Способ получения водонерастворимых протеиновых препаратов
ОП САНИЕ
ИЗОБРЕТЕН ИЯ
К ПА7ЕНУУ
Союз Советских
Социалистических
Республик (11): 576959 (61) Дополнительный к патенту— (22) Заявлено 27,03,73 (21) 1899004/05 (23) Приоритет (32) 30.03,72 (31) P 2215687.2 (33) ФРГ (43) Опубликовано 15.10.77. Бюллетень № 38 (45) Дата опубликования описания 18.11.77 (51) М. Кл, С08 Р 8/00
С07 G 7/00
Государственный номнтет
Совете Мнннотров СССР оо делам нэобретеннй
Н EETKPblTEIN (53) УДК 678.744З42° 139 (088.8) (72) Авторы изобретения
Иностранцы
Фритц Хюпер, Эрих Рауенбуш, Гюнтер Шмидт-Кастнер, Бруно Бемер н Херберт Бартл (ФРГ) Иностранная фирма
"Байер АГ (ФРГ) (71) Заявитель
\„
t (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ВОДОНЕРАСТВОРИМЫХ ПРОТЕИНОВЫХ ПРЕПАРАТОВ
Е0
20
1
Ф
Изобретение относится к области "получения новых водонерастворимых протеиновых препаратов, закрепленных на сшитых, набухаемых сополимерах.
Известен способ получения водонерастворимых протеиновых препаратов путем взаимодействия полимерного носителя с раствором протеина в водносуспензионной среде.
В качестве таких носителей используют сополнмеры малеинового ангидрида с этиленом и моновнниловыми соединениями (1) .
Однако указанные сополимеры прн реакции с водными растворами ферментов становятся более или менее растворимыми, так что перед или во время реакции вводят дополнительное сшивающее средство, например диамин. Получещгые по такому способу протеиновые препараты плохо фильтруются и имеют растворимые фракции, что ведет к потерям связанного фермента.
Цель данного изобретения — устранение указанного недостатка.
Эта цель достигается тем, что в качестве полимерного носителя используют сополимер
0,1 — 30 вес.% ангидрида а,/1 - моноолефиновой днкарбоновой кислоты с 35 — 90 вес.% ди-и/или полиметакрилата ди- н/или полиола и с 5-60 вес.% гидрофильного мономера.
Сополимеризацию проводят при температуре
20 — 200 С в присутствии соединений, образующих радикалы, методом осаднтельной или бисерной полимеризации в растворителе нли смеси растворителей, которые ннертны к ангидридным группам.
Из ангидридов сь/1 - моноолефинов ненасьпценIibIx днкарбоновых кислот с 4 — 9 атомами углерода, преимущественно с 4 — 5, необходимых для получения сополнмеров, используют главным образом ангидриды малеиновой, нтаконовой и цитраконовой кислот, преимущественно маминовьш ангидрид. Ди- и/или полнметакрилаты илн ди-и/илн полиакрнлаты ди- н/нли полиолы получают из соединений по крайней мере с 2 спиртовыми или фенольными, преимущественно спиртовыми HO - труппами, нли продукты их взаимодействия с алкнленоксидами с 2 — 8 атомами углерода, преимущественно с 2 — 4, или смесь зтих алкиленоксидов, причем на 1 моль гидрокснсоедннения прививают
1 — 10, предпочпчтельнс 1 — 10, звеньев алкнленоксида. Примерами алкиленокспдов являются этиленокснд, пропиленокснл, оутилснокслд, трнме нлеш ксид, IeIрамслепокс щ, бнс: лорметнлоксациклобутан, окись стирала, преимущ леноксид. Можно приме смдинений, по крайней по Церевитинову атома начало не от спиртов ил ми алкиленоксидами метакрилатов. Ди- и/и полиолы, применяемые чают известными мета стянем ди- и/или полно криловой кислоты в п малярных количеств, о третичных аминов, на температурах ниже 20 й/или полиолы по кр углерода, преимуществ рода, например этиле пропандиол- 1,3, бута
"1,4, гександиолы, дек тилолпропан, пентаэрит дукты их взаимодейс алкиленоксидами. При ме тилак сациклобутан, ди- и/или полиалов. П диакрилаты или димет мами углерода и/или одного моля этого ди оксида с 2 — 4 атомам пропантриметакрилат. крилаты этиленглико этиленгликоля, тетраэ полиалкиленгликолей до 500 или их смеси, сополимеризации сост ных, гидрофильных м применяют п алиме ри ненасыщенные соеди функциональных груп ангидридным группам полимеры.
Гидрофильные ма венно одну карбокси сульфо. или сульфами аминокарбонильной и жет быть замещен алк да или алкоксиметиль углерода в алкоксира следует привести акр вую кислоту, монозфи атомами углерода в с лактамы, например криламид, Ч - эамеще мер N - метил- и Nи N - акрилоилдимет количестве 5-60 вес.% в зависимости от т набухаемости получае, полиалкиленакснднай метакрилата, Добавк только на гидрофил углерода или триметилолПредпочтительны диметая, диэтиленгликоля, триленгликоля или высших с молекулярным весом ретья группа компонентов ит из простых ненасышенномеров. В качестве таких ационноспосабные простые ния, которые не имеют, активных па отношению к и образуют гидрофильные амеры имеют преимущестную, аминокарбонильную, ную группу, причем амин в
t сульфамидной группе молами с 1 — 4 атомами углерогой группой с 1 — 4 атомами кале. В качестве примера ловую кислоту, метакриломалеиновой кислоты с 1 — 8 иртовой группе, N - нинил- винилпирролидон, мета. ные метакриламиды, наприметоксиметилметакриламид таурин, Их добавляют в т общей смеси .мономсрав, ебуемой гидрофильнасти и
ых сополимеров и от длины юпи (и) мнагоосновнага, этих монамеров влияет не на=ть, на и на структуру ственно зтиленоксид и прапи. ять продукты взаимодействия мере, с двумя активными водорода, которые берут фенолов, с вью названныполученияя д - и/или полиметакрилаты ди- и/или по данному способу, полуми, например взаимодейов с хлорангидридом метан сутствии примерно эквиносительно хлорангидрида, имер триэтиламина, при в бензоле. Применяют дийней мере с 2 атомами нно с 2 — 12 атомами углегликоль, пропандиол- 1,2, олы, особенно бутандиолндиолы, глицерин, тримеит, сорбит, сукроза и проня с указанными выше одны также полибисхлоролистиролоксид или смесь имущественно применяют
-рилаты диолов с 2 — 4 атопродукты взаимодействия а с 1 — 10 молями алкиленмономера, что имеет значительное преимущество при получении полимера, так как при этом виде полимеризации выбор ргзбавителя сильно ограни. чен из-за условий нерастворимости смеси маномеров в парафиновых углеводородах и его инертности к ангидридным группам. Изменением состава мономерной смеси можно в широких пределах менять гидрофильность, густоту сетки, набухаемость и содержание ангидридных групп в предлагаемых сополимерах, пригодных для соответствующих цепей.
Наряду с ди- и/или полиметакрилатами добавляют также обычные средства для сшивания, ло крайней мере с 2 несопряженными двойными связями, например дивиниладипат, метиленбисакриламид, триакрилформаль или триаллилцианурат в количестве примерно 0,01 — 30 вес.% относительно мономерной смеси. Полимеризацию проводят в органическом растворителе в виде осадительной полимеризации, причем полимер начинает выпадать вскоре после начала полимеризации. Используют растворители, инертные к ангидридным группам: алифатические, циклоалифатические и ароматические углеводороды, а также галоидзамещенные углеводороды, алкилароматику и эфиры карбонавых кислот, например гелтан, октан, изооктан, бензиновые фракции с точками кипения от 60 до 200 С, циклогексан, бензал, толуол, ксилол, хлорбензол, дихлорбензолы, зтилацетат, бутилацетат. Растворитель должен иметь температуру кипения выше 60 С и хорошо удалятьЗО ся в вакууме из полимера, полученного осютительной полимеризацией. На 1 ч. мономерной смеси применяют примерно 2-50, предпочтительно
5 — 20 вес.ч. растворителя, На свойства сополимера, особенно на насыпной вес и удельную поверхность, Зб оказывает значительное влияние вид и количество растворителя. Во многих случаях применяют смесь вышеназванных растворителей, или начинают полимериэацию в растворителе для полимера и в процессе полимеризации непрерывно вводят осадитель для
10 полимера. Осадитель можно добавлять также в определенные моменты одной или несколькими порциями, Кроме того, мономерную смесь с подходящим инициатором можно подавать в виде раство. ра или без растворителя в рассчитанное количество
46 растворителя, так, чтобы ва время полимериэации сохранялась равномерная незначительная концентрация манаме ров. Благодаря применению метакриловых мономеров различной гидрофильности и вариацией условий полимеризации получают прадук.
50 ты хорошей механической стабильности с широкой областью,набухаемасти, плотности и удельной по. верхности.
Сополимеры преимущественно получают сус. пензианной палимериэацией. В известном виде би55 серной полимериэации, в котором мономеры с добавкой органического растворителя суспендируют в ваде„ангидрид очень быстро гидролизуется, возникающая дикарбановая кислота переходит в водную фазу и лишь незначительная часть входит в
60 полимер, поэтому суспензианную полимеризацию
576959 целесообразно проводить в органической среде. В качестве дисперсионной среды используют. парафиновые углеводороды, например гексан, гептан, октан и высшие гомологи, циклоалифатика, например циклогексан, а также смесь парафинов, например гексан, гептан, октан и высшие гомологи циклоалифатика, например циклогексан, а также смесь парафинов, например бензиновая фракция или парафиновое масло. Мономеры и инициатор растворяют в растворителе, не смешивающемся с парафинами и инертном к ангидридным группам, например ацетонитрил, диметилформамид, диметилсульфоксид юы триаьгид гексаметилфосфорной кислоты и распределяются в ñÂ0ðñHÎHHoí среде большей cTb10 при добавке диспергаторов. Соотношение, объемов дкперсионной среды и мономерной фазы составляет 1:1 — 10:1, преимущественно от 2:1 до 5:1.
Для стабилизации суспензии применяют, например моно- и диолеат глицерина, а также смесь этих соединений, моно- и триолеат или стеарат сорбита, моноэфиры полиэтнленгликоля со стеариловым и лауриловым спиртом или нонилфенолом, моноэфиры полиэтиленгликоля с олеиновой, стеариновой и другими жирными кислотами с числом атомов углерода более 10, а также натриевая соль диоктилового эфира сульфоянтарной кислоты. Эти вещества вводят в количествах, преимущественно
0,1 — 10% относительно мономерной смеси, и растворяют в углеводородной фазе. Размер частиц может быть уменьшен не только увеличением скорости перемешивания, но и добавлением 0,01-2%, относительно мономера, дру гого поверхностно- активного вещества, например алкилсульфоната. Полимеризацня инициируется радиальными инициаторами. Подходящими инициаторами являются, например азосоедине шя или перекиси, Азоизобутиронитрил является наиболее распространенным азосоединением для инициирования полимеризации. Из перекисных соединений применяют главным образом диацилперекиси, например перекись бензоила, или перкарбонаты, например диизопропил- и дициклогексилперкарбонат, а также диалкилперекиси, гидроперекиси и эффективные в органических растворителях редокс- системы. Инициаторы добавляют в количествах 0,01 — 10 вес,%, преимущественно 0,1 — 3 вес.%, относительно мономерной смеси. Полимеризацию проводят при температурах примерно 20 — 200 С, преимущественно при 50 — 100 С, в зависимости от скорости распада инициаторов и чаще всего ниже температуры кипения растворителя, а при бисерной полимериэации ниже температуры смешиваемости обеих фаз. Кроме того, полимеризацию выгодно проводить в инертной атмосфере в отсутствии кислорода. Сополимеры, полученные осадительной полимеризацией, являются бесцветными или светложелтыми порошкообразными веществами с насыпным объемом 1,5 — 30 мл/г, преимущественно
2 — 20 мл/г, и уд льной поверхностью 0,1 — 500 м /г, предпочтительно 1 — 400 M /ã. Содержание карбониньных групп, оцред ленных титрованием после
l5 0
ЗО
55 б0 о м ы пения ангидридных групп составляет
0,01 — 14 мэкв/г, преимущественно 0,01 — 1 i мэкв/г.
Суспенэионный полимер представляет собой белый или слегка окрашенный бисер, который в некоторых случаях может быть неправильной формы и имеет диаметр 0,03 — 3 мм, преимущественно 0 05 — 0,5 мм, и насыпной объем примерно 1,4-8 мл)г, преимущественно 1,4 — 5 мг/г.
Содержание карбонильных групп в нем, определенных после гидролиза ангидридных групп, составляет 0,01 — 14 мэкв/г, преимущественно 0,02—
11 мэкв/г. В сополимерах мономерные единицы в основном распределены статистически. Из-за . высокой плотности сетки в сополимерах, они растворимы ие во всех растворителях, поэтому нельзя определить их молекулярный вес. Сополимеры набухают в воде до 1,1 — 3-х кратного насыпного объема и могут быть использованы в качестве смолы-носителя для фиксирования веществ, способных реагировать с ангидридными группами сополимера. Кроме того, они обладают отличной механической стабильностью, и следовательно практически не изнашиваемы. Вьппеописаниые смолыносители образуют связи со всеми веществами, которые имеют функциональные группы, способные реагировать с ангидридными группами полимера. У протеинов и пептидов это прежде всего концевые аминогруппы лизина и свободные аминоI группы на концах пептидных цепей. Реакцию проводят путем добавления к перемешиваемому водному раствору протеина при 0 — 30 С необходимого количества полимера. Весовое соотношение протеина к смоле-чосителю может меняться в широких пределах, Хорошие выходы получают при соотношении 1 вес.ч. протеина и 4 — 10 вес.ч, полимерного носителя. Однако оптимальное соотношение зависит как от состава и структуры полимера, так и от вида протеина. Для многочисленных ферментов целесообразно добавлять стабилизаторы. В качестве таковых применяют полиэтиленгликоли и неионный смачиватель для ослабления денатурации на поверхности, а также известные сульфогидрильные реагенты или ионы металлов для специальных ферментов. рН-метром поддерживают оптимальное для соответствующей связи значение рН 2 — 9, преимущественно 5 — 7. При использовании пенициллинацилазы целесообразно значение рН 5,7 — o,8. Причем для постоянного поддержания рН добавляют неор- . ганические (раствор едкого натра) или органические (органические амины) основания. О ходе реакции судят по количеству основания, необходимого для поддержания постоянного рН. При комнатной температуре для завершения реакции необходимо примерно 16ч, при 4 С вЂ” до 40ч. Затем смолу отсасывают и для отделения незначительной доли ионносвязанного протеина промывают буферным раствором или раствором поваренной соли концентрацией от 0,2 до 1 М. Присоединенное вещество определяют элементарным анализом или для ферментов и ингиби торов ферме нтативной актив576959 ность
112 ор 40 мл уреаэы в 32 мл
r смолы-носителя, нолуи постоянном перемешимпературе величину рН и 6,0 добавлением 1 N
Реакция оканчивается чет и промывают буфером ность, U
168 постыл, или жщввлением ности. Выход иа присое от природы вещества и например аминокислоты пептиды практически п присоединении, но у протеи пенной ферментативной ак свыпю 90% первоначальной
Пример1а.70гтетр крилата, 20 г метакрилово вого анпщрида и 1 г аэо ряют в 1л бензола и сиа
60 С 4 ч. Затем добавляют и 200 мл бензина (Т.кип.ь1 зуют 2чпри 70 С и 2ч ный полимер основательн ным эфиром (Т.кип.= 3 кууме. Выход 96 г. На
Объем набухания в вод поверхность = 8,6м /г. омылеиия анпщридных гр
П риме р16.6гсмо по примеру 1 а, суспендир ннц (U) пеннпиллинацнла кой паствора1М йаОН с по живают рН6,3 и сусле при 25 С. Затем отсасы фильтр М 3 и промывают фосфатным буфером с раствор хлористого натрбез хлористого натрия.
Слив и промывные определяют их фермента
В аликвотном количестве и активность влажной смолы
Ферментативная ак (НИФАК вЂ” тест), И
Исходиьй раствбр
Слив и промывные
Смола-носитель по пения 92% исходной
Ферментатнвную ак зы измеряют колориме
0,002 М раствором 6 - ни
- аминобензойной кисл субстрата при рН7,5 и циент экстинкции соотве
-аминобензойной кисл
1 единица (U) соответств субстрата в мин.
Приме р 1в.Врас воды суспенди руют 400 ченной по примеру 1 а. П ванин при к.омнатной поддерживают посто я ни раствора едсого натрия, реэ 16 ч, смолу отсасыва как в примере 1 6.
Ферментативиая ак
Исх одный раствор рментативной активнное вещество зависит става полимера. Так, и низкомолекулярные стью расходуются в ов выход по присоедивности лежит от 20 до тив носхи. метиленгликольдиметакислоты, 20 r малеиноутироннтрила раство полимеризуют при г азоизобутиронитрила — 140 С) и полимери80 С. Порошкообразпромывают петролей-50 С) и, сушат в вашной объем 8,8мл/г.
= 12,4 мл/г. Удельная ержание кислоты посла
3,85 мэкв/г.
-носителя, полученного т в растворе 610 едив 150 мл воды. Добавощыо рН-метра поддерию перемешивают 20ч ают через стеклянный о 300 л саа0,05M
Н7,5, содержащий 1М, затем тем же буфером створы объединяют и ную активность. меряют ферментативную створы присоедитивности 561 ически или титрованием
- 3 - (И- фенилацетил). (НИФАБ) в качестве
5 С. Молярный коэффиствующей 6 - нитро - 3Равен Е4оа нм=9090. ет превращению 1 ммоля
64,5
Пример 3 а. 50 г тетраэтиленгликольдиметакрилата, 30 г метакриловой кислоты, 10 г малеинового ангидрида и 1 r аэоиэобутиронитрила растворяют в 300 мл ацетонитрила. Раствор сусленд руют в 1л бензина (Т.кип.= 100 — 140 С), который со. держит 5 г. смеси моно- и диолеата глицерина, и полимеризуют 22ч при 60 С. Полимерный бисер отфильтровьвают, трижды суспендируют в бензоле и затем дважды в петролейном эфире (Т,кип.=30-50 С) и сушат в вакууме. Выход 94 г белого бисера. Насыпной объем 4,4 мл/г; Объем набухания в воде
5,5 мл/г. Удельная поверхность 6,6м /г. Средний
Слив и промывные растворы
Смола-носитель после присоединения 52% исходной активности 87
Ферментативную активность уреазы определяют
5 титрованием 0,17 М раствором мочевины при 25 С и рН6,1 1 единица (Ц соответствует количеству фермента, который расходуется на 1 ммоль мочевины, на 2 ммоля соляной кислоты в минуту.
Пример 1 г. В раствор 100 мг трипеина в
32 мл 0,02 М растворе хлорида кальция суспендируют 500 мг смолы-носителя, полученной по примеру 1а. При постоянном перемешивании при 4 С величину рН поддерживают постоянной 6,3 добавкой 1N раствора едкого натрия. Через 16 ч смолу отсасывают и промывают буфером как в примере
И
Ферментативная активность, U
Исходный раствор 110
Слив и промывные растворы 15,6
Смола-носитель после присоединения 58% исходной активности 64
Ферментативную активность измеряют колориметрически по Туппи (Тирру), бензол - аргинин -л- нитроанилидом (БАПНА) в качестве субстрата.
1 единица (U) соответствует расщеплению 1 ммоль субстрата при 25 С и рН 7,8.
Пример 2 а. Раствор 80 г тетраэтнленгликольдиметакрилата, 10г метакриловой кислоты, 10 г малеинового ангидрида и 1 г азобутиронитрила в 1 л бензола полимериэуют при медленном перемешивании в течение 4 ч при 60 С, 2 ч при 70 С и 1 ч. при 80 С. Полимер отфильтровывают, трижды перемешивают в бензоле, промывают в петролейном эфире и сушат в вакууме. Выход составляет 70 г.
Насыпной объем 7,0 мл/г, объем набухания в воде
8,2 мл/г. Удельная поверхность 5,3 м /r. Содержа2 ние кислоты после омыления анпщридных групп
2,55 мэкв/г.
Пример 2 б. 1 r полимера, полученного по
40 примеру 2 а, взаимодействует аналогично примеру 16 с пенициллинацилаэой в 33 мл воды при рН 6,3.
Ферментативная активность, U
Исходный раствор 118
Слив и промьвные растворы 21
СМола- носитель после присоединения 69% исходной активности 82
576959 диаметр частиц 200 мкм. Содержание кислоты после омыления ангидридных групп 4,3 мэкв./г.
Пример 3 б. 1 r полимера, полученного по примеру 3 а, взаимодействует аналогично примеру 1 б с пенициллинацилазой в 33 мл воды при рН 6,3.
Ферментативная активность (НИФАБ-тест),0
Исходный раствор 118
Слив и промывные растворы 43
Смола-носитель после присоединения 81% исходной активности 96
Пример 4 а. Раствор 2100 г тетраэтиленгликольдиметакрилата, 600 г метакриловой кислоты, 300 г малеинового ангидрида и 30 г азоиэобутиронитрила в 7,5 л ацетонитрила суспендируют в 21 л бензина (Т,кип.1 00 — 140 С), в котором растворено
150 r смеси моно- и диолеата глицерина, и полимеризуют 1 ч. при 50 С и 20ч приб0 С. Бисерный полимер отсасывают, дважды перемешивают с петролейным эфиром (Т.кип.= 30 — 50 С) и сушат при 60 С, Выход 2,95 кг. Насыпной объем 4,7 мл/г.
Объем набухания в воде 5,4 мл/г. Средний размер частиц примерно 0,3 мм. Содержание кислоты после омыления ангидридных групп 4,0 мэкв/г.
Пример 4 б. 1 r полимера, полученного по примеру 1 б, взаимодействует с пенициллинацилазой в 33 мл воды при рН 6,3.
Ферментативная активность (НИФАБ — тест), 0
Исходный раствор 107
Слив и промывные растворы 27
Смола- носитель после присоединения 63% исходной активности 67
Пример 4 в. 20 г полимера, полученного по примеру 4 а, вводят при комнатной температуре в
600 мл раствора 1 r неспецифической эластазы из панкреазы свиньи при перемешивании. При этом рН поддерживают постоянной 5,8, Через 16ч смолу отсасывают и обрабатывают по способу, описанному в примере 1 б, Ферментативная активность (казеин-тест), Е
Исходный раствор 2180
Слив и промывные растворы 993
Смола-носитель после присоединения 56% исходной активности 1225
Ферментативную активность неспецифической эластаэы определяют титрованием казенном (концентрация 11,9 мг/мл) при рН 8,0 и 25 С. 1 единица (Е) соответствует расходованию 1 ммоль едкого калия в минуту.
Пример 5 а. Раствор 80 r тетраэтиленгликольдиметакрилата, 10 г метакриловой кислоты, 10 г малеинового ангидрида и 1 г азоиэобутиронитрила в 300 мл ацетонитрила полимернзуют по примеру 3 а. Выход 92 r белых, яйцеобразных частиц.
Насыпной объем 2,5 мл/г. Объем набухания в воде
3,2 мл/г. Удельная поверхность 1,7 м /г, Средний размер частиц 125 мкм. Содержание кислоты после омыления ацгидридных групп 3,5 мэкв/г.
1О
Пример 5 б, 1 г полимера, полученного по примеру 5 а, взаимодействует с пенициллинацилазой в 33 мл воды при рН6,3 аналогично примеру 1 6.
5 Фермеетативная активность (НИФАБ-тест), U
Исходный раствор 118
Слив и промывнь.е растворы 34
Смола-носитель после присоединения 52% исходной активности . 61
Пример 6 à. Раствор 50 г этиленгликольдиметакрилата, 40 г метакриловой кислоты, 10 г малеинового ангидрида и 1 г аэоизобутиронитрила в 300 мл ацетонитрила суспендируют в 1 л бензина !
5 (T.кип. = 100 — 140 C), в котором растворено 5 г смеси моно и диолеата глицерина, и полимеризуют
20 ч при 60 С. Бисерный полимер отфильтровывают, трижды суспендируют в бензоле и дважды в петролейном эфире (30 — 50 С) и сушат в вакууме
2с при 50 С. Выход 87 г. Насыпной объем .4,8 мл/г.
Объем набухания в воде 5,6 мл/г. Удельная поверхность 13,2 м /г. Содержание кислоты после омыления ангидридных групп 4,2 мэкв/г.
10 у, Пример б 6. 1 г полимера, полукнного по примеру б а, взаимодействует с пенициллинацилаэой в 33 мл воды при рН6,3 аналогично примеру 16, Ферментативная активность
ЗО (НИФАБ — тест), 0
Исходный раствор 118
Слив и промыв ные растворы 29
Смола- носитель после присоединения 47% исходной активности
Пример 7 а. Раствор 50 г тримелолпропантриметакрилата, 30 r метакриловой кислоты, 20г малеинов ого ангидрида и 1 г азоиэобутиронигрила в 300 мл ацетонитрила полимеризуют аналогично
4О примеру 6 а. Выход 86 г. Насьшной объем 2,0 мл/г.
Объем набухания в воде 2,2 мл/г. Средний размер частиц 30 мкм. Содержание кислоты после омыления анпщридных групп 4,1 мэкв/г.
45 Пример 7 б. 1 г полимера, полученного по примеру 7 а, при комнатной температуре и постоянном перемешиваиии смешивают с раствором 100 мг лизина в 32мл воды. Величину рН поддерживают постоянной 6,3. Через 16 ч смолу отсасывают, суспендируют в 50 мл 1 М раствора хлористого натрия, отсасывают и промывают 100 мл воды. Осадок сушат в вакууме при 100 С и определяют содержание азота по способу Кьельдаля, Сухой вес 860 кг.
Содержание азота 1,5% (соответственно содержа66 нию смолы с 65 мг лизина), что соответствует 65% введенного количества лизина.
Пример 8. Полимеризацию проводят аналогично примеру ба (в опытах 1 — 7 изменяют количества малеинового ангидрида), Результаты
® опытов приведены в таблице, I
Показатель
Количество
ТОГМ (r) 60
МАК (г) 2О
20 го
20 го
1О
АИБН (r) 250
250 250 250
250
250
Ацетонитрил (мл
Бензин (мл)
Эмульгатор (г) 1000
1ООО 1000 1ООО 1000 1ООО 1ООО
25 5:5 5 5
Выход (г) 93
УН (мл/г) у, (мл/г) Нб
3,5
2,6
3,4
3,0
c .. э
4,0
3,5
4,5
6,Î
3,4
Количество кисл ты (мэкв/г) 3,1
4,2 и е: 1 З1 М - тетраэтиленгликольдиметакрилат, (r); МАК - метакриловая кислота, (г); МА - малеиновый анпщрид, (г), АИБН - аэоизобутиронитрил, (г), эмульгатор-смесь моно- и диолеата гжщерина, (г); ацетонитрил и бензин, (мл); УН-насыпной объем„(мл/г); УНб - объем набухания в воде, (мл/г); кислота-содержание кислоты после омьшения ангидридных групп.
При меча ор 70 г тетраэтиленглиакриловой кислоты, 10 г
1 r азоизобутиронитрила ии воздуха и при медленеют 4ч при 60 С, 2ч . Высокоцисперсньгй полив бензоле и дважды в т и сушат в вакууме, Вым.6,8 мл/г. Объем набухаодержание кислоты после рупп 1,64 миллиэкв/г. полимера, полученного по ствует с пенициллинациларН6,3 аналогично при107
26 растворы ле присоедий активности
Пример 9 а. Ра кольдиметакрилата, 20 малеинового ангидрида в 1 л бензола в отсутс ном перемепивании при 70 С и 2ч при 80 мер суспендируют тр ацетонитриле, отсасыва ход 94 r, Насыпной об ния в воде 7,6мл/г. омыления ангидридных
Пример9б.1 примеру 9 а, взаимоде зой в 32мл воды п и меру 1 б.
Ферме нтативная тив (НИФАБ — тест), 0
Исходный раствор
Слив и промывны
Смола-носитель п пения 36% исходи
Пример 10 а. Раствор 50 г тетраэтиленгли40 кольдиметакрилата, 40; N-винилпирролидона, 10 r малеинового ангидрида и 1 г дициклогексилперкарбоната в 200 мл ацетоыприла суспендируют в 1 л бензина (Т,кип.= 100-140 С), который содержит г5 г смеси моно- и диолеата глицерина,. и rrpr перемео 1
45 шивании греют 18ч при 50 С. Затем добавляют 1 г инициатора и перемешивают 8 ч при 60 С. Полимерные шарики промывают бензолом и петролейным эфиро л и сушат в вакууме. Выход 54 r прозрачного бисера. Насыпной объем 1,6 мл/г. Объем набухания 0 в воде 2,4мл/г. Средний диаметр частиц 0,3 мм.
Содержание кислоты после омыления ангидридных групп 3,3 мэкв/г, Содержание азота 3,4% (27% й° винилпирролидон) .
Пример 10 б, 1 г полимера, полученного по примеру 10 а взаимодействует с пенициллинацилазой в 33 мл воды при рН 6,3, Ферментативная активность (НИФАБ — тест), О
Исходный раствор 107
Смола носитель после присоеди. нения 3 1% исходной активности
ЭЗ
Сон еентель в, 1)еда@се»
Техред Н, *ндреачун
Кнррен rap А Декаде редактор Н, Пстеноее — — — Ф
Эекее 2957/7(H Тираж 610 Иоддиеное цццИПИ рочудмроРиеннеге комитете (Оаете Ынннстрое (Ссу ло дедам идабретенна и атнрцти»! !ЗОВ, Маенае, )К-35, Реущеиее нее„д, 4/5
Фиднед ПНИ Петент" г Ужнарец, уд, 11роеипцн, 4
Слив и промывные растворы 26
Смола ° íîñèòåëb после присоедн. нения 77% исходной активности 82
Пример 11 а. Раствор 70 г тетраэтнленгликольдиметакрилата, 20г метакриламида, 10 г малеинового ангидрида, 1 г азоизобутиронитрила и
200 мл ацетоннтрила суспендируют в бензине аналогично примеру 5а н полимеризуют, Выход 93r.
Насыпной объем 2,0 мл/г. Объем набухания в воде
3,3 мл/г. Содержание кислоты после омыления ангидрндных групп 1,7 мэкв/г.
П р н м е р 11 б. 1 г полимера, полученного по примеру 11 а, взаимодействует с пеницнллинацила* зой в 32мл воды при рН6,3 аналогично приме. ру1 б.
Ферментатнвная активность (НИФАБ — тест), 0
Исходный раствор 107
Слив и промывные растворы 42 б Формула изобретения
Способ получения водонерастворнмых протеиновых препаратов путем взаимодействия полимерного носителя с раствором протеина в водно) О сусле нзионной среде, о т л н ч а ю шийся тем, что, с целью получения протеиновых препаратов с высокой степенью сшивки, в качестве полимерного носителя используют сополимер 0,1-30 sec,% ангидрида сц3 - моноолефиновой дикарбоновой кис.
l5 лоты с 35-90 вес.% ди- и/или полиметакрилата дни/нли полиола и с 5-60 вес.% гндрофильного моиомера.
Источники информации, принятые во внимание при знспертизе:
20 ), Biochemistry, 3 )96¹, 1905-)909.
