureus 400

Strep faecalis

Neisseria sicca

Тгеропегла hyodysenteriae

Strep. pyogenes

Bactегоides jragilis 35 614

C lost rid iu m i nocu1u m

Lactobacillus casei vrr. easel

25,00

12,50

12,50

50,60 (О, 10 (О, 10

0,20 (О, 10

0,19 (0, 10

0,78

0,39

0,39

1,56

3,12

100

0,39

0,10

0,78

0,20

0,20

0,39

12,50

50,СО

»0

25,03

6,25

3,12

Таблица 2

LD, (мг кг) при введени t

Соединение (М), смесь субкутанно орально

)-203

200

) 200

36 926

37 277

36 926+37 277 (1:1)

Сырая смесь антиб:;отиков

210

72 — 120

150 — 200 явиться агенты подслащивания или вкусовые вещества вместе с такими разбавителями, как вода, этанол, пропиленгликоль, глицерин и различные комбинации этих веществ.

Растворы антибиотиков в сезамовом или в арахисовом масле или в водном пропиленгликоле могут применяться при парэнтеральном введении.

Индивидуальные антибиотики проявляют бактерицидную активность, которая в основном является ба ктериостатической. Однако сырые смеси антибиотиков или смеси очищенСходные результаты были получены при индивидуальных испытаниях побочного макропик . Ического лактона — соединение № 35 763 (А ) и побочного депсипептида— соединения № 37 932 (В ), а также при испытании различных комоинаций: А — А, В В, (А +В ), (А +В), (А+В ), (А+В).

Максимальная синергическая активность у комоинаций очищенных макроциклических лактонов и депсппептидов была достигнута при соотношении около 1 — 2: 1. Примерно такие >ке соотношения наблюдаются для ферментационных бульонов А. auranticolor АТСС

31011 и для выделенных из них сырых смесей антибиотиков.

Это явление противоположно наблюдаемо>1) для других синергических смесей антибиотиков, для которых синергетические факторы наблюдаются у ферментационных бульонов и сырых смесей при бус-оптимальных соотношениях.

Данные, полученные 1п vivo, при оральном и субкутанном введении при проведении опытов на мышах, инифицированных штаммом

Staphylococcus aureus 01Л005, представлены в табл. 2.

Антибиотики, охватыва. мые настоящим изобретением. могут применяться в качестве агентов стимулирования роста домашней птицы и животных из-за и ирокого бактерицидного спектра и при лечении дизентерии у свиных депсипептидов и очищенных макроциклических лактонов проявляют синергическую активность, являющуюся по существу бактерицидной.

5 При индивидуальных испытаниях главного макроциклического лактона — соединение

¹ 36 926 (А) — и главного депсипептида— соединение № 37 277 (В) — или их комбинаций (путем раззавления в пробирках) против

10 различных организмов были выявлены минимальные ингибиру ощие концентрации. Результаты даны в табл. 1.

25 ней благодаря значительной активности против анаэробной спирохеты, вызывающей это заболевание.

Промотирующая рост активность сырой

30 смеси антибиотиков определяется на молодых поросятах в течение 40 дней. Средний привес в день, потребление корма и эффективность оказались значительно улучшенными у животных, получавших антибиотики, по сравие35 нию с контрольными животными (р(0,01).

Результаты приведены в табл. 3.

Сходные результаты получены и для других смесей антибиотиков, применяемых в количестве 10 — 100 частей на 10 частей корма.

40 Аналогичные результаты получены также при использовании .индивидуальных чистых соединений №№ 36 926, 37 932 и 37 277 или смесей чистых соединений.

552907

Таблица 3

Эффективность кормления, кг

5 привеса

Среднее дневное потребление корма, кг

Средний привес в день, кг

Доза знтибиотика части /10 частей корма

0,91 > 5

2,15

0,25

1,35

0,63

Эффективность применения антибиотиков для стимулирования роста была продемонстрирована при проведении опытов на цыпля15 тах, в корм которым вводили антибиотики. У них отмечается значительное улучшение привеса по сравнению с контрольными цыплятами (p(0,01) . Результаты представлены в табл. 4. 20

Таблица 4

Эффективность кормления, кг корма,/кг привеса

Среднее потреблеДоза антибиоСредний привес г тика, части/10 частей корма нпе корма г

939

1,66

566

1,56 30

949

608

Такие же результаты получены при применении других сырых смесей антибиотиков, со- 35 ставы которых приведены ниже, или использовании индивидуальных чистых соединений №№ 36 926, 37 932 и 37 277 или смесей чистых соединений.

Профилактическую эффективность антибио- 40 тиков, охватываемых настоящим изобретением, определяют на свиньях, экспериментально инфицированных дизентерией.

Корм, содержащий антибиотики, вводят в течение 28 дней. Полученные результаты 45 представлены в табл. 5.

Таблица 5

Доза антибиотика, части/10 частей корма

Средний дневной 50

Смертность

Заболеваемость, О привес, кг

50,00

37,50

25,00

12,50

6,25

Аналогичные результаты получены при введении (10 — 100 частей на 10 корма) чистых индивидуальных соединений K М 36 926, 65

О

О

О

О

О

О

10 — 0,13

О,бб 55

0,57

0,68

0,61

0,47

37 932 и 37 277 или смесей чистых соединений.

Пример 1. Готовят стерильную водную средх состава (г/л):

Глюкоза 10

Растворимый крахмал 20

Экстракт дрожжей 5

Продукт энзимати .еского дегидрирования казеина 5

Карбонат кальция 1

Величина рН 7

Клетки с пластинки с А. auranticolor АТСС

31011, выращенные на среде АТСС 172, переносят в несколько 300-миллилитровых конических колб Эрленмейера. в каждой из которых находится 50 мл этой среды и которые встряхивают на вращающемся сепараторе в течение 3 — 4 дней при 28 — 30 С. Аликвотные порции по 5 мл выращен .ого инокулята переносят в 300-миллилитровые конические колбы

Эпленмейера, каждая из которых содержит

100 мл описанной выше стерильной среды.

После встряхивания в течение 3 — 4 дней при 28 — 30 С 5 — 10% выращенного инокчлята переносят в четырехлитровый бродильный чан, соцеожащий 2 л сгерильной среды состава (г/л):

Экстракт дрожжей 2,000

Глюкоза 10,000 ,>Кидкость после замачивания кукурузы 1 (мл)

Продукт энзиматического дегидрирования казеина 5,000

Хлорид двухвалентного кобальта 0,002

Величина рН 7,0

Ферментацию проводят 20 — 30 час при 28—

30 С, пои перемешивании со скоростью

1700 об/мин и аэрации 1 объем воздуха на

1 объем бульона в 1 мин.

В случае необходимости величину рН всего бульона устанавливают на уровне 7 и ,чва>кды экстрагируют метилизобутилкетоном (1/3 — 1/2 от объема бульона). Экстракт в раство1>ителе кочпентрипуют в вакууме и обезжиривают экстракцией петролейным эфиром.

Активность бульона. экстракт в растворителе и последующие фракции контролируют методом тонкослойной хроматографии на силикагеле с использованием системы проявителей, состоящей из хлороформа — этанола (9:1), и проводят наблюдения в ультрафиолетовой области спектра при длине волны 254 ммк и

336 ммк.

Обезжиренный концентрат в растворителе высушивают досуха в вакууме. Твердые вещества подвергают противоточному распределению по Крэгу на шести тарелках с использованием толуола (5 частей), этанола (2 частей), водного фосфатного буферного раствора (рН 4,5; 3 части). После распределения слои контролируют методом тонкослойной хроматографии.

552907

60 б5

13

Депсипептид (соединение № 37 277) концентрируют в верхнем слое, в основном на нулевой тарелке. Второй депсипептид (соединение № 37 932) выделяют из верхних тарелок — 1-ой, 2-ой и 3-ей. Макроцикличвский лактон (соединение № 35 763) находится в основном в нижних слоях тарелок 0-ой и 1-ой.

Соединение М 36 926 концентрируют в нижних фазах тарелок 2-ой, З-ей, 4-ой и 5-ой.

Верхнюю фазу нулевой тарелки, содержащую соединение № 37 277, высушивают досуха в вакууме, растворяют в хлороформе и перемешивают 30 мин с активированным углем. Раствор фильтруют и высушивают в вакууме. Остаток растворяют в ацетоне, твердые вещества осаждают, прибавляя гептан, Осадившився твердые вещества растворяют в небольшом количестве хлороформа и хроматографируют на колонке силикагеля, забуференного до рН 6,0, изготовленной в присутствии смеси хлороформа с н.-пропанолом (99: 1). Колонку проявляют той же системой под давлением 5600 Н/м . Фракции из колонки контролируют методом тонкослойной хроматографии. Фракции, содержащие выделенное соединение № 37 277, объединяют, выпаривают в вакууме, и соединение кристаллизуют из ацетона — гептана.

Соединение № 37 277 не имеет отчетливой точки плавления. Разложение начинается при

140 †1 С. Соединение нерастворимо в диэтиловом эфире, гексане, гептане и воде. Оно слегка растворимо в ацетоне и бензоле и легко растворимо в метаноле, этаноле, хлороформе и хлористом метилене.

Анализ соединения № 37 277 дает следующие примерные результаты (о/о ): С 60,91;

Н 5,98; N 10,45; О (по разности) 22,66.

Соединение ¹ 37 277 оптически активно и

25 имеет угол вращения (u)D =+11 (с=1,0 этанол). Максимумы поглощения в ультрафиолетовой области находятся при длинах волн (ммк): 225, 274, 282, 303 и 355; е,";„

309,3; 36,67; 45,01 и 20.

Хлороформный раствор показывает характерное поглощение в инфракрасной области при следующих длинах волн (мкм): 3,05; 3,40;

5,70; 5,77; 6,07; 6,62; 6,82 и 7,67.

Фракции, полученные при противоточном распределении и содержащие соединения №№ 35 763 и 36 926, выпаривают в вакууме, остатки растворяют в этилацетате, раствор перемешивают с силикагелем. Профильтрованный раствор выпаривают в вакууме, остаток растворяют в этилацетате, твердые вещества осаждают, прибавляя гексан. Осадившиеся твердые вещества растворяют в небольшом количестве хлороформа и хроматографируют в колонке силикагеля, забуференного до рН 6,0, изготовленной в присутствии этилацетата. Колонку проявляют смесью этилацетата, тетрагидрофурана и гексана (80: 20: 20), насыщенной водным фосфатным

50 буферным раствором с рН 6,0, под давлением

5600 Н/м .

Первые 17 из полученных фракций (каждая объемом 20 мл) содержат желтое масло, которое отбрасывают. Фракции 26 — 40 имеют высокое содержание соединения № 36 926.

Фракции 41 — 50 представляют собой главным образом смеси соединений — 36 962 и 35 763.

Фракции 26 — 40 объединяют, концентрируют в вакууме и вновь хроматографИруют на силикагсле с отбором фракций по 20 мл. Первые

15 фракций содержат желтое масло, которое отбрасывают. Фракции 1б — 30 представляют собой, в основном, соединение № 36 926.

Фракции 31 — 40 содержат смесь соединений № 36 962 и ¹ 35 763. Фракции 16 — 30 выпаривают в вакууме, остаток растворяют в небольшом количестве хлороформа и вносят в колонку силикагеля, забуференного до рН 6,0, изготовленной в присутствии хлороформа. Колонку проявляют смесью хлороформа с этанолом (95,5 — 4,5 об. о/о) под давлением 9100

Н/м и собирают 160 фракций по 6 мл. Фракции 60 — 90 содержат только соединение № 36 926. Эти фракции объединяют и выпаривают в вакууме. Остаток растворяют в минимальном количестве этанола и осаждают диэтиловым эфиром для получения чистого аморфного соединения № 36 926.

Соединение № 36 926 растворимо в метаноле, этаноле, хлороформе и хлористом метилене, нерастворимо в диэтиловом эфире, гексане и гептане. Оно не имеет отчетливой температуры плавления, разложение начинается при температуре 100 С. При анализе установлены следующие средние соотношения (O ):

С 57,89; Н 6,78; N 8,04; О (по разности) 27,29.

Молекулярный вес, определенный по массовому спектру с высоким разрешением, равен

501, молекулярная формула С25Н35Й507.

Соединение № 36 926 обладает оптической

25 а ктив ностью с углом вращения (а) D

= — 130 С (с = 1,0, этанол) . Максимум поглощения в ультрафиолетовой области спектра в растворе этанола находится при длине волны 214 ммк; е," „=723,8.

Таблетка с бромистым калием показывает характерные максимумы поглощения в инфракрасной области при следующих длинах волн (мкм): 2,95; 3,40; 5,75; 5,98; 6,23; 6,58;

6,87; 7,45; 8,25; 8,38; 8,80; 9,08; 10,15;

10,35; 11,10 и 13,30.

Соединение № 35 763 выделяют и очищают таким же образом, как и соединение № 36926.

Чистое соединение растворимо в метаноле, этаноле, хлороформе и хлористом метилене, не растворимо в диэтиловом эфире, гексане и гептане. Оно не имеет отчетливой температуры плавления, разложение начинается при температуре -100 С. Анализ дает следующие средние соотношения (/о ): С 61,29;

Н 6,73; N 8,83; О (по разности) 23,15.

Молекулярный вес, определенный по массовому спектру с высоким разрешением, состав° e

g. . с ф

vQ g

16

Хлорид двухвалентного марганца

I I.

Глюкоза

Мука из соевых бобов жидкость, полученная при замачивании кукурузы

Ш.

Меласса

Продукт энзиматического дегидрирования казеина

Экстракт дрожжей жидкость, полученная при замачивании кукурузы

Казеин

0,02

10,0

10,0

1 (мл) 10,0

1,0

2,0

1 (мл) 3,0

Табли ца 6

Содержание (у) соединения, ¹

Смесь компонентов

Партия №

37932 37277

35763

36926

19,3

15,9

15,5

26,9

20,3

8,7

7,8

10,7

0,9

2,2

1,3

1,2

2,4

0,5

1,4

32,0

39,5

38,6

47,8

31,9

8,5

3,1

6,0

9,4

8 4

Формула изобретения

8,00

3,00

ЦНИИПИ Заказ 903/20 Изд. № 326 Тираж 589 Подписное

Типография, пр. Сапунова, 2

15 ляет 503, молекулярная формула С2аН37И307.

Соединение № 35763 обладает оптической

25 активностью и имеет угол вращения (а) р

= — 114 (c=-1,0, этанол). Максимум поглощения в ультрафиолетовой области спектра в растворе этанола находится при длине волны

218 ммк при e," ;„=668,9.

Таблетка с бромистым калием показывает в инфракрасной области спектра максимумы

-. поглощения при следующих длинах волн (мкм): 2,95; 3,38; 5,73; 6,00; 6,23; 6,60; 6,88;

7,23; 8,25; 8,38; 8,83 и 10,20.

Фракции, полученные противоточным распределением, содержащие соединение № 37 932, выпаривают в вакууме досуха, остаток растирают с петролейным эфиром и хроматографируют на колонке силикагеля, как это было описано выше. Соответствующие фракции объединяют и производят кристаллизацию из ацетона †гекса для получения

20 соединения № 37 932.

Соединение № 37 932 растворимо в метаноле, этаноле, хлороформе и хлористом метилене. Оно не имеет отчетливой температуры плавления, разложение начинается при температуре — 185 С Элементарный анализ дает следующие приблизительные соотношения (%): С 59,41; Н 6,01; N 10,6; О (по разности)

23,92.

Соединение ¹ 37 932 обладает оптической

25 о активностью с углом вращения (а)в =+5,0 (с=0,25, хлороформ). Максимумы поглощения в ультрафиолетовой области спектра (в растворе этанола), находятся при длинах волн 226, 276, 283, 305 и 355 ммк с величи.нами е, ";„=304,4; 36,8; 43,49; 70,25 и 20,07 соответственно.

Таблетки с бромистым калием показывают характерные максимумы поглощения при сле- 40 дующих длинах волн (мкм): 2,96; 3,05; 3,38;

568; 593; 598; 613; 650; 658; 688;

7,40; 7,65; 8,08; 8,45; 8,60; 9,03; 9,45;

9,70; 9,98; 10,55; 11,00; 11,25; 11,60; 12,35 и 13,25. 45

Пример 2. Опыт проводят по методике примера 1 и получают сходные результаты при применении ферментационных сред следующих составов (г/л):

1. 50

Глюкоза

Триптоза

Продукт энзиматического дегидрирования казеина 1,00

Глутаминовая кислота 1,00

Мука из соевых бобов 0,50

Хлористый натрий 8,30

Вторичный фосфат калия 2,40

Первичный фосфат калия 2,00 60

Пример 3. Опыт проводят по методике примера 1. Полученный в метилизобутилкетоне экстракт готового ферм ентацион ного бульона выпаривают досуха в вакууме и остаток растирают с петролейным эфиром.

Хрупкий материал размалывают, и количество антибиотических компонентов определяют жидкостной хроматографией под высоким давлением. Характерные партии сырых смесей антибиотиков, полученные при отдельных опытах ферментации, имеют различное содержание описываемых соединений. Результаты — в табл. 6.

Способ получения антибиотиков, о т л и ч аю щи и с я тем, что культуру штамма Actinoplanes auranticolor АТСС 31011 выращивают в аэробных условиях в жидкой питательной среде, содержащей усвояемые источники углерода и азота, с последующим выделением из культуральной жидкости целевого продукта в виде смеси соединений антибиотиков или отдельных компонентов ее.

Источники информации, принятые во внимание при экспертизе:

1. Пагент США № 3780174, кл. 424 †1, 1973.